CN114369149A - 一种具有抗逆能力的蛋白质、分离的核酸、重组载体、宿主细胞及其应用 - Google Patents
一种具有抗逆能力的蛋白质、分离的核酸、重组载体、宿主细胞及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗逆能力的蛋白质、分离的核酸、重组载体、宿主细胞及其应用，属于生物技术领域。该具有抗逆能力的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性，用于编码上述蛋白质的分离的核酸的序列与SEQ ID NO.2所示的碱基序列至少具有90％的同一性。本申请提供的具有抗逆能力的蛋白质具有较强的抗旱能力，可用于增强植物抗逆性。此外，本申请还提供了相应的重组载体、宿主细胞以及提高植物抗逆性的方法，上述方案为紫花苜蓿抗旱分子设计育种提供了新的基因资源，对培育和获得具有抗旱植物及其功能增强新品种具有参考及借鉴意义，对我国畜牧业、农业、林业等的发展起着积极作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种具有抗逆能力的蛋白质、分离的核酸、重组载体、宿主细胞及其应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生、豆科苜蓿属草本植物，其根系粗壮，根茎发达，再生性强，每年可以收割5-6次，亩产鲜草在2-6吨左右。因具有高产、富含丰富的蛋白质和家畜喜食等优点，在畜牧业上被广泛利用，素有“牧草之王”之称。紫花苜蓿不仅参与农业生态系统中的氮循环，还在固定氮素、培肥地力、改良土壤和防风固沙等方面发挥着不可替代的作用。
紫花苜蓿营养价值高，其粗蛋白水平可以达到干物质质量的12.3％-26.1％，优级苜蓿干草作为重要的绿色蛋白源泉，其含有的粗蛋白可高达20％。粗蛋白质中含有多种氨基酸，包括动物生长发育所需的必需氨基酸和一些稀有氨基酸，氨基酸组成中，赖氨酸和色氨酸含量比例均衡，从而可以较好地满足动物氨基酸摄入的需要。苜蓿中含有苜蓿多糖、大豆黄酮、异黄酮和UGF(未知促生长因子)等营养因子，在畜禽生产中具有改善生产性能、增强免疫力和提高畜禽肉品质的作用，还具有降脂、降血糖和抗癌等多种功效。此外，苜蓿含有优质粗纤维，能够调节肠道微生态平衡等生理功能。紫花苜蓿除了用于优质饲料外，还是一种低能量、高营养的菜品，常见于中国北方餐桌。在国外，紫花苜蓿加工产品或提取物作为药物和保健品见于市场。
紫花苜蓿作为重要的豆科植物之一，除了在畜牧业发展中占有不可替代的地位，还在生态恢复、涵养水源以及改良盐碱地等方面都发挥着重要作用。通常，在有限土地面积内种植粮食作物，发挥土地最大潜能是保障粮食安全的重要举措。苜蓿具抗旱、抗寒和耐盐碱特性，在土壤肥力低下或不适宜种植粮食作物的地区栽培既避免了牧草与粮食竞争耕地，又改良了土壤环境，同时向社会不断地输出肉、奶等畜产品。因此，苜蓿的栽培在生态和经济等方面起着不可或缺的作用。
在干旱胁迫下，紫花苜蓿的正常形态会受到影响，主要表现在细胞生长、细胞分化、叶片扩张、根系发育和分蘖等方面，从而严重影响紫花苜蓿的品质和产量，并限制紫花苜蓿的地理分布。
采用分子育种手段培育耐旱性较强的紫花苜蓿新品系并推广到畜牧业生产中，不仅能提高紫花苜蓿的产量，而且对紫花苜蓿的广泛种植也具有重要的意义。因此，对与胁迫耐受相关的关键基因的发现和应用对于培育具有或增强干旱耐受性的紫花苜蓿、扩大紫花苜蓿生产种植规模，加快畜牧产业发展具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有抗逆能力的蛋白质，可用于增强植物(如紫花苜蓿)的抗逆性。
本发明的目的之二在于提供一种编码上述蛋白质的分离的核酸。
本发明的目的之三在于提供一种包括上述核酸的重组载体。
本发明的目的之四在于提供一种包括上述重组载体或基因组中整合有外源的上述核酸的宿主细胞。
本发明的目的之五在于提供一种上述具有抗逆能力的蛋白质的制备方法。
本发明的目的之六在于提供一种上述蛋白质或上述核酸在增强植物抗逆性中的应用。
本发明的目的之七在于提供一种提高植物抗逆性的方法。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种具有抗逆能力的蛋白质，该具有抗逆能力的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性。
在优选的实施方式中，具有抗逆能力的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在可选的实施方式中，抗逆能力为抗旱性。
在可选的实施方式中，抗旱性为抗失水逆境的能力，失水逆境为与甘露醇终浓度为300-500mM的模拟逆境相同或等同的自然逆境。
