CN106932515B - 基于uhplc串联高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法 - Google Patents

基于uhplc串联高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于UHPLC串联高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法，将日照绿茶样品和待测的绿茶样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱‑四极杆‑轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到日照绿茶样品与待测绿茶样品的UHPLC‑MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析模型区分待测绿茶样品是否为日照绿茶。本发明的分析结果以PCA得分图的形式展示，本领域技术人员能够直观的判别其真假情况，无需再进行相关验证和分析，可以得到真假结论，检测结果准确可靠。

Description

基于UHPLC串联高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照 绿茶的分析方法
技术领域
本发明属于茶业品质检测技术领域，具体涉及一种基于UHPLC串联高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法。
背景技术
代谢组学是对一个生物系统的给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析,从而定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。代谢组学研究的对象是相对分子质量1000以内的小分子代谢产物，可以系统、细致的了解和认识生命机体的活动规律和代谢过程。
代谢组学的主要研究思想是“全局观点”，注重对生物代谢物的整体情况进行研究，更能反映生物的整体动态情况。代谢组学方法为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段,同时也为实践提供了新的技术支持与保障。
茶叶品质一般与色、香、味、形等因素有关，这些因素受海拔、纬度、光照、温度、湿度、栽培过程中的灌水及施肥等影响较大。而茶叶中有水分、生物碱、酶、茶多酚、维生素和氨基酸等上百种化学成分，这些化学成分之间也是相互联系的，它们共同决定着茶叶的品质，传统意义上的依靠感官的茶叶品质鉴定方式无法对茶叶中的化学物质进行定性定量测定，太过于主观，逐渐不适应当下茶业经济的发展，很难让人信服。
日照绿茶产于山东省日照市，日照是世界茶学家公认的三大海绿茶城市之一(另两个分别为韩国宝城和日本静冈)。日照市地处山东省东南部，东临黄海，属暖温带湿润季风气候，光照充足，雨量充沛，境内山地丘陵土壤呈微酸性，属黄棕壤土，含有丰富的有机质和微量元素，优越的沿海气候条件和优良的环境，孕育了日照绿茶“叶片厚、滋味浓、香气高、耐冲泡”的独待品质，冲泡后汤色黄绿明亮、栗香浓郁、回味甘醇，被誉为“江北第一茶”。2006年3月，国家质检总局批准对日照绿茶实施地理标志产品保护。因此，建立一种区分日照绿茶的方法有很强的实用意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于UHPLC串联四极杆-轨道阱高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法，该分析方法能够有效区分真日照绿茶和低价绿茶。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种基于UHPLC串联四极杆-轨道阱高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法，包括以下步骤：
将日照绿茶样品和待测的绿茶样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到日照绿茶样品与待测绿茶样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析(PCA)模型区分待测绿茶样品是否为日照绿茶。
本发明中，所述日照绿茶样品选择岚山区的茶叶、五莲县的茶叶、东港区的茶叶、莒县的茶叶中的一种或多种。为了能够得到有效区分真假日照绿茶，优先可以选用这四种茶叶样品。
本发明中，所述前处理采用的有机溶剂是甲醇水溶液，优选的，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为75～80％，最优选的为75％。
本发明中，样品前处理过程包括：将绿茶样品粉碎，与有机溶剂混合，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品。
其中，超声时间为10～30min，优选20min；离心条件：800～1200rpm离心4～8min，优选1000rpm离心5min；有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm；为保证样品中代谢物提取效果较好，样品与有机溶剂的添加比例为1g：(300～400)mL，优选1g：350mL。
