CN103955630A - 制备参考数据库及对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备参考数据库及对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法。其中，制备参考数据库的方法包括：对多个游离核酸样本进行测序；确定多个测序序列中比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基的测序深度；将该测序深度针对每一个碱基在参考序列上的位置进行作图；基于所得到的图和所述多个游离核酸样本的个数，确定筛选阈值；基于该筛选阈值，对该参考序列的目标区域进行筛选，以便获得参考数据库。利用该方法，能够有效地针对目标区域进行参考数据库的制备，使制备获得的参考数据库的序列相对于目标区域大大减少，进而将该参考数据库用于待测游离核酸样本的目标区域序列比对时，工作量显著降低，但比对结果准确、可靠。

Description

制备参考数据库及对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法

技术领域

本发明涉及制备参考数据库及对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法。

背景技术

目前常用的对游离核酸样本进行目标区域序列比对分析的方法，主要步骤包括：数据的质控；测序序列比对到参考序列上；统计参考序列的覆盖度；给出Z值。其中，Z值是实际数据和一个参考数据集的标准差，基于Z值，可以确定样本在目标区域是否存在异常。然而，该方法存在较多问题，例如：测序序列的比对时间久，Z值统计偏差较多。

因而，现阶段的对游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法，仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于目标区域序列比对的参考数据库，以及能够快速、高效地对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备参考数据库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：（1）对多个游离核酸样本进行测序，以便获得多个测序序列；（2）确定所述多个测序序列中比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基的测序深度；（3）将所述测序深度针对所述比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基在参考序列上的位置进行作图，其中，所述测序深度为Y轴，所述碱基在参考序列上的位置为X轴；（4）基于所述步骤（3）中所得到的图和所述多个游离核酸样本的个数，确定比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域的测序深度，作为筛选阈值；（5）基于所述筛选阈值，对所述参考序列的目标区域进行筛选，以便获得经过筛选的目标区域，所述经过筛选的目标区域构成所述参考数据库。

发明人惊奇地发现，利用本发明的制备参考数据库的方法，能够有效地针对目标区域进行参考数据库的制备，即去除实际测序数据进行分析时参考数据库中的冗余部分，使最终筛选获得的数据即制备获得的参考数据库的序列相对于目标区域大大减少，甚至仅为目标区域序列长度的几分之一，进而，将该参考数据库用于游离核酸样本的目标区域序列比对时，工作量显著降低，但比对结果准确、可靠。

另外，根据本发明上述实施例的制备参考数据库的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述游离核酸样本来源于哺乳动物优选人的外周血。

根据本发明的实施例，利用选自Hiseq、Miseq、Ion Torrent、Proton、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。由此，测序通量高，准确性好。

根据本发明的实施例，所述参考序列为人类基因组序列。根据本发明的一些具体示例，所述参考序列为选自人类染色体，优选人类21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体上的至少一段的序列。由此，能够有效实现制备获得人类染色体上特定区域的参考数据库。

根据本发明的实施例，所述筛选阈值是通过以下步骤确定的：计算所述多个测序序列对所述游离核酸样本所来源物种的整个基因组的覆盖度值M；在步骤（3）中所得到的图上，选取测序深度为N的比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域，作为待测区域，其中N大于M；基于所述多个游离核酸样本在所述待测区域的比对结果，确定所述多个游离核酸样本是否存在异常，以便获得第一异常确定结果；将所述多个测序序列直接比对到所述参考序列，并基于直接比对结果，确定所述多个核酸样本是否存在异常，以便获得第二异常确定结果；以及将所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果进行比较，并以所述多个游离核酸样本中99.9%以上的样本的所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果一致时的N值作为筛选阈值。

根据本发明的实施例，所述经过筛选的目标区域为测序深度大于所述筛选阈值的比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：根据前面所述的制备参考数据库的方法，针对所述目标区域制备参考数据库；对所述待测游离核酸样本进行测序，以便获得测序数据；以及将所述测序数据与所述参考数据库进行比对。

