JP2761402B2 - 普遍的なｔ―細胞エピトープ - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープ、
すなわち、例えばDR1、DR2、DR4、DR5、DRw6、DR7また
はDR9などのヒトMHCクラスII分子類との関連における、
多くの異なったヒトおよびマウス主要組織適合遺伝子複
合体（MHC）ハプロタイプとの会合において認識される
エピトープとしての、プラスモジウムファルシパルム
（Plasmodium falciparum;P.falciparum）のサーカムス
ポロゾイト（circumsporozoite;CS）蛋白質由来のペプ
チドおよびその誘導体の使用に関する。更に本発明は、
上述のペプチド類自体、およびそのようなペプチドまた
はその誘導体を含有する免疫原性組成物類に関する。こ
れらの免疫原性組成物類は、ヒトおよび動物類におい
て、該ホストの該MHCハプロタイプに関係なく、病原性
物質に対する永続性の免疫応答を誘導するためのワクチ
ン類として使用され得る。
すなわち、例えばDR1、DR2、DR4、DR5、DRw6、DR7また
はDR9などのヒトMHCクラスII分子類との関連における、
多くの異なったヒトおよびマウス主要組織適合遺伝子複
合体（MHC）ハプロタイプとの会合において認識される
エピトープとしての、プラスモジウムファルシパルム
（Plasmodium falciparum;P.falciparum）のサーカムス
ポロゾイト（circumsporozoite;CS）蛋白質由来のペプ
チドおよびその誘導体の使用に関する。更に本発明は、
上述のペプチド類自体、およびそのようなペプチドまた
はその誘導体を含有する免疫原性組成物類に関する。こ
れらの免疫原性組成物類は、ヒトおよび動物類におい
て、該ホストの該MHCハプロタイプに関係なく、病原性
物質に対する永続性の免疫応答を誘導するためのワクチ
ン類として使用され得る。
抗原構造（Ｂ−細胞エピトープ類）の選択された領域
を提示する化学合成ペプチド類は、天然の分子に結合す
る抗体類を誘導し得ることが知られている（Arnonら
の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 68、1450−1455［197
1］）。このようなペプチド類は、宿主中に注射される
ことができ、これによって保護的抗体応答が誘導される
（Shinnickらの、Ann.Rev.Microbiol.37、425−446［19
83］参照）。
を提示する化学合成ペプチド類は、天然の分子に結合す
る抗体類を誘導し得ることが知られている（Arnonら
の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 68、1450−1455［197
1］）。このようなペプチド類は、宿主中に注射される
ことができ、これによって保護的抗体応答が誘導される
（Shinnickらの、Ann.Rev.Microbiol.37、425−446［19
83］参照）。
しかしながら、多型的クラスII MHC遺伝子による個々
のエピトープ類に対する応答性の厳密な遺伝子的調節
は、単一的エピトープワクチンの有用性に限界を与え
る。
のエピトープ類に対する応答性の厳密な遺伝子的調節
は、単一的エピトープワクチンの有用性に限界を与え
る。
宿主中で常に免疫応答を誘導するとは限らないエピト
ープの例は、マラリア原虫P.falciparumの該CS蛋白質中
の反復配列Asn−Ala−Asn−Pro（NANP）である（Eneaら
の、Science、225、628−630［1984］;DameらのScience
225、593−599［1984］）。該反復性ペプチドは、寄生
動物−特異性免疫応答を、Ｈ−2bハプロタイプを保有す
るようにマウスにおいてのみ誘導するものとして見出さ
れた（Goodらの、J.Exp.Med.164、655−660［1986］;de
l Guidiceらの、J.Immunol.137、2952−2599［198
6］）。
ープの例は、マラリア原虫P.falciparumの該CS蛋白質中
の反復配列Asn−Ala−Asn−Pro（NANP）である（Eneaら
の、Science、225、628−630［1984］;DameらのScience
225、593−599［1984］）。該反復性ペプチドは、寄生
動物−特異性免疫応答を、Ｈ−2bハプロタイプを保有す
るようにマウスにおいてのみ誘導するものとして見出さ
れた（Goodらの、J.Exp.Med.164、655−660［1986］;de
l Guidiceらの、J.Immunol.137、2952−2599［198
6］）。
最近、該CS蛋白質（NANP）ｎの非免疫原性Ｂ−細胞エ
ピトープが、該CS蛋白質由来の326から343までのアミノ
酸残基を有するＴ−細胞エピトープに結合することによ
って、高度に免疫原性と成り得ることが示されている
（Goodらの、Science 235、1059−1062［1987］）。こ
のＴ−細胞エピトープに対応するアミノ酸配列を含むペ
プチドが、該反復性配列（NANP）５を含むペプチドに共
有的に結合された。該連結ペプチド類は、B10BRおよびB
10.A（4R）マウスにおいて高い抗体力価を誘導した。同
様に、Francisらは、Nature 330、168−170［1987］に
おいて手足口病ウイルスプペチドに対する非応答性が、
手足口病ウイルスＢ−細胞エピトープと、例えばオボア
ルブミンまたはマッコウクジラミオグロビン由来の外来
性ヘルパーＴ−細胞決定因子との結合によって解消され
ることを報告している。Goodら（［1987］、前出文献）
およびFrancisら（前出文献）によって記述されている
Ｔ−細胞決定因子に対する応答は、Ir遺伝子（免疫応答
遺伝子類）の制御下にある。このことは、“適切な"MHC
ハプロタイプを有した特定の同系繁殖のマウス系のみ
が、使用したＴ−細胞エピトープを認識し得たことを意
味している。
ピトープが、該CS蛋白質由来の326から343までのアミノ
酸残基を有するＴ−細胞エピトープに結合することによ
って、高度に免疫原性と成り得ることが示されている
（Goodらの、Science 235、1059−1062［1987］）。こ
のＴ−細胞エピトープに対応するアミノ酸配列を含むペ
プチドが、該反復性配列（NANP）５を含むペプチドに共
有的に結合された。該連結ペプチド類は、B10BRおよびB
10.A（4R）マウスにおいて高い抗体力価を誘導した。同
様に、Francisらは、Nature 330、168−170［1987］に
おいて手足口病ウイルスプペチドに対する非応答性が、
手足口病ウイルスＢ−細胞エピトープと、例えばオボア
ルブミンまたはマッコウクジラミオグロビン由来の外来
性ヘルパーＴ−細胞決定因子との結合によって解消され
ることを報告している。Goodら（［1987］、前出文献）
およびFrancisら（前出文献）によって記述されている
Ｔ−細胞決定因子に対する応答は、Ir遺伝子（免疫応答
遺伝子類）の制御下にある。このことは、“適切な"MHC
ハプロタイプを有した特定の同系繁殖のマウス系のみ
が、使用したＴ−細胞エピトープを認識し得たことを意
味している。
理想的なワクチンは、すべての個体に病原性物質に対
する免疫応答を誘導しなければならないため、それはす
べてのMHCハプロタイプにより認識されるＴ−細胞エピ
トープ（類）を含まなければならない。
する免疫応答を誘導しなければならないため、それはす
べてのMHCハプロタイプにより認識されるＴ−細胞エピ
トープ（類）を含まなければならない。
アミノ酸配列 を有するCS.T3ペプチドが、普遍的に認識されるＴ−細
胞エピトープとして使用され得ることが見出されてい
る。このことは、それが、例えばヒトMHC分子類DR1、DR
2、DR4、DR5、DRw6、DR7またはDR9との関連における多
くの異なったヒトおよびマウスMHCハプロタイプとの会
合において認識されることを意味する。該CS.TCペプチ
ドは、P.falciparum由来のCS蛋白質の378から398までの
残基（Dameらの前出文献）に対応しているが、天然の蛋
白質の384および398位のシステイン残基に替えて、２個
のアラニン残基を含んでいる。従って、該CS.T3ペプチ
ドは、［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）
とも称され得る。
胞エピトープとして使用され得ることが見出されてい
る。このことは、それが、例えばヒトMHC分子類DR1、DR
2、DR4、DR5、DRw6、DR7またはDR9との関連における多
くの異なったヒトおよびマウスMHCハプロタイプとの会
合において認識されることを意味する。該CS.TCペプチ
ドは、P.falciparum由来のCS蛋白質の378から398までの
残基（Dameらの前出文献）に対応しているが、天然の蛋
白質の384および398位のシステイン残基に替えて、２個
のアラニン残基を含んでいる。従って、該CS.T3ペプチ
ドは、［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）
とも称され得る。
更には、該CS.T3ペプチドのアミノ酸配列において僅
かな修飾を有するCS.T3ペプチド誘導体類もやはり普遍
的に認識されるＴ−細胞エピトープとして使用されるこ
とが見出された。かくして、普遍的に認識されるＴ−細
胞エピトープとしての用途をそこなうことなく、例えば
１または２個のアミノ酸を該ペプチドのいずれかの末端
において除去することができる。より多くのアミノ酸が
除去されるに従って、該ペプチドは異なったMHCハプロ
タイプにより認識される能力をより失なうが、該CS.T3
ペプチドのいずれかの末端において２個以上のアミノ酸
が除去された場合にも、該ペプチドは、なおほとんど全
てのMHCハプロタイプにより認識される。該ペプチドの
いずれかの末端において８個より多くのアミノ酸が除去
された場合には、それは、もはやいずれのMHCハプロタ
イプによってもＴ−細胞エピトープとして認識されない
（下記参照）。
かな修飾を有するCS.T3ペプチド誘導体類もやはり普遍
的に認識されるＴ−細胞エピトープとして使用されるこ
とが見出された。かくして、普遍的に認識されるＴ−細
胞エピトープとしての用途をそこなうことなく、例えば
１または２個のアミノ酸を該ペプチドのいずれかの末端
において除去することができる。より多くのアミノ酸が
除去されるに従って、該ペプチドは異なったMHCハプロ
タイプにより認識される能力をより失なうが、該CS.T3
ペプチドのいずれかの末端において２個以上のアミノ酸
が除去された場合にも、該ペプチドは、なおほとんど全
てのMHCハプロタイプにより認識される。該ペプチドの
いずれかの末端において８個より多くのアミノ酸が除去
された場合には、それは、もはやいずれのMHCハプロタ
イプによってもＴ−細胞エピトープとして認識されない
（下記参照）。
普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープとしての用途
に影響しないCS.T3ペプチドのアミノ酸配列の他の修飾
は、アミノ酸の置換ならびにＣ−末端および／またはＮ
−末端における付加である。従って、前記CS.T3ペプチ
ドまたはその誘導体は、より大きいポリペプチド、例え
ば天然CS蛋白質もしくはその断片、または外来ペプチド
配列、好ましくはマラリア寄生虫の他のポリペプチド由
来のペプチド配列を含む融合蛋白質の一部分でありう
る。更には、該CS.T3ペプチドまたはその誘導体のＣ−
末端は、アミド化されていてもよい。
に影響しないCS.T3ペプチドのアミノ酸配列の他の修飾
は、アミノ酸の置換ならびにＣ−末端および／またはＮ
−末端における付加である。従って、前記CS.T3ペプチ
ドまたはその誘導体は、より大きいポリペプチド、例え
ば天然CS蛋白質もしくはその断片、または外来ペプチド
配列、好ましくはマラリア寄生虫の他のポリペプチド由
来のペプチド配列を含む融合蛋白質の一部分でありう
る。更には、該CS.T3ペプチドまたはその誘導体のＣ−
末端は、アミド化されていてもよい。
該ペプチドのＮ−またはＣ−末端における修飾の他
に、該CS.T3ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列
内部における修飾も可能であり、この修飾は、該ペプチ
ドまたはその誘導体が、なお普遍的に認識されるＴ−細
胞エピトープとして使用されることを可能とする。これ
らの修飾は、除去、挿入および／またはアミノ酸の置換
である。このような誘導体の例は、天然のCS−蛋白質の
ように384および389位にシステイン残基を有するCS−蛋
白質の378から398までの残基を含むペプチドである。該
修飾の一般的特徴は、それらがペプチドの２次または３
次構造を実質的に変化させないことである（Doolittle,
R.F.の“The Proteins"、IV巻、Neurath,H.およびHill,
R.L.編、Academic Press社、ニューヨーク、１−119頁
［1979］）。上述した該誘導体は、該MHCクラスII分子
類に対して、該CS.T3ペプチドと少なくとも同程度か、
好ましくはより良く結合しなければならない。383位のI
leがLeuに置換されているか、および／または387位のGl
uがGlyに置換されている誘導体は、結合を競合結合検査
により測定した場合に、DR5およびDRw6の両者に対して
本来のCS.T3配列の約10−100倍より良く結合することが
観察された（KilgusらのProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、8
6、1629−1633［1989］）。
に、該CS.T3ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列
内部における修飾も可能であり、この修飾は、該ペプチ
ドまたはその誘導体が、なお普遍的に認識されるＴ−細
胞エピトープとして使用されることを可能とする。これ
らの修飾は、除去、挿入および／またはアミノ酸の置換
である。このような誘導体の例は、天然のCS−蛋白質の
ように384および389位にシステイン残基を有するCS−蛋
白質の378から398までの残基を含むペプチドである。該
修飾の一般的特徴は、それらがペプチドの２次または３
次構造を実質的に変化させないことである（Doolittle,
R.F.の“The Proteins"、IV巻、Neurath,H.およびHill,
R.L.編、Academic Press社、ニューヨーク、１−119頁
［1979］）。上述した該誘導体は、該MHCクラスII分子
類に対して、該CS.T3ペプチドと少なくとも同程度か、
好ましくはより良く結合しなければならない。383位のI
leがLeuに置換されているか、および／または387位のGl
uがGlyに置換されている誘導体は、結合を競合結合検査
により測定した場合に、DR5およびDRw6の両者に対して
本来のCS.T3配列の約10−100倍より良く結合することが
観察された（KilgusらのProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、8
6、1629−1633［1989］）。
従って、本発明は、アミノ酸配列 （式中、R1は、Ｈ−Asp−Ile、Ｈ−Ile−またはＨ−、
およびR2は、−Val−Asn−Ser−OH、−Val−Asn−OH、
−Val−OHまたは−OHである） を含有するポリペプチドまたはその誘導体の普遍的に認
識されるＴ−細胞エピトープとしての使用、該ポリペプ
チド自体、およびこれらのポリペプチド類の製造方法に
関するものである。また、本発明は、このようなポリペ
プチドおよびβ−細胞エピトープを提示する抗原構造を
有するポリペプチドを含有する免疫原性組成物に関す
る。
およびR2は、−Val−Asn−Ser−OH、−Val−Asn−OH、
−Val−OHまたは−OHである） を含有するポリペプチドまたはその誘導体の普遍的に認
識されるＴ−細胞エピトープとしての使用、該ポリペプ
チド自体、およびこれらのポリペプチド類の製造方法に
関するものである。また、本発明は、このようなポリペ
プチドおよびβ−細胞エピトープを提示する抗原構造を
有するポリペプチドを含有する免疫原性組成物に関す
る。
上述したポリペプチド類の誘導体は、上述したような
アミノ酸配列（Ｉ）中に修飾を有するポリペプチド類で
あって、この修飾は、該ポリペプチドの２次または３次
構造を変化させることがなく、従ってこれらのポリペプ
チドは、数種のMHCクラスII分子に対して、なお結合
し、かくして、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープ
として使用され得るものである。
アミノ酸配列（Ｉ）中に修飾を有するポリペプチド類で
あって、この修飾は、該ポリペプチドの２次または３次
構造を変化させることがなく、従ってこれらのポリペプ
チドは、数種のMHCクラスII分子に対して、なお結合
し、かくして、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープ
として使用され得るものである。
本発明において、普遍的に認識されるＴ−細胞エピト
ープとして使用される好ましいポリペプチド類は、以下
のアミノ酸配列 を有するポリペプチド類、あるいは該アミノ酸配列（I
I）ないし（XIII）を有するポリペプチドの誘導体であ
る。
ープとして使用される好ましいポリペプチド類は、以下
のアミノ酸配列 を有するポリペプチド類、あるいは該アミノ酸配列（I
I）ないし（XIII）を有するポリペプチドの誘導体であ
る。
本発明において普遍的に認識されるＴ−細胞エピトー
プとして使用される最適なポリペプチドは、上述したC
S.T3ペプチドと同じアミノ酸配列XIIIを有するポリペプ
チドである。
プとして使用される最適なポリペプチドは、上述したC
S.T3ペプチドと同じアミノ酸配列XIIIを有するポリペプ
チドである。
先に概略を述べたように、Ｔ−細胞エピトープとＢ−
細胞エピトープとの組合せは、Ｔ−ヘルパー細胞依存性
免疫応答を誘導することができる機能的な単位である。
従って、上述したＴ−細胞エピトープは、宿主に免疫応
答を誘導するためにＢ−細胞エピトープに会合していな
ければならない。該Ｂ−細胞エピトープは、抗原構造の
選択された領域を提示するペプチド、ハプテンまたは炭
水化物のいずれであってもよい。このような抗原構造
は、ポリペプチドの一部分であってよく、このポリペプ
チドは、グリコシル化されていてもよく、またはされて
なくともよい。該ポリペプチドは、病原性物質、例えば
疾患原因性細菌、ウイルス、カビまたは寄生虫の表面蛋
白質であってもよい。このような病原性物質の例は、Da
visらの“Microbiclogy."第３版、Harper Internationa
l Editionに記載されている。
細胞エピトープとの組合せは、Ｔ−ヘルパー細胞依存性
免疫応答を誘導することができる機能的な単位である。
従って、上述したＴ−細胞エピトープは、宿主に免疫応
答を誘導するためにＢ−細胞エピトープに会合していな
ければならない。該Ｂ−細胞エピトープは、抗原構造の
選択された領域を提示するペプチド、ハプテンまたは炭
水化物のいずれであってもよい。このような抗原構造
は、ポリペプチドの一部分であってよく、このポリペプ
チドは、グリコシル化されていてもよく、またはされて
なくともよい。該ポリペプチドは、病原性物質、例えば
疾患原因性細菌、ウイルス、カビまたは寄生虫の表面蛋
白質であってもよい。このような病原性物質の例は、Da
visらの“Microbiclogy."第３版、Harper Internationa
l Editionに記載されている。
本発明の普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープとし
て使用されるペプチドは、Ｂ−細胞エピトープを提示す
るペプチド、ハプテンまたは炭水化物のいずれかと共有
的に結合され得る。該結合は、普遍的に認識されるＴ−
細胞エプトープとして使用されるペプチド上の遊離のカ
ルボキシル、アミノまたはヒドロキシル基と、Ｂ−細胞
エピトープを提示するペプチド、ハプテンまたは炭水化
物上の対応する基との間のペプチドまたはエステル結合
形成により直接的にあるか、あるいは、通常の二官能性
結合基を介して間接的であってもよい。このような結合
基の形成のために使用される通常の二官能性結合剤の例
は、スルホサクシニミジル・４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）ブチレート（スルホ−SMPB）、スルホサクシニミ
ジル（４−イオドアセチル）アミノベンゾエート（スル
ホ−SIAB）、Ｎ−サクシニミジル（４−イオドアセチ
ル）アミノベンゾエート（SIAB）、２−イミノチオラン
・HCl（トラウト試薬）、ジメチル・ピメリミデート・2
HCl（DMP）、サクシニミジル・４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−サクシニミジル・３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、ビ
スマレイミドヘキサン（BMH）およびｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステル
（MBS）である。これらのもの、およびその他の二官能
性結合試薬は、Pierce Chemical Company、ロックフォ
ード、イリノイ、米国から商業的に入手可能である。別
法として、グルタルアルデヒド等のC2-7−ジアルカナー
ル類を用いることもできる（AvrameasのImmunochem.
