CN101967486B

CN101967486B - 一种抗虫基因OsRG1及其编码产物与应用

Info

Publication number: CN101967486B
Application number: CN2010102184317A
Authority: CN
Inventors: 娄永根; 周国鑫; 齐金峰; 任楠; 毛碧增
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: CN101967486A

Abstract

本发明公开了一种抗虫相关基因OsRG1其及其编码产物与应用，该抗虫基因OsRG1具有SEQ ID No.1的DNA序列。该序列由763个核苷酸碱基组成，包含一个由624个核苷酸构成的完整的编码框，编码208个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现OsRG1与水稻的抗虫相关，该基因的表达产物能对褐飞虱起很好的趋避和抗生作用。本发明将在作物育种，特别是在水稻抗虫育种中得到广泛应用。

Description

一种抗虫基因OsRG1及其编码产物与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种抗虫基因OsRG1及其编码产物与应用。

背景技术

随着全球人口的增加和耕地面积的减少，人们对粮食单产的要求越来越高。虫害造成的粮食损失一般约占粮食总产量的10-30％，重灾年份则颗粒无收，因此如何减少虫害以增加粮食总产量，是人们面临的迫切问题。培育抗性品种是减少害虫危害的一个重要措施。

稻飞虱属于同翅目飞虱科，主要包括褐飞虱Nilaparvata lugens

白背飞虱Sogatella furcifera等，是我国水稻上的最重要害虫之一。近几年来，则为稻飞虱主要种类之一的褐飞虱，更是年年大暴发，对我国水稻粮食生产造成了严重危害。据浙江省农业厅调查统计，2005年浙江省第5代褐飞虱发生量每667m²达30万头以上的有66.7万hm²，占水稻总种植面积的86％；每667m²在100万头以上的有33.3万hm²，占42％；最高田块的发生量达到每667m²1000万头以上；绝收的面积达5333hm²，造成直接水稻产量损失120万吨。造成褐飞虱近几年来特大爆发的一个重要原因，是目前生产上缺乏抗稻飞虱的水稻品种。因此，发掘抗稻飞虱基因，培育抗稻飞虱品种，将是控制稻飞虱危害的一个重要方面。

至今，国内外已在水稻抗稻飞虱基因鉴定与定位等方面取得了很大成绩。至今已命名了13个抗褐飞虱的主基因，并对其中的8个进行了染色体定位；此外，也鉴定和定位了10多个抗褐飞虱的数量形状基因座(QTL)。对抗白背飞虱的主基因已命名了6个，并对其中的2个进行了定位；同时，也有10多个抗白背飞虱的数量形状基因座被鉴定和定位。然而，至今为止，国内外尚没有克隆到水稻的抗稻飞虱基因。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗虫基因OsRG1及其编码产物与应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种抗虫基因OsRG1，它具有SEQ ID No.1的DNA序列。

一种权利要求1所述抗虫基因OsRG1的编码蛋白，它包含SEQ ID No.2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。

一种权利要求1所述抗虫基因OsRG1在转基因植物中的应用。

一种权利要求1所述抗虫基因OsRG1在作物育种中的应用。

本发明的有益效果是，本发明利用SSH方法和基因芯片技术分析了水稻在害虫为害后的差异表达基因，结合RT-PCR和RACE技术分离获得了OsRG1基因；以OsRG1基因片段合成同位素探针，应用Northern杂交方法分析了OsRG1基因在飞虱为害后的表达情况；利用转基因技术验证了OsRG1基因的生物学功能，发现OsRG1基因在水稻对稻飞虱的抗性中发挥着重要作用。该基因的分离克隆，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗稻飞虱育种将起到重要的促进作用。

