CN116419993A - Dna末端修复、连接接头试剂、试剂盒及dna文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种DNA末端修复试剂,包括:DNA末端修复组合酶;以及SSB。
Description
本公开涉及生物技术领域,尤其涉及一种DNA末端修复、连接接头试剂、试剂盒及DNA文库构建方法。
DNA文库是包含了某生物基因组中所有可表达的基因片段的集合体。以高通量测序(High throughput sequencing,HTS)平台为例,现有的常规建库流程为:片段化处理基因组DNA,对所形成的DNA片段进行末端修复并加A(腺嘌呤),对加A后的DNA片段连接测序接头,最后对接头连接产物进行富集纯化,即可完成文库构建。
发明内容
一方面,提供一种DNA末端修复试剂,包括:DNA末端修复组合酶;以及SSB。
在一些实施例中,所述SSB为T4噬菌体32编码蛋白。
在一些实施例中,所述SSB的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
在一些实施例中,所述SSB在所述DNA末端修复试剂中的浓度为0.5μg/μL~2μg/μL。
在一些实施例中,所述DNA末端修复组合酶包括:具有5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性的酶I。
在一些实施例中,所述酶I包括Klenow片段;或者,所述酶I包括Klenow片段的突变体。
在一些实施例中,所述Klenow片段的突变体的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
在一些实施例中,在所述DNA末端修复组合酶中的酶I包括Klenow片段的情况下,所述Klenow片段在所述DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.15U/μL;在所述DNA末端修复组合酶中的酶I包括Klenow片段的突变体的情况下,所述Klenow片段的突变体在所述DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.15U/μL。
在一些实施例中,还包括:PEG,所述PEG选自PEG-4000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或多种。
在一些实施例中,所述PEG在所述DNA末端修复试剂中的质量百分比为8%~25%。
另一方面,提供一种DNA末端修复试剂盒,包括:如上所述的DNA末端修复试剂。
另一方面,提供一种DNA接头连接试剂,包括:PEG,所述PEG选自PEG-4000。
在一些实施例中,所述PEG在所述的DNA接头连接试剂的质量百分比为8%~25%。
另一方面,提供一种DNA接头连接试剂盒,包括:如上所述的DNA接头连接试剂。
另一方面,提供一种DNA建库试剂盒,包括:如上所述的DNA末端修复试剂盒,以及如上所述的DNA接头连接试剂盒。
又一方面,提供一种DNA文库构建方法,包括:
对基因组DNA进行片段化,得到第一DNA片段。
采用如上所述的DNA末端修复试剂对所述第一DNA片段进行处理,得到第二DNA片段,所述第二DNA片段为末端齐平且5'端磷酸化,3'端加A的DNA片段,其中,处理条件为:先在15℃~25℃处理10min~20min,再在60℃~70℃处理10min~20min。
对所述第二DNA片段连接测序接头,得到接头连接产物。
对接头连接产物进行纯化,并对纯化后的产物进行富集。
在一些实施例中,对第二DNA片段连接测序接头,包括:
采用如上所述的DNA接头连接试剂对第二DNA片段进行处理,以对所述第二DNA片段连接测序接头。
为了更清楚地说明本公开中的技术方案,下面将对本公开一些实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例的附图,对于本领域普通技术人员来讲,还可以根据这些附图获得其他的附图。此外,以下描述中的附图可以视作示意图,并非对本公开实施例所涉及的产品的实际尺寸、方法的实际流程、信号的实际时序等的限制。
图1A为根据一些实施例的一种DNA发生5'-3'合成反应的流程图;
图1B为根据一些实施例的一种DNA发生3'-5'外切反应的流程图;
图2为根据一些实施例的一种DNA文库的构建方法的流程图;
图3为根据一些实施例的一种Y型接头的结构图。
下面将结合附图,对本公开一些实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本公开所提供的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本公开保护的范围。
