CN113481196A - 一种dna连接的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种DNA连接的方法及其应用。本发明首先设计了DNA连接用片段，其包括第一DNA片段和/或第二DNA片段。本发明设计的DNA片段不能发生自连接，且与待测DNA的连接有较好的方向性，将待测DNA经过酶切后，在DNA连接酶的作用下与本发明的DNA连接用片段进行连接，按照3’端至5’端的顺序形成第一DNA片段‑待测DNA‑第二DNA片段的结构。本发明的技术特别适用于痕量DNA的连接、DNA定量测定与测序文库的构建。

Description

一种DNA连接的方法及其应用
技术领域
本发明是关于一种DNA连接的方法及其应用，具体是关于一种特别适用于痕量DNA连接的方法、DNA定量测定与测序文库的构建，属于DNA检测领域。
背景技术
在核酸的研究中，常需要将两个或两个以上的核酸片段链接，例如在DNA分子上连接接头，接头一般为一段短的平末端或粘性末端的人工合成核苷酸片段。接头和核苷酸的连接效率直接影响测序文库构建的质量，目前对痕量DNA的连接无可行的方法。
精确定量DNA拷贝数是现代分子生物学和医学的重要应用之一。常见的DNA定量手段主要有紫外分光光度法、荧光染料法、聚合酶链式反应等。紫外分光光度法定量操作简单，对设备的要求也低，缺点是灵敏度和特异性都较低，且易受样品中其他杂质的干扰。荧光染料法是基于荧光染料与核酸分子结合发出荧光信号的强度与结合的核酸分子数成正比的原理，灵敏度和特异性都较高，但仍然受DNA浓度的限制，无法准确检测或检测不到微量DNA，且会受到其他类型核酸的干扰。紫外分光光度法和荧光染料法均无法检测DNA中特定序列模板的拷贝数。近年来，荧光定量PCR和数字PCR常用于微量DNA及特定序列模板拷贝数的定量。但荧光定量PCR和数字PCR都是基于荧光信号的有无和高低来反应DNA或特定模板的量，无法直接读取DNA序列，其准确性和可靠性都基于引物和探针的设计，结果的准确性可能会受到非特异性扩增的影响，并且其灵敏度普遍较低，不足够用于微量或痕量DNA的定量检测。此外，在很多研究中，还利用了磁球技术、DNA探针标记物等方法将检测信号进一步放大进行。
近几年来包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序。全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提供了坚实的平台。但依然有部分珍贵物种由于个体较小获得的基因组浓度较低等原因得到的DNA量低于按照现有的建库流程和方法建库难度非常大。目前针对低起始量的建库方法主要有转座酶建库和TA连接或平末端连接建库。转座酶建库主要是利用转座酶随机切割基因组并在片段两端加上接头，然后进行扩增建库。该方法是一种高效的低起始量建库方法。但这种建库方法有一个较为明显的缺点就是其使用转座酶随机切割打断过程中易受到样本中杂质的干扰导致打断建库失败，且酶切有偏向性，导致文库失真。TA连接或平末端连接建库无法进行低于20ng的建库。在起始量小于5ng时，由于连接效率较低，若需要达到某些应用，如起始50ng的捕获测序，只能通过连接后增加扩增循环数较达到目的。这样会导致文库中不同DNA片段比例失真或丢失。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种DNA连接新技术，提高连接效率。
为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种DNA连接用片段，其包括第一DNA片段和/或第二DNA片段，其中：
第一DNA片段具有式I所示核苷酸序列：
X1-X2-X3-X4 式I
其中，X1为12-50个任意核酸N；
X2为一段目的需求碱基，例如可以是MLBAC特定序列、Illumina Truseq一端接头序列等，具体可选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中的任一序列；
X3为6-15个T碱基；
X4为与X2基本上反向互补的碱基序列，例如可选自SEQ ID No.4～SEQ ID No.6中的任一序列；
第二DNA片段具有式II所示核苷酸序列：
X5-X6-X7-X8 式II
其中，X5为一段目的需求碱基，例如可以是MLBAC特定序列、Illumina Truseq一端接头序列等，具体可选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.9中的任一序列；
X6为6-15个T碱基；
X7为与X2基本上反向互补的碱基序列，例如可选自SEQ ID No.10～SEQ ID No.12中的任一序列；
X8为12-50个任意核酸N。
SEQ ID No.1：BAGATCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGCAT(其中B代表兼并碱基，是T或G或C)。
SEQ ID No.2：BAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC。
SEQ ID No.3：BAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGA。
SEQ ID No.4：ATGCACACTCTTTCCCTACACGACGATCT。
SEQ ID No.5：GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
SEQ ID No.6：TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
SEQ ID No.7：TCTAGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGGCAT。
SEQ ID No.8：TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC。
SEQ ID No.9：TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGAC。