附图说明

图1是OsRG1基因特异PCR扩增产物凝胶电泳图；

图2是pMD-19-OsRG1酶切鉴定凝胶电泳图；

图3是水稻受稻飞虱为害后OsRG1基因的表达情况电泳图；

图4是OsRG1基因的结构示意图；

图5是含OsRG1基因的水稻遗传转化质粒T-DNA框结构示意图；

图6是OsRG1基因表达减少稻飞虱的产卵量；

图7是OsRG1基因表达明显增强对稻飞虱的抗性。

具体实施方式

本发明利用差减杂交技术SSH，结合基因芯片检测技术，分析了水稻在害虫为害后所诱导的差异表达基因。从SSH克隆库中分析获得OsRG1基因片段，以此片段设计正向和反向引物，分别进行3’-RACE和5’-RACE RP-PCR获得了该基因的5’端和3’端基因PCR片段，并直接测序拼接。根据基因测序拼接获得DNA序列，在5’端和3’端非编码区重新设计一对引物OsRG1-F1和OsRG1-R1，提取害虫为害的水稻叶片mRNA并反转录成cDNA，以此cDNA为模板并以OsRG1-FA和OsRG1-R1为引物进行常规PCR反应，获得OsRG1全基因序列并连接到pMD-T克隆载体测序验证。Northern杂交结果证明OsRG1在害虫早期就开始诱导表达，并且持续相当长的时间，证明OsRG1基因在水稻种起重要作用。通过获得含OsRG1基因的水稻转基因突变体，通过生物测定，证明了OsRG1是一个重要抗飞虱基因。对该基因的分离和克隆以及生物学功能的分析，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗稻飞虱育种将起到重要的促进作用。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1.OsRG1基因的分离和序列分析

利用基因芯片技术和SSH技术分析了水稻在害虫为害后的差异表达基因，获得害虫为害诱导的特异表达基因克隆库，并筛选到单克隆LYG22。测序分析发现此克隆并没有覆盖该基因的完整编码区。

为了获得该片段的完整编码区序列，我们用3’-RACE和5’-RACE技术扩增该片段的3’末端和5’末端片段。根据TaKaRa Race试剂盒方法，以害虫为害水稻叶片mRNA为模板合成cDNA双链。以该片段正向引物F1与3’RACE锚定引物P3配对，反向引物R1与5’RACE锚定引物P5配对作常规PCR分别获得5’RACE PCR片段和3’RACE PCR片段，PCR片段经PCR片段回收试剂盒纯化后，测序得到LYG22的5’末端和3’末端序列信息。

以LYG22的5’末端和3’末端序列信息在5’端和3’端非编码区重新设计一对引物OsRG1-F1和OsRG1-R1，并以上面合成的cDNA双链为模板，PCR扩增后连接入pMD-19T克隆载体，挑取4个克隆送上海生物工程公司测序，每个分别测通2次。测序结果，用生物信息专业DNA拼接软件Conting 3.1拼接。获得OsRG1基因DNA序列，见序列表SEQ ID No.1表示的序列。根据该序列的开放阅读框(0RF)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。

2.OsRG1基因在害虫为害后的表达谱分析

取水稻经飞虱为害O，1.5，3，6，12，24，48，72h的茎杆，用Trizol法提取其总RNA，分别将10μg各时间点RNA经1％甲醛电泳分离后，通过毛细管上吸的方法转到尼龙膜上，经紫外交联固定RNA在膜上。以OsRG1基因片段合成同位素探针，对膜进行杂交分析。Northern杂交结果证明OsRG1在害虫为害早期就开始诱导表达，并且持续相当长的时间(图3)。

3.构建含OsRG1基因水稻遗传转化载体(图5)。构建的表达载体以电击法转化农杆菌，获得含有表达载体的工程农杆菌，以本实验成熟的农杆菌转基因方法侵染水稻愈伤，愈伤经抗性筛选后获得整合了目的基因的愈伤组织，再经分化培养基和生根培养基中培养，获得含OsRG1基因转基因水稻。对水稻植株进行观察未发现植株生理缺陷，能获得正常世代。生物测定试验表明，稻飞虱成虫含OsRG1基因水稻上的产卵量明显减少，如图6A和B。稻飞虱抗性实验表明含OsRG1基因水稻长势明显优于对照水稻，接稻飞虱在16天后对照水稻基本枯死，而含OsRG1基因水稻水稻仅外面的叶片枯黄(图7)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1、OsRG1 cDNA片段的获得

1)水稻茎杆RNA的提取、质量检测及总cDNA第一链合成；

2)从总cDNA第一连中以聚合酶链式反应(PCR)合成OsRG1 cDNA片段

上游引物：5’-ATCAGGATTTGAGAGAG-3’

下游引物：5’-ATTCTTGGATTCTATAAAGACCTA-3’

PCR扩增条件：95℃×3min→(98℃×10sec→68℃×1min)×30循环→72℃×1Omin，得到特异PCR扩增产物见附图1。

3)pMD-19-OsRG1克隆载体构建及基因碱基解析

PCR产物通过T克隆入Takara公司pMD-19载体获得pMD-19-OsRG1载体，并通过CaCl₂法转入TG1大肠杆菌。pMD-19-OsRG1经EcoRI和PstI酶切鉴定(图2)后，将含pMD-19-OsRG1载体的TG1菌液送上海生物工程有限公司测序。用软件Chromas和Contig对测序进行拼接获得序列表中的序列SEQ ID No.1。将此cDNA的基因命名为OsRG1。

