CN113125589B - 一种代谢组学分析技术鉴定鸭屎香单丛茶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于乌龙茶鉴定的技术领域，涉及一种代谢组学分析技术鉴定鸭屎香单丛茶的应用，所述代谢组学分析技术中通过Log₂ Fold Change、adj.p、VIP值识别鸭屎香单丛茶特征成分，筛选条件为∣Log₂ Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.01且VIP>1。利用代谢组学分析技术建立了鸭屎香全面、无歧视性的非靶向代谢组学分析方法，能够对不同品种的茶叶进行代谢成分分析，准确地找出鸭屎香的特征成分；以茶叶化学成分为基础，建立鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，结合化学计量学分析，从大数据中筛查有利于开展鸭屎香的真假鉴别、地理溯源及优质品种筛选、风味调控等应用的鸭屎香特征标志物。

Description

一种代谢组学分析技术鉴定鸭屎香单丛茶的应用

技术领域

本发明属于乌龙茶鉴定的技术领域，具体涉及一种代谢组学分析技术鉴定鸭屎香单丛茶的应用。

背景技术

鸭屎香单丛茶(以下简称“鸭屎香”)是地理标志产品凤凰单丛茶中的一个具特殊韵味的高价值品种，其叶片似大乌叶，香型似黄枝香，滋味和香味均好，备受消费者喜爱。尽管是当地种植面积最广的品种，仍然供不应求，加之不同品种、等级的茶叶价格不同，由于经济效益的驱使，市场上总有部分不法商贩以次充好、以假乱真。

传统的鉴别方法是通过感官评审对茶叶的特征进行评价鉴定，具有很强的主观性。茶叶的化学组成决定了茶叶的饮用价值和特征，以茶叶化学成分为基础建立鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，有利于开展鸭屎香的真假鉴别、地理溯源季优质品种筛选、风味调控等应用。但是茶叶的化学组成非常复杂，化学成分多达千余种。目前，对鸭屎香单丛茶中的非靶向代谢分析检测方法还未见报道，无法对相关应用提供技术指导。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种代谢组学分析技术在鉴定鸭屎香单丛茶的应用，利用代谢组学分析技术建立了鸭屎香的全面、无歧视性的非靶向代谢组学分析方法，其能够对不同品种的茶叶进行代谢成分分析，准确地找出鸭屎香的特征成分。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种代谢组学分析技术在鉴定鸭屎香单丛茶的应用。

本发明还提供了一种代谢组学分析技术在识别鸭屎香单丛茶特征成分的应用；

所述代谢组学分析技术中通过Log₂ Fold Change、adj.p、VIP值识别鸭屎香单丛茶特征成分；

所述识别鸭屎香单丛茶特征成分的筛选条件为∣Log₂ Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.01且VIP>1。

本发明还提供了一种识别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，包括如下步骤：

1)样品制备；

2)非靶向代谢组学分析；

3)特征峰的提取和鉴别；

4)相似性分析；

5)差异性分析以及筛选差异标志物。

步骤1)所述样品的制备包括如下步骤：将鸭屎香及其它与其性质接近的乌龙茶样品，粉碎研磨至50～70目，将茶叶粉末与提取剂混合进行超声处理，离心分离取上清液；

所述提取剂包括甲酸、甲醇和水的混合物，其中，甲酸的质量分数为0.8～1.2％，甲醇和水的体积比为(2～4)：1；

所述提取剂的使用体积为1～1.5mL/100mg茶叶粉末；

所述超声处理为在20～25℃温度下超声10～20min；

所述离心分离为在3～5℃、8000～12000rpm条件下离心8～10min，以使得提取体系更好地分层，分离得到上清液；

所述上清液经过0.1～0.3μm的有机滤膜进行过滤，取等量的过滤上清液作为质量控制样品，以提升整体分析方法的准确性。

步骤2)所述非靶向代谢组学分析包括采用高效液相色谱进行组分分离，应用质谱进行分析；

所述高效液相色谱的条件包括，色谱柱温度为35～45℃，进样流速为0.2～0.4μL/min，进样体积为1.5～2.5μL；流动相包括第一流动相和第二流动相，第一流动相为质量分数为0.08～0.2％的甲酸水溶液，第二流动相为质量分数为0.08～0.2％的甲酸乙腈溶液；