本发明中，超高效液相色谱条件为：超高效液相色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱(C18柱)；A相：甲酸水溶液，B相：甲酸乙腈溶液，梯度洗脱流程：0-2.5min 95％A，2.5-3min 95％-91％A，3-4min 91％-80％A，4-5.5min 80％-70％A，5.5-6.5min 70％-65％A，6.5-8min 65％-50％A，8-8.75min 50％-30％A，8.75-9.75min 30％-15％A，9.75-11.75min15％-10％A，11.75-14min 10％-1％A，14-16.5min 1％A，16.5-17.5min 1％-95％A，17.5-20min95％。流速：0.2～0.5mL/min，柱温30～37℃。
优选的，甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.1％；流速为0.3mL/min；柱温35℃；进样量2微升。
本发明中，四极杆-轨道阱高分辨质谱选用Thermo Fisher Q Exactive MassSpectrometer，质谱条件为：正离子模式，分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.1Kv；毛细管温度，320℃。扫描范围，m/z：75-1125。扫面模式：Full Ms(全扫描)。
相比于现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)应用了代谢组学技术结合超高效液相色谱串联四极杆-轨道阱高分辨质谱技术对绿茶中化学物质进行宏观分析，信服力高。
现有的对茶叶的检测项目仅仅局限在几个常见的指标，无法对茶叶品质做出有效判断，而人工的判断方法受各种因素的影响较大，信服力太弱，代谢组学技术可以对代谢物的整体情况进行研究，更能反映样本的整体情况，同时，可应用统计学知识寻找差异性的代谢物，为进一步研究提供技术支持。
采用本发明的分析方法能够有效区分日照绿茶和低价绿茶，结果以PCA得分图的形式展示，本领域技术人员能够直观的判别其真假情况，无需再进行相关验证和分析，可以得到真假结论，检测结果准确可靠。
(2)绿茶样品前处理方法简单快捷，方法建立后对检测人员操作技术要求较低。
在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取绿茶样品的代谢物信息，提取试剂用的是甲醇和水的混合溶剂对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。经过实验验证，不合适的前处理方法不能最大限度地提取日照绿茶的内源性代谢产物，将会造成不容易区分的检测结果，使得检测结果不准确。
(3)简化操作流程。传统的检测需要配置标准样品，绘制标准曲线，同时需要对多种化学物质进行测定，过程繁琐，费时费力。应用代谢组学方法进行测定，前处理过程简单，操作方便，上机操作也比较便捷，可以进行批量处理，省时省力，可信度高。
(4)针对UHPLC串联四极杆-轨道阱高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法，本发明根据日照绿茶样品的特点，优化筛选得到一组使得分析样品得到最佳分离效果和检测效果的超高效液相色谱条件以及四极杆-轨道阱高分辨质谱的工艺条件，经过试验验证，通过该工艺条件，能够在PCA得分图上将日照绿茶与劣质或低价绿茶有效区分。
(5)本发明使用了四极杆-轨道阱高分辨的质谱，故分辨率比较高，相比较于其他的检测方法，可以得到更准确和更多的物质，这在数据分析中有显著的优势。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是岚山区日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图，其中，lanshan，代表岚山区的茶叶；Jia，代表低价的绿茶。
图2是东港区日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图，其中，donggang，代表东港区的茶叶；Jia，代表低价的绿茶。
图3是五莲县、莒县日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图，其中，wulian，代表五莲县的茶叶；Juxian，代表莒县的茶叶样品；Jia，代表低价的绿茶。
图4是四个产地的日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图，其中，wulian，代表五莲县的茶叶；Juxian，代表莒县的茶叶样品；Lanshan，代表岚山区的茶叶；Donggang，代表东港区的茶叶；Jia，代表低价的绿茶。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
多元统计分析方法是建立在多元统计分布基础上的一类处理多元统计数据方法的总称，是统计学中的具有丰富理论成果和众多应用方法的重要分支。常用的多元统计分析方法主要包括：多元回归分析、聚类分析、判别分析、主成分分析、因子分析、对应分析、典型相关分析等。本发明主要采用主成分分析法。
仪器与设备：
ACQUITY UPLC BEH C18分析柱美国Waters公司(2.1×50mm,1.7μm)；
Thermo Scientific Q Exactive Thermo ScientificTM Ultimate3000美国Thermo Fisher公司；
SIGMA 3-18K高速冷冻离心机德国SIGMA公司；
MiLLi-Q-A-11超纯水机密理博公司；
超声波清洗机宁波新芝生物科技有限公司；
IKA MS 3basic涡旋混合器IKA公司；
材料与试剂：
日照绿茶不同日照绿茶产地处收集；
低价绿茶超市处购买，每斤在100元以下；
超纯水MiLLi-Q-A-11；
乙腈赛默飞世尔科技有限公司；
甲醇赛默飞世尔科技有限公司；
