CN111073952A - 构建dna文库的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了构建DNA文库的方法及其应用。其中，该方法包括将DNA样本进行末端修复后，利用耐高温聚合酶对DNA样本进行加腺苷酸尾处理，以便得到加尾后的DNA，其中，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的；以及将所述加尾后的DNA进行接头连接处理，以便得到连接产物，DNA文库其中，所述末端修复和加腺苷酸尾处理的条件是：27‑37摄氏度，5‑30分钟；70‑75摄氏度，10‑20分钟。该方法末端修复和加腺苷酸尾处理连续进行，中间无需纯化处理，稳定性好，同时还显著缩短了反应时间和反应流程。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体地，涉及构建DNA文库的方法和构建DNA文库的试剂盒。
背景技术
对基因组DNA进行二代测序及相应的生物信息学分析，可实现染色体异常诊断、相关致病基因的基因检测、基因组重测序、外显子测序等相关的医学健康领域和科技服务领域，应用范围广泛。
二代测序文库的构建的一般流程如下：对目的DNA片段化；对游离DNA进行末端平齐化处理；在平齐化后的DNA的3’末端突出腺苷酸化；将突出腺苷酸化的DNA片段与突出胸腺嘧啶化的双链Y型接头进行连接。文库构建的时间长，通常需要两个多小时，并且，转化效率低。
由此，构建DNA文库的方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种构建DNA文库的方法，该方法采用双温阶进行末端修复和加腺苷酸尾处理，并对该处理条件进行了优化，使打断末端修复、加腺苷酸尾处理连续进行，提高反应效率的同时显著缩短了反应时间和反应流程。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建DNA文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将DNA样本进行末端修复后，利用耐高温聚合酶对DNA样本进行加腺苷酸尾处理，以便得到加尾后的DNA，且所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的；以及将所述加尾后的DNA进行接头连接处理，以便得到连接产物，其中，所述末端修复和加腺苷酸尾处理的条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟DNA文库。
根据本发明实施例的构建DNA文库的方法，采用常温酶进行末端修复，耐热酶进行加腺苷酸尾处理，并对该处理条件进行了优化，即采用双温阶的连续反应，使末端修复和加腺苷酸尾处理得以连续进行，中间无需纯化处理，并且，该双温阶连续反应的条件实验，DNA片段的末端修复和加尾效率高，偏好性低，稳定性好，同时还显著缩短了反应时间和反应流程，使流程更加线化。
根据本发明的另一方面，本发明提高了一种构建DNA文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：末端修复和加腺苷酸尾区，所述末端修复和加腺苷酸尾区含有耐高温聚合酶；接头连接区；以及扩增区，所述扩增区用于进行扩增处理，扩增产物构成所述DNA文库，其中，所述末端修复和加腺苷酸尾区的处理条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。
根据本发明实施例的构建DNA文库的试剂盒，末端修复和加腺苷酸尾区内设置耐高温酶，采用耐高温酶进行末端修复和加腺苷酸尾处理，并对该处理条件进行了优化，即采用双温阶的连续反应，使末端修复和加腺苷酸尾处理得以连续进行，中间无需纯化处理，并且，该双温阶连续反应的条件实验，DNA片段的末端修复和加尾效率高，偏好性低，稳定性好，同时还显著缩短了反应时间和反应流程。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的末端碱基偏好性结果示意图，其中，图中5条曲线为末端5个碱基的偏好性变化曲线，曲线上的6个点是6种操作；
图2显示了根据本发明一个实施例的电泳结果示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的改良的Taq DNA聚合酶用量与文库产量关系的结果示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的反应的时间和温度与文库产量关系的结果示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的反应的时间和温度与文库产量关系的结果示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的转化率与接头量的关系的结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建DNA文库的方法。根据本发明实施例的构建DNA文库的方法，采用耐高温酶进行末端修复和加腺苷酸尾处理，并对该处理条件进行了优化，即采用双温阶的连续反应，使末端修复和加腺苷酸尾处理得以连续进行，中间无需纯化处理，并且，该双温阶连续反应的条件实验，DNA片段的末端修复和加尾效率高，偏好性低，稳定性好，同时还显著缩短了反应时间和反应流程，使流程线化。