进一步地，采用所述第一流动相和所述第二流动相配比逐渐变化进行梯度洗脱，在0～2min，第二流动相的质量分数保持在5％，在2～7min，第二流动相的质量分数从5％逐渐上升为25％；在7～11min，第二流动相的质量分数从25％逐渐上升为70％；在11min，第二流动相的质量分数从70％逐渐上升为95％；11～12.5min，第二流动相的质量分数保持在95％；在12.5～12.6min，第二流动相的质量分数从95％快速降低为5％；最后，在流动相中第二流动相质量分数为5％平衡3.0～4.0min；通过进一步优化了色谱条件，使得代谢物更好地进行分离，特别是流动相的选择和洗脱梯度的控制，进一步提升代谢物的分离效果；

所述色谱柱包括C18 Accucore柱，所采用的色谱柱能够更好地分离代谢物；

所述质谱条件包括，分辨率为65000～75000FWHM，喷雾电压2.5～3.5KV，鞘气压力35～45psi，辅助气8～12arb，毛细管温度为300～350℃，辅助气温度为310～340℃；更优选地，质谱扫描模式为full MS-dd/MS²，full MS对应的扫描范围100～1000m/z；dd/MS²对应的分辨率为17000～18000FWHM，NCE设定为15～60eV，质量窗口为1.5m/z；

步骤3)所述特征峰的提取和鉴别，将采集得到的不同茶叶原始数据采用CompoundDiscover软件对质谱分析得到的进行峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理；

所述Compound Discover软件进行数据处理过程中各参数的设置包括：峰对齐保留时间偏差为1.5～2.5min，化合物检测质量偏差为4～6ppm，最大未知元素组成设定为C90、H190、Br3、C14、K2、N10、O40、P3和S5，最小未知元素组成设定为C和H，最小峰强度设置为800000～1200000，信噪比(S/N)阈值为2.5～3.5，一级质谱图匹配的质量偏差为4.5～5.5ppm；

进一步地，所述一级质谱图匹配采用的数据库选自Nature Chemical Biology、Nature Chemistry、PlantCyc、PubMed、Chembank和Massbank中的至少一种；

对差异代谢物进行鉴别和确证是与二级质谱图进行匹配，并对具有标准品的化合物进行确证；

所述二级质谱图的数据库选自mz vault、mzCloud或Chemspider；

所述二级质谱图的数据库选自mz vault或mzCloud数据库进行匹配的得分大于70分，通过二级质谱图的匹配进一步提升差异代谢物检测的准确度，提升整体分析方法的准确率。

步骤4)所述相似性分析为，分析所述所有代谢物在不同乌龙茶的富集情况及鸭屎香与其它乌龙茶的相似性，将所有代谢物及鉴定到的代谢物的数据矩阵预处理后采用R语言进行层次聚类热图分析，查看不同乌龙茶品种的聚类情况；

步骤5)所述差异性分析为，将步骤3)得到的所有代谢物的峰面积数据等由Compound Discover3.1导出至Excel，分别预处理后将不同乌龙茶及质量控制(QC)样本的峰面积矩阵倒入SIMCA 14.1软件，进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，了解不同乌龙茶代谢物的总体差异分布，通过PCA得分图及OPLS-DA分布分析鸭屎香与其他乌龙茶成分的差异性；

所述进行PCA和OPLS-DA分析是将差异代谢物的数据由Compound Discover软件导出至Excel进行数据处理后，将不同茶叶及质量控制样本的峰面积矩阵导入SIMCA-P 14.1软件处理；

步骤5)所述筛选差异标志物是将是将采集得到的不同乌龙茶样品原始数据进行峰对齐、峰提取、降噪和归一化处理，并通过Log₂ Fold Change、adj.p、VIP值筛选出鸭屎香与其他乌龙茶的差异代谢物；

所述鸭屎香与其他乌龙茶的差异代谢物的筛选条件为∣Log₂Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.01且VIP>1；

统计鸭屎香与其他乌龙茶上调和下调差异代谢物的数量，通过火山图展示代谢物的变化情况，以更加清晰地展现差异代谢物的变化。

本发明的有益效果如下：

本发明的一种代谢组学分析技术在鉴定鸭屎香单丛茶的应用，利用代谢组学分析技术建立了鸭屎香的全面、无歧视性的非靶向代谢组学分析方法，其能够对不同品种的茶叶进行代谢成分分析，准确地找出鸭屎香的特征成分；本发明以茶叶化学成分为基础，建立鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，结合化学计量学分析，从大数据中筛查有利于开展鸭屎香的真假鉴别、地理溯源季优质品种筛选、风味调控等应用的鸭屎香特征标志物。