SEQ ID No.10：ATGCCACTGACCTCAAGTCTGCACACTAGAB。
SEQ ID No.11：GGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAB。
SEQ ID No.12：GTCTGCACACGAGAAGGCTAGAB。
除特别注明外，本发明中所有核苷酸序列，从左至右均为从5’端到3’端的顺序。各核苷酸序列均可采用现有技术的方法合成。
本发明中，所述“任意核酸N”为本领域中常用表达方式，意指每个N可以独立地为随机碱基A、T、G或C。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的DNA连接用片段，第一DNA片段选自如下所示核苷酸序列形成的多核苷酸片段：X1-BAGATCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGCAT-X3-ATGCACACTCTTTCCCTACACGACGATCT，X1-BAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC-X3-GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，或X1-BAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGA-X3-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。在这些具体实施方案中，X1为12-50个任意核酸N，优选为16-40个、更优选18-35个、进一步优选19-30个任意核酸N，例如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个任意核酸N；X3作为弯曲臂，为6-15个T碱基，例如可以为6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个T碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的DNA连接用片段，第二DNA片段选自如下所示核苷酸序列形成的多核苷酸片段：TCTAGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGGCAT-X6-ATGCCACTGACCTCAAGTCTGCACACTAGAB-X8，TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC-X6-GGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAB-X8，或TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGAC-X6-GTCTGCACACGAGAAGGCTAGAB-X8。在这些具体实施方案中，X6作为弯曲臂，为6-15个T碱基，例如可以为6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个T碱基；X8为12-50个任意核酸N，优选为16-40个、更优选18-35个、进一步优选19-30个任意核酸N，例如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个任意核酸N。
根据本发明的具体实施方案，本发明的DNA连接用片段，第二DNA片段5’端带有磷酸化修饰，3’端带有封闭基团修饰。封闭基团例如可选自磷酸化、C3～C18、dSpacer中的一种或多种。
本发明中，所述的DNA连接用片段的第一DNA片段与第二DNA片段可以组对应用于DNA定量测定或构建测序文库中的DNA连接。第一DNA片段或第二DNA片段也可以与其他DNA片段组合应用于其他方面，如转录等。
另一方面，本发明还提供了所述的DNA连接用片段作为接头用于DNA定量测定或构建测序文库中的DNA连接的应用。
本发明中，所述的DNA连接用片段在作为接头用于DNA定量测定或构建测序文库中的DNA连接时，第一DNA片段与第二DNA片段通常组对应用。第一DNA片段中的任意核酸N与第二DNA片段中的任意核酸N的长度可相同或不同。第一DNA片段中的弯曲臂X3与第二DNA片段中的弯曲臂X6的长度可相同或不同。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，DNA连接时按照3’端至5’端的顺序形成第一DNA片段-待测DNA-第二DNA片段的结构。
另一方面，本发明还提供了一种DNA连接方法，该方法包括：
将待测DNA经过酶切后，在DNA连接酶的作用下与本发明所述的DNA连接用片段进行连接。
本发明能够将低至100fg的DNA，经过DNA酶切后，在DNA连接酶的作用下与本发明所设计的两段DNA片段连接。本发明中所选的DNA连接酶优选为耐热的，例如，75℃时20分钟或95℃时5分钟不明显失活即可认为耐热。依据DNA连接酶耐热且能识别错配碱基的特性，设计的该两条DNA片段不能发生自连接，且与被检测DNA的连接有较好的方向性，连接顺序为第一DNA片段-待测DNA-第二DNA片段，经过多次变性与退火可将95％以上的待测DNA两端都连上人工合成DNA片段。该产物可应用于DNA定量与测序文库构建。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，酶切时选用Tn5转座酶、Fragmentase、DNase I、Endonuclease V中的一种或多种DNA内切酶。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，DNA连接酶选自HiFi Taq DNA Ligase、Taq DNA Ligase、9°NTMDNA Ligase中的一种或多种，酶的工作浓度为0.01U/μl～0.2U/μl。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，DNA连接用片段的工作浓度为0.01uM～0.2uM。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，DNA连接时的反应条件可以为：90-95℃5-10秒，37-65℃10秒-2min；依次重复以上过程2-30次。