实施例2、OsRG1基因表达谱分析-Northern杂交

将各种材料的总RNA荧光法定量后，取10μg各个样品在1.0％的琼脂糖凝胶上75V电压电泳60min，在GENE凝胶成像仪成像后，浸泡于0.05M的NaOH中25min，用DEPC处理的ddH20淋洗3-4次，放入10倍体积的20×SSC中，温和摇动45min。

用向上毛细管转移法，使RNA吸附在带正电的尼龙膜上，经UV交联仪交联后，80℃烘烤120min固定。

探针标记：按Prime-a-Gene Label ing Syntem(Promega)试剂盒说明书进行。RPH1基因DNA模板25ng，经95-100℃水浴变性5min，立即放冰上冷却，按表1要求加入相应的试剂，加入同位素的操作需在有机屏挡板后进行。25℃反应60min后，95-100℃变性5min，冰上放置5min，备用。

表1探针标记反应体系

组分	体积(μl)	终浓度
			模板DNA	10	500ng/ml
5×buffer	10	1×
			dNTP	2	20uM
BSA	2	400ug/ml
			[α-³²P]d CTP	2.5	333nM
DNA Polymerase	1	100U/ml
			H₂O	22.5
Tatol	50

预杂交和杂交：杂交膜在0.25M磷酸缓冲液(pH7.2)缓冲液中润湿，放入杂交管，加入10ml的预杂交液(0.5M pH7.2磷酸缓冲液；0.5M pH8.0EDTA；20％SDS；0.1g BSA)，在杂交炉中62-65℃预杂交1-4小时。加入OsRG1同位素探针，65℃杂交12-18小时。倒去杂交液，杂交膜在Wash solution I(1×SSPE，0.5％SDS(W/V))室温洗脱2次，每次5min；在Wash solution II(O.2×SSPE，0.1％SDS(W/V))65℃洗2次，每次15min。杂交膜用吸水纸吸干后，用保鲜膜包裹，平整放入磷屏。压屏2小时后在台风扫描仪成像。

实施例3、OsRG1基因抗虫功能研究

1)设计正向和反向引物，PCR扩增出第89到第627的长624个碱基的DNA片段OsRG1基因全编码序列。

2)以DNA亚克隆方法OsRG1基因插入到pCAMBIA1300，获得含OsRG1基因的表达载体p1300-OsRG1。

3)将p1300-OsRG1，以电击法转入农杆菌EHA105，获得农杆菌工程细胞系。以农杆菌转染法侵染水稻愈伤组织，共侵染水稻愈伤在含有潮霉素的NBDS培养基上培养，第1次筛选20天。当新的抗性愈伤长出后，将抗性愈伤从母体上剥离，转入新的筛选培养基NBDS2，一个抗性愈伤即为一个株系。抗性愈伤经继代扩繁后，在预分化培养基MS-PG上，26-28℃、避光，培养7-10天；然后，转入分化培养基MS-RG，16h光照、26-28℃培养2-3周，愈伤先转绿后分化出T₀代植株。

4)T₀代转基因植株获得的T₁代种子，经含潮霉素的培养基筛选，去除未含有OsRG1的植株，并单株种植。收获T₂代种子，对每个单株的种子进行鉴定。获得转OsRG1基因的纯合品系，用于后面的生物学功能分析。

5)转基因品系和非转基因水稻都进行害虫为害试验，比较稻飞虱雌成虫产卵量、选择性等指标，分析OsRG1的在抗稻飞虱中的作用。

实施例4、OsRG1基因在水稻抗虫育种中的应用

1)以实施例3获得的转OsRG1基因的纯合品系水稻为材料，分析OsRG1基因在水稻抗虫育种中的应用。

2)稻飞虱分别危害转基因苗与对照苗，16天后对照水稻基本枯死，而含OsRG1基因水稻水稻仅外面的叶片枯黄(图7)。可见OsRG1基因可以很好的应用于抗稻飞虱的水稻抗虫育种。

Claims

1.一种抗虫基因OsRG1，其特征在于，它的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述抗虫基因OsRG1的编码蛋白，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种权利要求1所述抗虫基因OsRG1在转基因水稻中的应用。

4.一种权利要求1所述抗虫基因OsRG1在水稻育种中的应用。