第二方面，本申请提供一种分离的核酸，该核酸编码前述实施方式的蛋白质。
在可选的实施方式中，上述核酸的碱基序列与SEQ ID NO.2所示的碱基序列至少具有90％的同一性。
在优选的实施方式中，核酸的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面，本申请提供一种重组载体，其包括前述实施方式任一项的核酸。
第四方面，本申请提供一种宿主细胞，其包括前述实施方式的重组载体或基因组中整合有外源的前述实施方式任一项的核酸。
第五方面，本申请提供一种前述实施方式具有抗逆能力的蛋白质的制备方法，包括：采用前述实施方式任一项的核酸进行编码并通过生物表达和/或人工合成制备。
第六方面，本申请提供一种前述实施方式具有抗逆能力的蛋白质或前述实施方式任一项的核酸在增强植物抗逆性中的应用。
第七方面，本申请提供一种提高植物抗逆性的方法，包括以下步骤：
将前述实施方式任一项的核酸或核酸中具有SEQ ID NO.3所示的碱基序列的CDS区域导入目标植物基因组中，获得转基因植物种子；将转基因植物种子进行人工培育或使转基因植物种子自然生长。
在可选的实施方式中，上述核酸或CDS区域通过重组表达载体导入植物。
在可选的实施方式中，重组表达载体是将上述核酸或CDS区域插入酶切系统载体pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG的重组位点得到。
在可选的实施方式中，植物包括拟南芥、烟草或豆科植物。
在优选的实施方式中，豆科植物为紫花苜蓿。
本申请的有益效果包括：
本申请提供的具有抗逆能力的蛋白质可从遗传学上对植物品种进行优化，在不改变植物基本的生理结构和营养价值的前提下，提升了植物对干旱胁迫的耐受能力，在无法改变生存现状的情况下，让植物能趋近于正常生长，不仅对研究相关的抗旱相关调控基因提供思路和方法，而且对培育和获得具有抗旱性的植物(如拟南芥、烟草或豆科植物)具有重要的参考及借鉴意义，有利于培育具有或增强干旱耐受性的紫花苜蓿、扩大紫花苜蓿生产种植规模，加快畜牧产业发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中MsLEA10与其他11个物种的氨基酸序列同源性比对结果图；
图2为实施例2中MsLEA10基因受胁迫诱导时的Real-time PCR表达结果图；
图3为实施例3中MsLEA10在烟草叶片中的亚细胞定位结果图；
图4为实施例4中分子检测在转基因拟南芥中的目的基因的结果图；
图5至图7为实施例5中转基因和野生型拟南芥抗旱性比较的对比结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的具有抗逆能力的蛋白质、分离的核酸、重组载体、宿主细胞及其应用进行具体说明。
本申请提出一种具有抗逆能力的蛋白质，该具有抗逆能力的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性。
上述具有抗逆能力的蛋白质可经以下分离的核酸编码而得，编码后的该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的同一性示例性地可以为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等。例如，可通过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而成为同一性非100％的氨基酸序列。
在一些优选的实施方式中，具有抗逆能力的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
需说明的是，本申请中所称的“抗逆能力”和“抗逆性”主要为抗旱性。该“抗旱性”指抗失水逆境的能力，具体的，失水逆境为与甘露醇终浓度为300-500mM的模拟逆境相同或等同的自然逆境。
相应地，本申请还提供了一种分离的核酸，该核酸编码上述蛋白质。
在可选的实施方式中，上述核酸的碱基序列与SEQ ID NO.2所示的碱基序列至少具有90％的同一性。
同理地，该核酸的碱基序列与SEQ ID NO.2所示的碱基序列的同一性可为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。也即，即使碱基序列与SEQ IDNO.2不同，但其满足上述范围(不等于100％)的同一性且能够编码得到具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的蛋白质均在本申请的保护范围内。
在一些优选的实施方式中，上述分离的核酸的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，用于扩增上述碱基序列中任意片段的引物对所含的引物包括如序列SEQ ID No.4至SEQ ID No.11所示的引物序列中的至少一条引物序列。