除非上下文另有要求,否则,在整个说明书和权利要求书中,术语“包括(comprise)”及其其他形式例如第三人称单数形式“包括(comprises)”和现在分词形式“包括(comprising)”被解释为开放、包含的意思,即为“包含,但不限于”。在说明书的描述中,术语“一个实施例(one embodiment)”、“一些实施例(some embodiments)”、“示例性实施例(exemplary embodiments)”、“示例(example)”、“特定示例(specific example)”或“一些示例(some examples)”等旨在表明与该实施例或示例相关的特定特征、结构、材料或特性包括在本公开的至少一个实施例或示例中。上述术语的示意性表示不一定是指同一实施例或示例。此外,所述的特定特征、结构、材料或特点可以以任何适当方式包括在任何一个或多个实施例或示例中。
以下,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本公开实施例的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
“A、B和C中的至少一个”与“A、B或C中的至少一个”具有相同含义,均包括以下A、B和C的组合:仅A,仅B,仅C,A和B的组合,A和C的组合,B和C的组合,及A、B和C的组合。
“A和/或B”,包括以下三种组合:仅A,仅B,及A和B的组合。
本文中“适用于”或“被配置为”的使用意味着开放和包容性的语言,其不排除适用于或被配置为执行额外任务或步骤的设备。
本公开的一些实施例提供了一种DNA建库试剂盒,包括:DNA末端修复试剂盒、DNA接头连接试剂盒、DNA扩增试剂盒等。
其中,DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸,即:腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)。
试剂盒,是用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。当然,本领域技术人员能够理解的是,为了盛放化学试剂,该盒子也可以是管子等其他容器。
本公开的一些实施例提供一种DNA末端修复试剂盒,包括DNA末端修 复试剂。DNA末端修复试剂可以包括:DNA末端修复组合酶,以及dNTP、dATP、PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)和缓冲液等。
其中,DNA末端修复组合酶用于与具有黏性末端的DNA片段(DNA片段的5'端突出或3'端突出)进行结合,以催化DNA片段发生5'-3'的合成反应,以及3'-5'的外切反应,从而将5'端突出末端补平和/或3'端突出末端削平,以形成完整的双链DNA,便于3'端加A(腺嘌呤)以及后续的接头连接反应。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,它们之间正好互补配对,这样的切口叫黏性末端。也就是说,限制性内切酶在DNA双链的不同位置切割DNA,产生的双链DNA的末端不是齐平的,而是一根链长出一点。
dNTP,是Deoxy-riboNucleoside TriphosPhate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写。是包括dATP(Deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸,3'-脱氧腺苷,又称去氧腺苷三磷酸)、dGTP(2'-deoxyaguanosine-5'-triphosphate trisodium salt,脱氧鸟苷三磷酸三钠、dTTP(脱氧胸苷三磷酸)和dCTP(Deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸)等在内的统称,N是指含氮碱基,代表变量指代A、T、G、C等中的一种。dNTP是用于合成DNA的原料,在此,是用于末端修复的原料。dATP(Deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸,3'-脱氧腺苷,又称去氧腺苷三磷酸)作为末端加A的原料。
PEG的作用是占据水分子,提高DNA片段与DNA末端修复组合酶的接触几率,从而加快酶促反应的进行,提高修复速率。
缓冲液用于对整个DNA末端修复反应体系的PH值进行调节,例如,缓冲液可以保持整个DNA末端修复反应体系的PH值为7.0~8.5之间。
在一些实施例中,DNA末端修复组合酶包括:具有5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性的酶I,在dNTP存在下能够使DNA的3'端加A的酶II,以及能够使DNA的5'端磷酸化的酶III等。
在一些实施例中,酶I可以包括T4DNA聚合酶以及Klenow片段。