根据本发明的实施例，利用本发明的对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法，能够有效实现对待测游离核酸样本的序列比对，并且相对于目前的测序比对方法，本发明的方法操作简便、成本低、工作量小、快速高效，且结果准确可靠。

根据本发明的实施例，所述目标区域为选自人类染色体，优选人类21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体上的至少一段的序列。由此，能够有效实现对待测游离核酸样本的人类染色体特定区域的序列比对。

根据本发明的实施例，进一步包括：基于比对结果，确定所述待测游离核酸样本是否存在异常。

根据本发明的实施例，利用选自Hiseq、Miseq、Ion Torrent、Proton、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。由此，测序通量高、结果准确，有利于后续的比对分析。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的制备参考数据库的方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例，比对到21号染色体上的碱基的测序深度分布图；

图3显示了根据本发明一个实施例，在图2上进行阈值筛选后的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

制备参考数据库的方法

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备参考数据库的方法。根据本发明的实施例，参照图1，该方法包括以下步骤：

（1）对多个游离核酸样本进行测序

首先，对多个游离核酸样本进行测序，以便获得多个测序序列。

根据本发明的实施例，所述游离核酸样本的来源不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述游离核酸样本来源于哺乳动物优选人的外周血游离DNA。

根据本发明的实施例，可以采用的测序装置不受特别限制，只要能够有效实现对多个游离核酸样本的测序即可。根据本发明的一些具体示例，可以利用选自Hiseq、Miseq、IonTorrent、Proton、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。由此，测序通量高，准确性好。

（2）确定多个测序序列中比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基的测序深度

其次，确定所述多个测序序列中比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基的测序深度。

根据本发明的实施例，所述参考序列为人类基因组序列。根据本发明的一些具体示例，所述参考序列为选自人类染色体，优选人类21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体上的至少一段的序列。由此，能够有效实现制备获得人类染色体上特定区域的参考数据库。

（3）将所述测序深度针对所述每一个碱基在参考序列上的位置进行作图

接着，将所述测序深度针对所述比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基在参考序列上的位置进行作图，其中，所述测序深度为Y轴，所述碱基在参考序列上的位置为X轴。

（4）基于所得到的图和所述多个游离核酸样本的个数，确定筛选阈值

接下来，基于所述步骤（3）中所得到的图和所述多个游离核酸样本的个数，确定比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域的测序深度，作为筛选阈值。

根据本发明的实施例，所述筛选阈值是通过以下步骤确定的：计算所述多个测序序列对所述游离核酸样本所来源物种的整个基因组的覆盖度值M；在步骤（3）中所得到的图上，选取测序深度为N的比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域，作为待测区域，其中N大于M；基于所述多个游离核酸样本在所述待测区域的比对结果，确定所述多个游离核酸样本是否存在异常，以便获得第一异常确定结果；将所述多个测序序列直接比对到所述参考序列，并基于直接比对结果，确定所述多个核酸样本是否存在异常，以便获得第二异常确定结果；以及将所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果进行比较，并以所述多个游离核酸样本中99.9%以上的样本的所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果一致时的N值作为筛选阈值。

具体地，例如：对10个人类游离核酸样本进行21号染色体三体的检测时，第一异常确定结果为5个阳性和5个阴性，而正常测序比对获得的检测结果即第二异常确定结果为6个阳性和4个阴性，其中有2个检测结果不正确，则仅有80%的样本的第一异常确定结果和第二异常确定结果一致，则此时的N值就不能作为筛选阈值。进而，可以选择大于该N值的测序深度，继续上述检测，直至所述多个游离核酸样本中99.9%以上的样本的所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果一致时，可将该N值作为筛选阈值。

（5）基于筛选阈值对参考序列的目标区域进行筛选，以便获得参考数据库

然后，基于所述筛选阈值，对所述参考序列的目标区域进行筛选，以便获得经过筛选的目标区域，所述经过筛选的目标区域构成所述参考数据库。具体地，根据本发明的实施例，所述经过筛选的目标区域为测序深度大于所述筛选阈值的比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域。