６、43−52［1969］）。
て使用されるペプチドは、Ｂ−細胞エピトープを提示す
るペプチド、ハプテンまたは炭水化物のいずれかと共有
的に結合され得る。該結合は、普遍的に認識されるＴ−
細胞エプトープとして使用されるペプチド上の遊離のカ
ルボキシル、アミノまたはヒドロキシル基と、Ｂ−細胞
エピトープを提示するペプチド、ハプテンまたは炭水化
物上の対応する基との間のペプチドまたはエステル結合
形成により直接的にあるか、あるいは、通常の二官能性
結合基を介して間接的であってもよい。このような結合
基の形成のために使用される通常の二官能性結合剤の例
は、スルホサクシニミジル・４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）ブチレート（スルホ−SMPB）、スルホサクシニミ
ジル（４−イオドアセチル）アミノベンゾエート（スル
ホ−SIAB）、Ｎ−サクシニミジル（４−イオドアセチ
ル）アミノベンゾエート（SIAB）、２−イミノチオラン
・HCl（トラウト試薬）、ジメチル・ピメリミデート・2
HCl（DMP）、サクシニミジル・４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−サクシニミジル・３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、ビ
スマレイミドヘキサン（BMH）およびｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステル
（MBS）である。これらのもの、およびその他の二官能
性結合試薬は、Pierce Chemical Company、ロックフォ
ード、イリノイ、米国から商業的に入手可能である。別
法として、グルタルアルデヒド等のC2-7−ジアルカナー
ル類を用いることもできる（AvrameasのImmunochem.
６、43−52［1969］）。
更には、該Ｂ−細胞およびＴ−細胞エピトープは、多
重抗原性ペプチド（MAP）の一部分でありうる。このよ
うなMAP類は、PosnettらのJ.Biol.Chem.263、1719−172
5［1988］によって記述されているようにして調製され
てもよい。MAPの例は、プラスモジウムファルシパルム
のCS蛋白質中に存在する反復配列（NANP）の多量体を含
む多重抗原性ペプチド系（MAPS）Ｂ−細胞エピトープ
［（NANP）３］８−Lys7−Aca−Cys−NH2である（国際
特許出願番号PCT/US85/01416、公開番号WO86/00911）。
このMAPSは、固相法により合成され得る。２つの別個の
免疫化の研究において、このMAPSが破傷風毒素に対して
結合した［Ac−Cys（NANP）３］25B−細胞エピトープに
ついて観察されたものと比較し得る抗体力価を誘導する
ことが見出された（HerringtonらのNature 328、257−2
59［1987］）。前述したMAPS B−細胞エピトープは、充
分特定された均質なペプチドであって、正確な投与を可
能とし、高い抗体力価を誘導するために担体蛋白質（例
えば破傷風毒素）との結合を必要としないことから、こ
の観察は特に重要である。従って、該MAPS B−細胞エピ
トープの手法は、（ａ）ペプチド−蛋白質結合の微変異
異性（microheterogeneity）および（ｂ）結合物の合成
ペプチド部分に対する免疫応答を妨害するであろう破傷
風毒素自体に対する抗体応答を含む蛋白質担体に結合さ
れたペプチドワクチン類に伴う問題を解決するであろう
（Herringtonらの前出文献）。
重抗原性ペプチド（MAP）の一部分でありうる。このよ
うなMAP類は、PosnettらのJ.Biol.Chem.263、1719−172
5［1988］によって記述されているようにして調製され
てもよい。MAPの例は、プラスモジウムファルシパルム
のCS蛋白質中に存在する反復配列（NANP）の多量体を含
む多重抗原性ペプチド系（MAPS）Ｂ−細胞エピトープ
［（NANP）３］８−Lys7−Aca−Cys−NH2である（国際
特許出願番号PCT/US85/01416、公開番号WO86/00911）。
このMAPSは、固相法により合成され得る。２つの別個の
免疫化の研究において、このMAPSが破傷風毒素に対して
結合した［Ac−Cys（NANP）３］25B−細胞エピトープに
ついて観察されたものと比較し得る抗体力価を誘導する
ことが見出された（HerringtonらのNature 328、257−2
59［1987］）。前述したMAPS B−細胞エピトープは、充
分特定された均質なペプチドであって、正確な投与を可
能とし、高い抗体力価を誘導するために担体蛋白質（例
えば破傷風毒素）との結合を必要としないことから、こ
の観察は特に重要である。従って、該MAPS B−細胞エピ
トープの手法は、（ａ）ペプチド−蛋白質結合の微変異
異性（microheterogeneity）および（ｂ）結合物の合成
ペプチド部分に対する免疫応答を妨害するであろう破傷
風毒素自体に対する抗体応答を含む蛋白質担体に結合さ
れたペプチドワクチン類に伴う問題を解決するであろう
（Herringtonらの前出文献）。
従って、該Ｔ−細胞およびＢ−細胞レベルの両者にお
ける長期免疫を有する理想的なワクチンを開発する試み
においての更なる改良として、配列Ｉまたはその誘導体
のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、上述したMAPS
B−細胞エピトープと結合されてもよい。例えば、アミ
ノ酸配列XIIIを有するポリペプチド（実施例、化合物5a
参照）またはアミノ酸配列Ｘを有するポリペプチド（実
施例、化合物7a参照）は、MAPS B−細胞エピトープ
［（NANP）３］８−Lys7−Aca−Cys−NH2と結合されて
もよい。後者のペプチド／ペプチドワクチンの模式的表
示が第１図に示されている。上述のペプチド／ペプチド
ワクチン類において、Ｔ−細胞エピトープを提示するペ
プチドは、β−細胞エピトープを提示するペプチドに共
有的に結合されている。しかしながら、Ｔ−細胞エピト
ープを提示するペプチドは、Ｂ−細胞エピトープを提示
するペプチドに共有的に結合されている必要はなく、該
ペプチド類は、免疫系の細胞に対して同時的提示をもた
らすような方法で会合していることのみが必要とされ
る。
ける長期免疫を有する理想的なワクチンを開発する試み
においての更なる改良として、配列Ｉまたはその誘導体
のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、上述したMAPS
B−細胞エピトープと結合されてもよい。例えば、アミ
ノ酸配列XIIIを有するポリペプチド（実施例、化合物5a
参照）またはアミノ酸配列Ｘを有するポリペプチド（実
施例、化合物7a参照）は、MAPS B−細胞エピトープ
［（NANP）３］８−Lys7−Aca−Cys−NH2と結合されて
もよい。後者のペプチド／ペプチドワクチンの模式的表
示が第１図に示されている。上述のペプチド／ペプチド
ワクチン類において、Ｔ−細胞エピトープを提示するペ
プチドは、β−細胞エピトープを提示するペプチドに共
有的に結合されている。しかしながら、Ｔ−細胞エピト
ープを提示するペプチドは、Ｂ−細胞エピトープを提示
するペプチドに共有的に結合されている必要はなく、該
ペプチド類は、免疫系の細胞に対して同時的提示をもた
らすような方法で会合していることのみが必要とされ
る。
該Ｂ−細胞および／またはＴ−細胞エピトープを提示
するペプチド類は、溶液または好ましくはMerrifieldの
固相法（J.Am.Chem.Soc.85、2149−2154［1963］）ある
いはこの分野で知られている他のいかなる同等な方法の
いずれかによる通常のペプチド合成法によって調製され
得る。
するペプチド類は、溶液または好ましくはMerrifieldの
固相法（J.Am.Chem.Soc.85、2149−2154［1963］）ある
いはこの分野で知られている他のいかなる同等な方法の
いずれかによる通常のペプチド合成法によって調製され
得る。
固相法は、保護されたアミノ酸を適当な樹脂に結合す
ることによってペプチドのＣ−末端から開始される。出
発材料は、アミノ−保護アミノ酸を、ベンジルエステル
結合を介してクロルメチル化樹脂もしくはヒドロキシメ
チル樹脂に、またはアミノ結合を介してベンズヒドリル
アミン（BHA）樹脂、メチルベンズヒドリルアミン（MBH
A）樹脂もしくはベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂に固定することによって調製され得る。これらの樹脂
は、商業的に入手可能であり、かつそれらの調製および
使用は周知である。
ることによってペプチドのＣ−末端から開始される。出
発材料は、アミノ−保護アミノ酸を、ベンジルエステル
結合を介してクロルメチル化樹脂もしくはヒドロキシメ
チル樹脂に、またはアミノ結合を介してベンズヒドリル
アミン（BHA）樹脂、メチルベンズヒドリルアミン（MBH
A）樹脂もしくはベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂に固定することによって調製され得る。これらの樹脂
は、商業的に入手可能であり、かつそれらの調製および
使用は周知である。
本発明において使用し得る、アミノ酸を保護し、また
保護基を除去するための一般的方法は、“The Peptide
s:Analysis,Synthesis,Biology"第２巻（E.Grossおよび
J.Meienhofer編、Academic Press、ニューヨーク、１−
284頁［1979］）およびAthertorらによる“The Peptide
s:Analysis,Synthesis,Biology"、第９巻、（S.Udenfri
edおよびJ.Meienhofer編、Academic Press、ニュヨーク
［1987］）に記載されている。保護基は、例えば、９−
フルオルエニル−メチルオキシカルボニル（Fmoc）、te
rt−ブチルオキシカルボニル（Boc）、ベンジル（Bz
l）、ｔ−ブチル（But）、２−クロロベンジルオキシカ
ルボニル（2Cl−Ｚ）、ジクロロベンジル（Dcb）および
3,4−ジメチルベンジル（Dmb）基を含んでいる。
保護基を除去するための一般的方法は、“The Peptide
s:Analysis,Synthesis,Biology"第２巻（E.Grossおよび
J.Meienhofer編、Academic Press、ニューヨーク、１−
284頁［1979］）およびAthertorらによる“The Peptide
s:Analysis,Synthesis,Biology"、第９巻、（S.Udenfri
edおよびJ.Meienhofer編、Academic Press、ニュヨーク
［1987］）に記載されている。保護基は、例えば、９−
フルオルエニル−メチルオキシカルボニル（Fmoc）、te
rt−ブチルオキシカルボニル（Boc）、ベンジル（Bz
l）、ｔ−ブチル（But）、２−クロロベンジルオキシカ
ルボニル（2Cl−Ｚ）、ジクロロベンジル（Dcb）および
3,4−ジメチルベンジル（Dmb）基を含んでいる。
第１の（Ｃ−末端）アミノ酸から該α−アミノ保護基
を除去した後に、残りの保護されたアミノ酸が所望の順
序で段階的に結合される。該完全ペプチドは、この方法
で合成されてもよい。別法として、後で結合して最終ペ
プチドの生成物を与える小さいペプチドを合成すること
もできる。適当な結合方法は、この分野において知られ
ており、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド/1−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（DCC/HOBt）またはｏ−ベ
ンゾトリアゾリル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニ
ウムヘクサフルオロホスフェート（HBTU）を使用するDo
urtoglouらの方法が特に適している。
を除去した後に、残りの保護されたアミノ酸が所望の順
序で段階的に結合される。該完全ペプチドは、この方法
で合成されてもよい。別法として、後で結合して最終ペ
プチドの生成物を与える小さいペプチドを合成すること
もできる。適当な結合方法は、この分野において知られ
ており、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド/1−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（DCC/HOBt）またはｏ−ベ
ンゾトリアゾリル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニ
ウムヘクサフルオロホスフェート（HBTU）を使用するDo
urtoglouらの方法が特に適している。
各々の保護されたアミノ酸またはペプチドは、過剰量
をもって固相反応器に導入され、そして結合は、ジメチ
ルホルムアミド（DMF）もしくは塩化メチレン（CH2C
l2）、またはそれらの混合物中の媒体中で行なわれる。
不完全な結合が起きた場合には、次のアミノ酸の結合に
先立って、Ｎα−アミノ保護基を除去する前に該結合処
理が繰り返される。合成の各段階における結合反応の成
功を監視してもよい。合成を監視する好ましい方法は、
ニンヒドリン反応によるものである。該結合反応および
洗浄工程は、自動化装置を用いて行なうことができる。
をもって固相反応器に導入され、そして結合は、ジメチ
ルホルムアミド（DMF）もしくは塩化メチレン（CH2C
l2）、またはそれらの混合物中の媒体中で行なわれる。
不完全な結合が起きた場合には、次のアミノ酸の結合に
先立って、Ｎα−アミノ保護基を除去する前に該結合処
理が繰り返される。合成の各段階における結合反応の成
功を監視してもよい。合成を監視する好ましい方法は、
ニンヒドリン反応によるものである。該結合反応および
洗浄工程は、自動化装置を用いて行なうことができる。
該樹脂からの該ペプチドの開裂は、ペプチド化学にお
いて良く知られている方法を用いて行なわれ得る。例え
ば、ｐ−クレゾールおよびジメチルスルフィドの存在下
における０℃、１時間のフッ化水素（HF）との反応は、
ｐ−クレゾールの存在下における０℃、２時間のフッ化
水素、またはトリフルオロ酢酸／塩化メチレン／アニソ
ールとの反応に引継がれてもよい。クロロメチル化また
はｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂支持体か
らのペプチド類の開裂は、Ｃ−末端にカルボキシル基を
有する最終ペプチドを生成する。ベンズヒドリルアミン
またはメチルベンズヒドリルアミン樹脂からのペプチド
類の開裂は、Ｃ−末端アミド基を有するペプチド類を生
成する。
いて良く知られている方法を用いて行なわれ得る。例え
ば、ｐ−クレゾールおよびジメチルスルフィドの存在下
における０℃、１時間のフッ化水素（HF）との反応は、
ｐ−クレゾールの存在下における０℃、２時間のフッ化
水素、またはトリフルオロ酢酸／塩化メチレン／アニソ
ールとの反応に引継がれてもよい。クロロメチル化また
はｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂支持体か
らのペプチド類の開裂は、Ｃ−末端にカルボキシル基を
有する最終ペプチドを生成する。ベンズヒドリルアミン
またはメチルベンズヒドリルアミン樹脂からのペプチド
類の開裂は、Ｃ−末端アミド基を有するペプチド類を生
成する。
別法として、普遍的に認識されるＴ−細胞エピトープ
または付加的にＢ−細胞エピトープを提示するペプチド
を含んだ結合ペプチドは、組換えDNA技術の方法を用い
て調製し得る。組換えDNA技術によってこのようなペプ
チドを調製する方法は、この分野においてはよく知られ
ている。前記ペプチドをコードするDNA断片は、この分
野でよく知られた方法、例えばホスホトリエステル法
（NarangらのMeth.Enzymol.68、90−108［1979］）また
はホスホジエステル法（BrownらのMeth.Enzymol.68、10
9−151［1979］）によって調製することができ、そして
Maniatisらの“Molecular Cloning−A Laboratory Manu
al"、Cold Spring Harbor Laboratory［1982］に記載さ
れたようにして発現ベクター中にクローン化することが
できる。
または付加的にＢ−細胞エピトープを提示するペプチド
を含んだ結合ペプチドは、組換えDNA技術の方法を用い
て調製し得る。組換えDNA技術によってこのようなペプ
チドを調製する方法は、この分野においてはよく知られ
ている。前記ペプチドをコードするDNA断片は、この分
野でよく知られた方法、例えばホスホトリエステル法
（NarangらのMeth.Enzymol.68、90−108［1979］）また
はホスホジエステル法（BrownらのMeth.Enzymol.68、10
9−151［1979］）によって調製することができ、そして
Maniatisらの“Molecular Cloning−A Laboratory Manu
al"、Cold Spring Harbor Laboratory［1982］に記載さ
れたようにして発現ベクター中にクローン化することが
できる。
本発明において使用されるペプチドは、公知の方法、
例えば分別遠心分離、硫酸アンモニウムを用いた沈澱、
脱塩のための透析（常圧または減圧下）、調製用等電的
フォーカシング、調製用ゲル電気泳動、または種々のク
ロマトグラフィー的方法、例えば、ゲルロ過、高速液体
クロマトブラフィー（HPLC）、イオン交換クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィーもしくはアフィニティ
クロマトグラフィー等により精製され得る。
例えば分別遠心分離、硫酸アンモニウムを用いた沈澱、
脱塩のための透析（常圧または減圧下）、調製用等電的
フォーカシング、調製用ゲル電気泳動、または種々のク
ロマトグラフィー的方法、例えば、ゲルロ過、高速液体
クロマトブラフィー（HPLC）、イオン交換クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィーもしくはアフィニティ
クロマトグラフィー等により精製され得る。
本発明による普遍的Ｔ−細胞エピトープを提示するペ
プチドおよびＢ−細胞エピトープを提示するペプチドを
含有する免疫性組成物は、製薬学的に許容されるアジュ
バントを付加的に含有してもよい。前記免疫原性組成物
は、上述したＢ−細胞エピトープを表現する病原性物質
に対して特異的な抗体の形成を誘導するためのワクチン
として使用することができる。“製薬学的に許容される
アジュバント”なる用語は、ヒトへの投与のために適し
