CN111435132A - 溶血磷脂酰胆碱检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种溶血磷脂酰胆碱检测试剂盒和检测方法，通过液相色谱‑串联质谱法特异性测量干血斑中C20，C22，C24和C26的溶血磷脂酰胆碱。检测试剂盒能保护和快速萃取所需物质，减少杂质干扰。检测方法操作简单、快速，高通量，建立了一种高特异性、准确度、灵敏度的定量定性方法。
Description
技术领域
本发明属于医学检测领域，特别涉及溶血磷脂酰胆碱快速检测试剂盒和检测方法。
技术背景
过氧化物酶体是存在于除成熟红细胞外的所有人细胞中的细胞器。它们具有必需的代谢功能，包括极长链脂肪酸(VLCFA)的β-氧化，植烷酸的α-氧化，以及缩醛磷脂和胆汁酸的生物合成。过氧化物酶体病症包括2个主要亚组：过氧化物酶体生物发生障碍和单过氧化物酶体酶转运蛋白缺陷。过氧化物酶体生物发生缺陷如Zellweger谱综合征的特征在于整个细胞器的组装缺陷，而在单个酶转运蛋白缺陷例如X-连锁的肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)中，其细胞器完整但特定功能被破坏。这些疾病在临床上是多种多样且严重程度不同，从新生儿致死到后期发病的轻度变异。
X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)是一种影响神经系统，肾上腺皮质和睾丸的疾病。它是最常见的过氧化物酶体病，在21,000名男性中影响17,000比1中的1例。所有X-ALD杂合子女性中至少有50％是有症状的。ABCD1基因的缺陷是导致该疾病的原因。X-ALD显示广泛的表型表达。在男性中发生的临床表型可以细分为4个主要类别：脑炎症，肾上腺髓质病(AMN)，仅Addison和无症状。前2种表型占近80％的患者，而无症状类别的频率随着年龄的增长而减少，并且在40岁后非常罕见。估计大约50％的杂合子发展为AMN样综合征。治疗选择是激素替代疗法，饮食干预或造血干细胞移植。
C24溶血磷脂酰胆碱(LPC)和C26(LPC)的升高可帮助鉴别诊断X-ALD。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供通过液相色谱-串联质谱法特异性测量干血斑中C20，C22，C24和C26的溶血磷脂酰胆碱(LPC)。使用试剂盒萃取液从血片中快速萃取所需要的物质，配合滤板和衍生化试剂提高检测物的纯净度、特异性和灵敏度，最后根据优化的色谱和质谱条件进行检测。
7)标准品制备：使用水/甲醇/乙腈混合液稀释以下标准品：C18:0、C20:0、C22:0、C24:0。
8)标准血片制备：取正常山羊或牛全血细胞，离心分钟，去除血浆，加入PBS，使用混匀仪混匀后静置，重复该步骤清洗血细胞。加入最终将清洗好的血细胞使用同等体积PBS、加入合适的标准品混合液及BHT试剂后混匀。滴入滤纸片作为标准品。
9)内标液配置：使用甲醇/异丙醇/乙腈稀释内标并按照设计浓度配置。C18:0-d3、C20:0-d3、C22:0-d3、C24:0-d3。(其中d3代表氘代内标，也就是放射性氘换常规的氢)
10)将目标血片及标准血片使用打孔器打入96孔反应滤板，加入萃取液(甲醇/异丙醇/乙腈/内标混合液)，静置后离心，加热氮气吹干。
11)衍生化：加入盐酸-正丁醇混合液,封闭加热，加热的氮气吹干，使用乙腈复溶。
12)质谱仪检测
有益效果：本发明的样本为血斑，并使用LC-MSMS技术，能够对血斑快速检测、同时分析4种溶血磷脂酰胆碱(LPC)浓度，方法操作简单、快速，高通量，建立了一种高特异性、准确度、灵敏度的定量定性方法。可以帮助诊断X-ALD疾病，适用于临床新生儿筛查检测。本发明的萃取液采用混合试剂，能够保护和快速萃取所需物质，减少杂质干扰。快速检测，质谱检测时间不超过3分钟；整个时间在2小时内；使用质谱检测4个检测物质定性准确，定量符合临床要求。使用本发明所述的质控血片，能够定量检测。
具体实施方式
实施例1
本实施例通过液相色谱-串联质谱法特异性测量样品干血斑中C20，C22，C24和C26的溶血磷脂酰胆碱(LPC)。具体检测步骤如下：
1)标准品制备：使用水/甲醇/乙腈混合液稀释以下标准品：C18:0、C20:0、C22:0、C24:0。(C18:0代表的是硬脂酸，有18个碳，不饱和度为0)具体的，水10％；甲醇60％；乙腈30％。
2)标准血片制备：取正常山羊或牛全血细胞，5000rpm离心10分钟，去除血浆，加入2倍体积的PBS，使用混匀仪混匀后静置5分钟，重复该步骤清洗血细胞2次。加入最终将清洗好的血细胞使用同等体积PBS、加入合适的标准品混合液及BHT试剂后混匀。取50ul滴入滤纸片作为标准品。
