CN109164194A - 干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒 - Google Patents

干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒 Download PDF

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刘辉宇
张瑞雪
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Abstract

本发明公开了干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒。采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液，在内标品中加入干血斑萃取液，混匀直至完全溶解，真空干燥制成内标品液，将内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液，利用工作液萃取待测滤纸片进行振荡孵育，采用串联质谱法检测样本中溶血磷脂酰胆碱类。本发明的检测方法高通量、高敏感、简单易行，可用于筛查新生儿X连锁肾上腺脑白质营养不良（XALD）症，也可以用于辅助诊断，增加新生儿遗传代谢疾病的筛查种类，给与及时诊断，使患儿得以及时治疗，减少出生缺限儿童的患病率。

Description

干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及生化检测设备技术领域，尤其涉及一种流动进样-串联质谱法筛查滤纸干血片中多种溶血磷脂酰胆碱(Lyso-PC)浓度的定量检测技术及试剂盒。
背景技术
新生儿遗传代谢病的筛查(Neonatal Screening，简称新筛)是对一些危害儿童生命、导致儿童体格及智能发育障碍的先天性、遗传性疾病进行筛查，以便作出早期诊断，在临床症状未表现之前或表现轻微时得以早期治疗，防止机体组织器官发生不可逆的损伤，避免患儿发生严重智力低下、严重疾病甚至死亡。
串联质谱法(TandemMass Spectrometry，MS/MS)是新筛的一个有用的检测工具，能在几分钟内对一个滤纸干血片样本进行几十种代谢产物分析，实现了“一次实验检测多种疾病”的要求，使新筛在内容和质量上都提高到一个新水平。
发明内容
本发明的目的在于提供干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法及其试剂盒。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱；22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱；所述方法包括如下步骤：
(1)制备内标品液：采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液，在内标品中加入干血斑萃取液，混匀直至完全溶解，真空干燥制成内标品液；
(2)制备工作液：将步骤(1)制备的内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液；
(3)利用打孔器将待测滤纸片、质控品滤纸片打孔，放入V截底型96孔板中，之后在各孔中加入步骤(2)制备的工作液；将96孔板密封放入孵育振荡器内孵育；
(4)振荡结束后，取孵育溶液，采用串联质谱法检测样本中溶血磷脂酰胆碱类。
本发明的方法，所述步骤(1)中，内标品成分为d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱。所述萃取液为含有0.05％甲酸的80:20甲醇水溶液。
所述步骤(2)中，将内标品溶液用干血斑萃取液按体积110倍稀释成工作液；稀释后内标品浓度为4μmol/L。
所述步骤(3)中，将96孔板密封放入孵育振荡器内，在温度为45℃±5℃、振荡频率为650-750转/分的条件下，振荡孵育45分钟。
所述质控品包括低水平质控及高水平质控品，低水平质控品为含1μmol/L的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的人全血滤纸干血片；高水平质控品为含5μmol/L的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的人全血滤纸干血片。
所述步骤(4)中，通过多反应监控MRM模式检测，质谱条件见下表：
表1溶血磷脂酰胆碱类检测质谱条件
分析物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 锥孔电压(V) 碰撞能量(eV)
20:0溶血磷脂酰胆碱 552 104 50 30
22:0溶血磷脂酰胆碱 580 104 50 30
24:0溶血磷脂酰胆碱 608 104 50 30
26:0溶血磷脂酰胆碱 636 104 50 30
本发明还提供了一种检测干血片中溶血磷脂酰胆碱类的试剂盒，所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱；22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱；
所述试剂盒包括：
(1)萃取液：含有0.05％甲酸的80:20甲醇水溶液；
(2)内标品：d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱；
(3)质控品，所述质控品为含有已知浓度的20:0溶血磷脂酰胆碱；22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的滤纸干血片，包括高水平质控品和低水平质控品。