另一方面，本发明还提供了一种DNA定量测定方法，该方法包括：
按照本发明的DNA连接方法对待测DNA进行连接；
连接产物进行PCR扩增，从而进行定量测定。
另一方面，本发明还提供了一种DNA文库构建方法，该方法包括：
按照本发明的DNA连接方法对待测DNA进行连接；
连接产物进行PCR扩增，从而构建DNA文库。
本发明能够将低至100fg的DNA高效率连接，这种连接可在DNA的5’端加第一片段和/或3’端加第二片段。本发明不仅连接效率高，而且连接方向性能很好的把控，同时接头的自连极少。可应用于DNA定量、测序文库构建、DNA转录。
附图说明
图1为本发明一具体实施例的扩增曲线图。
图2显示本发明一具体实施例中Cт与浓度关系。
图3显示本发明一具体实施例的基因拷贝数变异结果，图中CNV_NICS1与CNV_NICS2分别为两平行。
图4显示本发明另一具体实施例的基因拷贝数变异结果，图中CNV_1与CNV_2分别为两平行。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。实施例中，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件操作。
实施例1、DNA连接方法与DNA定量应用
本实施例提供了一种DNA连接方法与DNA定量应用，主要包括以下步骤：
步骤一：DNA消化
1.向200ul PCR管中加入以下试剂：
试剂名称 体积
DNA内切酶 1μl
10x buffer 1μl
DNA 8μl
DNA内切酶为Fragmentase(发明人在研究过程中另采用Tn5转座酶、DNase I或Endonuclease V，与Fragmentase相比，实验效果无显著差异)。
2.用枪头轻轻吹吸混匀，37℃10分钟。
步骤二：DNA连接
1.向200ul PCR管中加入以下试剂：
试剂名称 体积 浓度范围
DNA连接酶 1μl .0.1U/μl
10x buffer 1μl
人工合成DNA片段1 1μl 0.1μM
人工合成DNA片段2 1μl 0.1μM
上一步反应产物 10μl
NF水 6μl
2.用枪头轻轻吹吸混匀，将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：
Figure BDA0003140442680000061
可选DNA连接酶为HiFi Taq DNA Ligase(发明人在研究过程中另采用TaqDNALigase或9°NTMDNA Ligase，与HiFi Taq DNA Ligase相比，实验效果无显著差异)。
可选的人工合成DNA片段1为：
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNBAGATCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGCATTTTTTTTTTATGCACACTCTTTCCCTACACGACGATCT(与该序列相比，发明人在研究过程中另采用其中N长度为25的DNA片段1，实验效果无显著差异)。
可选的人工合成DNA片段2为：
TCTAGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGGCATTTTTTTTTATGCCACTGACCTCAAGTCTGCACACTAGABNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(与该序列相比，发明人在研究过程中另采用其中N长度为25的DNA片段2，实验效果无显著差异)。DNA五端需磷酸化修饰。3端需要封闭。磷酸化修饰的步骤、封闭委托第三方合成公司合成，其中封闭的基团可选磷酸化、C3～C18、dSpacer等，具体操作条件/步骤参照现有技术的公开资料或行业相关标准即可。
DNA连接时的反应条件为：90℃10秒，37℃2min，依次重复以上温度20次。
步骤三：DNA扩增
1.向200ul PCR管中加入以下试剂：
试剂名称 体积 浓度范围
2 X qPCR Mix 10μl
引物1 1μl 0.1μM
引物2 1μl 0.1μM
上一步反应产物 1-8μl
NF水 至20μl
2.用枪头轻轻吹吸混匀，将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：
Figure BDA0003140442680000071
可选的引物1为CTCTTTCCCTACACGACGATCT(SEQ ID No.13)。
可选的引物2为CCTCAAGTCTGCACACTAGA(SEQ ID No.14)。
结果
分别以100fg、1pg、10pg、100pg起始量DNA为模板按照上述步骤进行DNA消化、DNA连接、DNA扩增，每个浓度设置两个平行，扩增结果如图1所示。
分别以100fg、1pg、10pg、100pg起始量DNA为模板按照上述步骤进行DNA消化、DNA连接、DNA扩增，每个浓度设置两个平行，Cт与浓度关系如图2所示。
实施例2、DNA连接方法与与DNA文库构建
本实施例提供了一种DNA连接方法与DNA文库构建应用，主要包括以下步骤：
步骤一：DNA消化
1.向200ul PCR管中加入以下试剂：
试剂名称 体积
DNA内切酶 1μl
10x buffer 1μl
DNA 8μl
可选DNA内切酶为Endonuclease V(发明人在研究过程中另采用Tn5转座酶、DNaseI或Fragmentase，与Endonuclease V相比，实验效果无显著差异)。
2.用枪头轻轻吹吸混匀，37℃10分钟。
步骤二：DNA连接
1.向200ul PCR管中加入以下试剂：
试剂名称 体积 浓度范围
DNA连接酶 1μl 0.1U/μl
10x buffer 1μl
人工合成DNA片段1 1μl 0.1μM