其中,T4DNA聚合酶同时具有5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性,T4DNA聚合酶所具有的5'-3'DNA聚合酶活性,能够催化DNA发生5'-3'合成反应,将5'端突出末端补平,T4DNA聚合酶所具有的3'-5'DNA外切酶活性,能够催化DNA发生3'-5'外切反应,将3'端突出末端削平。如图1A所示,示出了DNA发生5'-3'合成反应,将5'端突出末端补平的示例,如图1B所示,示出了DNA发生3'-5'外切反应,将3'端突出末端削平的示例,从Klenow片段(克列诺片段,Klenow fragment,或称克列诺酶,Klenow enzyme), 为E.coli DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的具有C末端、605个氨基酸残基的片段。Klenow片段保留了DNA聚合酶I的5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性,其5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性的作用机理和上述T4DNA聚合酶所具有5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性的作用机理相同。
在一些实施例中,Klenow片段的分子量为76kDa。
在一些实施例中,Klenow片段的氨基酸序列如序列表中序列3所示。该序列3如下:
在另一些实施例中,酶I可以包括T4DNA聚合酶以及Klenow片段的突变体。
其中,Klenow片段的突变体是Klenow片段通过截短改造得到的,是通过大肠杆菌表达的重组酶,在经过点突变重组后,此酶的5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性均有所提高。
示例的,Klenow片段的突变体是使Klenow片段中第442个苯丙氨酸突变成酪氨酸得到。Klenow片段的突变体的分子量为68.2kDa。
在一些实施例中,Klenow片段的突变体的氨基酸序列如序列表中序列2所示,该序列2如下:
在一些实施例中,酶II可以包括Taq DNA聚合酶,酶III可以包括T4PNK(T4多聚核苷酸激酶,T4PolyNucleotide Kinase)。
在一些实施例中,T4DNA聚合酶在DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.1U/μL,例如可以为0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL或0.1U/μL,T4PNK在DNA末端修复试剂中的浓度为0.05U/μL~0.15U/μL,例如可以为0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL、0.1U/μL、0.11U/μL、0.12U/μL、0.13U/μL、0.14U/μL或0.15U/μL,Taq DNA聚合酶在DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.15U/μL,例如可以为0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL、0.1U/μL、0.11U/μL、0.12U/μL、0.13U/μL、0.14U/μL或0.15U/μL。
其中,酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位(U)(active unit)表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(IU)来表示酶的活力,规定为:在最适条件(25℃)下,每分钟内催化1微摩尔(μmol)底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位,即1IU=1μmol/min。也即,酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示(U/g或U/ml),其中,U是IU的简写。
在一些实施例中,在酶I包括Klenow片段的情况下,Klenow片段在DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.15U/μL。例如可以为0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL、0.1U/μL、0.11U/μL、0.12U/μL、0.13U/μL、0.14U/μL或0.15U/μL。
在一些实施例中,在酶I包括Klenow片段的突变体的情况下,Klenow片段的突变体在DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.15U/μL。例如可以为0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL、0.1U/μL、0.11U/μL、0.12U/μL、0.13U/μL、0.14U/μL或0.15U/μL。
