DE3723190A1

DE3723190A1 - Verfahren zum nachweis von verfaelschungen des honigs

Info

Publication number: DE3723190A1
Application number: DE19873723190
Authority: DE
Inventors: Josef Dipl Biol Lipp; Hubert Prof Dr Ziegler
Original assignee: OETKER AUGUST DR FA
Current assignee: OETKER AUGUST DR FA
Priority date: 1987-07-14
Filing date: 1987-07-14
Publication date: 1989-01-26

Description

Es besteht die Gefahr, daß beim Import und Vertrieb von Honig durch sogenannte Billiganbieter dieser durch Zusatz von Stärkehydrolysaten verfälscht wird.

Bisher war es nicht möglich, Verfälschungen des Honigs exakt auch noch in einem Bereich unter 5% festzustellen. Zwar hat Kushnir 1979 (Journal of the association of official analytical chemists 62 (4) 917-920, 1979) eine Analytik von Sacchariden beschrieben, bei der Verfälschungen des Honigs durch Hochfructosesirupe (HFCS) mittels Dünnschichtchromatographie (DC) nachgewiesen werden konnten. Dabei handelte es sich um eine Methode, die zwar sensitiv genug ist, Verfälschungen im Bereich von 5% noch zu entdecken, die aber viel Zeit beansprucht und keine vollständige Trennung der Saccharide gewährleistet. Eine weitere Methode zur Qualitätskontrolle des Honigs stellt die w-¹³C-Methode von Ziegler 1977 (Apidologie, 1977, 8 (4) 337-347) dar. Sie wurde an verschiedenen Honig/Sirup-Mischungen durchgeführt. Mit dieser Methode können Verfälschungen des Honigs mit Stärkematerial aus C₄-Pflanzen, nicht aber aus C₃-Pflanzen nachgewiesen werden.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein quantitatives Verfahren zum Nachweis von Verfälschungen des Honigs zu finden, bei dem auch Verfälschungen unter 5 Gewichts-% noch zuverlässig detektiert werden können, das weniger zeitaufwendig als die bisher bekannten Verfahren ist, für die industrielle Routineanalytik einsetzbar ist und bei dem auch Verfälschungen mit Stärkematerial aus C₃-Pflanzen nachgewiesen werden können.

Die Lösung der vorstehend geschilderten Aufgabe wird durch die Merkmale des kennzeichnenden Teils des Anspruchs 1 verwirklicht.

Weitere Ausführungsformen und Modifizierung des erfindungsgemäßen Gegenstands sind in den Unteransprüchen beschrieben.

In nachstehenden Ausführungen wird besonderes Augenmerk auf Substanzen gelegt, die in aus Pflanzenstärken gewonnenen Sirupen, aber nicht in Honigen vorkommen. Solche Verbindungen stellen Oligo- bis Polysaccharide dar, die dadurch entstehen, daß die Enzyme, durch welche die Pflanzenstärken hydrolysiert werden, nicht nur abbauend, sondern auch aufbauend wirken.

Diese Substanzen werden mittels der Niederdruckflüssigkeitschromatographie (LPLC) oder der Niedervakuumflüssigkeitschromatographie (LVLC) angereichert. Sie können mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) in ihren anomeren Formen erkannt, isoliert und als Qualitätsparameter herangezogen werden. Als Zusatzmethode wurde zur Überprüfung der HPLC die traditionelle Dünnschichtchromatographie (DC) nach Kushnir, aber auch eine DC mit verändertem Laufmittel angewandt. Die Flecken auf der Dünnschichtplatte wurden mittels präparativer DC den Peaks der HPLC zugeordnet.

Gemäß der Erfindung wird zunächst eine Niederdruckflüssigkeitschromatographie (LPLC) oder eine Niedervakuumflüssigkeitschromatographie (LVLC) durchgeführt. Mit dieser Methode lassen sich Zucker an Aktivkohle adsorbieren und durch verschiedene Konzentrationen von Ethanol selektiv auswaschen. Höhere Oligosaccharide können damit angereichert werden. Um das entsprechende Verfahren anzuwenden, wird eine LPLC-Glassäule, vorzugsweise mit einer Länge von 33 cm und einem Innendurchmesser von 25 mm, gekoppelt mit einer Niederdruckflüssigkeitschromatographiepumpe verwendet. Die Packung der Säule stellt eine Mischung aus Aktivkohle und Celite-Kieselgur, vorzugsweise Type 545 der Firma Serva, im vorgegebenen Verhältnis dar, wobei sich ein Verhältnis von 50 : 50 als optimal ergeben hat.

Bei der Niederdruckvakuumflüssigkeitschromatographie (LVLC) werden Plastikspritzen, wobei 20 ml sich für geeignet erwiesen haben, mit nicht weniger als 2 g obiger Mischung gefüllt (Schlemmverfahren) und auf ein Vakuumextraktionssystem aufgesteckt. Die Elution der Lösungsmittel erfolgt durch Unterdruck, welcher durch Wasserstrahlvakuum erreicht werden kann. Der Vorteil dieser Anwendung ist die parallele Vorbereitung mehrer Proben, womit eine Zeitersparnis erreicht wird, die den Einsatz dieses Systems in der Routineanalytik zuläßt.

Ca. 1 g (LPLC) und 0,7 g (LVLC) der Honig- bzw. Sirupprobe wird in 10 ml Wasser gelöst, gefilert, vorzugsweise mit einem 3 µm Membranfilter, und auf die Säule(n) gegeben. Danach wird folgende Elutionsfolge durchgeführt: Niederdruckflüssigkeitschromatographie (LPLC): 300 ml 7% Ethanol zur Elution der Mono- und Disaccharide, gefolgt von 100 ml 50% Ethanol zur Elution der Oligo- und Polysaccharide.