其中，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5对应紫花苜蓿MsLEA10基因PCR引物，SEQ IDNo.6和SEQ ID No.7对应紫花苜蓿MsLEA10基因qPCR引物，SEQ ID No.6和SEQ ID No.7对应紫花苜蓿MsLEA10基因亚细胞定位载体构建引物，SEQ ID No.10和SEQ ID No.11对应紫花苜蓿MsLEA10基因过表达载体构建引物。
对应的扩增方法为PCR扩增法，具体的扩增条件可参照现有技术，在此不做过多赘述。
为便于区分，本申请中将具有上述分离的核酸的抗逆性基因定义为“MsLEA10基因”，经其编码的蛋白定义为“MsLEA10蛋白”。
此外，本申请还提供了一种重组载体，其包括上述核酸。
此外，本申请还提供了一种宿主细胞，其包括上述重组载体或基因组中整合有外源的上述分离的核酸。
此外，本申请还提供了一种上述具有抗逆能力的蛋白质的制备方法，例如可包括：采用上述核酸进行编码并通过生物表达和/或人工合成制备。
此外，本申请提供了一种上述具有抗逆能力的蛋白质或前述实施方式任一项的核酸在增强植物抗逆性中的应用。
在一些优选的实施方式中，上述应用可以是使分离的核酸在目标微生物(如细菌)体内表达。可参考地，上述目标微生物示例性但非限定性地可以为农杆菌或大肠杆菌。
此外，本申请还提供了一种提高植物抗逆性的方法，包括以下步骤：
将上述核酸或核酸中具有SEQ ID NO.3所示的碱基序列的CDS区域导入目标植物基因组中，获得转基因植物种子；将转基因植物种子进行人工培育或使转基因植物种子自然生长。
在可选的实施方式中，上述核酸或CDS区域通过重组表达载体导入植物。可参考地，重组表达载体是将上述核酸或CDS区域插入酶切系统载体pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG的重组位点得到。
上述植物可以为双子叶植物，也可以为单子叶植物，具体的，其示例性但非限定性地可包括拟南芥或烟草，优选为拟南芥。
需说明的是，本申请未提及和公开的有关编码、重组、表达等内容可参照相关现有技术，在此不做过多赘述。
承上，本申请提供的技术方案可从遗传学上对植物品种进行优化，在不改变植物基本的生理结构和营养价值的前提下，提升了植物对干旱胁迫的耐受能力，在无法改变生存现状的情况下，让植物能趋近于正常生长，有利于推动畜牧业、农业、林业的发展。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例提供的抗逆性相关的蛋白质，源于紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，是一种具有脱水耐受性功能的LEA家族蛋白，命名为MsLEA10；该抗逆性相关的蛋白质MsLEA10，由93个氨基酸残基组成。
实施例1
克隆和测序MsLEA10编码基因
包括以下步骤：
植物材料：紫花苜蓿中苜1号。
在正常条件下将健康饱满的种子在铺好双层滤纸的培养皿中萌发5d，当幼苗子叶展开后，移至配好的pH＝5.8的1/2MS营养液。培养7d后，在1/2MS营养液中添加NaC1至终浓度为150mM，处理24h，分别快速的取植物地上部分和地下部分，在液氮速冻，在-80℃保存备用。
用Trizo1提取法提取样品的RNA，然后用cDNA合成反转录试剂盒反转录成cDNA。PCR的检测体系的总体积为20μL，体系为引物(SEQIDNo.10)MsLEA10-F(5’-3’)：cggggtaccatggctcgttctttcgctaac 1μL、引物(SEQIDNo.11)MsLEA10-R(5’-3’)：cgcgtcgacgttgttgaattttttgcgg 1μL、2×EcoTaqPCRSuperMix 10μl、ddH2O 6μl和cDNA 2μL。
反应程序为：第一轮：94℃预变性3min；第二轮：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，第二轮循环38次；第三轮：72℃延伸7min；16℃终止，反应完成。
用1％琼脂糖中电泳检测结果，目的基因的长度为282bp，回收该基因的DNA片段，与表达载体pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG共同进行双酶切，酶切位点选择KpnI和SalI，通过凝胶电泳确认酶切结果，随后使用DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒(B110092，上海生工生物工程股份有限公司)进行产物回收，最后，利用T4DNA连接酶(M0202，NewEnglandBiolabs北京有限公司)，将酶切后的目的片段与表达载体连接起来，转入到大肠杆菌DH5a感受态细胞，均匀涂布在含Kan的LB抗性平板涂上，37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑，挑入含有Kan抗性的液体培养基中，在37℃摇床中200rpm过夜培养。