根据本发明的一些实施例，该构建DNA文库的方法可以实现在30分钟内完成双链DNA片段化→DNA末端修复→末端腺苷酸突出化→Y型接头连接这四个步骤，而且兼容多种DNA样本来源和下游用途，利用该方法可以实现在一台液体处理工作站上一天完成96x8个样本的illumina测序文库构建。
根据本发明的实施例，该构建DNA文库的方法使用相同流程兼容更多种类的样本和应用方向，减少了处理过程中对机器、环境和人工操作精度的要求。该方法采用双温阶连续反应进行末端修复和加腺苷酸尾处理，并对末端修复和腺苷酸化的缓冲液进行优化，同时改良了Taq DNA聚合酶，并对用酶的量进行精确的调整，使之能兼容1至100ng甚至高达200ng的DNA投入，以满足大部分测序应用项目，如基因组重测序、捕获测序、转录组分析、低起始量cfDNA建库等需求，并显著降低了对各步酶投入量的依赖。
根据本发明的实施例，该方法构建所需的时间短，仅需1小时左右，文库构建流程更加简单、流畅、高效，并可兼容处理基因组DNA、cDNA、cfDNA等不同的样本类型。且测序数据质量满足基因组组装、捕获测序和转录组分析等需求。
其中，需要说明的是，本文中术语“双温阶连续反应”是指末端修复在常温条件下进行，加A尾在高温条件下进行，例如，本发明中，末端修复的条件是27-37摄氏度，5-30分钟；加腺苷酸尾的条件是70-75摄氏度，10-20分钟，末端修复和加腺苷酸尾二者在两个不同的温度条件下进行。
根据本发明的实施例，对该构建DNA文库的方法进行解释说明，该方法包括：
S10末端修复和加腺苷酸尾处理
根据本发明的实施例，利用耐高温聚合酶对DNA样本进行末端修复和加腺苷酸尾处理，得到加尾后的DNA。其中，需要说明的是，该末端修复和加腺苷酸尾处理是连续进行的，也就是说末端修复的产物直接进行加腺苷酸尾处理，中间无需纯化。
发明人通过采用耐高温聚合酶，使聚和反应在较高的温度下即可进行，并且，发明人对该末端修复和加腺苷酸尾处理的反应条件进行了反复的摸索，发现当末端修复和加腺苷酸尾处理的条件是27-37摄氏度，5-30分钟，具体地，可以是该温度和时间条件下的任意组合，末端修复的温度还可以是28、29、31、33、36、37、38和39摄氏度，时间还可以是7、9、10、11、13、17、19、23、26、28和29分钟；70-75摄氏度，10-20分钟，具体地，可以是该温度和时间条件下的任意组合，加腺苷酸尾的温度还可以是71、73和74摄氏度，时间还可以是9、10、11、13、16、17和19分钟，该条件下DNA片段的末端修复和加尾效率高，偏好性低，稳定性好，并且，该条件不仅适用于非打断DNA，还适用于打断DNA，对打断DNA的末端修复效果也很好，可以对多种样本兼容处理；进一步地，根据本发明的优选实施例，该末端修复和加腺苷酸尾处理的条件：32-37℃，时间为8-14分钟；温度为72-75℃，时间为10-12分钟更优地，该末端修复和加腺苷酸尾处理的条件可以是：温度为37℃，时间为10分钟；温度为75℃，时间为10分钟。由此，末端修复和加腺苷酸尾效率进一步提高，偏好性更低，稳定性更佳，样本兼容性更好。
由于DNA样本的种类较多，并且，通常在末端修复前需要进行片段化处理，也就是说，如本发明的一些实施例，该末端修复前进一步包括：将该DNA样本进行片段化预处理，得到DNA片段。进一步地，根据本发明的实施例，该片段化预处理可以为酶切或机械打断。需要说明的是，该片段化预处理与后续的末端修复和加腺苷酸尾可以是连续进行的。
由于DNA文库所有腺苷酸化酶均显示出一定的偏好性，3’末端为嘧啶(dT或dC)比3’末端为嘌呤(dA或dG)的DNA片段更易被腺苷酸化，不完全腺苷酸化将导致DNA片段间的平末端连接反应，影响测序数据的基因组序列组装。为此，发明人对末端修复和加腺苷酸尾处理的缓冲液的成分和pH值条件进行了优化，即缓冲液的pH值为8.5-9.0，镁离子浓度为8-12mM，使该缓冲液适用于多种DNA样本，例如基因组DNA、cDNA、cfDNA，并且对酶切DNA和机械打断DNA均适用，同时，有利于提高末端腺苷酸化的反应效率，降低了偏好性。进一步地，根据本发明的优选实施例，该缓冲液的pH值为8.8，镁离子浓度为10mM。由此，缓冲液的兼容性好，稳定性高，并且，在末端修复和加腺苷酸尾处理过程中均适用，同时，末端腺苷酸化的反应效率高，偏好性低。
具体地，根据本发明的优选实施例，该缓冲液可以含有8-12mM Tris-HCl、8-12mMMgCl2、45-55mM KCl和0.05-0.15％Triton-x-100，PH8.5-9.0。由此，缓冲液的兼容性更佳，稳定性显著提高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性。此外，该缓冲液对T4DNA连接酶无明显的抑制作用，在这些体系用酶量的1/5以下，能达到更高的连接效率，有利于关注底物转化效率的应用项目。并且，该缓冲液使该构建DNA文库的方法对投入的DNA纯度容忍度提高，在同样的操作条件能获得纯度更高的满足下游NGS文库构建的产物，降低了样本准入的纯度标准，适于用于高通量样本处理。