发明人惊奇地发现，利用本发明的制备参考数据库的方法，能够有效地针对目标区域（例如人类21号染色体）进行参考数据库的制备，即去除实际测序数据中的冗余部分，使最终筛选获得的数据即制备获得的参考数据库的序列相对于目标区域大大减少，甚至仅为目标区域序列长度的几分之一，进而，将该参考数据库用于游离核酸样本的目标区域序列（例如人类21号染色体）的比对时，工作量显著降低，但比对结果准确、可靠。

对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

首先，根据前面所述的制备参考数据库的方法，针对所述目标区域制备参考数据库。根据本发明的实施例，所述目标区域为选自人类染色体，优选人类21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体上的至少一段的序列。由此，能够有效实现对待测游离核酸样本的人类染色体特定区域的序列比对。

接着，对所述待测游离核酸样本进行测序，以便获得测序数据。根据本发明的实施例，可以采用的测序装置不受特别限制，只要能够有效实现对多个游离核酸样本的测序即可。根据本发明的一些具体示例，可以利用选自Hiseq、Miseq、Ion Torrent、Proton、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。由此，测序通量高、结果准确，有利于后续的比对分析。

然后，将所述测序数据与所述参考数据库进行比对。

根据本发明的实施例，可以进一步包括：基于比对结果，确定所述待测游离核酸样本是否存在异常。由此，基于本发明的方法能够有效实现对游离核酸样本进行序列分析和倍型异常检测，例如可以有效地用于例如孕妇胎儿21号染色体三体的检测。

根据本发明的实施例，利用本发明的对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法，能够有效实现对待测游离核酸样本目标区域例如人类21号染色体的序列比对，并且相对于目前的目标区域测序比对方法，本发明的方法操作简便、成本低、工作量小、快速高效，且结果准确可靠。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1：

参照图1，根据本发明的制备参考数据库的方法，按照以下步骤，以人类21号染色体为目标区域，制备参考数据库：

（1）利用Illumina Hiseq PE-100程序测序对120个来源于孕妇外周血的游离核酸样本进行测序，以便获得多个测序序列，具体操作流程详见Hiseq操作说明书。其中，每个样本约5M(百万)个测序序列，每个测序序列的读长为35个碱基。

（2）确定所述多个测序序列比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基的测序深度。其中，该参考序列的目标区域即前述的人类21号染色体的核苷酸序列。

（3）将所述测序深度针对所述比对到21号染色体上的每一个碱基在人基因组上的位置进行作图，其中，所述测序深度为Y轴，所述碱基在人基因组上的位置为X轴。结果，见图2。

（4）计算所述多个测序序列对人类基因组的覆盖度值M；在图2上选取测序深度为N的比对到所述21号染色体上的多段连续区域，作为待测区域，其中N大于M；基于所述多个游离核酸样本在所述待测区域的比对结果，确定所述多个游离核酸样本是否存在异常，以便获得第一异常确定结果；将所述多个测序序列直接比对到人基因组上，并基于直接比对结果，确定所述多个核酸样本是否存在21号染色体三体的情况，以便获得第二异常确定结果；以及将所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果进行比较，并以所述多个游离核酸样本中99.9%以上的样本的所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果一致时的N值作为筛选阈值。

具体地：

首先，将前面获得的120个样本的多个测序序列直接比对到人基因组上，经生物信息分析得到了所述第二异常确定结果：120个样本中有9个为21三体阳性，其余为正常样本。

然后，在步骤（1）中120个样本经测序总共得到约600M（0.6G）个测序序列，按照一个人的基因组为3G(30亿)个碱基计算，其对整个人基因组的覆盖度值M=0.6G*35/3G=7倍。进而，经过反复的检测，发明人发现，当在图2上选取测序深度为N=13的比对到21号染色体上的多段连续区域，即该图上13倍覆盖度的多段连续区域作为待测区域时，获得的第一异常确定结果与前述的第二异常确定结果一致，即可以检测到120个样本中所有的21三体阳性样本（9个为阳性）。从而，将筛选阈值确定为13（倍测序深度）。