た標準的な組成物または動物へのワクチン接種に使用さ
れる典型的なアジュバントおよび賦形剤（例えば血清ア
ルブミンまたは血漿調製物）のいずれかを意味してい
る。動物のワクチン接種のために好適なアジュバント
は、フロイントの完全または不完全アジュバント（ヒト
または家畜への使用には適さない）、アジュバント65
（ピーナッツ油、モノオレイン酸マンニドおよびモノス
テアリン酸アルミニウムを含む）、水酸化アルミニウ
ム、リン酸アルミニウムおよびみょうばん等の鉱物ゲ
ル、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレ
シチン、ジメチルジオクチルデシルアンモニウムブロマ
イド、N,N−ジオクタデシル−Ｎ′,N′−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）プロパンジアミン、メトキシヘキシデ
シルグリセロールおよびプロパン酸ポリオール類等の界
面活性剤、ピラン、硫酸化デキストラン、ポリIC、ポリ
アクリル酸およびカルボポール等のポリアニオン類、ミ
ュラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン等
のペプチド類およびアミノ酸類ならびに油のエマルジョ
ンを含むが、これらに限定されるものではない。本発明
のポリペプチドは、リポゾーム類もしくは他のマイクロ
キャリア類中への結合の後、あるいは多糖類、他の蛋白
質類もしくは他のポリマー類との結合の後、または、
“Iscoms"（免疫促進複合体類）を形成するQuil−Ａと
の組合せにおいても投与することが可能である。（Alli
sonらのJ.Immunol.Meth.95、157−168［1986］;Morein
らのNature 308、457−460［1984］）。更に、普遍的Ｔ
−細胞エピトープを提示するポリペプチドをコードして
いる遺伝子を発現し得るワクシニア（Vaccinia）または
サルモネラ（salmonella）等の遺伝子的に加工された微
生物は、ワクチン投与系として使用可能である（Macket
tのImmunol.Letters 16、243−248［1987］）。
プチドおよびＢ−細胞エピトープを提示するペプチドを
含有する免疫性組成物は、製薬学的に許容されるアジュ
バントを付加的に含有してもよい。前記免疫原性組成物
は、上述したＢ−細胞エピトープを表現する病原性物質
に対して特異的な抗体の形成を誘導するためのワクチン
として使用することができる。“製薬学的に許容される
アジュバント”なる用語は、ヒトへの投与のために適し
た標準的な組成物または動物へのワクチン接種に使用さ
れる典型的なアジュバントおよび賦形剤（例えば血清ア
ルブミンまたは血漿調製物）のいずれかを意味してい
る。動物のワクチン接種のために好適なアジュバント
は、フロイントの完全または不完全アジュバント（ヒト
または家畜への使用には適さない）、アジュバント65
（ピーナッツ油、モノオレイン酸マンニドおよびモノス
テアリン酸アルミニウムを含む）、水酸化アルミニウ
ム、リン酸アルミニウムおよびみょうばん等の鉱物ゲ
ル、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレ
シチン、ジメチルジオクチルデシルアンモニウムブロマ
イド、N,N−ジオクタデシル−Ｎ′,N′−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）プロパンジアミン、メトキシヘキシデ
シルグリセロールおよびプロパン酸ポリオール類等の界
面活性剤、ピラン、硫酸化デキストラン、ポリIC、ポリ
アクリル酸およびカルボポール等のポリアニオン類、ミ
ュラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン等
のペプチド類およびアミノ酸類ならびに油のエマルジョ
ンを含むが、これらに限定されるものではない。本発明
のポリペプチドは、リポゾーム類もしくは他のマイクロ
キャリア類中への結合の後、あるいは多糖類、他の蛋白
質類もしくは他のポリマー類との結合の後、または、
“Iscoms"（免疫促進複合体類）を形成するQuil−Ａと
の組合せにおいても投与することが可能である。（Alli
sonらのJ.Immunol.Meth.95、157−168［1986］;Morein
らのNature 308、457−460［1984］）。更に、普遍的Ｔ
−細胞エピトープを提示するポリペプチドをコードして
いる遺伝子を発現し得るワクシニア（Vaccinia）または
サルモネラ（salmonella）等の遺伝子的に加工された微
生物は、ワクチン投与系として使用可能である（Macket
tのImmunol.Letters 16、243−248［1987］）。
該免疫原性組成物は、本発明による普遍的Ｔ−細胞エ
ピトープ提示ペプチドを、Ｂ−細胞エピトープ提示ペプ
チドおよび必要に応じて製薬学的に許容されるアジュバ
ントと組合せることにより調製される。好ましくは、該
免疫原性組成物は、単位投与量の形態である。ワクチン
接種または医薬として一時または一期間を通じて投与さ
れる活性物質の量は、治療される対象、投与の方法およ
び形態、ならびに治療にあたる医師の判断に依存するで
あろう。しかしながら、効果的な投与量は、本発明の組
成物の約1ngから約1mgの範囲、好ましくは約100μｇか
ら約500μｇであり、また、これより低いおよび高い投
与量も有用でありうると認識される。該免疫原性組成物
は、種々の形態であってよい。これらは、例えば固体、
半固体および液体の投与形態を含む。単位投与量は、好
ましくは該免疫原性組成物を0.9％（w/v）のNaCl溶液中
のサスペンジョンの形態で収容した1mlのバイアル中に
封入してなる。最も好ましい免疫原性組成物は、850μ
ｇのAl（OH）3/mlに吸着された0.4mg/mlの蛋白質（Ｔ−
およびＢ−細胞エピトープペプチド）および100μg/ml
のMerthiolateTM（Eli Lilly）を含有している。該バイ
アルは、好ましくは該免疫原性組成物の正しい使用を知
らせる指示書と共に入れ物に包装される。本発明は、入
れ物に、最も好ましくは適切な指示書と共に包装された
免疫原性組成物のこのような単位投与量にも関連する。
更に本発明は、前記免疫原性組成物を用いたヒトまたは
動物の免疫化方法に加え、該免疫原性組成物またはその
単位投与量の製造方法に関する。
ピトープ提示ペプチドを、Ｂ−細胞エピトープ提示ペプ
チドおよび必要に応じて製薬学的に許容されるアジュバ
ントと組合せることにより調製される。好ましくは、該
免疫原性組成物は、単位投与量の形態である。ワクチン
接種または医薬として一時または一期間を通じて投与さ
れる活性物質の量は、治療される対象、投与の方法およ
び形態、ならびに治療にあたる医師の判断に依存するで
あろう。しかしながら、効果的な投与量は、本発明の組
成物の約1ngから約1mgの範囲、好ましくは約100μｇか
ら約500μｇであり、また、これより低いおよび高い投
与量も有用でありうると認識される。該免疫原性組成物
は、種々の形態であってよい。これらは、例えば固体、
半固体および液体の投与形態を含む。単位投与量は、好
ましくは該免疫原性組成物を0.9％（w/v）のNaCl溶液中
のサスペンジョンの形態で収容した1mlのバイアル中に
封入してなる。最も好ましい免疫原性組成物は、850μ
ｇのAl（OH）3/mlに吸着された0.4mg/mlの蛋白質（Ｔ−
およびＢ−細胞エピトープペプチド）および100μg/ml
のMerthiolateTM（Eli Lilly）を含有している。該バイ
アルは、好ましくは該免疫原性組成物の正しい使用を知
らせる指示書と共に入れ物に包装される。本発明は、入
れ物に、最も好ましくは適切な指示書と共に包装された
免疫原性組成物のこのような単位投与量にも関連する。
更に本発明は、前記免疫原性組成物を用いたヒトまたは
動物の免疫化方法に加え、該免疫原性組成物またはその
単位投与量の製造方法に関する。
該免疫原性組成物の投与形態および経路ならびに注射
の頻度は、すべて、この分野の通常の技術を用いて至適
化されるべき因子である。典型的には、免疫学的に有効
な量の該ワクチンによる最初のワクチン接種は、数週間
後に１回以上の“推進”ワクチン接種に引継がれ、その
真正の効果は特定の病原性物質に対する抗体の高い力価
の生成にある。
の頻度は、すべて、この分野の通常の技術を用いて至適
化されるべき因子である。典型的には、免疫学的に有効
な量の該ワクチンによる最初のワクチン接種は、数週間
後に１回以上の“推進”ワクチン接種に引継がれ、その
真正の効果は特定の病原性物質に対する抗体の高い力価
の生成にある。
この発明を一般的に記述したが、これは、添付の図面
１ないし６との関連において以下の実施例を参照するこ
とによってより容易に理解されるであろう。
１ないし６との関連において以下の実施例を参照するこ
とによってより容易に理解されるであろう。
第１図 MAPS B−細胞エピトープ［（NANP）３］８−Ly
s7−Aca−Cys−NH2およびＴ−細胞エピトープAc−Cys−
Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（380−396）−NH
2を含むペプチド／ペプチドワクチンの模式的表示。
Ｎ、Ａ、Ｐ、Ｋは、それぞれアスパラギン、アラニン、
プロリンおよびリジンを示す。
s7−Aca−Cys−NH2およびＴ−細胞エピトープAc−Cys−
Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（380−396）−NH
2を含むペプチド／ペプチドワクチンの模式的表示。
Ｎ、Ａ、Ｐ、Ｋは、それぞれアスパラギン、アラニン、
プロリンおよびリジンを示す。
第２図A,B MAPS B−細胞エピトープ［（NANP）３］８
−Lys7−Aca−Cys−NH2の固相ペプチド合成（SPPS）の
模式的表示。
−Lys7−Aca−Cys−NH2の固相ペプチド合成（SPPS）の
模式的表示。
第３図 MAPS B−細胞エピトープ［（NANP）３］８−Ly
s7−Aca−Cys−NH2と普遍的Ｔ−細胞エピトープAc−Cys
−Aca−［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）
−NH2との共有結合の模式的表示。
s7−Aca−Cys−NH2と普遍的Ｔ−細胞エピトープAc−Cys
−Aca−［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）
−NH2との共有結合の模式的表示。
第４図 MAPS B−細胞エピトープ［（NANP）３］８−Ly
s7−Aca−Cys−NH2と普遍的Ｔ−細胞エピトープAc−Cys
−Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（380−396）−
NH2との2,2′−ジピリジルジスルフィドを介しての共有
結合の模式的表示。
s7−Aca−Cys−NH2と普遍的Ｔ−細胞エピトープAc−Cys
−Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（380−396）−
NH2との2,2′−ジピリジルジスルフィドを介しての共有
結合の模式的表示。
第５図 （NANP）３−CS.T3 またはMAPS B−細胞エピトープ［（NANP）３］８−Lys7
−Aca−Cys−NH2に共有的に結合した普遍的Ｔ−細胞エ
ピトープAc−Cys−Aca［Ala384,389］−P.falciparum C
S（378−398）−NH2 により免疫化したBALB/cマウスのプラズマ中の抗−（NA
NP）50抗体の存在についての酵素−結合免疫吸着アッセ
イ。
−Aca−Cys−NH2に共有的に結合した普遍的Ｔ−細胞エ
ピトープAc−Cys−Aca［Ala384,389］−P.falciparum C
S（378−398）−NH2 により免疫化したBALB/cマウスのプラズマ中の抗−（NA
NP）50抗体の存在についての酵素−結合免疫吸着アッセ
イ。
第６図 （NANP）３−CS.T3 またはMAPS B−細胞エピトープ［（NANP）３］８−Lys7
−Aca−Cys−NH2と共有的に結合した普遍的Ｔ−細胞エ
ピトープAc−Cys−Aca−［Ala384,389］−P.falciparum
CS（378−398）−NH2 により免疫化したBALB/cマウスのプラズマ中の抗−（NA
NP）50抗体の存在についての免疫ケイ光アッセイ。
−Aca−Cys−NH2と共有的に結合した普遍的Ｔ−細胞エ
ピトープAc−Cys−Aca−［Ala384,389］−P.falciparum
CS（378−398）−NH2 により免疫化したBALB/cマウスのプラズマ中の抗−（NA
NP）50抗体の存在についての免疫ケイ光アッセイ。
以下の実施例は、単に例示を目的とするものであっ
て、本発明は、ここに示された特定の実施態様にいかな
る方法においても限定して解釈されるべきではないもの
と理解されるべきである。使用した略号は、ペプチド化
学において一般的に用いられるものに従っている（“Th
e Peptides"Vol.2,S.UdenfriendおよびJ.Meienhofer
編、Academic Press、ニューヨーク［1987］参照）。
て、本発明は、ここに示された特定の実施態様にいかな
る方法においても限定して解釈されるべきではないもの
と理解されるべきである。使用した略号は、ペプチド化
学において一般的に用いられるものに従っている（“Th
e Peptides"Vol.2,S.UdenfriendおよびJ.Meienhofer
編、Academic Press、ニューヨーク［1987］参照）。
実施例 CS.T3ペプチドの合成および精製 ペプチドCS.T3を、塩基反応性Ｎ−フルオルエニルメ
トキシカルボニル−アミノ酸、ｔ−ブチルに基づく側鎖
保護基およびｐ−ベンジルオキシベンジルアルコールポ
リスチレン樹脂を用い、Athertonらの“The Peptides:A
nalysis,Synthesis,Biology"9巻（S.Udenfriendおよび
J.Meienhofer編、Academic Press,ニューヨーク［198
7］）により記述されているように固相法により合成し
た。
トキシカルボニル−アミノ酸、ｔ−ブチルに基づく側鎖
保護基およびｐ−ベンジルオキシベンジルアルコールポ
リスチレン樹脂を用い、Athertonらの“The Peptides:A
nalysis,Synthesis,Biology"9巻（S.Udenfriendおよび
J.Meienhofer編、Academic Press,ニューヨーク［198
7］）により記述されているように固相法により合成し
た。
最初の合成は、Fmoc−Ser（But）−Ｏ−CH2C6H4O−CH
2C6H4−樹脂を用いて手動振とう器中で開始した。典型
的な合成サイクルについてのプロトコールは次のとおり
であった。
2C6H4−樹脂を用いて手動振とう器中で開始した。典型
的な合成サイクルについてのプロトコールは次のとおり
であった。
得られた保護されたペプチド樹脂Ｈ−Asp（OBut）−I
le−Glu（OBut）−Lys（Boc）−Lys（Boc）−Ile−Ala
−Lys（Boc）−Met−Glu（OBut）−Lys（Boc）−Ala−S
er（But）−Ser（But）−Val−Phe−Asn−Val−Val−As
n−Ser（But）−Ｏ−CH2C6H4OCH2C6H4−樹脂を、トリフ
ルオロ酢酸−塩化メチレン−アニソール（49:49:2）を
用いて処理し、遊離のペプチドを得た。該ペプチドを、
Lichrosorb RP18（10μ）カラム（Merck、Darmstadt、F
RG）を用いた0.1％トリフルオロ酢酸−エタノール勾配
系における高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により
精製した。
le−Glu（OBut）−Lys（Boc）−Lys（Boc）−Ile−Ala
−Lys（Boc）−Met−Glu（OBut）−Lys（Boc）−Ala−S
er（But）−Ser（But）−Val−Phe−Asn−Val−Val−As
n−Ser（But）−Ｏ−CH2C6H4OCH2C6H4−樹脂を、トリフ
ルオロ酢酸−塩化メチレン−アニソール（49:49:2）を
用いて処理し、遊離のペプチドを得た。該ペプチドを、
Lichrosorb RP18（10μ）カラム（Merck、Darmstadt、F
RG）を用いた0.1％トリフルオロ酢酸−エタノール勾配
系における高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により
精製した。
該トリアトリアコンタペプチド（NANP）３−SC.T3
を、古典的な溶液法と固相ペプチド合成との組合せによ
って合成した。該保護されたテトラペプチドFmoc−Asn
−Ala−Asn−Pro−OHを以下の模式図に従って合成し
た： Ｎα−非保護の上記ペプチド樹脂に対するHBTU方法に
よるＮα−保護テトラペプチドの３回反復しての結合に
より、保護されたトリアトリアコンタペプチド樹脂を得
た。トリフルオロ酢酸（TFA）／塩化メチレン／アニソ
ールを用いた処理によって該遊離のペプチドが遊離され
た。精製は、上述した勾配系におけるHPLCによって行な
った。
を、古典的な溶液法と固相ペプチド合成との組合せによ
って合成した。該保護されたテトラペプチドFmoc−Asn
−Ala−Asn−Pro−OHを以下の模式図に従って合成し
た： Ｎα−非保護の上記ペプチド樹脂に対するHBTU方法に
よるＮα−保護テトラペプチドの３回反復しての結合に
より、保護されたトリアトリアコンタペプチド樹脂を得
た。トリフルオロ酢酸（TFA）／塩化メチレン／アニソ
ールを用いた処理によって該遊離のペプチドが遊離され
た。精製は、上述した勾配系におけるHPLCによって行な
った。
該ペプチドは、分析用HPLCにより均質であり、酸加水
分解の後に予期されたアミノ酸組成を示した。
分解の後に予期されたアミノ酸組成を示した。
CS.T3−特異性Ｔ−細胞クローン類の制限特異性 ８人の志願者（マラリア感染の経歴のないヨーロッパ
人血液提供者MG、DP、JK、BR、BH、AH、SDおよびPE）か
らの末梢血単核細胞は、標準的なNattional Institutes
of Health（Bethesda、Maryland、U.S.A.）の補体−媒
体微少毒性アッセイ（Amos,D.B.の“Cytotoxicity test
ing"、NIHD Manual of Tissue Typing Techniques、NIH
Publication 80−545［1979］、U.S.Department of He
alth、Education and Welfare、Atlanta、Georgia、U.