进一步的，所述高水平质控品浓度为5μmol/L，低水平质控品浓度为1μmol/L。
所述试剂盒还可包括V截底型96孔板、V型96孔板、微孔板粘贴膜、铝箔制微孔板封套、质量分析报告和产品说明书。
本发明的检测原理是在已知浓度的相应内标品存在下，新生儿滤纸干血片中的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱被样本前处理试剂萃取，萃取样本经过处理后，经由进样器和微型泵进入到质谱仪的离子源，形成带电均匀喷雾，离子被导入质谱第一级质量过滤器中，按质荷比大小而被分离后进入碰撞室，被碰撞激活解离，较小的子代离子随后被导入第二级的质量过滤器，在此按质荷比进行分离，而后送到检测器内通过选择性反应监控(SRM)等模式得到离子信号。每种分析物的信号强度与相应内标品的响应程度成正比例，从而计算出滤纸干血片中的分析物浓度。数据采集与分析处理由质谱仪系统内的软件自动执行。
本发明采用串联质谱(MS/MS)技术，来实现对滤纸干血片中20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的定量检测，检测结果可以辅助临床医生诊断患者是否有溶血磷脂酰胆碱代谢相关的疾病，用于筛查新生儿X连锁肾上腺脑白质营养不良(XALD)症，也可以用于辅助诊断，提高新生儿筛查的疾病种类，及时诊断新生儿遗传代谢病，使患儿得以及时治疗，减少出生缺乏儿童的发生率。
本发明的串联质谱法筛查滤纸干血片中20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱浓度的定量检测技术及试剂盒，可以使准确地检测各类型滤纸干血片中的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱浓度，其结果能够有效筛查和诊断新生儿和儿童多种多样遗传代谢病。
附图说明
图1为本发明实施例的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱内标品质谱检测图；上图为4种溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱同位素内标品的多反应监测质谱图，下图为4种溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱同位素内标的总离子流图。
图2为本发明实施例的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱及其26:0溶血磷脂酰胆碱内标品质谱检测离子流图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过具体实施例并参见附图，对本发明进行详细说明。
实施例中，滤纸干血片样本的采集方法参考《新生儿疾病筛查技术规范》中《新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范》。合格滤纸干血片标准如下：
(1)每一样本至少3个血斑，且每个血斑直径均大于8毫米。
(2)血滴自然渗透，滤纸正反面血斑一致。
(3)血斑无污染。
(4)血斑无渗血环。
(5)有完整的干血斑片采集信息记录。
实施例使用仪器：
超高效液相色谱-串联质谱仪(Waters ACQUITY UPLC I-Class IVD/Waters XevoTQ-D IVD System，USA)；
微孔板振荡器(货号2000A011，质谱生物科技有限公司产品)；
V截底型96孔板(货号2000F01，质谱生物科技有限公司)；
V底型96孔板(货号2001F01，质谱生物科技有限公司)；
1/8英寸(3.2mm)打孔器(货号2001A011，质谱生物科技有限公司产品)；
本发明试剂盒主要组成包括：
(1)萃取液：含有0.05％甲酸的80:20甲醇水溶液；
(2)内标品：d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱；试剂盒中每瓶内标品种类及大约含量见下表2。
表2内标品的浓度值
内标物 110倍稀释后浓度
d<sub>4</sub>-20:0溶血磷脂胆碱内标品干粉 4μmol/L
<sup>13</sup>C<sub>6</sub>-22:0溶血磷脂胆碱内标品干粉 4μmol/L
<sup>13</sup>C<sub>6</sub>-24:0溶血磷脂胆碱内标品干粉 4μmol/L
<sup>13</sup>C<sub>6</sub>-26:0溶血磷脂胆碱内标品干粉 4μmol/L
(3)质控品，所述质控品为含有已知浓度的20:0溶血磷脂酰胆碱；22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的滤纸干血片，包括高水平质控品和低水平质控品。
质控品中含有的分析物见表3。
表3质控品中含有的分析物
试剂盒组分各个包装在打开之前，应恢复到室温，以防止产生冷凝水。
1.准备内标品
采用萃取液萃取干血斑获得非衍生化干血斑萃取液，取1.0mL非衍生化干血斑萃取液(含有0.05％甲酸的80:20甲醇水溶液)，加入到内标品小瓶中进行复溶，将液体混匀，直到完全溶解，大约需要2个小时，必要时冰浴下超声促溶。2℃～8℃条件下储存在密封的原装小瓶中，此溶液配制后可稳定保存30天。
2.准备日常工作溶液
将步骤1的内标品溶液用非衍生化干血斑萃取液按体积比1:110的比例稀释成日常工作溶液。该溶液在24小时内稳定，随用随配。
3.打孔
取一块新的V截底型96孔板，使用自动或手动打孔器将质控品和待测滤纸干血片样本打孔，直径约为3.2mm(1/8英寸)，依次放入到洁净的V截底型96孔板中。
4.向以上各孔加入步骤2中预先配制好的日常工作溶液100μL。