人工合成DNA片段2 1μl 0.1μM
上一步反应产物 10μl
NF水 6μl
2.用枪头轻轻吹吸混匀，将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：
Figure BDA0003140442680000081
可选DNA连接酶为HiFi Taq DNA Ligase(发明人在研究过程中另采用Taq DNALigase或9°NTMDNA Ligase，与HiFi Taq DNA Ligase相比，实验效果无显著差异)。
可选的人工合成DNA片段1为：
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNBAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTTTTTTTTTTGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(与该序列相比，发明人在研究过程中另采用其中N长度为25的DNA片段1，实验效果无显著差异)。
可选的人工合成DNA片段2为：
TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTTTTTTTTTGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGABNNNNNNNNNN(与该序列相比，发明人在研究过程中另采用其中N长度为25的DNA片段2，实验效果无显著差异)。DNA5’端需磷酸化修饰，3’端需dSpacer。
DNA连接时的反应条件为：95℃5秒，65℃10秒，依次重复以上温度30次。
步骤三：PCR扩增
1.向200ul PCR管中加入以下试剂：
试剂名称 体积 浓度范围
2X Hifi PCR Mix 25μl
引物1 1μl 0.1μM
引物2 1μl 0.1μM
上一步反应产物 20μl
NF水 3μl
2.用枪头轻轻吹吸混匀，将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：
Figure BDA0003140442680000091
可选的引物1为：
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTTTTTTTTCGATTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T(SEQ ID No.15)(*为硫修饰)
可选的引物2为：
CCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T(SEQ ID No.16)(*为硫修饰)。
3.将扩增产物转移至离心管中，取0.8×(40μl)Ampure XP磁珠，与扩增产物混匀后置于磁力架上静置5min；
4.待磁珠全部吸附到管壁上(约2min)，弃上清后用新配制的80％乙醇清洗磁珠两次，弃上清；
5.室温静置5min，待磁珠干燥后(请注意不要过分干燥致使磁珠开裂，以免影响回收效率)，根据下游需要以17.5μl TE buffer、EB buffer或去核酸水重悬磁珠；
6.室温静置5min后将离心管置于磁力架上，吸取15μl上清，此上清为可用于测序的文库。
结果
分别以8μl的囊胚培养液为模板按照上述步骤进行DNA消化、DNA连接、PCR扩增，再进行上机测序与CNV分析，两个重复。数据质控结果见表1，基因拷贝数变异结果图见图3。
表1数据质控结果
Figure BDA0003140442680000101
分别以单个RWPE-1细胞为模板按照上述步骤进行DNA消化、DNA连接、PCR扩增，再进行上机测序与CNV分析，两个重复。数据质控结果见表2，基因拷贝数变异结果图见图4。
表2数据质控结果
Figure BDA0003140442680000102
可以看出，本发明的方法连接效率高，建库质量高及成功率高。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 序康医疗科技（苏州）有限公司
<120> 一种DNA连接的方法及其应用
<130> GAI21CN4209
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> b=g或c或t
<400> 1
bagatcgtcg tgtagggaaa gagtgtgcat 30
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> b=g或c或t
<400> 2
bagatcggaa gagcacacgt ctgaac 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> b=g或c或t
<400> 3
bagatcggaa gagcgtcgtg taggga 26
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<400> 4
atgcacactc tttccctaca cgacgatct 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<400> 5
gttcagacgt gtgctcttcc gatct 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<400> 6
tccctacacg acgctcttcc gatct 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<400> 7
tctagtgtgc agacttgagg tcagtggcat 30
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 8
tctagccttc tcgcagcaca tccc 24
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<211> 22