S.A.）を使用してHLAに分類された。該細胞をペプチドC
S.T3（10mg/ml）により刺激し、IL−２含有培地に展開
し、そして既に記述されているようにしてクローン化し
た（Sinigagliaらの、Eur.J.Immunol.17、187−192［19
87］）。増殖性アッセイにおける該クローンの抗原反応
性および制限特異性を試験するために、クローン化され
たＴ−細胞（２×104）を104の照射された自系またはDR
同型接合のEBV形質転換Ｂ−細胞（SingagliaらのEMBO
J.４、3819−3822［1985］）と共に該抗原CS.T3（10mg/
ml）含有または非含有の0.2mlの完全培地中で３組によ
り共培養した。3H−チミジンの取込みを72時間後に測定
した。代表クローンの１分間あたりのカウント（cpm）
の平均値により示される結果を第１表に示した。
人血液提供者MG、DP、JK、BR、BH、AH、SDおよびPE）か
らの末梢血単核細胞は、標準的なNattional Institutes
of Health（Bethesda、Maryland、U.S.A.）の補体−媒
体微少毒性アッセイ（Amos,D.B.の“Cytotoxicity test
ing"、NIHD Manual of Tissue Typing Techniques、NIH
Publication 80−545［1979］、U.S.Department of He
alth、Education and Welfare、Atlanta、Georgia、U.
S.A.）を使用してHLAに分類された。該細胞をペプチドC
S.T3（10mg/ml）により刺激し、IL−２含有培地に展開
し、そして既に記述されているようにしてクローン化し
た（Sinigagliaらの、Eur.J.Immunol.17、187−192［19
87］）。増殖性アッセイにおける該クローンの抗原反応
性および制限特異性を試験するために、クローン化され
たＴ−細胞（２×104）を104の照射された自系またはDR
同型接合のEBV形質転換Ｂ−細胞（SingagliaらのEMBO
J.４、3819−3822［1985］）と共に該抗原CS.T3（10mg/
ml）含有または非含有の0.2mlの完全培地中で３組によ
り共培養した。3H−チミジンの取込みを72時間後に測定
した。代表クローンの１分間あたりのカウント（cpm）
の平均値により示される結果を第１表に示した。
第１表中に示されるように、Ｔ−細胞クローンは、自
系EBV−Ｂ細胞上または提供者のDR特異性の一つを有す
るDR−同型接合EBV−Ｂ系上に提示される場合には、CS.
T3抗原に同様によく反応する。従って、少くとも７種の
異なったDR分子は、提示のために該CS.T3ペプチドと会
合することができる。該抗−DRモノクローナル抗体E.31
（TruccoらのImmunol.Rev.47、219−242［1979］）は、
腹水の1/100希釈として培養物に添加した。
系EBV−Ｂ細胞上または提供者のDR特異性の一つを有す
るDR−同型接合EBV−Ｂ系上に提示される場合には、CS.
T3抗原に同様によく反応する。従って、少くとも７種の
異なったDR分子は、提示のために該CS.T3ペプチドと会
合することができる。該抗−DRモノクローナル抗体E.31
（TruccoらのImmunol.Rev.47、219−242［1979］）は、
腹水の1/100希釈として培養物に添加した。
提供者MC（HLA型DR2,9）からは、12種のCS.T3−特異
性クローンが得られ、８種がDR2および４種がDR9に制限
され;DP（DR1,4）からは、11種のCS.T3−特異性クロー
ンが分析され、３種がDR−１制限および８種がDR4−制
限であり;JK（DRw11（５）,7）からは、９種のCS.T3−
特異性クローンが分析され、それらのすべてがDR5に制
限され;BR（DR4,w6）からは、10種のCS.T3−特異性クロ
ーンが試験され、それらの半数がDR4、および半数がDRw
6−制限であり;BH（DR1,3）からは、16種の抗原−特異
性クローンが得られ、それらのすべてがDR1に制限され;
SD（DR5,7）からは、17種のクローンが試験され、それ
らの４種がDR5および13種がDR7に制限され；そして最終
的に13種のCS.T3−特異性クローンがPE（DR5,w6）から
得られ、13種がDR5−制限であり、DRw6に制限されるも
のは無かった。得られたすべてのCS.T3−特異性クロー
ンは、それらがＴ−ヘルパー細胞（TH）であることを示
すCD4+、CD8-であった（EnglemanらのJ.Exp.Med.153、1
93−198［1981］）。
性クローンが得られ、８種がDR2および４種がDR9に制限
され;DP（DR1,4）からは、11種のCS.T3−特異性クロー
ンが分析され、３種がDR−１制限および８種がDR4−制
限であり;JK（DRw11（５）,7）からは、９種のCS.T3−
特異性クローンが分析され、それらのすべてがDR5に制
限され;BR（DR4,w6）からは、10種のCS.T3−特異性クロ
ーンが試験され、それらの半数がDR4、および半数がDRw
6−制限であり;BH（DR1,3）からは、16種の抗原−特異
性クローンが得られ、それらのすべてがDR1に制限され;
SD（DR5,7）からは、17種のクローンが試験され、それ
らの４種がDR5および13種がDR7に制限され；そして最終
的に13種のCS.T3−特異性クローンがPE（DR5,w6）から
得られ、13種がDR5−制限であり、DRw6に制限されるも
のは無かった。得られたすべてのCS.T3−特異性クロー
ンは、それらがＴ−ヘルパー細胞（TH）であることを示
すCD4+、CD8-であった（EnglemanらのJ.Exp.Med.153、1
93−198［1981］）。
総じて298種の抗−CS.T3クローンが制限希釈により刺
激されたPBMCから誘導された。298種のすべてのＴ−細
胞クローンは、CS.T3に対して特異的であり、P.falcipa
rumのCS蛋白質から誘導された対照ペプチド（CS蛋白質
のアミノ酸残基325−342）の存在下では増殖しなかっ
た。各CS.T3−特異性Ｔ−細胞クローンのMHC制限パター
ンを、Ｔ−細胞増殖応答に対する抗−MHCクラスIIモノ
クローナル抗体（mAbs）の効果を試験することにより評
価した。試験した187のクローン増殖は、単一型DR決定
因子を認識するモノクローナル抗体E.31により阻害され
た（第１表）。抗−DP（WatsonらのNature 304、358−3
61［1983］および抗−DQ（ZieglerらのNature 279、243
−244［1979］）抗体のいずれもが有効ではなかった。
これらの結果は、該DR分子がCS.T3−特異性Ｔ−細胞ク
ローンに対する制限要素であることを示している。各C
S.T3−特異性Ｔ−クローンのDR制限パターンを、HLA−D
R同型接合提示細胞のパネルの存在下において創生され
るCS.T3ペプチドに対する応答を比較することによって
評価した（BellらのProc.Natl.Acad.Sci.USA 84、6234
−6238［1987）。HLA−DR同型接合提示細胞類は、Europ
ean Collection for Biomedical Research（E.C.B.
R.）、European Cellection of Human Lymphoblastoid
Cell Lines、Instituto Nazionale per la Ricerca sul
Cancro、Immunogenetics Lab、Viale Benedetto XV、1
0、16132、Genova、Italyから入手することができる。
第１表のデータ作成に用いたHLA−DR同型接合提示細胞
類、すなわち、DR1同型接合提示細胞EDR、DR2同型接合
提示細胞NOL、DR4同型接合提示細胞BSM、DR5同型接合提
示細胞ATH、DRw6同型接合提示細胞APD、DR7同型接合提
示細胞EKRおよびDR9同型接合提示細胞DKBは、オラン
ダ、ライデンのUniversity HospitalのDepartment of I
mmunohaematology（E.GoulmyおよびJ.van Rood両博士）
から入手した。該細胞類は、2mMのＬ−グルタミン、1mM
のピルビン酸ナトリウム、５×10-5Mのβ−メルカプト
エタノール、１％の非必須アミノ酸（100％保存溶液:Gi
bco）、50U/mlのストレプトマイシンおよび10％の牛胎
児血清が補充されたRPMI 1640培地（Gibco、Paisley、S
cotland）中にて維持した。該細胞系は、Epstein−Barr
ウイルス−形質転換Ｂ（EBV−Ｂ）細胞系であり、抗原
−提示細胞として用いる前に照射（5000Rad）を行なっ
た。
激されたPBMCから誘導された。298種のすべてのＴ−細
胞クローンは、CS.T3に対して特異的であり、P.falcipa
rumのCS蛋白質から誘導された対照ペプチド（CS蛋白質
のアミノ酸残基325−342）の存在下では増殖しなかっ
た。各CS.T3−特異性Ｔ−細胞クローンのMHC制限パター
ンを、Ｔ−細胞増殖応答に対する抗−MHCクラスIIモノ
クローナル抗体（mAbs）の効果を試験することにより評
価した。試験した187のクローン増殖は、単一型DR決定
因子を認識するモノクローナル抗体E.31により阻害され
た（第１表）。抗−DP（WatsonらのNature 304、358−3
61［1983］および抗−DQ（ZieglerらのNature 279、243
−244［1979］）抗体のいずれもが有効ではなかった。
これらの結果は、該DR分子がCS.T3−特異性Ｔ−細胞ク
ローンに対する制限要素であることを示している。各C
S.T3−特異性Ｔ−クローンのDR制限パターンを、HLA−D
R同型接合提示細胞のパネルの存在下において創生され
るCS.T3ペプチドに対する応答を比較することによって
評価した（BellらのProc.Natl.Acad.Sci.USA 84、6234
−6238［1987）。HLA−DR同型接合提示細胞類は、Europ
ean Collection for Biomedical Research（E.C.B.