根据本发明的实施例，采用T4DNA聚合酶进行末端修复，T4DNA聚合酶具有较高的保真性，适于进行末端修复，在抑制引入随机突变的表现比其它同类酶类更有优势，并且，在高温条件下失活，即在双温阶的高温反应阶段失活，T4DNA聚合酶的外切酶作用得以消除，使其不影响后续的腺苷酸化处理。
此外，发明人通过大量研究，从大量的聚合酶中挑选了热敏感的具有高保真性的聚合酶作为末端修复的核心酶，和嗜高温的没有外切酶活性的聚合酶作为突出腺苷酸化的核心酶。根据本发明的实施例，该耐高温聚和酶可以为Taq DNA聚合酶，具体地，该聚合酶可以是商业化的产品上的HemoKlen Taq酶。该Taq DNA聚合酶热稳定好，在低温下也不会对连接反应造成负面的影响，适于双温阶反应中进行腺苷酸化处理。
进一步地，发明人对Taq DNA聚合酶进行了优化改良，删除了其N端289个氨基酸，通过该优化改良，提高了聚合酶的保真性和耐热性，使加腺苷酸的过程更稳定，反应效率更高，偏好性更低，有利于关注数据质量的项目。具体地，该改良的Taq DNA聚合酶具有SEQ IDNO：1所示的序列，序列如下：
LLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGE WTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO：1)
并且，在前述的缓冲液中，Taq DNA聚合酶的用量也有所调整，发明人研究发现，随着Taq DNA聚合酶浓度的增加，文库产量先增加后降低。根据本发明的实施例，该Taq DNA聚合酶的浓度为0.2-1U，优选地，可以为0.3-0.5U，更优选地，可以为0.4U。由此，在该浓度下，文库产量高。
S20接头连接处理
根据本发明的实施例，将加尾后的DNA进行接头连接处理，得到连接产物。本发明前述的缓冲液可以兼容接头连接处理过程，从而，连接接头后的样本无需分离纯化即可直接用于接头连接处理，节省了反应步骤和时间。
由于前述的缓冲液对T4DNA连接酶无明显的抑制作用，在这该缓冲液中，酶的用量下降，甚至达到常规酶用量的1/5以下，并实现了更高的连接效率，有利于关注底物转化效率的应用项目。根据本发明的实施例，该接头连接处理是利用T4DNA连接酶进行的，且该T4DNA连接酶的浓度为4-6U。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：
S30扩增
根据本发明的实施例，对连接产物进行扩增，该扩增产物构成DNA文库。
进一步地，根据本发明的实施例，该测序可以采用双端测序，例如利用Illumina平台(例如HiSeq4000或HiSeq X Ten或NextSeq500)进行的双端测序。
根据本发明的另一方面，本发明提高了一种构建DNA文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒可以包括：末端修复和加腺苷酸尾区和接头连接区，其中，该末端修复和加腺苷酸尾区含有耐高温聚合酶，其中，所述末端修复和加腺苷酸尾区的处理条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。
其中，需要说明的是，末端修复和加腺苷酸尾区与接头连接区可以位于一个空间内，但是接头连接区内所设置的组分需独立放置，根据程序设置，按照时间添加，例如，可以在完成加腺苷酸尾后，向末端修复和加腺苷酸尾区添加接头连接区所含有的组分。
根据本发明实施例的构建DNA文库的试剂盒，末端修复和加腺苷酸尾区内设置耐高温酶，采用耐高温酶进行末端修复和加腺苷酸尾处理，并对该处理条件进行了优化，即采用双温阶的连续反应，使末端修复和加腺苷酸尾处理得以连续进行，中间无需纯化处理，并且，该双温阶连续反应的条件实验，DNA片段的末端修复和加尾效率高，稳定性好，同时还显著缩短了反应时间和反应流程。
根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：扩增区，该扩增区用于进行扩增处理，扩增产物构成DNA文库。
根据本发明的实施例，所述末端修复和加腺苷酸尾区还含有缓冲液，所述缓冲液含有8-12mM镁离子，且pH值为8.5-9.0。如前所述，该缓冲液有利于提高末端腺苷酸化的反应效率，降低了偏好性。根据本发明的优选实施例，该缓冲液的pH值为8.8，镁离子浓度为10mM。由此，缓冲液的兼容性好，稳定性高，并且，在末端修复和加腺苷酸尾处理过程中均适用，同时，末端腺苷酸化的反应效率高，偏好性低。
根据本发明的实施例，该缓冲液含有8-12mM Tris-HCl、8-12mM MgCl2、45-55mMKCl和0.05-0.15％Triton-x-100，PH8.5-9.0。如前所述，该缓冲液的兼容性更佳，稳定性显著提高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4DNA连接酶无明显的抑制作用。
根据本发明的实施例，该末端修复和加腺苷酸尾区还含有T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶。其中，T4DNA聚合酶进行末端修复，T4DNA聚合酶具有较高的保真性，适于进行末端修复，在抑制引入随机突变的表现比其它同类酶类更有优势，并且，在高温条件下失活，即在双温阶的高温反应阶段失活，T4DNA聚合酶的外切酶作用得以消除，使其不影响后续的腺苷酸化处理。而Taq DNA聚合酶，例如市售的HemoKlen Taq酶，酶的热稳定好，在低温下也不会对连接反应造成负面的影响，适于双温阶反应中进行腺苷酸化处理。进一步的，该TaqDNA聚合酶还可以是前述改良的Taq DNA聚合酶，即该酶具有SEQ ID NO：1所示的序列。