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> b=g或c或t
<400> 10
atgccactga cctcaagtct gcacactaga b 31
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> b=g或c或t
<400> 11
gggatgtgct gcgagaaggc tagab 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA连接用片段
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> b=g或c或t
<400> 12
gtctgcacac gagaaggcta gab 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ctctttccct acacgacgat ct 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cctcaagtct gcacactaga 20
<210> 15
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tttttttttc gatttcagac gtgtgctctt 60
ccgatct 67
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat ttcagacgtg tgctcttccg atct 54

Claims (10)

1.一种DNA连接用片段，其包括第一DNA片段和/或第二DNA片段，其中：
第一DNA片段具有式I所示核苷酸序列：
X1-X2-X3-X4 式I
其中，X1为12-50个任意核酸N；
X2选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中的任一序列；
X3为6-15个T碱基；
X4选自SEQ ID No.4～SEQ ID No.6中的任一序列；
第二DNA片段具有式II所示核苷酸序列：
X5-X6-X7-X8 式II
其中，X5选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.9中的任一序列；
X6为6-15个T碱基；
X7选自SEQ ID No.10～SEQ ID No.12中的任一序列；
X8为12-50个任意核酸N。
2.根据权利要求1所述的DNA连接用片段，其中：
第一DNA片段选自如下所示核苷酸序列形成的多核苷酸片段：
X1-BAGATCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGCAT-X3-ATGCACACTCTTTCCCTACACGACGATCT，
X1-BAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC-X3-GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，或
X1-BAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGA-X3-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
第二DNA片段选自如下所示核苷酸序列形成的多核苷酸片段：
TCTAGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGGCAT-X6-ATGCCACTGACCTCAAGTCTGCACACTAGAB-X8，
TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC-X6-GGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAB-X8，或
TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGAC-X6-GTCTGCACACGAGAAGGCTAGAB-X8；
优选地，第二DNA片段5’端带有磷酸化修饰，3’端带有封闭基团修饰。
3.权利要求1-2任一项所述的DNA连接用片段作为接头用于DNA定量测定或构建测序文库中的DNA连接的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，DNA连接时按照3’端至5’端的顺序形成第一DNA片段-待测DNA-第二DNA片段的结构。
5.一种DNA连接方法，该方法包括：
将待测DNA经过酶切后，在DNA连接酶的作用下与权利要求1-2任一项所述的DNA连接用片段进行连接。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，DNA连接时按照3’端至5’端的顺序形成第一DNA片段-待测DNA-第二DNA片段的结构。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，酶切时选用Tn5转座酶、Fragmentase、DNase I、Endonuclease V中的一种或多种DNA内切酶；
DNA连接酶选自HiFi Taq DNA Ligase、Taq DNA Ligase、9°NTMDNA Ligase中的一种或多种，酶的工作浓度为0.01U/μl～0.2U/μl。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，DNA连接用片段的工作浓度为0.01uM～0.2uM。
9.一种DNA定量测定方法，该方法包括：
按照权利要求5-8任一项所述的方法对待测DNA进行连接；
连接产物进行PCR扩增，从而进行定量测定。
10.一种DNA文库构建方法，该方法包括：
按照权利要求5-8任一项所述的方法对待测DNA进行连接；
连接产物进行PCR扩增，从而构建DNA文库。
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