R.）、European Cellection of Human Lymphoblastoid
Cell Lines、Instituto Nazionale per la Ricerca sul
Cancro、Immunogenetics Lab、Viale Benedetto XV、1
0、16132、Genova、Italyから入手することができる。
第１表のデータ作成に用いたHLA−DR同型接合提示細胞
類、すなわち、DR1同型接合提示細胞EDR、DR2同型接合
提示細胞NOL、DR4同型接合提示細胞BSM、DR5同型接合提
示細胞ATH、DRw6同型接合提示細胞APD、DR7同型接合提
示細胞EKRおよびDR9同型接合提示細胞DKBは、オラン
ダ、ライデンのUniversity HospitalのDepartment of I
mmunohaematology（E.GoulmyおよびJ.van Rood両博士）
から入手した。該細胞類は、2mMのＬ−グルタミン、1mM
のピルビン酸ナトリウム、５×10-5Mのβ−メルカプト
エタノール、１％の非必須アミノ酸（100％保存溶液:Gi
bco）、50U/mlのストレプトマイシンおよび10％の牛胎
児血清が補充されたRPMI 1640培地（Gibco、Paisley、S
cotland）中にて維持した。該細胞系は、Epstein−Barr
ウイルス−形質転換Ｂ（EBV−Ｂ）細胞系であり、抗原
−提示細胞として用いる前に照射（5000Rad）を行なっ
た。
該DR同型接合提示細胞は、本発明を実施するために必
須ではないことが強調される。これらは、本実施例にお
いて、該CS.T3ポリペプチドが実際に普遍的に認識され
るＴ−細胞エプトープであることを示すためにのみ使用
された。
須ではないことが強調される。これらは、本実施例にお
いて、該CS.T3ポリペプチドが実際に普遍的に認識され
るＴ−細胞エプトープであることを示すためにのみ使用
された。
異なったDR対立遺伝子類により制限されるＴ−細胞クロ
ーン類に認識されるCS.T3決定因子の定義 単一のCS.T3ペプチドを提示し得るDRタイプの広い範
囲の故に、該ペプチドは、１種以上のＴ−細胞エピトー
プを含むことが推定された。異なったDR分子により制限
されるＴ−細胞クローンが、該CS.T3配列上の異なった
決定因子を認識するのであるかを測定するために、Ｎ−
またはＣ−末端のいずれかから１度に１残基が短縮され
た一連のペプチド類の存在下において該Ｔ−細胞クロー
ンの増殖応答を試験した。
ーン類に認識されるCS.T3決定因子の定義 単一のCS.T3ペプチドを提示し得るDRタイプの広い範
囲の故に、該ペプチドは、１種以上のＴ−細胞エピトー
プを含むことが推定された。異なったDR分子により制限
されるＴ−細胞クローンが、該CS.T3配列上の異なった
決定因子を認識するのであるかを測定するために、Ｎ−
またはＣ−末端のいずれかから１度に１残基が短縮され
た一連のペプチド類の存在下において該Ｔ−細胞クロー
ンの増殖応答を試験した。
第２表に示したアミノ酸配列を有するペプチド類を合
成し、切断し、そして前述のようにしてHPLCにより精製
した。これらのペプチド類は、該CS.T3ペプチドのＮ−
末端またはＣ−末端のいずれかにおいて１、２またはそ
れ以上のアミノ酸が除去されている誘導体である。第１
表に示したクローンのＴ−細胞類（２×104）を、0.1か
ら100μg/mlまでの範囲の種々の濃度の抗原の存在下
で、照射された自系EBV−Ｂ細胞類（104）と共に培養し
た。100μg/mlにおいて増殖を刺激しなかったいずれの
ペプチドも非−抗原性（−）とみなした。全体長のペプ
チド（378−398）の存在下において得られる最大値の50
％までを与えるペプチドを（＋）として示し、一方、全
体長のペプチドCS.T3（378−398）に匹敵する値を与え
るペプチドを（＋＋）により示してある。各クローン
は、同じDR制限を有するCS.T3−特異性クローンの群
（少なくとも４）の代表である。
成し、切断し、そして前述のようにしてHPLCにより精製
した。これらのペプチド類は、該CS.T3ペプチドのＮ−
末端またはＣ−末端のいずれかにおいて１、２またはそ
れ以上のアミノ酸が除去されている誘導体である。第１
表に示したクローンのＴ−細胞類（２×104）を、0.1か
ら100μg/mlまでの範囲の種々の濃度の抗原の存在下
で、照射された自系EBV−Ｂ細胞類（104）と共に培養し
た。100μg/mlにおいて増殖を刺激しなかったいずれの
ペプチドも非−抗原性（−）とみなした。全体長のペプ
チド（378−398）の存在下において得られる最大値の50
％までを与えるペプチドを（＋）として示し、一方、全
体長のペプチドCS.T3（378−398）に匹敵する値を与え
るペプチドを（＋＋）により示してある。各クローン
は、同じDR制限を有するCS.T3−特異性クローンの群
（少なくとも４）の代表である。
アミノ酸配列XIIを有するペプチド380−398、アミノ
酸配列IIを有するペプチド378−395およびアミノ酸配列
XIII、VIII、VIおよびIIIを有する長いペプチド類は試
験した全ての場合に刺激性であった。しかしながら、短
かいペプチド類は、異なるDR分子類に対して制限される
CS.T3−特異性クローン類に対する異なる認識パターン
を区別し得た。両極端にあるのは、DR2−およびDR5−制
限されたクローン類である。Ｃ−末端の端から395位のV
al迄の削除およびＮ−末端からAla384迄の削除は、DR2
−制限されたクローン類に対して感知できない効果であ
った。Ala384の削除は、いずれの投与試験に於ても認識
が＜50％に減少した。更に、Ｎ−末端からのLys385の除
去またはＣ−末端からのVal395の除去は、認識の完全な
喪失をもたらした。逆に、DR5−制限クローン類は、Ｎ
−末端の端からLys381の削除までおよびＣ−末端の端か
らSer390の削除までに応答することができた。従って、
DR2およびDR5に関して刺激する別個のＮ−およびＣ−末
端の截断によって定義される極少の領域は、Lys385−Va
l395残基およびLys381−Ser390残基にそれぞれ対応す
る。第２表は、またDR4に対する最少刺激領域が、383−
394残基の間を含み、両方のDRw6およびDR7の両者に対す
る領域が381−393/394残基に対応すると同時にDR1−制
限クローン類が、382−395（図示されていない）または
381−392のいずれかを認識することを示す。截断された
ペプチド類に対するDR9−制限Ｔ−細胞クローン類の応
答は、更に記述するのに値する。これらのクローン類
（４試験のうちの４つ）に対して、Lys381の削除が、認
識の喪失をもたらし、381−398ペプチドは、広範囲の濃
度に対して同様に認識されなかった。しかし、Lys382お
よびIle383のなお一層の除去は、免疫原性の再出現をも
たらす。最終的に、ペプチド385−398は、すべて非−刺
激であった。第２表に示されたデータひとまとめにする
と、異なって重複している決定因子類が、異なったDR分
子類と関連することが分かる。
酸配列IIを有するペプチド378−395およびアミノ酸配列
XIII、VIII、VIおよびIIIを有する長いペプチド類は試
験した全ての場合に刺激性であった。しかしながら、短
かいペプチド類は、異なるDR分子類に対して制限される
CS.T3−特異性クローン類に対する異なる認識パターン
を区別し得た。両極端にあるのは、DR2−およびDR5−制
限されたクローン類である。Ｃ−末端の端から395位のV
al迄の削除およびＮ−末端からAla384迄の削除は、DR2
−制限されたクローン類に対して感知できない効果であ
った。Ala384の削除は、いずれの投与試験に於ても認識
が＜50％に減少した。更に、Ｎ−末端からのLys385の除
去またはＣ−末端からのVal395の除去は、認識の完全な
喪失をもたらした。逆に、DR5−制限クローン類は、Ｎ
−末端の端からLys381の削除までおよびＣ−末端の端か
らSer390の削除までに応答することができた。従って、
DR2およびDR5に関して刺激する別個のＮ−およびＣ−末
端の截断によって定義される極少の領域は、Lys385−Va
l395残基およびLys381−Ser390残基にそれぞれ対応す
る。第２表は、またDR4に対する最少刺激領域が、383−
394残基の間を含み、両方のDRw6およびDR7の両者に対す
る領域が381−393/394残基に対応すると同時にDR1−制
限クローン類が、382−395（図示されていない）または
381−392のいずれかを認識することを示す。截断された
ペプチド類に対するDR9−制限Ｔ−細胞クローン類の応
答は、更に記述するのに値する。これらのクローン類
（４試験のうちの４つ）に対して、Lys381の削除が、認
識の喪失をもたらし、381−398ペプチドは、広範囲の濃
度に対して同様に認識されなかった。しかし、Lys382お
よびIle383のなお一層の除去は、免疫原性の再出現をも
たらす。最終的に、ペプチド385−398は、すべて非−刺
激であった。第２表に示されたデータひとまとめにする
と、異なって重複している決定因子類が、異なったDR分
子類と関連することが分かる。
（NANP）３−CS.T3ペプチドによって免疫化されたマウ
スにおける抗体応答 以下の結果は、上記したヒトＴ−細胞の優性部位が異
なるマウス系において抗−（NANP）３応答のためのヘル
パー決定因子として作用しうることを示す。CS.T3ペプ
チドに結合された反復（NANP）３−配列を、７つの異な
る同系交配系に投与し、そして抗−NANPnおよび抗−ス
ポロゾイト抗体応答を測定した。
スにおける抗体応答 以下の結果は、上記したヒトＴ−細胞の優性部位が異
なるマウス系において抗−（NANP）３応答のためのヘル
パー決定因子として作用しうることを示す。CS.T3ペプ
チドに結合された反復（NANP）３−配列を、７つの異な
る同系交配系に投与し、そして抗−NANPnおよび抗−ス
ポロゾイト抗体応答を測定した。
マウス（１群当り２ひき）を、尾の付け根に於て、不
完全フロインドのアジュバント（IFA）中の50μｇの（N
ANP）３−CS.T3で免疫化させた。８週間後、マウスに、
完全フロインドのアジュバント（CFA）中の25μｇの免
疫原で補助注射を行なった。２および６週間の間に血漿
を取り、抗−（NANP）50抗体の存在に関してELISA（Rit
e TognaらのJ.Immunol.137、2956−2960［1986］）によ
ってそれぞれ試験を行った。ELISA−力価は、0D455＞0.
1および＞２を有する血漿の最終希釈度と生理食塩水が
注射されたマウスからの血漿の0D455との積の幾何平均
である。ELISAプレートを被覆するのに使用した抗原
は、（NANP）50であった。
完全フロインドのアジュバント（IFA）中の50μｇの（N
ANP）３−CS.T3で免疫化させた。８週間後、マウスに、
完全フロインドのアジュバント（CFA）中の25μｇの免
疫原で補助注射を行なった。２および６週間の間に血漿
を取り、抗−（NANP）50抗体の存在に関してELISA（Rit
e TognaらのJ.Immunol.137、2956−2960［1986］）によ
ってそれぞれ試験を行った。ELISA−力価は、0D455＞0.
1および＞２を有する血漿の最終希釈度と生理食塩水が
注射されたマウスからの血漿の0D455との積の幾何平均
である。ELISAプレートを被覆するのに使用した抗原
は、（NANP）50であった。
第３表は、試験された全ての異なる種が、（NANP）50
およびスポロゾイトの両方に対して抗体応答を備えたこ
とを示す。C57BL/6マウスが、反復領域を包含するＴ−
細胞部位を認識することはすでに知られていた（Good
ら、［1986］、前出文献;del Guidiceら、［1986］、前
出文献）。反復領域を認識しない全ての他の系は、CS.T
3の決定因子を認識していたに違いない。試験された全
ての系が応答するという事実は、試験された多数のヒト
MHC遺伝子産物に加えて多数の異なるマウスI a分子に関
してCS.T3 T−細胞部位が認識されることを示し、従っ
て、更に普遍的に認識されたＴ−細胞エピトープを提示
する。
およびスポロゾイトの両方に対して抗体応答を備えたこ
とを示す。C57BL/6マウスが、反復領域を包含するＴ−
細胞部位を認識することはすでに知られていた（Good
ら、［1986］、前出文献;del Guidiceら、［1986］、前
出文献）。反復領域を認識しない全ての他の系は、CS.T
3の決定因子を認識していたに違いない。試験された全
ての系が応答するという事実は、試験された多数のヒト
MHC遺伝子産物に加えて多数の異なるマウスI a分子に関
してCS.T3 T−細胞部位が認識されることを示し、従っ
て、更に普遍的に認識されたＴ−細胞エピトープを提示
する。
CS.T3ペプチドを含む多重抗原ペプチド系Ｂ細胞エピト
ープの調製 全ての光学活性なアミノ酸類は、Ｌ−立体配置であ
り、薄層クロマトグラフィー、融点測定、核時期共鳴分
析および旋光性を測定することによって純度が検査され
た。Ｎα−Bocアミノ酸を合成に使用し、更に三官能ア
ミノ酸類を、Ｎα−Boc−Lys−（２−ClZ）、Ｎα−Boc
−Asp（OcHex）、Ｎα−Boc−Ser（Bzl）およびＮα−B
oc−Glu（OBzl）として保護した。Boc−Asn−Ala−Asn
−Pro−OBzlを、接触的に水素添加させ、更に得られたB
oc−Asn−Ala−Asn−Pro−OHが、高性能液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）によって均質になることが示された。
使用された溶媒類および試薬類は、最高純度であった。
カップリング反応は、ヒドロキシベンゾトリアゾールエ
ステルと結合されたアスパラギンを除き、その場に於け
るDCCまたは対称的無水物法により行った。ペプチド
を、Applied Biosystemsペプチド合成機・モデル430A
（Applied Biosystems、Foster City、California、U.
S.A.）を使用するアミノ酸類の継続的なカップリングを
用い、メリフィールド固相法によりまたは手作業により
調製した。
ープの調製 全ての光学活性なアミノ酸類は、Ｌ−立体配置であ
り、薄層クロマトグラフィー、融点測定、核時期共鳴分
析および旋光性を測定することによって純度が検査され
た。Ｎα−Bocアミノ酸を合成に使用し、更に三官能ア
ミノ酸類を、Ｎα−Boc−Lys−（２−ClZ）、Ｎα−Boc
−Asp（OcHex）、Ｎα−Boc−Ser（Bzl）およびＮα−B
oc−Glu（OBzl）として保護した。Boc−Asn−Ala−Asn
−Pro−OBzlを、接触的に水素添加させ、更に得られたB
oc−Asn−Ala−Asn−Pro−OHが、高性能液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）によって均質になることが示された。
使用された溶媒類および試薬類は、最高純度であった。
カップリング反応は、ヒドロキシベンゾトリアゾールエ
ステルと結合されたアスパラギンを除き、その場に於け
るDCCまたは対称的無水物法により行った。ペプチド
を、Applied Biosystemsペプチド合成機・モデル430A
（Applied Biosystems、Foster City、California、U.
S.A.）を使用するアミノ酸類の継続的なカップリングを
用い、メリフィールド固相法によりまたは手作業により
調製した。
Boc−Cys（Dmb）−ベンズヒドリルアミン−樹脂の調
製、1. ベンズヒドリルアミン樹脂の懸濁液（24g、0.54m当量
/g、12.96mモル）を、手動振とう機に留められた反応容
器に入れ、順次塩化メチレン（CH2Cl2;4×250ml）、10
％のジイソプロピルエチルアミン（DIEA;1×250ml、10
分）およびジエチルホルムアミド（DMF;4×250ml）で洗
浄した。この方法を繰り返し、次いで樹脂を、メタノー
ル（MeOH;2×250ml）、CH2Cl2（２×250ml）およびジメ
チルホルムアミド（DMF;4×250ml）で洗浄した。DMF（2
00ml）中のBoc−Cys（Dmb）−OH（13.27g、38.9mモル）
の溶液を、添加し、更に５分間振とうさせた。DIEA（2
0.32ml、116.6mモル）の添加にひき続いて直ちにDME（5
0ml）中のベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ
ス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート（BOP;17.20g、38.9mモル）の溶液をスラリー
に添加し、更に振とうを150分間継続した。樹脂の分別
量を移し（100mg）、Gisin試験（Anal.Chim.Acta 58、2
48−249［1972］）によってアッセーした。置換は0.23m
当量/g−樹脂であることが検出された。全ての樹脂をろ
過し、DMF（２×250ml）、CH2Cl2（２×250ml）で洗浄
し、更にCH2Cl2（250ml）中で24時間、Boc−Cys（Dmb）
（13.27g、38.9mモル）および1,3−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（DCC;8.02g、38.2mモル）と再結合させ
た。Gisin試験を、100mgの樹脂の分別量に対して繰り返
し行ない、更に負荷が、0.36mモル/g−樹脂であること
が測定された。樹脂を、150mlのピリジンおよび150mlの
無水酢酸中に懸濁させ、１時間振とうさせ、CH2Cl2（２
×250ml）、MeOH（２×250ml）、CH2Cl2（２×250ml）
で洗浄し、更に真空乾燥させた。
製、1. ベンズヒドリルアミン樹脂の懸濁液（24g、0.54m当量
/g、12.96mモル）を、手動振とう機に留められた反応容
器に入れ、順次塩化メチレン（CH2Cl2;4×250ml）、10
％のジイソプロピルエチルアミン（DIEA;1×250ml、10
分）およびジエチルホルムアミド（DMF;4×250ml）で洗
浄した。この方法を繰り返し、次いで樹脂を、メタノー
ル（MeOH;2×250ml）、CH2Cl2（２×250ml）およびジメ
チルホルムアミド（DMF;4×250ml）で洗浄した。DMF（2
00ml）中のBoc−Cys（Dmb）−OH（13.27g、38.9mモル）
の溶液を、添加し、更に５分間振とうさせた。DIEA（2
0.32ml、116.6mモル）の添加にひき続いて直ちにDME（5
0ml）中のベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ
ス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート（BOP;17.20g、38.9mモル）の溶液をスラリー
に添加し、更に振とうを150分間継続した。樹脂の分別
量を移し（100mg）、Gisin試験（Anal.Chim.Acta 58、2
48−249［1972］）によってアッセーした。置換は0.23m
当量/g−樹脂であることが検出された。全ての樹脂をろ
過し、DMF（２×250ml）、CH2Cl2（２×250ml）で洗浄
し、更にCH2Cl2（250ml）中で24時間、Boc−Cys（Dmb）
（13.27g、38.9mモル）および1,3−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（DCC;8.02g、38.2mモル）と再結合させ
た。Gisin試験を、100mgの樹脂の分別量に対して繰り返
し行ない、更に負荷が、0.36mモル/g−樹脂であること