附图说明

图1为鸭屎香与其他乌龙茶所有代谢物的层次聚类热图分析；

图2为鸭屎香与其他乌龙茶已鉴定代谢物的层次聚类热图分析；

图3为鸭屎香与其他乌龙茶的PCA得分图；

图4为鸭屎香与其他乌龙茶的OPLS-DA得分图；

图5为鸭屎香与其他乌龙茶的上调和下调代谢物数量统计图；

图6为实施例1与实施例2在不同前处理条件下的总离子图对比图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例1

一种识别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法：

1)样品制备

选取茶叶品种为鸭屎香、大乌叶、黄枝香、蜜兰香、芝兰香、岭头单丛茶及福建的铁观音，其中，除铁观音之外，其他6种均为单丛茶品种；每个品种均采集6个成品拼配茶，所有样品采集均设置3个重复。

将所选茶叶均匀取样100g左右采用研磨仪进行粉碎，过60目筛后于-20℃冰箱中保存待测。称取100mg茶叶粉末样品置于1.5mL离心管中，加入1mL含1％甲酸的甲醇/水(75/25，v/v)溶液；将混合物于20℃条件下超声10min，然后用低温离心机在4℃条件下11000rpm离心10min；取上清液，过0.22μm有机滤膜于2mL进样小瓶中，即得茶叶提取液。分别从各样品溶液中取等量溶液，混匀，置于液相小瓶中作为质量控制(quality control，QC)样品。

2)非靶向代谢组学分析～

用Thermo fisher U 3000超高效液相色谱仪，色谱柱为C18Accucore aQ柱(1502.1mm，2.6μm)，柱温40℃，进样流速为0.3μL/min，进样体积为2μL，流动相为0.1％甲酸水溶液(第一流动相A)和0.1％甲酸乙腈溶液(第二流动相B)，梯度洗脱流程为：0～2min，5％B；2～7min，5～25％B；7～11min，25～70％B；11min，70～95％B；11～12.5min，95％B，12.5～12.6min，95～5％B，最后，采用5％B平衡2.5min，共15min。

质谱条件：Thermo Scientific TM Q Exactive Orbitrap质谱仪，采用电喷雾电离(ESI)源，于正、负模式下分别扫描。各参数设置如下：分辨率70000(FWHM)；喷雾电压3.2KV；鞘气压力40psi；辅助气10arb；毛细管温度320℃；辅助气温度325℃；质谱扫描模式full MS-dd/MS²，full scan的扫描范围100～1000m/z；dd/MS²：分辨率17500，NCE 15、20、30、40、60eV，质量窗口为1.5m/z。

3)特征峰的提取和鉴别

使用Compound Discover 3.1软件对步骤色谱和质谱所得检测数据进行预处理，包括峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理、化合物鉴别；在Compound Discover 3.1数据处理过程中各参数设置如下：峰对齐保留时间偏差为2min；化合物检测质量偏差为5ppm，最大未知元素组成设定为据C90、H190、Br3、Cl4、N10、O40、P3、S5，最小未知元素组成设定为C、H，最小峰强度设置为1000000，信噪比(S/N)阈值设为3；SearchChemspider中选择NatureChemical Biology、Nature Chemistry、PlantCyc、PubMed数库进行一级质谱图的匹配，质量偏差为5ppm。通过Compound Discover 3.1软件的mzVault、mzCloud等数据库中的二级质谱图进行匹配。剔除QC样品峰面积CV>20的特征峰，正负离子模式下分别获得6110和6195个共12305个代谢物特征峰，其中，采用mzVault或mzCloud匹配的二级质谱图得分大于70分为鉴定标准，正离子模式下共鉴定到459个化合物信息，负离子模式下共鉴定到139个化合物，鉴定到的化合物主要为黄酮苷类、儿茶素及其衍生物类、芳香族化合物、氨基酸类、花青素类。