无水甲酸赛默飞世尔科技有限公司。
正如背景技术中所介绍的，为了克服现有技术中的所存在的不足，本发明提供一种基于UHPLC串联四极杆-轨道阱高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法。
该分析方法的原理是：绿茶中含有上百种化学成分，它们影响了茶叶的品质，使用UHPLC可以将茶叶中的化学物质分开，使用质谱技术进行检测，可以得到茶叶的液相和质谱数据，然后应用代谢组学分析技术，对所得的数据应用PCA技术进行分析，从而直观区分待测绿茶样品是否为日照绿茶。
高效液相色谱是一种采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2μm)和超高压系统(压力大于105千帕)的新型液相色谱技术,能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。同时，Thermo Fisher QExactive Mass Spectrometer具有超高分离度、超高速度、超高灵敏度等特点，可以对茶叶中的化学物质进行更精确地检测，使结果更可靠，更有信服力。
具体包括以下步骤：
将日照绿茶样品和待测的绿茶样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到日照绿茶样品与待测绿茶样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析(PCA)模型区分待测绿茶样品是否为日照绿茶。
对于不同产地的日照绿茶，由于其品质与色、香、味、形等因素有关，这些因素受海拔、纬度、光照、温度、湿度、栽培过程中的灌水及施肥等影响较大，所以即使同为日照绿茶，不同产地之间的日照绿茶中的代谢物组成和浓度不会完全相同，故它们之间会呈现一定差异，但是经过本发明的实验验证，这并不影响最终的检测结果，能够与劣质或低价的绿茶进行有效的区分。在本发明的某些实施例中，所述日照绿茶样品选择岚山区的茶叶、五莲县的茶叶、东港区的茶叶、莒县的茶叶中的一种或多种。为了能够得到有效区分真假日照绿茶，优先可以选用这四种茶叶样品。
在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取样品的代谢物信息，提取试剂优先选用的是甲醇和水的混合溶剂对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。在本发明的优选实施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为75％。本发明还进行可其他提取剂的研究，例如乙醇水溶液，但是得到的效果并不理想，无法有效区分日照绿茶和低价绿茶。
在本发明某些优选的实施例中，样品前处理过程包括：将绿茶样品粉碎，与有机溶剂混合，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品。其中，超声时间为10～30min，优选20min；离心条件：800～1200rpm离心4～8min，优选1000rpm离心5min；有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm；为保证样品中代谢物提取效果较好，绿茶样品与有机溶剂的添加比例为1g：(300～400)mL，优选1g：350mL。其中，所述绿茶样品与有机溶剂的添加比例较为关键，能够对测试样品充分溶解，从而获取更多的样品代谢物信息，使得最终检测结果更加准确。
色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的，为了使每个组分都得到分离和鉴定，必须选择合适的色谱和质谱分析条件。
本发明针对日照绿茶样品组分的特点，考察了超高效液相色谱中的流动相、梯度洗脱流程、柱温和进样量等条件对分离效率和分析速度的影响，最终优化筛选得到一组使得分析样品得到最佳分离效果的超高效液相色谱条件。
在本发明某些优选的实施例中，超高效液相色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱(C18柱)；A相：甲酸水溶液，B相：甲酸乙腈溶液，梯度洗脱流程：0-2.5min 95％A，2.5-3min95％-91％A，3-4min 91％-80％A，4-5.5min 80％-70％A，5.5-6.5min 70％-65％A，6.5-8min65％-50％A，8-8.75min 50％-30％A，8.75-9.75min 30％-15％A，9.75-11.75min15％-10％A，11.75-14min 10％-1％A，14-16.5min 1％A，16.5-17.5min 1％-95％A，17.5-20min 95％。流速：0.2～0.5mL/min，柱温30～37℃。
绿茶样品是一个成分复杂的试样，本发明筛选得到的梯度洗脱程序能够更好的对绿茶中复杂包含很多物质的组分进行强有力的分离，为后续区分日照绿茶和低价绿茶作好基础。本发明还采用了其他的梯度洗脱程序，发现不合适的梯度洗脱程序，无法使每个组分都得到有效分离，进而无法有效区分日照绿茶和低价绿茶。
在本发明优选的实施例中，甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.1％；流速为0.3mL/min；柱温35℃；进样量2微升。
本发明针对日照绿茶样品的组分特点，为改善化合物的雾化和电离状况，提高灵敏度，通过对分辨率、气体流速、喷雾电压等条件进行考察，最终优化筛选得到一组使得检测效果准确的四极杆-轨道阱高分辨质谱条件。