菌液检测合适后送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果表明菌落具有SEQ ID No.2中的核苷酸序列，将其命名为MsLEA10基因，将该基因编码的蛋白命名为MsLEA10蛋白，蛋白序列如SEQ ID No.1所示。
MsLEA10蛋白在GeneBank上与其他11个物种进行比对(结果如图1所示)，与赤豆的XP_017439080.1同源性最高，该基因在这些物种中的同源基因均属于LEA基因家族。
实施例2
实时荧光定量PCR分析MsLEA10编码基因的表达特性
包括如下步骤：
紫花苜蓿种子萌发和水培同实施例1。
用12d的紫花苜蓿幼苗进行胁迫处理：
干旱处理：在1/2MS水培营养液中添加Mannitol至终浓度为500mM，处理时间分别为0，1，3，6，12和24h及复水1，12h。分别快速的取植物地上部分和地下部分，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
盐处理：在1/2MS水培营养液中添加NaC1至终浓度为150mM，处理时间分别为0，1，3，6，12和24h及去除胁迫1，12h。分别快速的取植物地上部分和地下部分，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
植物激素脱落酸处理：在1/2MS水培营养液中添加植物激素脱落酸至终浓度为80μM，处理时间分别为0，1，3，12h。分别快速的取植物地上部分和地下部分，每个样品设置3个技术重复，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
样品RNA提取和反转录cDNA方法同实施例1。将cDNA稀释成50ng/μl。用(SEQIDNo.6)qRTMsLEA10-F(5’-3’)：tctccaacactctcacaagacgt1μl和(SEQIDNo.7)qRTMsLEA10-R(5’-3’)：ccatgaaaccttataagtcgaagc对样品进行扩增检测目的基因，以MsACTIN-F(5’-3’)：gacaatggaactggaatgg和MsACTIN-R(5’-3’)：caataccgtgctcaatgg作为内参。
qRT-PCR检测体系的总体积为20μl，体系为引物qRTMsLEA10-F 0.5μL、引物qRTMsLEA10-R 0.5μL、2×SG Fast qPCR Master Mix 10μL、DNF buffer 2μL、ddH2O 0.5μL和cDNA 2μL。
反应程序为：第一轮：95℃预变性10min；第二轮：95℃变性15s，60℃退火1min，第二轮循环40次，反应完成。
仪器为ABI7500实时荧光定量PCR，作图软件为Origin 9。
计算相对表达量的方法为2-△△Ct方法。△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参基因)Time x-(Ct目的基因-Ct内参基因)Time 0；Time x表示逆境处理时间，即x代表1，3，6，12或24h。Time 0表示没有经过逆境处理。
实验结果如图2所示，图2中，图表(A)为Mannito1终浓度为500mM条件下地上部分和地下部分MsLEA10蛋白在各时间点的表达情况；图表(B)为NaC1终浓度为150mM条件下地上部分和地下部分MsLEA10蛋白在各时间点的表达情况；图表(C)为植物激素脱落酸终浓度为80μM条件下地上部分和地下部分MsLEA10蛋白在各时间点的表达情况。
上述结果显示：MsLEA10基因在紫花苜蓿无论地上部分还是地下部分中均受到Mannitol、NaC1和植物激素脱落酸诱导。表明MsLEA10在逆境条件下基因水平受到影响，但在地上和地下受到影响程度不同。
实施例3
MsLEA10亚细胞定位分析
包括如下步骤：
1.材料准备
本实例中的植物材料为本氏烟草。在正常条件下将健康饱满的种子在离心管中用蒸馏水浸泡2h，在每个小穴盘中分散点播2-3粒种子，6-7周后烟草可接受侵染。
2.亚细胞载体的构建