4)相似性分析

将步骤3)中所有代谢物及鉴定到的代谢物的数据矩阵预处理后采用R语言进行层次聚类热图分析，如图1、图2所示，图中左图为正离子模式，右图为负离子模式，Y代表鸭屎香，D代表大乌叶，H代表黄枝香，M代表蜜兰香，Z代表芝兰香，B代表白叶单丛，T代表铁观音。图中每一纵列表示一个乌龙茶样本，每个像素点代表一个化合物。像素点颜色表示代谢物相对含量的高低，颜色由浅到深表示含量由低到高，右边的点表示上调，左边的点表示下调。所有代谢物的层次聚类分析结果均表明，鸭屎香在正负离子模式下均与黄枝香、大乌叶和芝兰香聚为一类；鉴定到的代谢物的层次聚类分析结果显示，鸭屎香在正离子模式下与黄枝香、大乌叶和芝兰香聚为一类，在负离子模式下与黄枝香聚为一类；铁观音与所有单丛茶之间存在明显差异，蜜兰香与白叶单丛茶聚为一类。

5)差异性分析以及筛选差异标志物

将步骤3)得到的12305个代谢物的峰面积等数据由Compound Discover 3.1导出至Excel，分别预处理后将7个不同乌龙茶及QC样本的峰面积矩阵导入SIMCA-14.1软件，进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，了解不同乌龙茶代谢物的总体差异分布。

如图3所示，正负离子模式下QC样本均紧密的聚集在一起，说明实验期间该仪器精密度良好。当R2X越接近1，代表模型的拟合能力越强；Q²＞0.5和Q²＞0.9分别代表模型预测能力较好和极好。正负离子模式下PCA模型的R2X分别为0.951和0.952，Q²分别为0.882和0.900，表明该模型拟合能力较好，预测能力较强。

如图3所示，左图为正离子模式，右图为负离子模式，从PCA得分图可以看出，铁观音与单丛茶可以明显区分开，各自聚为一类，说明铁观音与单丛茶的化学成分差异较为明显；但是不同单丛茶之间区分效果不明显，鸭屎香与其他单丛茶之间的差异较小。

正负离子模式下OPLS-DA模型的R2X分别为0.830和0.904，Q2分别为0.880和0.936，表明预测模型的拟合能力和预测能力良好。如图4所示，左上图为正离子模式，右上图为负离子模式；左下为正离子模式下置换检验图，右下为离子模式下置换检验图，n＝200，从OPLS-DA判别分析图可以看出，正负离子模式下的鸭屎香均与其他乌龙茶有显著差异，尤其是铁观音与单从茶之间的差异明显，其中负离子模式下区分效果更明显。为了进一步验证该模型的可靠性，采用了置换检验对模型进行验证。通过200次随机改变类别变量Y(鸭屎香)的排列顺序，得到累积贡献率R²和预测能力Q²。正离子模型中置换检验的R²和Q²回归线与纵轴的截距分别为0.22和-0.404，负离子模型中置换检验的R²和Q²回归线与纵轴的截距分别为0.315和-0.52(图4)，最右端鉴别模型的原始Q2值大于左边任何一个Y变量随机排列模型的Q²值，说明所构建的OPLS-DA模型没有出现过拟合现象，预测能力较好，模型可靠。置换检验结果显示判别分析模型结果可靠，Q²<0.05，表明预测能力良好。

通过Compound Discover 3.1软件内置的数据统计功能筛选差异代谢物，筛选条件为：∣Log₂ Fold Change∣＞1.5，且adj.p＜0.01。根据上述条件统计鸭屎香与其他茶叶上调和下调的代谢物数量，并用R语言生成火山图5。从图5可以看出，鸭屎香与铁观音之间代谢物含量水平变化较大，且上调化合物数量多于下调化合物，鸭屎香与大乌叶、黄枝香之间代谢物含量水平变化较小，且上调化合物数量均少于下调化合物。

继续以OPLS-DA模型分析获得的代谢物VIP结果，以VIP>1为阈值，鉴别到L-精氨酸、L-络氨酸、山柰酚-3-鼠李糖苷等9个鸭屎香的特征标志物，标志物信息如表1所示，且其丰度均显著高于其他乌龙茶品种，其中L-络氨酸、山柰酚-3-鼠李糖苷在正负离子模式下均为特征标志物。

如表1所示为基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS技术鉴定的9个化合物信息。

表1基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS技术鉴定得到的鸭屎香标志物

综上，L-精氨酸、L-络氨酸、山柰酚-3-鼠李糖苷等9个化合物为鸭屎香的特征标志物，所述的代谢组分分析方法测定茶叶样品中上述9个化合物的峰面积，将结果与鸭屎香样品中化合物的峰面积进行比对，查看∣Log₂ Fold Change∣值是否均大于1.5，可以用于判别其是否为鸭屎香。