在本发明优选的实施例中，四极杆-轨道阱高分辨质谱选用Thermo Fisher QExactive Mass Spectrometer，质谱条件为：正离子模式，分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.1kV；毛细管温度，320℃。扫描范围，m/z：75-1125。扫面模式：Full Ms(全扫描)。
经过试验验证，通过该超高效液相色谱和质谱的工艺条件，能够在PCA得分图上将日照绿茶与劣质或低价绿茶有效区分，否则，无法有效区分日照绿茶和低价绿茶。
应用代谢组学技术可以测定许多内源性化合物的定性/定量信息。这些信息在输出的谱图上表现为许多信号峰，在色谱质谱图上表现为不同保留时间出现色谱峰。
从处理效果和方便性来讲，在本发明的优选的实施例中，对得到的日照绿茶样品和待测的绿茶样品的UHPLC-MS原始数据采用Compound Discover软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据；然后通过多元统计分析方法PCA得分图的形式对区分结果进行展示。
其中，Compounds Discoverer软件是赛默飞世尔科技有限公司研制的一种处理LC-MS原始数据的软件。
区分方法是：在PCA得分图中，将待测的绿茶样品点与日照绿茶样品点所归属的区域进行比较，若是两者的样品点分别归属于不同的区域，比如，如图1～4所示，可判定待测的绿茶样品不属于日照绿茶；若是两者的样品点相互重叠或者相互掺杂在一起，可判定待测的绿茶样品属于日照绿茶。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种基于UHPLC串联四极杆-轨道阱高分辨质谱应用代谢组学技术区分日照绿茶和低价绿茶的分析方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
将茶叶样品粉碎，称取0.1g样品于50mL离心管中，加入35mL提取剂(75％甲醇水溶液(v/v))，涡旋混匀溶解，超声20min，1000rpm离心5分钟，然后将提取溶液充分混匀，0.22微米滤膜过滤，上机，进样体积为2微升。
(2)应用UHPLC串联Thermo Fisher Q Exactive Mass Spectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定。
1)液相色谱参数
色谱柱：Water BEH C18(1.7μm 2.1x50mm)色谱柱。
液相：A相，0.1％甲酸水，B相，0.1％甲酸乙腈；流速：0.3mL/min，柱温35℃。
2)质谱参数
正离子模式
(3)数据处理与多元统计分析
对得到的茶叶样品的UHPLC-MS原始数据采用Compound Discover软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取，峰对齐，去噪音等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据，然后通过SIMCA软件的多元统计分析方法PCA得分图的形式对区分结果进行展示。
PCA得分图是PCA模型的一种分布图，由于PCA分析是建立在同一个数据集X基础上，经过投影方法计算PCA第一主成分后，可以得到各个样品点在第一个主成分的得分t1，再得到各个样品点的第二个主成分上的得分t2。各个样品在各个主成分的得分就是其在计算的数学模型中的空间坐标，自然也就决定了其在模型中的具体位置，并直接反映各个样品在数学模型空间中的分布情况。
(4)不同应用对象的成果展示：
1)岚山区日照绿茶和低价绿茶的比较
茶叶样品为岚山区日照绿茶和低价绿茶，其中岚山区日照绿茶的样品个数为25个，从不同茶农处收集，低价绿茶的样品个数为23个，按照(1)～(3)的流程进行操作，得到岚山区日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图。
结果如图1所示，从PCA得分图可以看出各个样品的聚集、离散程度，每一个点代表一个样品，其中，岚山区日照绿茶的样品个数为25个，该25个样品点全部相对集中在图1中的右半部分，低价绿茶的样品个数为23个，该23个样品点全部集中在图1中的左半部分。
图1说明这25个岚山区日照绿茶的样品含有的代谢物组成很接近，组内差异较小，而与低价绿茶样品点距离很大，这说明岚山区日照绿茶含有的代谢物组成和浓度与低价绿茶的区别较大，采用该方法可以有效区分岚山区日照绿茶和低价绿茶，可见低价绿茶并非岚山区的高品质绿茶。
2)东港区日照绿茶和低价绿茶的比较
茶叶样品为东港区日照绿茶和低价绿茶，其中东港区日照绿茶的样品个数为20个，从不同茶农处收集，低价绿茶的样品个数为19个，按照(1)～(3)的流程进行操作，得到东港区日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图。
结果如图2所示，从PCA得分图可以看出各个样品的聚集、离散程度，每一个点代表一个样品，其中，东港区日照绿茶的样品个数为20个，该20个样品点全部相对集中在图2中的右半部分，低价绿茶的样品个数为19个，该19个样品点全部集中在图2中的左半部分。
图2说明这20个东港区日照绿茶的样品含有的代谢物组成很接近，组内差异较小，而与低价绿茶样品点距离很大，这说明东港区日照绿茶含有的代谢物组成和浓度与低价绿茶的区别较大，采用该方法可以有效区分东港区日照绿茶和低价绿茶，可见低价绿茶并非东港区的高品质绿茶。
3)五莲县、莒县日照绿茶和低价绿茶的比较
茶叶样品为五莲县、莒县日照绿茶和低价绿茶，其中五莲县日照绿茶的样品个数为7个，莒县日照绿茶的样品个数为7个，从不同茶农处收集，低价绿茶的样品个数为14个，按照(1)～(3)的流程进行操作，得到五莲县、莒县日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图。