在一些实施例中,PEG选自PEG-4000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或多种。
PEG-4000是指分子量为4000的PEG,PEG-6000是指分子量为6000的PEG,PEG-8000是指分子量为8000的PEG。
通过对PEG的分子量进行选择,可以更有效地使目的DNA片段(如需要测序的DNA片段)与DNA末端修复组合酶进行接触,而使另一部分DNA片段(如这部分DNA片段的分子量大于或小于上述的目的DNA片段)与DNA末端修复组合酶远离,从而可以提高酶促效果,进而提高后续文库转化效率。
在一些实施例中,PEG选自PEG-4000。也即,通过实验发现,在选择PEG的分子量为4000的情况下,能够最大程度上提高酶促效果。
在一些实施例中,PEG在DNA末端修复试剂中的质量百分比为8%~25%。例如可以为8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或25%。
在一些实施例中,该DNA末端修复试剂还包括:SSB。
SSB(单链结合蛋白,single strand DNA-binding protein):又称DNA结合蛋白,是DNA复制所必须的。DNA解旋后,DNA分子只要碱基配对,就有结合成双链的趋向。SSB结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区,能够防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质。并且,在SSB结合到单链DNA上后,使其呈伸展状态,没有弯曲和结节,有利于单链DNA作为模板。
在这些实施例中,通过在DNA末端修复试剂中添加SSB,利用SSB与单链DNA结合的特性,在上述末端修复加A过程中,SSB可以结合到黏性末端上,一方面,能够使DNA片段(也即第一DNA片段10)的黏性末端呈伸展状态,没有弯曲和结节,从而可以防止形成DNA超二级结构(如发夹结构),这样,便于DNA末端修复组合酶如酶I与DNA片段的黏性末端结合,促使酶促反应的进行,并在新生的DNA链合到黏性末端被SSB结合的位置时,SSB就会脱落,从而有利于DNA片段的黏性末端的修复,提高修复效率,防止大量DNA片段无法形成完整的双链DNA而造成损失,从而可以提高文库产量,并提高文库转化效率。另一方面,在上述整个酶促反应过程中,在初始阶段,使SSB与DNA片段的黏性末端进行结合,可以对DNA片段的黏性末端进行保护,防止发生酶解反应,可以保持DNA片段的完整性,从而可以防止文库构建过程中需要测序的DNA片段发生缺失等不良,所构建的文库可以满足高通量测序和后端靶向测序的使用要求。
以DNA片段的单侧黏性末端的碱基数目为10~20个为例,单链结合蛋白可以特异性地结合部分碱基(如8~16个碱基),即可起到对DNA片段的黏 性末端进行保护,并使DNA片段的黏性末端处于伸展状态的作用。
在一些实施例中,SSB可以是T4噬菌体32编码蛋白。T4噬菌体32编码蛋白以四聚体形式存在,分子量为33KDa,它可以协调性地结合并稳定瞬时形成的DNA单链区域,起到使DNA片段的黏性末端处于伸展状态的作用。同时,研究表明,T4噬菌体32编码蛋白还能够增强T4DNA聚合酶的活性,可以加快DNA末端修复。
在一些实施例中,SSB的氨基酸序列如序列表中序列1所示,该序列1如下:
在一些实施例中,上述DNA片段的片段大小可以为150bp~200bp。DNA片段的大小单位是碱基对,常用的有bp(碱基对),Kbp(千碱基对)和Mbp(兆碱基对)。这里示出了DNA片段的大小单位是bp(碱基对)的情形,是指上述所获得的DNA片段(包括黏性末端)所包含的碱基对的数目为150个~200个。
在一些实施例中,SSB在DNA末端修复试剂中的浓度为0.5μg/μL~2μg/μL。例如可以为0.5μg/μL、0.6μg/μL、0.7μg/μL、0.8μg/μL、0.9μg/μL、1μg/μL、1.1μg/μL、1.2μg/μL、1.3μg/μL、1.4μg/μL、1.5μg/μL、1.6μg/μL、1.7μg/μL、1.8μg/μL、1.9μg/μL或2.0μg/μL。
通过将SSB在DNA末端修复试剂中的浓度限定在上述范围内,在使用时,通过配置DNA末端修复反应体系,如将DNA末端修复试剂稀释一定的倍数,即可直接使用,并且,通过实验证明,通过将SSB在DNA末端修复试剂中的浓度限定在上述范围内,在使用时,可以起到较为明显的提高文库产量和文库转化效率的效果。
其中,需要说明的是,上述所提及的dNTP、dATP、PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)、缓冲液,以及T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow片段的突变体和SSB均可以通过商业途径获得。