实施例2

一种对鸭屎香单丛茶特征成分识别的代谢组学分析方法，其与实施例1的具体步骤相同，区别在于样品量及提取剂的不同，具体为取1g茶叶粉末置于50mL离心管中，加入25mL 100℃的热水。

如图6所示，图中的上图和下图分别为正负离子模式，与实施例1的前处理方法相比，实施例2的样品获得的总离子图的特征峰分离效果较差，部分特征峰的响应低于实施例1，尤其是在负离子模式下效果不如实施例1。

实施例3

一种对鸭屎香单丛茶特征成分识别的代谢组学分析方法，其与实施例1的具体步骤相同，区别在于筛选差异物的源数据是选择所有提取峰还是采用mzVault或mzCloud匹配的二级质谱图得分大于70分的代谢物。

以得分大于70分的代谢物做数据分析：筛选出的6个差异代谢物为鸭屎香的特征标志物，所述标志物的心细如表2所示，通过代谢组分分析方法测定茶叶样品中上述化合物的峰面积。将结果与鸭屎香样品中化合物的峰面积进行比对，查看∣Log₂ Fold Change∣值是否均大于1.5，可以用于判别其是否为鸭屎香。

如表2所述，实施例3会使特征标志物数量减少，且L-精氨酸、L-络氨酸、山柰酚-3-鼠李糖苷等6个化合物全部与实施例1筛选得到的标志相同。

表2基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS技术鉴定的6个化合物信息

本发明实施例中所限定的具体软件仅为优选实施例，在其它实施例中也可以采用本发明实施例所限定之外的其它软件进行分析。

Claims (6)

1.一种代谢组学分析技术在识别鸭屎香单丛茶特征成分的应用，其特征在于，所述代谢组学分析技术是通过相似性与差异性分析与鸭屎香单丛茶性质接近的其它乌龙茶样品的代谢物信息，通过Log₂ Fold Change、adj.p、VIP值识别鸭屎香单丛茶特征成分；

所述识别鸭屎香单丛茶特征成分的筛选条件为∣Log₂ Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.01且VIP>1；

所述鸭屎香的特征标志物为山柰酚-3-槐二糖-6-鼠李糖苷、香豆酮、L-精氨酸、L-络氨酸、丁基苯酞、茉莉酸、γ-苄基L-谷氨酸、二氢咖啡酸以及邻香豆酸9个化合物；

所述鸭屎香及其它与其性质接近的乌龙茶样品的制备包括如下步骤：将样品粉碎研磨得到茶叶粉末，与提取剂混合进行超声处理，离心分离取上清液；

所述提取剂包括甲酸、甲醇和水的混合物，甲酸的质量分数为0.8~1.2%，甲醇和水的体积比为（2~4）：1；

所述提取剂的使用体积为1~1.5 mL/100mg茶叶粉末。

2.一种识别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）样品制备：将鸭屎香及其它与其性质接近的乌龙茶样品，粉碎研磨得到茶叶粉末，与提取剂混合进行超声处理，离心分离取上清液；

所述提取剂包括甲酸、甲醇和水的混合物，甲酸的质量分数为0.8~1.2%，甲醇和水的体积比为（2~4）：1；

所述提取剂的使用体积为1~1.5 mL/100mg茶叶粉末；

2）非靶向代谢组学分析：包括采用高效液相色谱进行组分分离，应用质谱进行分析；

所述高效液相色谱的条件包括，色谱柱温度为35~45℃，进样流速为0.2~0.4 μL/min，进样体积为1.5~2.5 μL；流动相包括第一流动相和第二流动相，第一流动相为质量分数为0.08~0.2%的甲酸水溶液，第二流动相为质量分数为0.08~0.2%的甲酸乙腈溶液；

所述色谱柱包括C18 Accucore柱；

采用所述第一流动相和所述第二流动相配比逐渐变化进行梯度洗脱，在0~2 min，第二流动相的质量分数保持在5%，在2~7 min，第二流动相的质量分数从5%逐渐上升为25%；在7~11 min，第二流动相的质量分数从25%逐渐上升为70%；在11min，第二流动相的质量分数从70%逐渐上升为95%；11~12.5 min，第二流动相的质量分数保持在95%；在12.5~12.6 min，第二流动相的质量分数从95%快速降低为5%；最后，在流动相中第二流动相质量分数为5%平衡3.0~4.0 min；