结果如图3所示，从PCA得分图可以看出各个样品的聚集、离散程度，每一个点代表一个样品，其中，五莲县日照绿茶的样品个数为7个，莒县日照绿茶的样品个数为7个，该14个日照绿茶样品点全部相对集中在图3中的右半部分，低价绿茶的样品个数为14个，该14个样品点全部集中在图3中的左半部分。图3说明这13个日照绿茶的样品含有的代谢物组成很接近，组内差异较小，而与低价绿茶样品点距离很大，这说明这两个产地的日照绿茶含有的代谢物组成和浓度与低价绿茶的区别较大，采用该方法可以有效区分这两个产地的日照绿茶和低价绿茶，可见低价绿茶并非这两个日照产地的高品质绿茶。
4)四个产地的日照绿茶和低价绿茶间的比较
茶叶样品为五莲县、莒县、岚山区、东港区日照绿茶和低价绿茶，其中五莲县日照绿茶的样品个数为4个，莒县日照绿茶的样品个数为4个，岚山区日照绿茶的样品个数为4个，东港区日照绿茶的样品个数为4个，从不同茶农处收集，低价绿茶的样品个数为14个，按照(1)～(3)的流程进行操作，得到这四个产地的日照绿茶和低价绿茶的PCA得分图。
结果如图4所示，从PCA得分图可以看出各个样品的聚集、离散程度，每一个点代表一个样品，其中，四个产地的16个日照绿茶样品点全部相对集中在图4中的右半部分，低价绿茶的样品个数为14个，该14个样品点全部集中在图4中的左半部分。图4说明这16个日照绿茶的样品含有的代谢物组成很接近，组内差异较小，而与低价绿茶样品点距离很大，这说明这四个产地的日照绿茶含有的代谢物组成和浓度与低价绿茶的区别较大，采用该方法可以有效区分这四个产地的日照绿茶和低价绿茶，可见低价绿茶并非这四个日照产地的高品质绿茶。
综上，基于本发明的前处理方法、液相色谱参数和四极杆-轨道阱高分辨质谱参数的前提下，应用代谢组学方法，从图中可以看到，每一个产地和低价的绿茶做对比时，日照绿茶和低价茶叶都可以很好地分开；四个产地作为整体和低价绿茶做对比时，两者也可以很好地分开。由此可见，本研究所使用的方法对于区分低价绿茶和日照绿茶有很好的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于UHPLC串联四极杆-轨道阱高分辨质谱应用代谢组学技术区分真假日照绿茶的分析方法，其特征是，包括以下步骤：
将日照绿茶样品和待测的绿茶样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到日照绿茶样品与待测绿茶样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析模型区分待测绿茶样品是否为日照绿茶；
所述日照绿茶样品选择岚山区的茶叶、五莲县的茶叶、东港区的茶叶、莒县的茶叶中的一种或多种；
所述前处理采用的有机溶剂是甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为75～80％；
超高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱；A相：0.1％甲酸水溶液，B相：0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱流程：0-2.5min95％A，2.5-3min95％-91％A，3-4min91％-80％A，4-5.5min80％-70％A，5.5-6.5min70％-65％A，6.5-8min65％-50％A，8-8.75min50％-30％A，8.75-9.75min30％-15％A，9.75-11.75min15％-10％A，11.75-14min10％-1％A，14-16.5min1％A，16.5-17.5min1％-95％A，17.5-20min95％；流速：0.2～0.5mL/min，柱温30～37℃；
正离子模式，分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.1Kv；毛细管温度，320℃；扫描范围，m/z：75-1125；扫面模式：全扫描；
得到日照绿茶样品与待测绿茶样品的UHPLC-MS原始数据采用Compound Discover软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据；然后通过多元统计分析方法PCA得分图的形式对区分结果进行展示。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为75％。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：样品前处理过程包括：将绿茶样品粉碎，与有机溶剂混合，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品。
4.如权利要求3所述的分析方法，其特征是：超声时间为10～30min；
离心条件：800～1200rpm离心4～8min。
5.如权利要求4所述的分析方法，其特征是：超声时间为20min；
离心条件：1000rpm离心5min。
6.如权利要求3所述的分析方法，其特征是：有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm；
样品与有机溶剂的添加比例为1g：300～400mL。
7.如权利要求6所述的分析方法，其特征是：有机滤膜的孔径为0.22μm；
样品与有机溶剂的添加比例为1g：350mL。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.1％；流速为0.3mL/min；柱温35℃；进样量2微升。
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