还需要说明的是,上述仅示出了酶I包括T4DNA聚合酶以及Klenow片段,以及酶I包括T4DNA聚合酶以及Klenow片段的突变体的示例,本领域 技术人员能够理解的是,酶I也可以仅包括T4DNA聚合酶、Klenow片段和Klenow片段的突变体中的任一种,或者,在另一些实施例中,酶I可以包括Klenow片段和Klenow片段的突变体。
本公开的一些实施例提供一种DNA接头连接试剂盒,DNA接头连接试剂盒包括DNA接头连接试剂。
在一些实施例中,DNA接头连接试剂包括:DNA连接酶、测序接头、缓冲液和PEG等。
其中,DNA连接酶的作用是促使测序接头和进行末端修复后的DNA片段连接。测序接头示例的可以为Y型接头。缓冲液为接头连接反应提供稳定的pH环境。PEG与上述DNA末端修复试剂所包含的PEG的作用相同,同样可以提高目的DNA片段与DNA连接酶的接触几率,提高接头连接产率。
在一些实施例中,PEG选自PEG-4000。PEG-4000是指分子量为4000的PEG。
与相关技术中PEG选自PEG-8000相比,可以有效地使目的DNA片段(如想要测序的DNA片段)与DNA连接酶进行接触,而使另一部分DNA片段(如这部分DNA片段的分子量大于或小于上述的目的DNA片段)与DNA连接酶远离,从而可以提高接头连接产率。
在一些实施例中,PEG在DNA接头连接试剂中的浓度为8%~25%。例如可以为8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或25%。
在一些实施例中,DNA连接酶在DNA接头连接试剂中的浓度为0.3U/μL~3U/μL,缓冲液使DNA接头连接反应体系的pH值保持在7.0~8.5。
本公开的一些实施例提供一种DNA的建库方法,如图2所示,包括:
S11、对基因组DNA100进行片段化,得到第一DNA片段10。
其中,基因组DNA100可以为动物、植物、病毒等任一种的基因组DNA。
对基因组DNA100进行片段化,可以包括:
通过机械方式或酶解方式对基因组DNA100进行片段化处理。
其中,在通过机械方式对基因组DNA100进行片段化处理时,可以采用超声破碎仪对基因组DNA100进行超声破碎处理。在通过酶解方式对基因组DNA进行片段化处理时,可以采用非特异性核酸酶对基因组DNA100进行随机打断。
其中,上述基因组DNA100可以通过DNA提取方式获得,也可以通过商业途径获得,在此不做具体限定。
在一些实施例中,第一DNA片段10的片段大小可以为150bp~200bp。
这里,需要说明的是,通过机械方式和酶解方式打断后的DNA的两端大多都会带有5'-或3'-突出的黏性末端。被打断后的DNA两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,它们之间正好互补配对,这样的切口叫黏性末端。也就是说,通过机械方式和酶解方式使得在DNA双链的不同位置切割DNA,产生的双链DNA的末端不是齐平的,而是一根链长出一点。
S12、采用如上所述的DNA末端修复试剂对第一DNA片段10进行处理,得到第二DNA片段20。第二DNA片段20为末端齐平且5'端磷酸化3'端加A的DNA片段。其中,处理条件为:先在15℃~25℃处理10min~20min,再在60℃~70℃处理10min~20min。
为了对被打断的DNA片段进行测序,首先必须对其末端进行修复,以满足测序接头连接的需要。
采用DNA末端修复试剂对第一DNA片段10进行处理,可以包括:
如图1A和图1B所示,利用DNA末端修复试剂所包含的DNA末端修组合酶催化第一DNA片段10发生5'-3'的合成反应,以及3'-5'的外切反应,从而将5'端突出末端补平和/或3'端突出末端削平,形成完整的双链DNA,并使该双链DNA发生5'端磷酸化反应和3'端加A反应。
在此过程中,在15℃~25℃时,DNA末端修组合酶中的酶I和酶III发挥催化作用,进行末端修复和削平,在60℃~70℃时,DNA末端修组合酶中的酶I和酶III变性,酶II发挥催化作用,进行末端加A。
例如,T4DNA聚合酶和Klenow片段具有5'-3'DNA聚合酶和3'-5'核酸外切酶活性,可以在15℃~25℃时,在dNTP的存在下,将DNA片段的5'-黏性末端进行补平,同时可以切除突出的3'-黏性末端,以及T4PNK(T4多聚核苷酸激酶,T4 PolyNucleotide Kinase)可以在5'-末端加入磷酸基团,在60℃~70℃时,Taq DNA聚合酶可以在ATP的存在下,在DNA的3'-末端加A,通过以上过程,即可完成对被打断后得到的DNA片段(也即第一DNA片段10)的末端修复并加A。
同时,由于DNA末端修复试剂还包括SSB,因此,在上述末端修复加A过程中,SSB可以结合到黏性末端上,一方面,能够使DNA片段(也即第一DNA片段10)的黏性末端呈伸展状态,没有弯曲和结节,从而可以防止形成DNA超二级结构(如发夹结构),这样,便于DNA末端修复组合酶如酶I与DNA片段的黏性末端结合,促使酶促反应的进行,并在新生的DNA链合到黏性末端被SSB结合的位置时,SSB就会脱落,从而有利于DNA片段的 黏性末端的修复,提高修复效率,防止大量DNA片段无法形成完整的双链DNA而造成损失,从而可以提高文库产量,并提高文库转化效率。另一方面,在上述整个酶促反应过程中,在初始阶段,使SSB与DNA片段的黏性末端进行结合,可以对DNA片段的黏性末端进行保护,防止发生酶解反应,可以保持DNA片段的完整性,从而可以防止文库构建过程中需要测序的DNA片段发生缺失等不良,所构建的文库可以满足高通量测序和后端靶向测序的使用要求。