（5）基于所述筛选阈值13（倍测序深度），对21号染色体区域进行筛选，具体地，在图2上筛选测序深度大于13的比对到21号染色体上的多段连续区域作为经过筛选的目标区域，结果见图3。如图3所示，图中阴影部分涉及的21号染色体区域，即为经过筛选的目标区域（约为21染色体区域长度的1/10），所述经过筛选的目标区域构成所述参考数据库。

实施例2

根据本发明的对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法，对50个人外周血游离DNA样本（已知9个为21三体阳性，41个正常）进行21号染色体序列比对以及21三体检测，具体步骤如下：

1、Hiseq测序

基于Illumina Hiseq PE-100测序标准，对50个人外周血游离DNA样本进行文库构建，并利用Illumina Hiseq PE-100测序仪进行测序，具体操作流程详见Hiseq操作说明书。其中，测序序列为5M，每个测序序列的读长为35个碱基。

由此，获得各人外周血游离DNA样本的测序结果。

2、比对分析

将上述获得的各人外周血游离DNA样本的测序结果，与实施例1中制备的参考数据库进行比对，即仅选取图3中阴影部分涉及的21号染色体区域进行测序序列比对分析。进而，基于比对结果，确定50个人外周血游离DNA样本中9个为21三体阳性，41个正常。与已知结果完全一致。

并且，基于参考数据库仅为21号染色体区域的1/10，从而在不改变原来的测序方法，每个样本测序约5M的序列，在计算分析的时候，只需要原来的1/10的计算量，就可以达到区分阳性样本的效果。换言之，在同样的测序量的基础上，在数据分析时，采用本发明的方法，可以节省90%的计算资源。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (11)

1.一种制备参考数据库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对多个游离核酸样本进行测序，以便获得多个测序序列；

（2）确定所述多个测序序列中比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基的测序深度；

（3）将所述测序深度针对所述比对到参考序列的目标区域上的每一个碱基在参考序列上的位置进行作图，其中，所述测序深度为Y轴，所述碱基在参考序列上的位置为X轴；

（4）基于所述步骤（3）中所得到的图和所述多个游离核酸样本的个数，确定比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域的测序深度，作为筛选阈值；

（5）基于所述筛选阈值，对所述参考序列的目标区域进行筛选，以便获得经过筛选的目标区域，所述经过筛选的目标区域构成所述参考数据库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述游离核酸样本来源于哺乳动物优选人的外周血。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用选自Hiseq、Miseq、Ion Torrent、Proton、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参考序列为人类基因组序列。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述参考序列为选自人类染色体，优选人类21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体上的至少一段的序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选阈值是通过以下步骤确定的：

计算所述多个测序序列对所述游离核酸样本所来源物种的整个基因组的覆盖度值M；

在步骤（3）中所得到的图上，选取测序深度为N的比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域，作为待测区域，其中N大于M；

基于所述多个游离核酸样本在所述待测区域的比对结果，确定所述多个游离核酸样本是否存在异常，以便获得第一异常确定结果；

将所述多个测序序列直接比对到所述参考序列，并基于直接比对结果，确定所述多个核酸样本是否存在异常，以便获得第二异常确定结果；以及

将所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果进行比较，并以所述多个游离核酸样本中99.9%以上的样本的所述第一异常确定结果和所述第二异常确定结果一致时的N值作为筛选阈值。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经过筛选的目标区域为测序深度大于所述筛选阈值的比对到所述参考序列的目标区域上的多段连续区域。

8.一种对待测游离核酸样本进行目标区域序列比对的方法，其特征在于，包括：

根据权利要求1～7任一项所述的方法，针对所述目标区域制备参考数据库；

对所述待测游离核酸样本进行测序，以便获得测序数据；以及

将所述测序数据与所述参考数据库进行比对。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述目标区域为选自人类染色体，优选人类21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体上的至少一段的序列。

10.根据权利要求8所述的方法，进一步包括：

基于比对结果，确定所述待测游离核酸样本是否存在异常。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用选自Hiseq、Miseq、Ion Torrent、Proton、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。