根据MsLEA10基因的序列设计引物GFP-MsLEA10-F和GFP-MsLEA10-R，引物5’端分别引入BamHI和SacI酶切位点：(SEQIDNo.8)GFP-MsLEA10-F(5’-3’)：cgggatccatggctcgttctttcgctaac(SEQIDNo.9)GFP-MsLEA10-R(5’-3’)：gtgagctcttagttgttgaattttttgcgg。
以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用GFP-MsLEA10-F和GFP-MsLEA10-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μL，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μL、2.5mMdNTP 4μL引物GFP-MsLEA10-F 1μL、GFP-MsLEA10-R 1μL、ddH2O 32.5μL、Phusion DNAPolymerase 0.5μL和cDNA 1μL。
扩增条件为，第一轮：98℃预变性30s；第二轮：98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸15s，第二轮循环32次；第三轮：72℃延伸5min；第四轮：16℃终止。
用1％琼脂糖中电泳检测结果，目的基因的长度约为300bp。
回收纯化PCR扩增产物：用限制性内切酶BamHI和SacI酶切，回收酶切后的PCR产物，酶切产物的大小为282bp；同样，用限制性内切酶BamHI和SacI对PBI121-GFP表达载体酶切，酶切产物的大小为1.4kb。
将目的基因的酶切产物和PBI121-GFP表达载体的酶切产物用DNA连接酶(TakaRa，货号：6022)连接。热击连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞，在37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑送测序。选取MsLEA10测序序列与其CDS序列完全一致的阳性克隆菌落提质粒，并转入到农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBI121-MsLEA10-GFP，将菌液与50％甘油按1:1的体积比例混合，液氮速冻，-80℃保存备用。
从-80℃取重组农杆菌EHA105/pBI121-MsLEA10-GFP置于冰上，挑取部分冻住的菌块与3mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇24h。
取50μL小摇菌液加入到100mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇16-20h，摇到OD600＝0.5-1。
取部分大摇菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用MS重悬液重悬和稀释至OD500＝0.4-0.6，在28℃和120rpm复苏2-3h，即可注射烟草叶片。
注射法转化烟草叶片：
注射前一天给烟草浇充足的水，在光培养2-3h，使烟草处于健康饱满的状态。用1mL注射器将菌体从烟草叶背面无叶脉出注射进入叶片，叶片不要有太多注射孔。注射完后，黑暗处理24h，再在光照下生长24-96h即可切片观察。
使用仪器为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜：
观察方法：取注射孔附近健康的一小片叶片置于载玻片上，先在荧光显微镜下观察，若表达则用共聚焦显微镜拍照，以转内质网Maker(mCherry，RFP)的烟草作为maker。
结果如图3所示(包括3-1、3-2、3-3和3-4)，其中3-1为MsLEA10的GFP荧光图像；3-2为内质网marker的荧光图像；3-3为明场图像；3-4为3-1、3-2、3-3重合图像。
上述结果显示：MsLEA10基因定位于细胞核，内质网和细胞膜上。
实施例4
MsLEA10在提高拟南芥抗逆性中的应用
需说明的是：拟南芥作为模式植物，本申请利用其对MsLEA10基因进行功能分析和验证，其结论可以认为等同于紫花苜蓿中MsLEA10调控植物响应干旱的分子机理。
本实施例实验操作包括如下步骤：
一、转MsLEA10拟南芥的制备
1.重组载体的构建
1)MsLEA10基因的克隆
根据MsLEA10基因的序列设计引物MsLEA10-F和MsLEA10-R，引物5’端分别引入KpnI和SalI酶切位点：(SEQ ID No.10)MsLEA10-F(5’-3’)：cggggtaccatggctcgttctttcgctaac(SEQ ID No.11)MsLEA10-R(5’-3’)：cgcgtcgacgttgttgaattttttgcgg。