S13、对第二DNA片段20连接测序接头,得到接头连接产物30。
示例的,测序接头可以为Y型接头。如图3所示,Y型接头可以包括P5/P7、Index以及R1SP/R2SP序列。其中P5/P7序列能够跟测序芯片上的P5/P7序列互补和相同,以将待测片段固定在Flowcell上进行桥式PCR扩增;Index又称为barcode,目的是给文库加上特定的标签,用于文库混合测序时区分不同的文库样本;R1SP/R2SP是Read1和Read2测序引物结合的区域,在dNTP和DNA聚合酶的作用下能够进行碱基的延伸。
Y型接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物,从而可以通过后续的PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)扩增形成两端带有不同核苷酸序列(P5/P7)的文库。
其中,根据Index位置的不同,测序接头可以分为单端和双端Index接头。单端Index接头只在P7端存在Index序列,双端Index接头在P5和P7两端均存在Index序列,如图3所示,示出了测序接头为双端Index接头的情形。
对第二DNA片段20连接测序接头,可以包括:
采用上述所述的DNA接头连接试剂对第二DNA片段20进行处理,以对第二DNA片段20连接测序接头。
具体的,利用DNA接头连接试剂所包含的DNA连接酶促使第二DNA片段20和测序接头发生反应。
在本公开的实施例中,由于DNA接头连接试剂包括PEG,且PEG选自PEG-4000,通过实验发现,与相关技术中PEG为PEG-8000相比,可以更有效地使目的DNA片段(如想要测序的DNA片段(也即上述片段大小在150bp~200bp的DNA片段))与DNA连接酶接触,而使另一部分DNA片段(如这部分DNA片段的分子量大于或小于上述的目的DNA片段)与DNA连接酶远离,从而可以提高酶促效果,进而提高后续文库转化效率。
其中,第二DNA片段20和测序接头发生反应的温度为20℃~25℃,时间为15min~20min。
S14、对接头连接产物30进行纯化,并对纯化后的产物进行富集,即可得到DNA文库。
对接头连接产物30进行纯化,可以包括:
利用磁珠对接头连接产物30进行吸附,去除反应体系中的酶、盐离子和残余的测序接头。
其中,磁珠的表面具有连接基团,连接基团与接头连接产物30之间可以通过静电作用等结合,从而实现磁珠对接头连接产物30吸附。
对纯化后的产物进行富集,可以包括:
采用PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)扩增法对纯化后的产物进行富集。
具体包括变性、退火和延伸三个反应步骤。例如,可以对纯化后的产物加热至95℃左右一定时间(如3min),使纯化后的产物解离成两条单链,随后加热至98℃下一定时间(如20s),保证纯化后的产物完全变性(也即完全变成两条单链),接着,温度降温至60℃左右并保持一定时间(如30s),引物对所包含的两个引物分别与解离成的两条单链DNA通过碱基互补配对结合(其中,引物对中的其中一个引物(如引物一)是图2中与P7互补配对的链段中的一个片段,另一个(如引物二)是图2中与P5互补配对的链段中的一个片段),然后,将温度升至72℃,并保持一定时间(如30s),每条单链DNA和引物的结合物在DNA聚合酶的作用下合成一条与单链DNA互补的复制链,从而形成双链DNA,如此循环5到10次,即可获得富集产物40。
另外,为了获得纯度较高的富集产物,可选的,该DNA的建库方法还包括:采用磁珠对富集产物40进行纯化。
具体的,可以利用磁珠法对DNA片段进行纯化。
为了对本公开的实施例的技术效果进行客观评价,本公开的实施例将通过如下对比例和实验例对本公开的实施例进行详细地示例性地描述。
对比例1
对比例1中的DNA文库构建方法如下:
步骤1)、基因组DNA片段化:将1ng~100ng样本(如1ng、10ng、50ng、100ng)分别加入到0.6mL PCR管中,TE缓冲液补足至50μL,充分混匀并离心,用Bioruptor超声破碎仪对样本进行破碎,进行20个循环,每个循环中对超声破碎仪开启30s,关闭30s,得到DNA片段。超声结束后,用AMpure XP磁珠对DNA片段进行纯化,得到片段大小为150bp~200bp的DNA片段10_a。
步骤2)、配置DNA末端修复试剂,具体组分和浓度如下表1所示。
表1
步骤3)、采用表1所示的DNA末端修复试剂对片段大小为150bp~200bp的DNA片段10_a进行末端修复加A。其中,可以将15μL的DNA末端修复试剂和50μL的DNA片段10_a混合,放在一个小管子里,把管子放在一个加热器中,先在20℃保持15min,而后在65℃保持15min进行反应,最后得到末端修复产物20_a。