3)内标液配置：使用甲醇/异丙醇/乙腈4v:3v:3v稀释内标并按照设计浓度配置(2umol)，C18:0-d3、C20:0-d3、C22:0-d3、C24:0-d3。(其中d3代表氘代内标，也就是放射性氘换常规的氢)
4)将目标血片及标准血片使用3mm打孔器打入96孔反应滤板，加入100ul萃取液(甲醇/异丙醇/乙腈/内标混合液3v：3v：3v:1v)，静置20分钟后3000rpm离心，45℃加热氮气吹干。
5)衍生化：加入盐酸-正丁醇(1：9)混合液,60℃封闭加热30分钟后，45℃加热氮气吹干，使用80％乙腈100ul复溶。
6)安排质谱仪检测，质谱参数如下：
使用质谱电喷雾离子源(ESI)，电压3500-5500V；温度350-760℃；GAS1(气体1)：40-70psl；GAS2(气体2):40-80psl；扫描方式：质谱多反映检测(MRM)及中性丢失(Neutralloss scan)；色谱流动相：70％乙腈+0.1％乙酸铵(可以成为调节液)；液相流速50ul-500ul梯度进样；进样量20ul，得质谱图。
实施例2对检测本底信号的对比实验
按实施例1的方法，使用普通处理液萃取(甲醇)(对照1)与混合处理(甲醇/异丙醇/乙腈/内标混合液3v：3v：3v:1v)处理(本发明)。对样本1至5进行萃取并测定，测试结果见表1。采用本发明所述的萃取液试剂，能够保护和快速萃取所需物质，减少杂质干扰。
表1
| 甲醇处理本底信号 | 混合试剂的本底信号 | |
| 样本1 | 3120 | 257 |
| 样本2 | 5010 | 301 |
| 样本3 | 6190 | 660 |
| 样本4 | 980 | 310 |
| 样本5 | 1770 | 270 |
实施例3临床样本的定量测定
按实施例1的方法，对标准品和样本1至6进行LC-MSMS定量测定。测定结果见表2。从表中可以证明本发明所述方法能对样本进行定量测定。内标参考能够定性。
表2
Claims (8)
1.溶血磷脂酰胆碱的检测试剂盒，包括萃取液，其特征在于，所述萃取液包括甲醇/异丙醇/乙腈/内标混合液。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括标准品，所述标准品包括用水/甲醇/乙腈混合液稀释以下标准品：C18:0、C20:0、C22:0、C24:0。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括内标液。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，甲醇/异丙醇/乙腈/内标混合液的比例为3v：3v：3v:1v。
5.一种溶血磷脂酰胆碱的检测方法，包括以下步骤：
1)标准品制备：使用水/甲醇/乙腈混合液稀释以下标准品：C18:0、C20:0、C22:0、C24:0；
2)标准血片制备：取正常山羊或牛全血细胞，离心分钟，去除血浆，加入PBS，使用混匀仪混匀后静置，重复该步骤清洗血细胞，加入最终将清洗好的血细胞使用同等体积PBS、加入合适的标准品混合液及BHT试剂后混匀，滴入滤纸片作为标准品；
3)内标液配置：使用甲醇/异丙醇/乙腈稀释内标并按照设计浓度配置，C18:0-d3、C20:0-d3、C22:0-d3、C24:0-d3；
4)将目标血片及标准血片使用打孔器打入反应滤板，加入萃取液，静置后离心，加热氮气吹干；
5)衍生化：加入盐酸-正丁醇混合液,封闭加热，加热的氮气吹干，使用乙腈复溶；
6)质谱仪检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述萃取液包括甲醇/异丙醇/乙腈/内标混合液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述衍生化包括加入盐酸-正丁醇(1：9)混合液,60℃封闭加热30分钟后，45℃加热氮气吹干，使用80％乙腈100ul复溶。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述质谱参数包括质谱电喷雾离子源，电压3500-5500V；温度350-760℃；GAS1：40-70psl；GAS2:40-80psl；扫描方式：质谱多反映检测(MRM)及中性丢失；色谱流动相：70％乙腈+0.1％乙酸铵；液相流速50ul-500ul梯度进样；进样量20ul。
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