以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用MsLEA10-F和MsLEA10-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μl，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL、引物GFP-MsLEA10-F 1μL、GFP-MsLEA10-R 1μL、ddH2O 32.5μL、Phusion DNA Polymerase0.5μL和cDNA 1μL。
扩增条件为：第一轮：98℃预变性30s；第二轮：98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸15s，第二轮循环32次；第三轮：72℃延伸5min；第四轮：16℃终止。
2)MsLEA10基因与表达载体的酶切
用1％琼脂糖中电泳检测结果，目的基因的长度为282bp，回收该基因的DNA片段，与表达载体pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG共同进行双酶切，酶切位点选择KpnI和SalI，通过凝胶电泳确认酶切结果，随后使用DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒(B110092，上海生工生物工程股份有限公司)进行产物回收。
3)MsLEA10基因与表达载体的连接
利用T4 DNA连接酶(M0202，New England Biolabs北京有限公司)，将酶切后的目的片段与表达载体连接起来，转入到大肠杆菌DH5a感受态细胞，均匀涂布在含Kan的LB抗性平板涂上，37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑，挑入含有Kan抗性的液体培养基中，在37℃摇床中200rpm过夜培养。菌液检测合适后送上海生工生物工程有限公司进行测序。获得与MsLEA10基因CDS序列完全一致的阳性克隆菌落提质粒。
4)重组农杆菌获得
用重组的pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG-MsLEA10载体转入到农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG-MsLEA10，将菌液与50％甘油按1:1的体积比混合，液氮速冻，-80℃保存备用。
2.转MsLEA10拟南芥获得
从-80℃取出重组农杆菌置于冰上，重组农杆为：EHA105/pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG-MsLEA10，挑取部分冻住的菌块于3mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇24h。
取2mL小摇菌液加入到200mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇20-24h，摇到OD600＝1.2-2.0。
取部分大摇菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用5％蔗糖重悬和稀释至OD600＝0.8的花浸泡缓冲液。
将拟南芥(哥伦比亚生态型Co1-0)花序(前两天可以剪掉果荚，提高转染效率)浸泡入侵染液中，侵染3-5s；浸泡完毕后，取出花盆，黑暗处理24h，于温室中继续培养。1周后侵染第2次。
收获T1代种子，筛选阳性植株用草铵膦(PPT，10mg/mL)筛选，传代，直至T3代获得纯合株系。
T2代表示T1代自交产生的种子及种子生长所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及种子生长所长成的植株。
以T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用目的基因引物对(SEQIDNo.12)35SF(5’-3’)：gatgacgcacaatcccactatc和(SEQIDNo.5)MsLEA10-R(5’-3’)：gttgttgaattttttgcgg，以及PPT引物对(SEQIDNo.13)PPT-F(5’-3’)：gtactggcaggctgaagtcc和(SEQIDNo.14)PPT-R(5’-3’)：atgagcccagaacgacgcc进行PCR扩增。目的基因和PPT基因的PCR检测体系和扩增条件一致。PCR检测体系为：PCR的总体积为20μL，其中包括2×EcoTaqPCRSuperMix 10μL，上游引物1μL、下游引物1μL、ddH2O 6μL和DNA模板(50ng/μL)2μL；扩增条件为：(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环35次；(6)72℃延伸7min。