步骤4)配置接头连接反应体系,具体组分和体积如下表2所示。在20℃保持15min,得到接头连接产物30_a。
表2
步骤5)、向接头连接产物30_a中加入88μL的磁珠,充分混匀后室温静置5min,放置于磁力架大约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清,小心移除上清;加入200μL新配制的80%乙醇进行漂洗,室温静置30s-60s,小心移除上清,重复一次;待磁珠干燥后,加入22μL超纯水洗脱,室温放置3min后置于磁 力架,待溶液澄清吸取20uL上清液,即为纯化后的接头连接产物30_a。
步骤6)、配置PCR富集反应体系,具体组分和体积如下表3所示。将20uL的纯化后的接头连接产物30_a和30uL的PCR富集试剂放在一个管子里,加热至95℃左右保持3min,随后加热至98℃保持20s,接着,将温度降温至60℃左右并保持30s,而后,将温度升至72℃保持30s,完成一个循环,如此循环5到10次,即可获得富集产物40_a。
表3
组分 | 体积(μL) |
纯化后的接头连接产物 | 20 |
引物对混合液 | 5 |
2*热启动DNA聚合酶混合液 | 25 |
步骤7)、向富集产物40_a中加入60μL体积的磁珠,充分混匀后室温静置5min,放置于磁力架大约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清,小心移除上清;加入200μL新配制的80%乙醇进行漂洗,室温静置30s-60s,小心移除上清,重复一次;待磁珠干燥后,加入22μL超纯水洗脱,室温放置3min后置于磁力架,待溶液澄清吸取20uL上清液,即为纯化后的富集产物40_a。
实验例1
实验例1的DNA的文库构建方法与对比例1基本相同,不同的是,在实验例1的步骤2)中,所配置的DNA末端修复试剂的具体组分和浓度如下表4所示。也即,与对比例1相比,实验例1中的DNA末端修复试剂还添加了SSB,且SSB的浓度为1ug//μL,最终得到的纯化后的富集产物记为富集产物40_b。
表4
对比例2
对比例2的DNA的文库构建方法与对比例1基本相同,不同的是,在实验例1的步骤2)中,所配置的DNA末端修复试剂的具体组分和浓度如下表5所示。也即,与对比例1相比,对比例2中的DNA末端修复试剂采用Klenow片段的突变体,最终得到的纯化后的富集产物记为富集产物40_c。
表5
实验例2
实验例2的DNA的文库构建方法与对比例2基本相同,不同的是,在实 验例2的步骤2)中,所配置的DNA末端修复试剂的具体组分和浓度如下表6所示。也即,与对比例2相比,实验例2中的DNA末端修复试剂还添加了SSB,且SSB的浓度为1ug//μL,最终得到的纯化后的富集产物记为富集产物40_d。
表6
实验例3
实验例3的DNA的文库构建方法与实验例2基本相同,不同的是,在实验例3的步骤2)中,所配置的DNA末端修复试剂的具体组分和浓度如下表7所示,最终得到的纯化后的富集产物记为富集产物40_e。
表7
实验例4
实验例4的DNA的文库构建方法与实验例2基本相同,不同的是,在实验例4的步骤2)中,所配置的DNA末端修复试剂的具体组分和浓度如下表8所示,最终得到的纯化后的富集产物记为富集产物40_f。
表8
实验例5
实验例5的DNA的文库构建方法与实验例2基本相同,不同的是,在实 验例5的步骤2)中,所配置的DNA末端修复试剂的具体组分和浓度如下表9所示,最终得到的纯化后的富集产物记为富集产物40_g。
表9
分别取适量不同样本起始投入量的富集产物作为测量样本,例如,对于对比例1~对比例2,以及实验例1~实验例4,分别取各自的基因组DNA的起始投入量分别为1ng、10ng、50ng和100ng的纯化后的富集产物各1μL作为测量样品,使用Qubit 4.0 Fluorometer,对上述测量样品中富集产物的浓度进行测量,并计算获得对比例1~对比例2,以及实验例1~实验例4在不同的样本起始投入量下的各自的文库产量、文库片段均值、以及文库转化效率,具体数据如下表10所示。
表10
文库产量通过将所测得的富集产物的浓度乘以50μL得到。文库片段均值 是通过对各测量样品中的DNA片段进行荧光标记,再通过测量各测量样品中的DNA片段的片段大小并求平均值得到。文库转化效率等于各测量样品中的连接有测序接头的DNA片段数量与所有DNA片段数量之比乘以100%,其中,富集产物中连接有测序接头的DNA片段数量通过荧光定量PCR测得,富集产物中的所有片段数量等于富集产物的浓度乘以50μL,然后除以文库片段均值得到。
由表10可知,实验例1与对比例1相比,通过添加SSB,实验例1的文库产量和文库转化效率均有较大提高,文库片段均值相差不大,实验例2~实验例5与对比例2相比,文库产量和文库转化效率也均有较大提高,同样地,文库片段均值也相差不大。同时,由实验例1和实验例2对比可知,相对于Klenow片段,采用Klenow片段的突变体文库产量和文库转化效率均有一定程度的提升,由实验例2~实验例5可知,随着SSB的浓度增大,其文库产量和文库转化率均呈现增大趋势。