が測定された。樹脂を、150mlのピリジンおよび150mlの
無水酢酸中に懸濁させ、１時間振とうさせ、CH2Cl2（２
×250ml）、MeOH（２×250ml）、CH2Cl2（２×250ml）
で洗浄し、更に真空乾燥させた。
Boc−Aca−Cys（Dmb）−ベンズヒドリルアミン−樹脂の
調製、2. Boc−Cys（Dmb）−ベンズヒドリルアミン−樹脂、１
（20g、7.2mモル）を、CH2Cl2（250ml）で洗浄し、250m
lの50％TFA−CH2Cl2で１分間脱保護させ、CH2Cl2（250m
l）で洗浄し、更に250mlの50％TFA−CH2Cl2で20分間再
び脱保護させた。次いで樹脂を、CH2Cl2（３×250m
l）、MeOH（２×250ml）およびCH2Cl2（２×250ml）で
洗浄した。中和反応を、10％DIEA−CH2Cl2（２×250m
l）で各５分間、CH2Cl2（２×250ml）、MeOH（２×250m
l）およびCH2Cl2（４×250ml）で洗浄することによって
行なわせた。次いで、CH2Cl2（250ml）中のBoc−アミノ
カプロン酸（Boc−Aca−OH）（0.66g、2.88mモル、0.40
当量）の溶液を添加し、更に反応溶液を５分間撹拌させ
た。ジシクロヘキシルカルボジイミド（0.59g、2.88mモ
ル、0.40当量）を添加し、更に混合物を２時間撹拌し
た。混合物をろ過し、CH2Cl2（２×100ml）、MeOH（２
×100ml）およびCH2Cl2（２×100ml）で洗浄した。樹脂
の分別量（50.3mg）を、加水分解させ（6M HCl/プロピ
オン酸、110℃、24時間）、更にアミノ酸分析は、ｇ樹
脂当り0.08mモルのAcaの置換を示した。化合物１と同様
にして、その樹脂をAc2O−ピリジンで“キャップ（capp
ed）”させた。
調製、2. Boc−Cys（Dmb）−ベンズヒドリルアミン−樹脂、１
（20g、7.2mモル）を、CH2Cl2（250ml）で洗浄し、250m
lの50％TFA−CH2Cl2で１分間脱保護させ、CH2Cl2（250m
l）で洗浄し、更に250mlの50％TFA−CH2Cl2で20分間再
び脱保護させた。次いで樹脂を、CH2Cl2（３×250m
l）、MeOH（２×250ml）およびCH2Cl2（２×250ml）で
洗浄した。中和反応を、10％DIEA−CH2Cl2（２×250m
l）で各５分間、CH2Cl2（２×250ml）、MeOH（２×250m
l）およびCH2Cl2（４×250ml）で洗浄することによって
行なわせた。次いで、CH2Cl2（250ml）中のBoc−アミノ
カプロン酸（Boc−Aca−OH）（0.66g、2.88mモル、0.40
当量）の溶液を添加し、更に反応溶液を５分間撹拌させ
た。ジシクロヘキシルカルボジイミド（0.59g、2.88mモ
ル、0.40当量）を添加し、更に混合物を２時間撹拌し
た。混合物をろ過し、CH2Cl2（２×100ml）、MeOH（２
×100ml）およびCH2Cl2（２×100ml）で洗浄した。樹脂
の分別量（50.3mg）を、加水分解させ（6M HCl/プロピ
オン酸、110℃、24時間）、更にアミノ酸分析は、ｇ樹
脂当り0.08mモルのAcaの置換を示した。化合物１と同様
にして、その樹脂をAc2O−ピリジンで“キャップ（capp
ed）”させた。
（Lys）７−Aca−Cys（Dmb）−ベンズヒドリルアミン−
樹脂の調製、3. Boc−Aca−Cys（Dmb）−ベンズヒドリルアミン−樹
脂、２（20g、0.08m当量/g、1.6mモル）を、化合物１に
対して記した洗浄、脱保護および中和反応に付した。Bo
c−Lys（Boc）−OH（1.99g、5.76mモル、3.6当量）を、
CH2Cl2（250ml）中に溶解させ、Ｈ−Aca−Cys（Dmb）−
BHA−樹脂、２に添加し、更に縮合剤としてDCC（1.18
g、5.76mモル、3.6当量）を使用し、固相合成のサイク
ルに付した（２時間）。分別量（100mg）のBoc−Lys（B
oc）−Aca−Cys（Dmb）−BHA−樹脂、3aを、加水分解さ
せ、0.056m当量Lys/g樹脂の置換を示した。固相ペプチ
ド合成を、Boc−Lys（Boc）−OH（3.98g、11.52mモル、
3.6当量）およびDCC（2.36g、11.52mモル、3.6当量）を
用い、前記の方法に従って継続させた。ペプチド樹脂の
アミノ酸分析は、0.15m当量Lys/gの（Lys）３−Aca−Cy
s（Dmb）−BHA−樹脂、3bの負荷を示した。合成を、Boc
−Lys（Boc）−OH（7.96g、23.04mモル、3.6当量）およ
びDCC（4.75g、23.04mモル、3.6当量）を用い、前記方
法に従って継続させた。分別量の樹脂を、加水分解さ
せ、更にアミノ酸組成は、0.20m当量Lys/g置換の（Ly
s）７−Aca−Cys（Dmb）−BHA−樹脂、3cを示した。そ
のペプチド樹脂を、真空乾燥させた。最終重量＝20.1
g。
樹脂の調製、3. Boc−Aca−Cys（Dmb）−ベンズヒドリルアミン−樹
脂、２（20g、0.08m当量/g、1.6mモル）を、化合物１に
対して記した洗浄、脱保護および中和反応に付した。Bo
c−Lys（Boc）−OH（1.99g、5.76mモル、3.6当量）を、
CH2Cl2（250ml）中に溶解させ、Ｈ−Aca−Cys（Dmb）−
BHA−樹脂、２に添加し、更に縮合剤としてDCC（1.18
g、5.76mモル、3.6当量）を使用し、固相合成のサイク
ルに付した（２時間）。分別量（100mg）のBoc−Lys（B
oc）−Aca−Cys（Dmb）−BHA−樹脂、3aを、加水分解さ
せ、0.056m当量Lys/g樹脂の置換を示した。固相ペプチ
ド合成を、Boc−Lys（Boc）−OH（3.98g、11.52mモル、
3.6当量）およびDCC（2.36g、11.52mモル、3.6当量）を
用い、前記の方法に従って継続させた。ペプチド樹脂の
アミノ酸分析は、0.15m当量Lys/gの（Lys）３−Aca−Cy
s（Dmb）−BHA−樹脂、3bの負荷を示した。合成を、Boc
−Lys（Boc）−OH（7.96g、23.04mモル、3.6当量）およ
びDCC（4.75g、23.04mモル、3.6当量）を用い、前記方
法に従って継続させた。分別量の樹脂を、加水分解さ
せ、更にアミノ酸組成は、0.20m当量Lys/g置換の（Ly
s）７−Aca−Cys（Dmb）−BHA−樹脂、3cを示した。そ
のペプチド樹脂を、真空乾燥させた。最終重量＝20.1
g。
［（Asn−Ala−Asn−Pro）３］８−Lys7−Aca−Cys−
（NH2）の調製、4. Lys7−Aca−Cys−（Dmb）−BAH樹脂3cの一部（5.0g、
0.20m当量のLys/g、1.0当量のLys、0.143mモルのペプチ
ド）を、DMF（0.5％のDIEAを含有する250ml）中、保護
されたテトラペプチド、Boc−Asn−Ala−Asn−Pro−O
H、（1.28g、2.5mモル、2.5当量）、およびBOP試薬（1.
1g、2.5mモル、2.5当量）を用いて固相ペプチド合成の
サイクルに付した。18時間後、ニンヒドリン試験は、反
応が完結したことを示した。分別量のペプチド−樹脂
を、加水分解させ（6N HCl、150℃、２時間）、予期さ
れたアミノ酸組成:Asp,15.90（16）;Pro,6.99（８）;Al
a,8.50（８）;Lys,7.00（７）が得られた。樹脂を、TFA
で脱保護させ、更に上記方法を、Boc−Asn−Ala−Asn−
Pro−OHを用いて第２サイクルによって繰り返し（単一
カップリング）、樹脂を加水分解させ、更にアミノ酸組
成は、予期された取り込み;Asp,32.42（32）;Pro,15.07
（16）;Ala,16.92（16）;Lys,7.26（７）を示した。TFA
を用いて脱保護させた後、上記と同様にBoc−Asn−Ala
−Asn−Pro−OHによる最終カップリングは、6.3gの
［（Boc−Asn−Ala−Asn−Pro）３］８−Lys7−Aca−Cy
s−BHA−樹脂を与えた。分別量の加水分解（上記のよう
に）は:Asp,48.00（48）;Pro,20.32（24）;Ala;24.96
（24）;Lys,7.26（７）を与えた。この材料の一部（6
g）を、０℃で２時間、無水フッ化水素酸（HF;10％の１
−プロパンチオールを含有する60ml）で開裂させた。こ
のHFを、０℃で蒸発させ（高真空、CaOトラップ）、更
に粗ペプチドおよび樹脂混合物を、EtOAcと共に摩砕
し、TFA（３×50ml）で抽出し、蒸発させ、無水エーテ
ルと共に摩砕し、更に乾燥させることにより1.3gの粗ペ
プチドを得た。
（NH2）の調製、4. Lys7−Aca−Cys−（Dmb）−BAH樹脂3cの一部（5.0g、
0.20m当量のLys/g、1.0当量のLys、0.143mモルのペプチ
ド）を、DMF（0.5％のDIEAを含有する250ml）中、保護
されたテトラペプチド、Boc−Asn−Ala−Asn−Pro−O
H、（1.28g、2.5mモル、2.5当量）、およびBOP試薬（1.
1g、2.5mモル、2.5当量）を用いて固相ペプチド合成の
サイクルに付した。18時間後、ニンヒドリン試験は、反
応が完結したことを示した。分別量のペプチド−樹脂
を、加水分解させ（6N HCl、150℃、２時間）、予期さ
れたアミノ酸組成:Asp,15.90（16）;Pro,6.99（８）;Al
a,8.50（８）;Lys,7.00（７）が得られた。樹脂を、TFA
で脱保護させ、更に上記方法を、Boc−Asn−Ala−Asn−
Pro−OHを用いて第２サイクルによって繰り返し（単一
カップリング）、樹脂を加水分解させ、更にアミノ酸組
成は、予期された取り込み;Asp,32.42（32）;Pro,15.07
（16）;Ala,16.92（16）;Lys,7.26（７）を示した。TFA
を用いて脱保護させた後、上記と同様にBoc−Asn−Ala
−Asn−Pro−OHによる最終カップリングは、6.3gの
［（Boc−Asn−Ala−Asn−Pro）３］８−Lys7−Aca−Cy
s−BHA−樹脂を与えた。分別量の加水分解（上記のよう
に）は:Asp,48.00（48）;Pro,20.32（24）;Ala;24.96
（24）;Lys,7.26（７）を与えた。この材料の一部（6
g）を、０℃で２時間、無水フッ化水素酸（HF;10％の１
−プロパンチオールを含有する60ml）で開裂させた。こ
のHFを、０℃で蒸発させ（高真空、CaOトラップ）、更
に粗ペプチドおよび樹脂混合物を、EtOAcと共に摩砕
し、TFA（３×50ml）で抽出し、蒸発させ、無水エーテ
ルと共に摩砕し、更に乾燥させることにより1.3gの粗ペ
プチドを得た。
この粗ペプチド（1.3g）を、溶解させ（40mlの0.025
％のTFA/H2O）、ろ過し（0.45μのMillex−HVフィルタ
ー）、更にNucleosil C−18カラム（１×50cm）上に負
荷させた。このカラムを、A:H2O（0.025％のTFAを含
有）およびB:CH2CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶
媒系を用い、２時間に於て10％の（Ｂ）から25％の
（Ｂ）の直線勾配のモードで溶離（7ml/分）させた。分
画を集め（7ml）、更に分別量を分析HPLC（カラム:Lich
rosorb RP−８（５μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO
4（pH2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:20分間で、15％のＢから5
5％のB;流速:1ml/分；保持時間:9.1分）によって分析し
た。合された分画（10−18）中に現われた生成物を蒸発
させ、更に凍結乾燥させることによって純粋な［（NAN
P）３］８−K7−Aca−Cys−NH2、４を得た。収量:1.06g
（67.3％）その化合物は、分析HPLCによって均質である
ことを示し、酸加水分解（6N HCl;150℃;1時間）の後、
予期されたアミノ酸組成が得られた:Asp,45.5（48）;Pr
o,23.8（24）;Ala,23.6（24）;Lys,7.0（７）;Cys,1.12
（Ellman試験;Ellman、Arch、Biochem.Biophys.82 70−
77［1959］参照）。更に、構造の確認が、マイクロシー
ケンス分析およびFABマス分光法によって行われた：計
算価（Ｍ＋2H）2;10,644.5;実験値:10,642。
％のTFA/H2O）、ろ過し（0.45μのMillex−HVフィルタ
ー）、更にNucleosil C−18カラム（１×50cm）上に負
荷させた。このカラムを、A:H2O（0.025％のTFAを含
有）およびB:CH2CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶
媒系を用い、２時間に於て10％の（Ｂ）から25％の
（Ｂ）の直線勾配のモードで溶離（7ml/分）させた。分
画を集め（7ml）、更に分別量を分析HPLC（カラム:Lich
rosorb RP−８（５μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO
4（pH2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:20分間で、15％のＢから5
5％のB;流速:1ml/分；保持時間:9.1分）によって分析し
た。合された分画（10−18）中に現われた生成物を蒸発
させ、更に凍結乾燥させることによって純粋な［（NAN
P）３］８−K7−Aca−Cys−NH2、４を得た。収量:1.06g
（67.3％）その化合物は、分析HPLCによって均質である
ことを示し、酸加水分解（6N HCl;150℃;1時間）の後、
予期されたアミノ酸組成が得られた:Asp,45.5（48）;Pr
o,23.8（24）;Ala,23.6（24）;Lys,7.0（７）;Cys,1.12
（Ellman試験;Ellman、Arch、Biochem.Biophys.82 70−
77［1959］参照）。更に、構造の確認が、マイクロシー
ケンス分析およびFABマス分光法によって行われた：計
算価（Ｍ＋2H）2;10,644.5;実験値:10,642。
［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）−NH2の
調製5a. Boc−Ser（Dmb）−BHA−樹脂（3.4g、0.35m当量/g−
樹脂、1.19mモル）を、手動振とう機に留められた100ml
の反応容器に充填し、ペプチド合成を、全部で４サイク
ル行ない、P.falciparum CS（394−398）−BHA−樹脂
（3.5g）を得た。1.5g（0.5mモル）ずつを除去し、更に
Applied Biosystems 430A合成器を用い、固相合成の追
加のサイクルに付すことによって2.2gの保護された［Al
a384,389］−P.falciparum CS（378−398）−BHA−樹脂
を得た。0.4gずつの保護されたペプチドを、無水HF（化
合物４に対するのと同様）を用いて開裂させ、更に0.22
6gの粗［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）
−NH2を得た。この粗材料を10mlのH2Oに溶解させ、ろ過
し、（0.45μ型HA Milliporeフィルター）、更にWates
Associates、Milford、Massachusetts、U.S.A.から入手
可能なWaters C−18カラム（1.9×30cm）に負荷させ
た。そのカラムを、（Ａ）水（0.025％のTFAを含有）お
よび（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶媒
系を用い、120分間で、10％の（Ｂ）−35％の（Ｂ）の
直線勾配モードで溶離させた。分画を集め（１分ご
と）、更に分別量を分析HPLC（カラム:Lichrosorb RP−
８（10μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH2.5）
（Ｂ）CH3CN;勾配:20分間で、20％のＢから40％のB;流
速:1.5ml/分；保持時間:16分）によって分析した。合さ
れた分画68と69中に現われた生成物を、蒸発させ、更に
凍結乾燥させることによってCS.T3ペプチドのアミノ化
された形態の10mg（3.7％の収率）の純粋な［Ala
384,389］−P.falciparum CS（378−398）−NH2を得
た。その生成物は、分析HPLCによって均質であることを
示し、酸加水分解（6NのHCL;150℃;24時間）の後、正確
なアミノ酸組成Asp,2.83（３）;Ser,2.79（３）;Met,0.
90（１）;Glu,1.89（２）;Ala,2.00（２）；（6N HCL;1
10℃;72時間）:Val,2.89（３）;Ile,1.87（２）;Phe,0.
97（１）;Lys,4.14（４）が得られた。更に、構造の確
認が、FABマス分光法によって行なわれた。計算値（Ｍ
＋Ｈ）+:2337.7、実験値:2338.0。
調製5a. Boc−Ser（Dmb）−BHA−樹脂（3.4g、0.35m当量/g−
樹脂、1.19mモル）を、手動振とう機に留められた100ml
の反応容器に充填し、ペプチド合成を、全部で４サイク
ル行ない、P.falciparum CS（394−398）−BHA−樹脂
（3.5g）を得た。1.5g（0.5mモル）ずつを除去し、更に
Applied Biosystems 430A合成器を用い、固相合成の追
加のサイクルに付すことによって2.2gの保護された［Al
a384,389］−P.falciparum CS（378−398）−BHA−樹脂
を得た。0.4gずつの保護されたペプチドを、無水HF（化
合物４に対するのと同様）を用いて開裂させ、更に0.22
6gの粗［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）
−NH2を得た。この粗材料を10mlのH2Oに溶解させ、ろ過
し、（0.45μ型HA Milliporeフィルター）、更にWates
Associates、Milford、Massachusetts、U.S.A.から入手
可能なWaters C−18カラム（1.9×30cm）に負荷させ
た。そのカラムを、（Ａ）水（0.025％のTFAを含有）お
よび（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶媒
系を用い、120分間で、10％の（Ｂ）−35％の（Ｂ）の
直線勾配モードで溶離させた。分画を集め（１分ご
と）、更に分別量を分析HPLC（カラム:Lichrosorb RP−
８（10μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH2.5）
（Ｂ）CH3CN;勾配:20分間で、20％のＢから40％のB;流
速:1.5ml/分；保持時間:16分）によって分析した。合さ
れた分画68と69中に現われた生成物を、蒸発させ、更に
凍結乾燥させることによってCS.T3ペプチドのアミノ化
された形態の10mg（3.7％の収率）の純粋な［Ala
384,389］−P.falciparum CS（378−398）−NH2を得
た。その生成物は、分析HPLCによって均質であることを
示し、酸加水分解（6NのHCL;150℃;24時間）の後、正確
なアミノ酸組成Asp,2.83（３）;Ser,2.79（３）;Met,0.
90（１）;Glu,1.89（２）;Ala,2.00（２）；（6N HCL;1
10℃;72時間）:Val,2.89（３）;Ile,1.87（２）;Phe,0.