根据本发明的实施例，该Taq DNA聚合酶的浓度为0.3-0.5U。由此，在该浓度下，文库产量高。
根据本发明的实施例，该接头连接区含有T4DNA连接酶，该T4DNA连接酶的浓度为4-6U。下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
构建DNA文库的一般流程和条件：
末端修复和加腺苷酸尾
加接头(Fermentas T4ligase)
其中，2×快速连接缓冲液(2×rapid ligation buffer)
纯化：1×磁珠纯化，适量洗脱液洗脱后进行PCR。
*DNaseI为可选择成分，在做转录组测序建库或机械打断时以5U T4PNK和2.5Uklenow片段代替DNaseI。
该构建DNA文库的一般流程和条件均适用于下述实施例中。
实施例1
本实施例中，对末端修复和末端突出腺苷酸化的反应条件进行优化，具体如下：
由于腺苷酸化酶通常显示出一定的偏好性，3’末端为嘧啶(dT或dC)比3’末端为嘌呤(dA或dG)的DNA片段更易被腺苷酸化，不完全腺苷酸化将导致DNA片段间的平末端连接反应，影响测序数据的基因组序列组装。为了改进这一点，在聚合酶基础缓冲体系的基础上将PH提高至8.8，并调整镁离子浓度至10mM，形成了适用于一步末端修复和加A尾的改良缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgCl2,50mM KCl，0.1％Triton-x-100，PH8.8)，如表1和图1所示，相对于现有缓冲液(Blue buffer)提高了末端腺苷酸化的反应效率，降低了偏好性。
本实施例中，对突出腺苷酸化酶Taq进行了进一步改造，删除了其N端289个氨基酸，提高了聚合酶的保真性和耐热性，使加腺苷酸过程更稳定，反应效率更高。
表1
表1中加A尾使用的模板均为末端修复完全的1ng cfDNA，使用Klenow exo-及不同的缓冲液在37℃下加腺苷酸尾30min得到的结果。从表中得出的结果来看，改良缓冲液有利于提高加腺苷酸尾的反应效率。
对构建的测序文库利用Nextseq500测序，测序结果如图1所示，改良Taq酶纯化蛋白质电泳结果如图2所示，其中改良缓冲液1、2和3为三个重复，是以1ng cfDNA为模板使用Klenow exo-在改良的缓冲体系中一步末端修复加腺苷酸尾30min得到的偏好性结果。现有缓冲液(blue buffer)1、2、3为三个重复，是以1ng cfDNA为模板使用Klenow exo-在现有的blue buffer的缓冲体系中加腺苷酸(A)30min得到的偏好性结果。结果表明，改良缓冲液有利于降低DNA片段末端碱基偏好性。
实施例2
利用实施例1的改良缓冲液，对加腺苷酸尾反应的温度和时间条件对文库产量的影响进行了摸索，酶的用量，以及反应的时间和温度如图3和4所示，具体的，改良Taq DNA聚合酶的浓度分别为0.1U、0.2U、0.4U和1U，加腺苷酸尾反应反应的时间和温度分别为68摄氏度，10分钟；68摄氏度，30分钟；72摄氏度，10分钟；72摄氏度，30分钟；75摄氏度，10分钟；75摄氏度，30分钟。同时以100ng酶切DNA片段作为底物，对改良Taq DNA聚合酶的使用量进行了摸索。
结果如图3和4所示，在图3中，将实施例1的改良缓冲液和改良的Taq DNA聚合酶，用于一步末端修复和加腺苷酸反应中，底物量为100ng，当酶的浓度为0.2-1U时，文库产量较高，其中，当酶的浓度为0.4U时，效果更佳。图4中，并加腺苷酸尾反应的温度和时间条件进行了摸索，得到了72℃，30min的优选反应条件。
实施例3
在实施例1的改良缓冲液中，加入打断缓冲液(0.1×DnaseI Buffer，1×BlueBuffer，50mM Nacl，0.1％TritonX-100，120ng sso7d)，使用NA12878标准底物在此缓冲体系中进行建库，对DNA片段化酶兼容能力做出了评价，底物的用量和文库产量见表2。
表2
打断建库一体化的条件为37℃10min，72℃20min。反应2和3为反应1的重复，结果如图5所示。
实施例4
本实施例中，以100ng酶切DNA作为底物，对实施例1的改良的缓冲液进行连接体系兼容能力评价，结果如图6所示，随着接头量的增加，转化效率增加，其中，转化效率是指连接产物中双端加上接头的DNA片段与所有DNA片段的比值。连接缓冲液为2×Rapidligation buffer(Vazyme)。结果表明，随着接头量的增加，转化效率逐渐增加，例如，当接头量为40pmol时转化效率达到了分步文库构建效率的1.6倍，接头转化效率显著提高。
实施例5
本实施例中，对本发明实施例的构建DNA文库的试剂盒的文库构建总体效果进行评价，具体如下：
(1)基因组重测序
使用标准品HD701(Horizon Quantitative Multiplex Reference Standard)作为模板DNA，分别使用以实施例1的缓冲液为基础，采用37℃10min，75℃20min双温阶条件的本发明的试剂盒和KAPA Hyperplus Library Prep Kit(双温阶条件：20℃30min，65℃30min)进行建库，对比了基础数据质控情况和突变检测情况，结果如下：