综上所述,通过在DNA末端修复试剂中添加SSB,在对DNA片段的黏性末端进行修复时,SSB可以结合到黏性末端上,一方面,能够使DNA片段的黏性末端呈伸展状态,没有弯曲和结节,从而可以防止形成DNA超二级结构(如发夹结构),这样,便于DNA末端修复组合酶如酶I与DNA片段的黏性末端结合,促使酶促反应的进行,并在新生的DNA链合到黏性末端被SSB结合的位置时,SSB就会脱落,从而有利于DNA片段的黏性末端的修复,提高修复效率,防止大量DNA片段无法形成完整的双链DNA而造成损失,从而可以提高文库产量,并提高文库转化效率。另一方面,在上述整个酶促反应过程中,在初始阶段,使SSB与DNA片段的黏性末端进行结合,可以对DNA片段的黏性末端进行保护,防止发生酶解反应,可以保持DNA片段的完整性,从而可以防止文库构建过程中需要测序的DNA片段发生缺失等不良,所构建的文库可以满足高通量测序和后端靶向测序的使用要求。
以上所述,仅为本公开的具体实施方式,但本公开的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内,想到变化或替换,都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此,本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (17)
- 一种DNA末端修复试剂,包括:DNA末端修复组合酶;以及SSB。
- 根据权利要求1所述的DNA末端修复试剂,其中,所述SSB为T4噬菌体32编码蛋白。
- 根据权利要求1或2所述的DNA末端修复试剂,其中,所述SSB的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
- 根据权利要求1~3任一项所述的DNA末端修复试剂,其中,所述SSB在所述DNA末端修复试剂中的浓度为0.5μg/μL~2μg/μL。
- 根据权利要求1~4任一项所述的DNA末端修复试剂,其中,所述DNA末端修复组合酶包括:具有5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性的酶I。
- 根据权利要求5所述的DNA末端修复试剂,其中,所述酶I包括Klenow片段;或者,所述酶I包括Klenow片段的突变体。
- 根据权利要求6所述的DNA末端修复试剂,其中,所述Klenow片段的突变体的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
- 根据权利要求6或7所述的DNA末端修复试剂,其中,在所述DNA末端修复组合酶中的酶I包括Klenow片段的情况下,所述Klenow片段在所述DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.15U/μL;在所述DNA末端修复组合酶中的酶I包括Klenow片段的突变体的情况下,所述Klenow片段的突变体在所述DNA末端修复试剂中的浓度为0.02U/μL~0.15U/μL。
- 根据权利要求6~8任一项所述的DNA末端修复试剂,还包括:PEG,所述PEG选自PEG-4000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或多种。
- 根据权利要求9所述的DNA末端修复试剂,其中,所述PEG在所述DNA末端修复试剂中的质量百分比为8%~25%。
- 一种DNA末端修复试剂盒,包括:如权利要求1~10任一项所述的DNA末端修复试剂。
- 一种DNA接头连接试剂,包括:PEG,所述PEG选自PEG-4000。
- 根据权利要求12所述的DNA接头连接试剂,其中,所述PEG在所述的DNA接头连接试剂的质量百分比为8%~25%。
- 一种DNA接头连接试剂盒,包括:如权利要求12~13任一项所述的DNA接头连接试剂。
- 一种DNA建库试剂盒,包括:如权利要求11所述的DNA末端修复试剂盒,以及如权利要求14所述的DNA接头连接试剂盒。
- 一种DNA文库构建方法,包括:对基因组DNA进行片段化,得到第一DNA片段;采用如权利要求1~10任一项所述的DNA末端修复试剂对所述第一DNA片段进行处理,得到第二DNA片段,所述第二DNA片段为末端齐平且5'端磷酸化,3'端加A的DNA片段,其中,处理条件为:先在15℃~25℃处理10min~20min,再在60℃~70℃处理10min~20min;对所述第二DNA片段连接测序接头,得到接头连接产物;对接头连接产物进行纯化,并对纯化后的产物进行富集。
- 根据权利要求16所述的DNA文库构建方法,其中,对第二DNA片段连接测序接头,包括:采用如权利要求12~13任一项所述的DNA接头连接试剂对第二DNA片段进行处理,以对所述第二DNA片段连接测序接头。
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