97（１）;Lys,4.14（４）が得られた。更に、構造の確
認が、FABマス分光法によって行なわれた。計算値（Ｍ
＋Ｈ）+:2337.7、実験値:2338.0。
Ac−Cys−Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−
398）−NH2、5bの調製 0.8g（0.182mモル）ずつの保護された［Ala384,389］
−P.falciparum CS（378−398）−BHA−樹脂（上記参
照）を２サイクルの固相合成に付し、更にアセチル化
（50％のAc2O/ピリジン;30ml;1時間）させることにより
保護されたAc−Cys−Aca［Ala384,389］−P.falciparum
CS（378−398）−BHA−樹脂（600mg）を得た。無水HF
を用いた処理は、水に溶解された360mgの粗生成物をも
たらし、ろ過（実施例5aに於けるの同様）し、更にμ−
Bondapak C−18カラム（1.9×30cm）にかけた。そのカ
ラムを、（Ａ）H2O（0.025％のTFAを含有）および
（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶媒系を
用い、90分間で、20％の（Ｂ）−40％の（Ｂ）の直線勾
配のモードで溶離させた。分画を集め（１分ごと）、更
に分別量を分析HPLC（カラム:Lichrosorb RP−８（５
μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH2.5）（Ｂ）CH3C
N;勾配:20分間で、30％のＢから55％のB;流速:1ml/分；
保持時間:10分）によって分析した。合された分画33−3
5中に現われた生成物を、蒸発させ、更に凍結乾燥させ
た。収量:19mg（3.4％の収率）。精製したAc−Cys−Aca
［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）−NH2,5
bは、分析HPLCによって本質的に均質であることを示
し、更に予期されたアミノ酸組成：（6N HCl;110℃;24
時間）:Asp,2.87（３）;Ser,2.77（３）;Glu,1.98
（２）;Ala,2.00（２）;Val,2.05（２）;Ile,1.69
（２）;Met,0.99（１）;Phe,1.00（１）;Lys,4.07
（４）;Cys,0.86（Ellmam試験）が得られた。更に、構
造の確認が、FABマス分光法によって行なわれた。計算
値（Ｍ＋Ｈ）+:2596.2;実験値:2595.8。
398）−NH2、5bの調製 0.8g（0.182mモル）ずつの保護された［Ala384,389］
−P.falciparum CS（378−398）−BHA−樹脂（上記参
照）を２サイクルの固相合成に付し、更にアセチル化
（50％のAc2O/ピリジン;30ml;1時間）させることにより
保護されたAc−Cys−Aca［Ala384,389］−P.falciparum
CS（378−398）−BHA−樹脂（600mg）を得た。無水HF
を用いた処理は、水に溶解された360mgの粗生成物をも
たらし、ろ過（実施例5aに於けるの同様）し、更にμ−
Bondapak C−18カラム（1.9×30cm）にかけた。そのカ
ラムを、（Ａ）H2O（0.025％のTFAを含有）および
（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶媒系を
用い、90分間で、20％の（Ｂ）−40％の（Ｂ）の直線勾
配のモードで溶離させた。分画を集め（１分ごと）、更
に分別量を分析HPLC（カラム:Lichrosorb RP−８（５
μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH2.5）（Ｂ）CH3C
N;勾配:20分間で、30％のＢから55％のB;流速:1ml/分；
保持時間:10分）によって分析した。合された分画33−3
5中に現われた生成物を、蒸発させ、更に凍結乾燥させ
た。収量:19mg（3.4％の収率）。精製したAc−Cys−Aca
［Ala384,389］−P.falciparum CS（378−398）−NH2,5
bは、分析HPLCによって本質的に均質であることを示
し、更に予期されたアミノ酸組成：（6N HCl;110℃;24
時間）:Asp,2.87（３）;Ser,2.77（３）;Glu,1.98
（２）;Ala,2.00（２）;Val,2.05（２）;Ile,1.69
（２）;Met,0.99（１）;Phe,1.00（１）;Lys,4.07
（４）;Cys,0.86（Ellmam試験）が得られた。更に、構
造の確認が、FABマス分光法によって行なわれた。計算
値（Ｍ＋Ｈ）+:2596.2;実験値:2595.8。
Ac−Cys−Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（378
−398）−NH2、5b（2.5mg;0.82μモル、２当量）および
［（Asn−Ala−Asn−Pro）３］8Lys7−Aca−Cys−NH2,
4、（4.74mg;0.41μモル;1当量）を、1.8mlの蒸留水に
溶解させ、次いで7.6mlの0.2MのNH4HCO3（pH7.8）を添
加した。反応混合物を、室温で24時間放置し、更に凍結
乾燥させた。残渣を、2mlの0.025％のTFA/H2O中に溶解
させ、ろ過し更にNucleosil C−18カラム（0.4×25cm）
にかけた。そのカラムを、（Ａ）水（0.025％のTFAを含
有）および（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成
る溶媒系を用い、120分間で、10％の（Ｂ）−40％の
（Ｂ）の直線勾配のモードで溶離させた。分画を集め
（１分ごと）、更に分別量を分析HPLC（カラム:Lichros
orb RP−８（５μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH
2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:30分間で、10％のＢから55％の
B;流速:1ml/分；保持時間:21分）によって分析した。合
された分画42−45中に現われた生成物を、蒸発させ、更
に凍結乾燥させることによって1.5mg（25％の収率）の
生成物６を得た。その生成物は、分析HPLCによって均質
であることを示し、更に酸化水分解（6N HCl;110℃;24
時間）の後、予期されたアミノ酸組成:Asp,52.0（51）;
Ser,3.4（３）;Glu,2.5（２）;Ala,24.7（26）;Val,2.5
（３）;Met,1.0（１）;Ile,2.2（２）;Phe,1.1（１）;L
ys,11.5（11）が得られた。
−398）−NH2、5b（2.5mg;0.82μモル、２当量）および
［（Asn−Ala−Asn−Pro）３］8Lys7−Aca−Cys−NH2,
4、（4.74mg;0.41μモル;1当量）を、1.8mlの蒸留水に
溶解させ、次いで7.6mlの0.2MのNH4HCO3（pH7.8）を添
加した。反応混合物を、室温で24時間放置し、更に凍結
乾燥させた。残渣を、2mlの0.025％のTFA/H2O中に溶解
させ、ろ過し更にNucleosil C−18カラム（0.4×25cm）
にかけた。そのカラムを、（Ａ）水（0.025％のTFAを含
有）および（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成
る溶媒系を用い、120分間で、10％の（Ｂ）−40％の
（Ｂ）の直線勾配のモードで溶離させた。分画を集め
（１分ごと）、更に分別量を分析HPLC（カラム:Lichros
orb RP−８（５μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH
2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:30分間で、10％のＢから55％の
B;流速:1ml/分；保持時間:21分）によって分析した。合
された分画42−45中に現われた生成物を、蒸発させ、更
に凍結乾燥させることによって1.5mg（25％の収率）の
生成物６を得た。その生成物は、分析HPLCによって均質
であることを示し、更に酸化水分解（6N HCl;110℃;24
時間）の後、予期されたアミノ酸組成:Asp,52.0（51）;
Ser,3.4（３）;Glu,2.5（２）;Ala,24.7（26）;Val,2.5
（３）;Met,1.0（１）;Ile,2.2（２）;Phe,1.1（１）;L
ys,11.5（11）が得られた。
［Ala384,389］−P.falciparum CS（380−396）−NH2、
7aの調製 Boc−Val−ベンズヒドリルアミン−樹脂（1.5g、0.2m
当量/g;0.3mモル）を、Applied Biosystems 430A合成器
を用いる16サイクルの固相ペプチド合成に付することに
よって2.1gの保護された［Ala384,389］−P.falciparum
CS（380−396）−BHA−樹脂を得た。0.4gずつの保護さ
れたペプチド樹脂を、無水HF（化合物４に対するのと同
様）を用いて開裂させ、更に121mgの粗［Ala384,389］
−P.falciparum CS（380−396）−NH2を得た。粗生成物
（60mg）の一部を、0.025％のTFA/H2O中に溶解させ、ろ
過し、更にNucleosil C−18カラム（1.0×50cm）にかけ
た。そのカラムを、（Ａ）水（0.025％のTFAを含有）お
よび（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶媒
系を用い、180分間で、15％の（Ｂ）−35％の（Ｂ）の
直線勾配のモードで溶離させた。分画を集め（１分ご
と）、分別量を分析HPLC（カラム:Lichrosorb RP−８
（５μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH2.5）（Ｂ）
CH3CN;勾配:20分間で、30％のＢから55％のB;流速:1.0m
l/分；保持時間:8.0分）によって分析した。合された分
画34−46中に現われた生成物を、蒸発させ、更に凍結乾
燥させることによって14mg（20％の収率）の純粋な［Al
a384,396］−P.falciparum CS（378−398）−NH2、7aを
得た。その生成物は、分析HPLCによって均質であること
を示し、更に酸加水分解（6NHCl;110℃;72時間）の後、
正確なアミノ酸組成:Asp,0.95（１）;Ser,1.88（２）;G
lu,2.00（２）;Ala,2.00（２）;Met,0.93（１）；（6N
HCl;110℃;72時間）:Val,2.91（３）;Ile,0.97（１）;P
he,1.17（１）;Lys,4.10（４）が得られた。更に、構造
の確認が、マイクロシーケンス分析およびFABマス分光
法によって行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｈ）+:1908.3;実
験値:1908.0。
7aの調製 Boc−Val−ベンズヒドリルアミン−樹脂（1.5g、0.2m
当量/g;0.3mモル）を、Applied Biosystems 430A合成器
を用いる16サイクルの固相ペプチド合成に付することに
よって2.1gの保護された［Ala384,389］−P.falciparum
CS（380−396）−BHA−樹脂を得た。0.4gずつの保護さ
れたペプチド樹脂を、無水HF（化合物４に対するのと同
様）を用いて開裂させ、更に121mgの粗［Ala384,389］
−P.falciparum CS（380−396）−NH2を得た。粗生成物
（60mg）の一部を、0.025％のTFA/H2O中に溶解させ、ろ
過し、更にNucleosil C−18カラム（1.0×50cm）にかけ
た。そのカラムを、（Ａ）水（0.025％のTFAを含有）お
よび（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）から成る溶媒
系を用い、180分間で、15％の（Ｂ）−35％の（Ｂ）の
直線勾配のモードで溶離させた。分画を集め（１分ご
と）、分別量を分析HPLC（カラム:Lichrosorb RP−８
（５μ）；溶出液：（Ａ）0.1MのHClO4（pH2.5）（Ｂ）
CH3CN;勾配:20分間で、30％のＢから55％のB;流速:1.0m
l/分；保持時間:8.0分）によって分析した。合された分
画34−46中に現われた生成物を、蒸発させ、更に凍結乾
燥させることによって14mg（20％の収率）の純粋な［Al
a384,396］−P.falciparum CS（378−398）−NH2、7aを
得た。その生成物は、分析HPLCによって均質であること
を示し、更に酸加水分解（6NHCl;110℃;72時間）の後、
正確なアミノ酸組成:Asp,0.95（１）;Ser,1.88（２）;G
lu,2.00（２）;Ala,2.00（２）;Met,0.93（１）；（6N
HCl;110℃;72時間）:Val,2.91（３）;Ile,0.97（１）;P
he,1.17（１）;Lys,4.10（４）が得られた。更に、構造
の確認が、マイクロシーケンス分析およびFABマス分光
法によって行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｈ）+:1908.3;実
験値:1908.0。
Ac−Cys−Aca−［Ala384,389］−P.falciparum CS（380
−396）−NH2、7bの調製 化合物１に於けるのと同様にして調製したBoc−Val−
benzhydrylamine−樹脂（20g;0.5mモル/g;10mモル）
を、Kraft Shakerに留めた１の反応容器に充填し、更
に固相ペプチド合成を全部で19サイクル行なうことによ
ってAc−Cys−Aca−［Ala384,389］−P.falciparum CS
（380−396）−BHA−樹脂（44.9g）を得た。一部の保護
されたペプチド樹脂（5g;1.11mモル）を、無水HF（化合
物４に対するのと同様）で処理し、更に2.21gの粗生成
物を得た。粗生成物の一部（1.1g）を、40mlの0.025％
のTFA/H2Oに溶解させ、ろ過し、更にNucleosil C−18カ
ラム（2.2×25cm）にかけた。そのカラムを、（Ａ）H2O
（0.025％のTFAを含有）および（Ｂ）CH3N（0.025％のT
FAを含有）から成る溶媒系を用い、120分間で、10％の
（Ｂ）−35％の（Ｂ）の直線勾配のモードで溶離させ
た。分画を集め（１分ごと）、更に、分別量を分析HPLC
（カラム:Lichrosorb RP−８（５μ）；溶出液：（Ａ）
0.1MのHClO4（pH2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:20分間で、30
％のＢから55％のB;流速:1.0ml/分；保持時間:10分）に
よって分析した。合された分画65−72中に現われた生成
物を、蒸発させ、更に凍結乾燥させることによって144m
g（9.9％の収率）の生成物を得た。精製されたAc−Cys
−Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（380−396）−
NH2、7bは、分析HPLCによって均質であることを示し、
更に酸加水分解（6N HCl;150℃;1時間）の後、予期され
たアミノ酸組成:Asp,1.09（１）;Ser,1.90（２）;Glu,
1.98（２）;Ala,2.00（２）;Met,0.93（１）;Phe.0.95
（１）。（6N HCl;110℃;72時間）;Val,2.76（３）;Il
e,1.04（１）;Lys,4.35（４）;Cys,1.10（Ellman試験）
が得られた。更に、構造の確認が、FABマス分光法によ
って行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｈ）+:2166.6;実験値:21
67.0。
−396）−NH2、7bの調製 化合物１に於けるのと同様にして調製したBoc−Val−
benzhydrylamine−樹脂（20g;0.5mモル/g;10mモル）
を、Kraft Shakerに留めた１の反応容器に充填し、更
に固相ペプチド合成を全部で19サイクル行なうことによ
ってAc−Cys−Aca−［Ala384,389］−P.falciparum CS
（380−396）−BHA−樹脂（44.9g）を得た。一部の保護
されたペプチド樹脂（5g;1.11mモル）を、無水HF（化合
物４に対するのと同様）で処理し、更に2.21gの粗生成
物を得た。粗生成物の一部（1.1g）を、40mlの0.025％
のTFA/H2Oに溶解させ、ろ過し、更にNucleosil C−18カ
ラム（2.2×25cm）にかけた。そのカラムを、（Ａ）H2O
（0.025％のTFAを含有）および（Ｂ）CH3N（0.025％のT
FAを含有）から成る溶媒系を用い、120分間で、10％の
（Ｂ）−35％の（Ｂ）の直線勾配のモードで溶離させ
た。分画を集め（１分ごと）、更に、分別量を分析HPLC
（カラム:Lichrosorb RP−８（５μ）；溶出液：（Ａ）
0.1MのHClO4（pH2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:20分間で、30
％のＢから55％のB;流速:1.0ml/分；保持時間:10分）に
よって分析した。合された分画65−72中に現われた生成
物を、蒸発させ、更に凍結乾燥させることによって144m
g（9.9％の収率）の生成物を得た。精製されたAc−Cys
−Aca［Ala384,389］−P.falciparum CS（380−396）−
NH2、7bは、分析HPLCによって均質であることを示し、
更に酸加水分解（6N HCl;150℃;1時間）の後、予期され
たアミノ酸組成:Asp,1.09（１）;Ser,1.90（２）;Glu,
1.98（２）;Ala,2.00（２）;Met,0.93（１）;Phe.0.95
（１）。（6N HCl;110℃;72時間）;Val,2.76（３）;Il
e,1.04（１）;Lys,4.35（４）;Cys,1.10（Ellman試験）
が得られた。更に、構造の確認が、FABマス分光法によ
って行なわれた。計算値（Ｍ＋Ｈ）+:2166.6;実験値:21
67.0。
Ac−Cys（Ｓ−pyridyl）−Aca［Ala384,389］−P.falci
parum CS（380−396）−NH2、８の調製 2.2′−ジピリジルジスルフィド（10.8mg、49μモ
ル、1.64当量）をトリフルオロエタノール（14ml、４％
のAcOHを含有）に溶解させ、トリフルオロエタノール
（14ml、４％のAcOHを含有）中のAc−Cys−Aca−［Ala
384,289］−P.falciparum CS（380−396）−NH2,7b（78
mg、29.8μモル、１当量）の混合溶液に添加した。その
混合物を、１時間撹拌し、蒸発させ、更に残渣を無水エ
ーテルで磨砕し、更に乾燥させた。収量:73.3mg（99.9
％の収率）。生成物は、分析HPLC（カラム:Nucleosil C
−18（５μ）；溶出液：（Ａ）H2O（0.025％のTFAを含
有）、（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）：勾配:20分
間に於て15％Ｂないし40％Ｂおよび40％Ｂに於て15分間
保持した；流速:1.4ml/分；保持時間:23分）によって本
質的に均質であることを示した。酸加水分解（6NのHCl;
72時間）の後、アミノ酸分析は、予期した組成:Asp,1.0
7;Ser,2.05;Glu,2.13;Ala,2.03;Val,1.87;Met,0.94;
（0.025％のTFAを含有）および（Ｂ）CH2CN（0.025％の