Niedervakuumflüssigkeitschromatographie (LVLC): 100 ml 7% Ethanol, gefolgt von 50 ml 50% Ethanol.

Die Flußrate wird bei der Niederdruckflüssigkeitschromatographie auf 8,8 ml eingestellt, wobei ein Druck von 3 bar nicht überschritten wird.

Bei der Niedervakuumflüssigkeitschromatographie (LVLC) wird der gleiche Unterdruck ∼ (-3 bar) durch Anlegen eines Wasserstrahlvakuums erreicht.

Die erste Fraktion wird verworfen, die zweite am Rotationsverdampfer getrocknet. Man erhält ein weißes Pulver, dessen Gewicht durch Subtraktion des Kolbenleer-Gewichtes vom Gewicht des Kolbens mit Pulver ermittelt wird (zwischen 15 und 70 mg).

Mit den so erhaltenen Oligo- und Polysacchariden wird folgendermaßen verfahren:

Die Trennung und Analyse der Zucker erfolgt vorzugsweise mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie. Es werden zwei Säulen verwendet.

1. "Carbohydrate"-Säule (Calcium beladenes sulphoniertes Polystyrol)
2. RP-18 HPLC-Säule 250 × 4 mm (an Silicagel gebundene Octadecylgruppen).

Die nach der Erfindung verwendete Hochdruckflüssigkeitschromatographie stellt ein isokratisches System mit RI-Detektion dar.

Zur Durchführung der analytischen Dünnschichtchromatographie werden einerseits die traditionellen Laufmittel zur Saccharidanalyse

a) Chloroform : Essigsäure : Wasser (30 : 35 : 5; v : v : v)
b) iso-Butanol : Essigsäure : Wasser (2 : 1 : 1; v : v : v),

andererseits ein Gemisch aus n-Butanol : Pyridin : Wasser (20 : 19 : 11; v : v : v : v) verwendet, welches eine bessere Trennung des Oligo- und Polsaccharidgemisches zuläßt.

Die aufgetragenen Probenmengen bei der DC sollten zwischen 250 und 500 mg liegen. Die für die analytische Dünnschichtchromatographie verwendeten Platten werden mit einem Gemisch aus Anilin, Diphenylamin, Aceton und konzentrierter Phosphorsäure entwickelt (1 ml Anilin und 1 g Diphenylamin in 100 ml Aceton lösen; zu je 10 ml dieser Lösung 1 ml 85%ige Phosphorsäure geben).

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Verfälschungen des Honigs, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine Niederdruckflüssigkeitschromatographie (LPLC) durchgeführt wird, bei der eine Glassäule mit einer Länge von vorzugsweise 33 cm und einem Innendurchmesser von vorzugsweise 25 mm, die mit einer Niederdruckflüssigkeitschromatographie-Pumpe gekoppelt ist, verwendet und die Säule mit Aktivkohle/Celite-Kieselgur, vorzugsweise im Verhältnis 50/50 (s. v.), gepackt wird. Ca. 1 g Honig/Sirup werden in 10 ml Wasser gelöst, gefiltert und auf die Säule gegeben. Daraufhin werden folgende Elutionen durchgeführt:
300 ml 7% Ethanol, gefolgt von 100 ml 50% Ethanol, dabei wird die Flußrate vorzugsweise auf 8,8 ml/min eingestellt und ein Druck von 3 bar nicht überschritten. Die erste Fraktion wird verworfen, während die zweite am Verdampfer, vorzugsweise einem Vakuumrotationsverdampfer, zur Trockene eingeengt wird.
b) in der Routineanalytik wahlweise eine Niedervakuumflüssigkeitschromatographie (LVLC) durchgeführt wird, bei der vorzugsweise 20 ml-Plastikspritzen verwendet werden, die auf ein Extraktionssystem aufgesteckt und mit 5 g Aktivkohle/Kieselgur (50/50, s. v.) gepackt sind, wobei die Proben, wie unter a) (LPLC) beschrieben, aufgetragen und folgende Elutionen durchgeführt werden: 100 ml 7% Ethanol, gefolgt von 50 ml 50% Ethanol,
c) die nach den vorstehenden Methoden erhaltenen Oligo- und Polysaccharide nach folgendem System weiterbehandelt werden:
d) die Trennung und Analyse der so erhaltenen Oligo- und Polysaccharide mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) erfolgt, wobei zwei Säulen, nämlich eine "Carbohydrate"-Säule (vorschlagsgemäß 300 × 7,5 mm; s. y.), vorzugsweise aber eine Reversed phase-18-Säule (vorschlagsgemäß (250 × 4 mm; s. v.) verwendet werden.
e) als Zusatzmethode (Überprüfung) die analytische Dünnschichtchromatographie durchgeführt wird, wobei als Laufmittel vorzugsweise ein Gemisch aus n-Butanol : Pyridin : Wasser im Verhältnis von 20 : 19 : 11 gewählt wird.

2. Verfahren zum Nachweis von Verfälschungen des Honigs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Laufmittel bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) 99,8% Wasser, 0,1% Essigsäure, 0,1% Methanol, gewählt werden wird, welches mit 1,0 ml/min über eine RP-18-HPLC-Säule gepumpt wird.

3. Verfahren zum Nachweis von Verfälschungen des Honigs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elutionsfolge bei der LPLC 300 ml 7% Ethanol, gefolgt von 100 ml 50% Ethanol, bei der LVLC 100 ml 7% Ethanol, gefolgt von 50 ml 50% Ethanol betragen soll.