5.用微孔板粘贴膜覆盖整块V截底型96孔板(质谱生物科技有限公司产品)，确保密封，将挥发量降至最低。
6.立即将严密封盖V截底型96孔板置于微孔板振荡器内，在温度为45℃(±5℃)、振荡频率为650-750转/分的条件下，振荡孵育45分钟。
7.振荡结束后，取出V截底型96孔板，小心揭去板上覆盖的微孔板粘贴膜，从每个孔位中吸取75ul转移至对应孔位的V型96孔板中。
8.使用铝箔制微孔板封套紧密覆盖V型96孔板，将溶液挥发量降至最低。
9.将带有铝箔制微孔板封套紧密覆盖的V型96孔板放入质谱仪自动进样器中。质谱条件如表1所示。
启用MS/MS应用软件，建立工作列表，选择正确的数据采集方法，参考阅读产品质量分析报告，输入正确的各内标品浓度，启动检测。
质量控制
使用自动或手动打孔器将质控品滤纸干血片样本打孔，直径约为3.2mm(1/8英寸)，依次放入到洁净的V截底型96孔板中。第1、2孔放入空白滤纸片、第3、4孔放入低质控品、第5、6孔放入高质控品(建议每48孔按此排列6孔)。
质控品和样本在同样状态下运行，质控品检测结果的均值应在质控品质量分析报告允许范围内。
若质控品的检测结果不在允许范围内，要检查质谱仪及相应的操作，检查质谱仪是否进行定期校准，是否需要维护。
表4溶血磷脂酰胆碱类的参考值范围
分析物 参考值范围(μg/mL)
20:0溶血磷脂酰胆碱 0.14(0.06–0.35)
22:0溶血磷脂酰胆碱 0.09(0.06–0.13)
24:0溶血磷脂酰胆碱 0.19(0.14–0.26)
26:0溶血磷脂酰胆碱 0.18(0.12–0.23)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，其特征在于，所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱；22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱；所述方法包括如下步骤：
(1)制备内标品液：采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液，在内标品中加入干血斑萃取液，混匀直至完全溶解，真空干燥制成内标品液；
(2)制备工作液：将步骤(1)制备的内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液；
(3)利用打孔器将待测滤纸片、质控品滤纸片打孔，放入V截底型96孔板中，之后在各孔中加入步骤(2)制备的工作液；将96孔板密封放入孵育振荡器内孵育；
(4)振荡结束后，取孵育溶液，采用串联质谱法检测样本中溶血磷脂酰胆碱类。
2.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，内标品成分为d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱。
3.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，萃取液为含有0.05％甲酸的80:20甲醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将内标品溶液用干血斑萃取液按体积110倍稀释成工作液；稀释后内标品浓度为4μmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将96孔板密封放入孵育振荡器内，在温度为45℃±5℃、振荡频率为650-750转/分的条件下，振荡孵育45分钟。
6.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，质控品包括低水平质控及高水平质控品，低水平质控品为含1μmol/L的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的人全血滤纸干血片；高水平质控品为含5μmol/L的20:0溶血磷脂酰胆碱、22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的人全血滤纸干血片。
7.根据权利要求1所述的一种干血片中溶血磷脂酰胆碱类的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，通过多反应监控MRM模式检测，质谱条件见下表1：
表1溶血磷脂酰胆碱类检测质谱条件
8.一种检测干血片中溶血磷脂酰胆碱类的试剂盒，其特征在于，所述溶血磷脂酰胆碱类为20:0溶血磷脂酰胆碱；22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱；
所述试剂盒包括：
(1)萃取液：含有0.05％甲酸的80:20甲醇水溶液；
(2)内标品：d4-20:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-22:0溶血磷脂酰胆碱、13C6-24:0溶血磷脂酰胆碱和13C6-26:0溶血磷脂酰胆碱；
(3)质控品，所述质控品为含有已知浓度的20:0溶血磷脂酰胆碱；22:0溶血磷脂酰胆碱、24:0溶血磷脂酰胆碱和26:0溶血磷脂酰胆碱的滤纸干血片，包括高水平质控品和低水平质控品。
9.根据权利要求8所述的一种检测干血片中溶血磷脂酰胆碱类的试剂盒，其特征在于，所述高水平质控品浓度为5μmol/L，低水平质控品浓度为1μmol/L。
10.根据权利要求8所述的一种检测干血片中溶血磷脂酰胆碱类的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括V截底型96孔板、V型96孔板、微孔板粘贴膜、铝箔制微孔板封套、质量分析报告和产品说明书。
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