TFAを含有）する溶媒系を用いて、100分間で、10％の
（Ｂ）−40％の（Ｂ）の直線勾配のモードて溶離（9ml/
分）させた。分画を集め（１分ごと）、分別量をHPLCに
よって分析した（カラム:Lichrosorb RP−８（５μ）；
溶出液:0.1M HClO4（pH2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:30分間
で、10％のＢから55％のB;流速:1ml/分；保持時間:19.7
分）。ためられた分割36−34中に現われた生成物を蒸発
させ、更に凍結乾燥させることによって92mg（74.5の収
率）の生成物が得られた。その生成物は、分析HPLCによ
って均質であることを示し、更に酸加水分解（6N HCl;1
10℃;72時間）の後、予期されたアミノ酸組成:Asp,51.3
0（49）;Ser,1.99（２）;Glu,2.07（２）;Pro,25.13（2
4）;Ala,26.00（26）;Val,2.40（３）;Met,0.96（１）;
Ile,1.04（１）;Phe,1.03（１）;Lys,11.35（11）が得
られた。Ellman試験は、システインSH基の存在を確認し
た。加えて、ジチオスレイトールによる減圧条件下の処
理は、出発材料の［（Asn−Ala−Asn−Pro）３］８−Ly
s7−Aca−Ile,0.92;Phe,0.92;Lys,3.94;Aca,0.98を与え
た。Ellman試験はシステイニル・フルフィジル基の不存
在を示した。1H−NMR（DMSO−d6は、構造と一致し、更
にピリジル部分：δ7.22（1H,d），δ7.32（2H,m）およ
びδ7.83（1H,m）。U.V.λmax（50％ TFE/H2O）280nm
（ε3780）の存在を示した。
parum CS（380−396）−NH2、８の調製 2.2′−ジピリジルジスルフィド（10.8mg、49μモ
ル、1.64当量）をトリフルオロエタノール（14ml、４％
のAcOHを含有）に溶解させ、トリフルオロエタノール
（14ml、４％のAcOHを含有）中のAc−Cys−Aca−［Ala
384,289］−P.falciparum CS（380−396）−NH2,7b（78
mg、29.8μモル、１当量）の混合溶液に添加した。その
混合物を、１時間撹拌し、蒸発させ、更に残渣を無水エ
ーテルで磨砕し、更に乾燥させた。収量:73.3mg（99.9
％の収率）。生成物は、分析HPLC（カラム:Nucleosil C
−18（５μ）；溶出液：（Ａ）H2O（0.025％のTFAを含
有）、（Ｂ）CH3CN（0.025％のTFAを含有）：勾配:20分
間に於て15％Ｂないし40％Ｂおよび40％Ｂに於て15分間
保持した；流速:1.4ml/分；保持時間:23分）によって本
質的に均質であることを示した。酸加水分解（6NのHCl;
72時間）の後、アミノ酸分析は、予期した組成:Asp,1.0
7;Ser,2.05;Glu,2.13;Ala,2.03;Val,1.87;Met,0.94;
（0.025％のTFAを含有）および（Ｂ）CH2CN（0.025％の
TFAを含有）する溶媒系を用いて、100分間で、10％の
（Ｂ）−40％の（Ｂ）の直線勾配のモードて溶離（9ml/
分）させた。分画を集め（１分ごと）、分別量をHPLCに
よって分析した（カラム:Lichrosorb RP−８（５μ）；
溶出液:0.1M HClO4（pH2.5）（Ｂ）CH3CN;勾配:30分間
で、10％のＢから55％のB;流速:1ml/分；保持時間:19.7
分）。ためられた分割36−34中に現われた生成物を蒸発
させ、更に凍結乾燥させることによって92mg（74.5の収
率）の生成物が得られた。その生成物は、分析HPLCによ
って均質であることを示し、更に酸加水分解（6N HCl;1
10℃;72時間）の後、予期されたアミノ酸組成:Asp,51.3
0（49）;Ser,1.99（２）;Glu,2.07（２）;Pro,25.13（2
4）;Ala,26.00（26）;Val,2.40（３）;Met,0.96（１）;
Ile,1.04（１）;Phe,1.03（１）;Lys,11.35（11）が得
られた。Ellman試験は、システインSH基の存在を確認し
た。加えて、ジチオスレイトールによる減圧条件下の処
理は、出発材料の［（Asn−Ala−Asn−Pro）３］８−Ly
s7−Aca−Ile,0.92;Phe,0.92;Lys,3.94;Aca,0.98を与え
た。Ellman試験はシステイニル・フルフィジル基の不存
在を示した。1H−NMR（DMSO−d6は、構造と一致し、更
にピリジル部分：δ7.22（1H,d），δ7.32（2H,m）およ
びδ7.83（1H,m）。U.V.λmax（50％ TFE/H2O）280nm
（ε3780）の存在を示した。
Ac−Cys（Ｓ−ピリジル）−Aca［Ala384,389］−P.fa
lciparum CS（380−396）−NH2,8（53.4mg、20.4μモ
ル、2.35当量）をトリフルオロエタノール（4.8ml）中
に溶解させ、更に0.2MのNH4HCO（12ml、pH8.7）を添加
した。蒸留H2O（7.2ml）中の［（Asn−Ala−Asn−Pro）
３］８−Lsy7−Aca−Cys−NH2,4（100.4mg、8.69μモ
ル、１当量）を、該混合溶液に添加し、反応混合物を、
25℃で２時間撹拌し、更に凍結乾燥させた。残渣を、10
mlの0.02％のTFA/H2Oに溶解させ、ろ過し、更にNucleos
il C−18カラム（2.2×25cm）にかけた。カラムを、
（Ａ）H2OCys−NH2,4,およびAc−Cys−Aca−［Ala
384,389］−P.falciparum CS（380−396）−NH2,7bを与
えた。
lciparum CS（380−396）−NH2,8（53.4mg、20.4μモ
ル、2.35当量）をトリフルオロエタノール（4.8ml）中
に溶解させ、更に0.2MのNH4HCO（12ml、pH8.7）を添加
した。蒸留H2O（7.2ml）中の［（Asn−Ala−Asn−Pro）
３］８−Lsy7−Aca−Cys−NH2,4（100.4mg、8.69μモ
ル、１当量）を、該混合溶液に添加し、反応混合物を、
25℃で２時間撹拌し、更に凍結乾燥させた。残渣を、10
mlの0.02％のTFA/H2Oに溶解させ、ろ過し、更にNucleos
il C−18カラム（2.2×25cm）にかけた。カラムを、
（Ａ）H2OCys−NH2,4,およびAc−Cys−Aca−［Ala
384,389］−P.falciparum CS（380−396）−NH2,7bを与
えた。
（MAP−NANP）−CS.T3によって免疫化されたマウスにお
ける抗体応答 BALB/cマウスを（１群当り５ひき）を、40μｇの（NA
NP）３−CS.T3 または完全フロインドのアジュバント（CFA）中、MAPS
B−細胞エピトープ［（NANP）３］８−Lys7−Aca−Cys
−NH2 に共有結合されたアミノ酸配列XIII（CS.T3ペプチド）
を有するアミド化された形態のポリペプチドから成る化
合物６ を用いて腹腔内的に免疫化させた。４週間後、補助注射
（CFA中、40μｇの免疫原）を与えた。血漿を、図に示
された様に毎週取り、抗−（NANP）50抗体の存在につい
て酵素−結合免疫吸収検定によって試験し（第５図）、
更にスポロゾイト類に対する抗体について間接免疫ケイ
光によって試験した（第６図）。化合物６によって高め
られた抗血清類の力価は、固定したスポロゾイト類に対
する間接免疫ケイ光検定によって測定して、（NANP）３
−CS.T3によって誘発されたものに比べて４倍高く、従
って、普遍的なＴ−細胞エピトープを提出するポリペプ
チドと前記したMAPS B−細胞エピトープとの組み合せ
が、Ｂ−細胞エピトープが線状ペプチド（NANP）３であ
る場合よりも強い免疫応答をもたらすことを意味する。
ける抗体応答 BALB/cマウスを（１群当り５ひき）を、40μｇの（NA
NP）３−CS.T3 または完全フロインドのアジュバント（CFA）中、MAPS
B−細胞エピトープ［（NANP）３］８−Lys7−Aca−Cys
−NH2 に共有結合されたアミノ酸配列XIII（CS.T3ペプチド）
を有するアミド化された形態のポリペプチドから成る化
合物６ を用いて腹腔内的に免疫化させた。４週間後、補助注射
（CFA中、40μｇの免疫原）を与えた。血漿を、図に示
された様に毎週取り、抗−（NANP）50抗体の存在につい
て酵素−結合免疫吸収検定によって試験し（第５図）、
更にスポロゾイト類に対する抗体について間接免疫ケイ
光によって試験した（第６図）。化合物６によって高め
られた抗血清類の力価は、固定したスポロゾイト類に対
する間接免疫ケイ光検定によって測定して、（NANP）３
−CS.T3によって誘発されたものに比べて４倍高く、従
って、普遍的なＴ−細胞エピトープを提出するポリペプ
チドと前記したMAPS B−細胞エピトープとの組み合せ
が、Ｂ−細胞エピトープが線状ペプチド（NANP）３であ
る場合よりも強い免疫応答をもたらすことを意味する。
本発明は以下のような実施態様を含むものである。
i.R1がＨ−Asp−Ile−を示し、R2が−OHを示す請求項１
または２に定義したポリペプチドの使用法。
または２に定義したポリペプチドの使用法。
ii.R1がＨ−Asp−Ile−を示し、R2が−Val−OHを示す請
求項１または２に定義したポリペプチドの使用法。
求項１または２に定義したポリペプチドの使用法。
iii.R1がＨ−Asp−Ile−を示し、R2が−Val−Asn−OHを
示す請求項１または２に定義したポリペプチドの使用
法。
示す請求項１または２に定義したポリペプチドの使用
法。
iv.R1がＨ−Ile−を示し、R2が−OHを示す請求項１また
は２に定義したポリペプチドの使用法。
は２に定義したポリペプチドの使用法。
v.R1がＨ−Ile−を示し、R2が−Val−OHを示す請求項１
または２に定義したポリペプチドの使用法。
または２に定義したポリペプチドの使用法。
vi.R1がＨ−Ile−を示し、R2が−Val−Asn−OHを示す請
求項１または２に定義したポリペプチドの使用法。
求項１または２に定義したポリペプチドの使用法。
vii.R1がＨ−Ile−を示し、R2が−Val−Asn−Ser−OHを
示す請求項１または２に定義したポリペプチドの使用
法。
示す請求項１または２に定義したポリペプチドの使用
法。
viii.R1がＨ−を示し、R2が−OHを示す請求項１または
２に定義したポリペプチドの使用法。
２に定義したポリペプチドの使用法。
ix.R1がＨ−を示し、R2が−Val−OHを示す請求項１また
は２に定義したポリペプチドの使用法。
は２に定義したポリペプチドの使用法。
x.R1がＨ−を示し、R2が−Val−Asn−OHを示す請求項１
または２に定義したポリペプチドの使用法。
または２に定義したポリペプチドの使用法。
xi.R1がＨ−を示し、R2が−Val−Asn−Ser−OHを示す請
求項１または２に定義したポリペプチドの使用法。
求項１または２に定義したポリペプチドの使用法。
xii.R1がＨ−Asp−Ile−を示し、R2が−Val−Asn−Ser
−OHを示す請求項１または２に定義したポリペプチドの
使用法。
−OHを示す請求項１または２に定義したポリペプチドの
使用法。
第１図は、本発明のペプチド／ペプチドワクチンの一例
を示す模式図、第2A図及び第2B図は、本発明のワクチン
合成の一例としての固相ペプチド合成を示す模式図、第
３図は、Ｂ−細胞エピトープとＴ−細胞エピトープとの
間の結合形成の一例を示す模式図、第４図は、Ｂ−細胞
エピトープとＴ−細胞エピトープとの間の2,2′−ジピ
リジルジスルフィドを用いた結合形成の一例を示す模式
図、第５図は、酸素−結合免疫吸着アッセイの結果を示
すグラフ、第６図は、免疫ケイ光アッセイの結果を示す
グラフである。
を示す模式図、第2A図及び第2B図は、本発明のワクチン
合成の一例としての固相ペプチド合成を示す模式図、第
３図は、Ｂ−細胞エピトープとＴ−細胞エピトープとの
間の結合形成の一例を示す模式図、第４図は、Ｂ−細胞
エピトープとＴ−細胞エピトープとの間の2,2′−ジピ
リジルジスルフィドを用いた結合形成の一例を示す模式
図、第５図は、酸素−結合免疫吸着アッセイの結果を示
すグラフ、第６図は、免疫ケイ光アッセイの結果を示す
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/445 A61K 37/02,39/00 C12P 21/08 C07K 7/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】プラスモジウムのＢ細胞エピトープを提示
する抗原構造と会合させた、普遍的に認識されるＴ細胞
エピトープとして、下記のアミノ酸配列 （式中、R1はＨ−Asp−Ile、Ｈ−Ile−またはＨ−を示
し、 R2は−Val−Asn−Ser−OH、−Val−Asn−OH、−Val−OH
または−OHを示す） を有するポリペプチドまたはその誘導体を含有する、宿
主のMHCハプロタイプに関係なくマラリアに対する免疫
応答を誘導できる、免疫原性組成物。 - 【請求項２】該アミノ酸配列においてR1がＨ−Asp−Ile
の時、R2は−Val−Asn−Ser−OHではない請求項１に記
載の組成物。 - 【請求項３】Ｂ細胞エピトープを提示する抗原構造が多
重抗原ペプチドである、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項４】多重抗原ペプチドがプラスモジウム・ファ
ルシパルム（Plasmodium falciparum）のCS蛋白質中に
存在する反復配列NANPの多量体を包含する、請求項３に
記載の組成物。 - 【請求項５】多重抗原ペプチドが、 である、請求項４に記載の組成物。
- 【請求項６】多重抗原ペプチドが である、請求項４に記載の組成物。
- 【請求項７】ポリペプチドが普遍的Ｔ細胞エピトープで
ある請求項２ないし６のいずれか一つに記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888812214A GB8812214D0 (en) | 1988-05-24 | 1988-05-24 | Use of peptide from circumsporozoite protein of p falciparum as universally recognized t-cell epitope |
| GB8812214.8 | 1988-05-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242099A JPH0242099A (ja) | 1990-02-13 |
| JP2761402B2 true JP2761402B2 (ja) | 1998-06-04 |
Family
ID=10637401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1129037A Expired - Fee Related JP2761402B2 (ja) | 1988-05-24 | 1989-05-24 | 普遍的なｔ―細胞エピトープ |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5114713A (ja) |
| EP (1) | EP0343460B1 (ja) |
| JP (1) | JP2761402B2 (ja) |
| AT (1) | ATE156841T1 (ja) |
| AU (1) | AU627459B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340472C (ja) |
| DE (1) | DE68928251T2 (ja) |
| DK (1) | DK250589A (ja) |
| GB (1) | GB8812214D0 (ja) |
| NZ (1) | NZ229146A (ja) |
| ZA (1) | ZA893702B (ja) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2031197A1 (en) * | 1989-04-12 | 1990-10-13 | James P. Tam | Dendritic polymer of multiple antigen peptide system useful as anti-malarial vaccine |
| GB8924438D0 (en) * | 1989-10-31 | 1989-12-20 | Hoffmann La Roche | Vaccine composition |
| US5547669A (en) * | 1989-11-03 | 1996-08-20 | Immulogic Pharma Corp | Recombinant peptides comprising T cell epitopes of the cat allergen, Fel d I |
| IT1241395B (it) * | 1990-04-02 | 1994-01-10 | Eniricerche Spa | Composti immunogenici,il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalaria |
| CH683101A5 (de) * | 1990-09-18 | 1994-01-14 | Biotech Australia Pty Ltd | T-Zellen-Epitope. |
| DE4102042A1 (de) * | 1991-01-24 | 1992-07-30 | Bayer Ag | Substituierte aminosaeureamid-derivate deren herstellung und verwendung als fungizide |
| KR100251505B1 (ko) * | 1991-11-16 | 2000-05-01 | 장 스테판느 | 말라리아원충으로부터의 cs 및 hbsag 사이의 혼성 단백질(hybrid protein between cs from plasmodium and hbsag) |
| US5928902A (en) * | 1992-02-27 | 1999-07-27 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg |
| US6169171B1 (en) | 1992-02-27 | 2001-01-02 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hybrid protein between CS from plasmodium and HBSAG |
| GB9215780D0 (en) * | 1992-07-24 | 1992-09-09 | Univ London Pharmacy | Peptide compounds |
| CA2143823C (en) | 1992-08-27 | 2005-07-26 | Alfio Comis | Retro-, inverso - and retro-inverso synthetic peptide analogues |
| US5674977A (en) * | 1993-02-05 | 1997-10-07 | The Ontario Cancer Institute | Branched synthetic peptide conjugate |
| JP3795914B2 (ja) * | 1993-04-27 | 2006-07-12 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド | ワクチン用免疫原性ｌｈｒｈペプチド構築体および合成普遍免疫刺激器 |
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