表3
从表3中可知本发明的试剂盒的上机数据在基础数据质控方面与现有的KAPAHyperplus prep kit水平相当，并且，本发明的试剂盒的建库时间仅为KAPA Hyperplusprep kit的一半。
表4种建库试剂盒突变检出数的比较
| 全部snp | |
| 本发明试剂盒 | 1293220 |
| KAPA_Hyperplus | 1286132 |
| KAPA_Hyperplus2 | 1275470 |
从表4中可见，本发明的试剂盒的突变检出数高于KAPA Hyperplus Prep Kit。
至2018年8月份构建的8872个基因组重测序文库中建库成功率达到98％，样本涉及40多个物种，样品等级涉及ABCD四个等级。
(2)捕获测序
使用以实施例1的改良缓冲液为基础的本发明试剂盒进行建库捕获测序与安捷伦官方流程进行比较，其捕获特异性优于安捷伦试剂盒。
表5
至2018年8月份构建的713个捕获测序文库中建库成功率达到99.3％，样本涉及40多个物种，样品等级涉及ABCD四个等级。
(3)转录组测序
在2017年12月-2018年3月中共构建了5552个转录组文库，涉及95个物种，样本质量涉及A、B、C、D四个等级，建库成功率达到95.77％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 构建DNA文库的方法及其应用
<130> 1801
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 552
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser
20 25 30
Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg
35 40 45
Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp
50 55 60
Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu
85 90 95
Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg
100 105 110
Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu
115 120 125
Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu
130 135 140
Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val
145 150 155 160
Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu
165 170 175
Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala
180 185 190
Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp
195 200 205
Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly
210 215 220
Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu
225 230 235 240
Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg
245 250 255
Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu
260 265 270
Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala
275 280 285
Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile
290 295 300
Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala
305 310 315 320
Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu
325 330 335
Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe
340 345 350
Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly
355 360 365
Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr
370 375 380
Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln
385 390 395 400
Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr
405 410 415
Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu
420 425 430
Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg
435 440 445
Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala
450 455 460
Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu
465 470 475 480
Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly
485 490 495
Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro
500 505 510
Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu
515 520 525
Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly
530 535 540
Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
545 550
Claims (10)
1.一种构建DNA文库的方法，其特征在于，包括：
将DNA样本进行末端修复后，利用耐高温聚合酶对DNA样本进行加腺苷酸尾处理，以便得到加尾后的DNA，且所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的；以及
将所述加尾后的DNA进行接头连接处理，以便得到连接产物，
其中，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理的条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是在缓冲液中进行的，所述缓冲液的pH值为8.5-9.0，镁离子浓度为8-12mM，
任选地，所述缓冲液的pH值为8.8，镁离子浓度为10mM。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液含有8-12mM Tris-HCl、8-12mMMgCl2、45-55mM KCl和0.05-0.15％Triton-x-100，PH8.5-9.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐高温聚和酶为Taq DNA聚合酶，
任选地，所述Taq DNA聚合酶为改良的Taq DNA聚合酶，所述改良的Taq DNA聚合酶具有SEQ ID NO：1所示的序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述耐高温聚合酶的浓度为0.2-1U。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理的条件：温度为32-37℃，时间为8-14分钟；温度为73-75℃，时间为10-12分钟。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述末端修复前进一步包括：
将所述DNA样本进行片段化预处理，以便得到DNA片段，
任选地，所述片段化预处理为酶切或机械打断。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接头连接处理是利用T4 DNA连接酶进行的，且所述T4 DNA连接酶的浓度为4-6U，
任选地，进一步包括：对所述连接产物进行扩增，所述扩增产物构成所述DNA文库。
9.一种构建DNA文库的试剂盒，其特征在于，包括：
末端修复和加腺苷酸尾区，所述末端修复和加腺苷酸尾区含有耐高温聚合酶；以及
接头连接区；
其中，所述末端修复和加腺苷酸尾区具有反应控制件，所述反应控制件的控制条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述末端修复和加腺苷酸尾区还含有缓冲液，所述缓冲液含有8-12mM镁离子，且pH值为8.5-9.0；
所述缓冲液的pH值为8.8，镁离子浓度为10mM，
任选地，所述缓冲液含有8-12mM Tris-HCl、8-12mM MgCl2、45-55mM KCl和0.05-0.15％Triton-x-100，PH8.5-9.0，
任选地，所述末端修复和加腺苷酸尾区还含有T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶，
任选地，所述Taq DNA聚合酶的浓度为0.3-0.5U，
任选地，所述接头连接区含有T4 DNA连接酶，所述T4 DNA连接酶的浓度为4-6U，
任选地，进一步包括：
扩增区，所述扩增区用于进行扩增处理，扩增产物构成所述DNA文库。
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