3）特征峰的提取和鉴别；

4）相似性分析：分析所有代谢物在不同乌龙茶的富集情况及鸭屎香与其它乌龙茶的相似性，将所有代谢物及鉴定到的代谢物的数据矩阵预处理后采用R语言进行层次聚类热图分析，查看不同乌龙茶品种的聚类情况；

5）差异性分析以及筛选差异标志物：将步骤3）得到的所有代谢物的峰面积数据等由Compound Discoverer 3.1导出至Excel，分别预处理后将不同乌龙茶及质量控制样本的峰面积矩阵导入SIMCA 14.1软件，进行主成分分析PCA和正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA，了解不同乌龙茶代谢物的总体差异分布，通过PCA得分图及OPLS-DA分布分析鸭屎香与其他乌龙茶成分的差异性；

所述PCA和OPLS-DA分析是将差异代谢物的数据由Compound Discoverer软件导出至Excel进行数据处理后，将不同茶叶及质量控制样本的峰面积矩阵导入SIMCA-P 14.1软件处理；

步骤5）所述筛选差异标志物是将采集得到的不同乌龙茶样品原始数据进行峰对齐、峰提取、降噪和归一化处理，并通过Log₂ Fold Change、adj.p、VIP值筛选出鸭屎香与其他乌龙茶的差异代谢物；

统计鸭屎香与其他高度相似乌龙茶上调和下调差异代谢物的数量，通过火山图展示代谢物的变化情况；

所述鸭屎香与其他乌龙茶的差异代谢物的筛选条件为∣Log₂ Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.01且VIP>1。

3.由权利要求2所述的识别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤1）所述超声处理为在20~25℃温度下超声10~20min；

所述离心分离为在3~5℃、8000~12000 rpm条件下离心8~10min，以使得提取体系更好地分层，分离得到上清液；

所述上清液经过0.1~0.3 μm的有机滤膜进行过滤。

4.由权利要求2所述的识别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤2）采用所述第一流动相和所述第二流动相配比逐渐变化进行梯度洗脱，在0~2 min，第二流动相的质量分数保持在5%，在2~7 min，第二流动相的质量分数从5%逐渐上升为25%；在7~11 min，第二流动相的质量分数从25%逐渐上升为70%；在11min，第二流动相的质量分数从70%逐渐上升为95%；11~12.5 min，第二流动相的质量分数保持在95%；在12.5~12.6 min，第二流动相的质量分数从95%快速降低为5%；最后，在流动相中第二流动相质量分数为5%平衡3.0~4.0 min；所述质谱条件包括，分辨率为65000~75000 FWHM，喷雾电压2.5~3.5 KV，鞘气压力35~45psi，辅助气8~12arb，毛细管温度为300~350℃，辅助气温度为310~340℃。

5.由权利要求4所述的识别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，其特征在于，所述质谱的扫描模式为full MS-dd/MS²，full MS对应的扫描范围100~1000m/z；dd/MS²对应的分辨率为17000~18000 FWHM，NCE设定为15~60 eV，质量窗口为1.5m/z。

6.由权利要求2所述的识别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤3）所述特征峰的提取和鉴别，使用Compound Discover 3.1软件对色谱和质谱所得检测数据进行预处理，包括峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理、化合物鉴别；

所述Compound Discoverer软件进行数据处理过程中各参数的设置包括：峰对齐保留时间偏差为1.5~2.5min，化合物检测质量偏差为4~6ppm，最大未知元素组成设定为C90、H190、Br3、C14、K2、N10、O40、P3和S5，最小未知元素组成设定为C和H，最小峰强度设置为800000~1200000，信噪比阈值为2.5~3.5，一级质谱图匹配的质量偏差为4.5~5.5ppm；

所述一级质谱图匹配采用的数据库选自Nature Chemical Biology、NatureChemistry、PlantCyc、PubMed、Chembank和Massbank中的至少一种；

对差异代谢物进行鉴别和确证是与二级质谱图进行匹配，并对具有标准品的化合物进行确证；

所述二级质谱图的数据库选自mz vault、mzCloud或Chemspider；所述二级质谱图的数据库选自mz vault或mzCloud 数据库进行匹配的得分大于70分。

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