结果如图4中(A)所示：图4中(A)为电泳图，M为DL500Marker，(-)为水对照，(+)为阳性对照，1-17为T3代17个纯合株系。该图结果显示：T3代17个纯合株系在282bp扩增出单一条带。
提取T3代再生植株的整个植株的RNA，并反转录成cDNA作为模板，用目的基因部分片段引物对qRTMsLEA10-F和qRTMsLEA10-R，以及内参基因对AtACTIN-F(5’-3’)tgtgccaatctacgagggttt和AtACTIN-R(5’-3’)tttcccgctctgctgttgt进行qRT-PCR扩增。
qRT-PCR体系包括2×SG Fast qPCR Master Mix 10μL，引物qRTMsLEA10-F0.5μL，引物qRTMsLEA10-R0.5μL，DNF buffer 2μL，ddH2O5μL和cDNA 2μL，总体积为20μL。qRT-PCR扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)至(3)循环40次。
结果如图4中(B)所示：图4中(B)为相关蛋白表达情况柱状图，WT为野生型，OE1至OE17为T3代17个纯合株系。该图结果显示：MsLEA10在野生型株系(Col-0)中不表达，而在纯合株系中有不同程度的表达。从纯合株系中挑选3个高表达株系进行后续的生理分析。
二、转基因植物的抗逆性评价
1.转基因植物的抗失水能力性评价
1)干旱胁迫对萌发率的影响
将T3代转MsLEA10拟南芥的3个代表性株系OE2、OE6、OE8和野生型Col-0各49粒种子经消毒处理后，用10μL枪头均匀分点在MS培养基和含有300mmol/L甘露醇的MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3d后，移入22℃，16h光照，8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养7d，每天统计萌发率，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
结果如图5所示：该图为野生型和转基因株系在MS培养基、含有300mM mannitol的MS培养基中的萌芽情况对比。其结果显示：在MS平板上，野生型和转基因株系萌发率和萌发速率基本一致；而在300mmo1/L甘露醇平板上，MsLEA10转拟南芥株系的萌发率和萌发速率都明显大于野生型。
2)失水逆境对根长的影响
植物材料为T3代转MsLEA10拟南芥的3个代表性株系OE2、OE6、OE8和野生型Col-0。
将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用10μL枪头均匀点在培养基上，培养基分为：MS培养基、含有300mM manntiol的MS培养基上，用封口膜密封，春化3d后，移入温度22℃、光照时间为16h、相对湿度60％的培养箱中培养7d，挑选根系长度一致的3个转基因株系和野生型Col-0幼苗分别移至MS培养基、含有300mM manntiol的MS培养基上，培养12d后统计各株系根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
结果如图6所示：该图为T3代株系OE2、OE6、OE8和野生型株系Col-0分别在MS培养基、含有300mM mannitol的MS培养基上生长的根系对比图。其结果显示：在MS平板上，无论是野生型和MsLEA10转拟南芥株系根长基本一致；而在含有300mM manntiol的平板上，野生型比MsLEA10转拟南芥株系的根长较小。
3)土壤失水对转基因植株抗性的影响
植物材料为T3代转MsLEA10拟南芥的3个代表性株系OE2、OE6、OE8和野生型Col-0。将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用10μL枪头均匀点在培养基上，用封口膜密封，春化3d后，移入温度22℃、光照时间为16h、相对湿度60％的培养箱中培养14d，将幼苗移小方盆中，每盆土壤重量一致，每盆9株苗，正常条件培养14d后，使每盆土壤吸水至饱和，然后断水，进行失水处理30d，直至野生型植株萎蔫，然后开始复水，在正常条件7d，观察植物表型并拍照(图7所示)。
图7为T3代株系OE2、OE6、OE8和野生型株系WT分别在正常供水(Before droughttreatment)、失水处理(After drought treatment for 30days)和复水处理后(After re-watering for 7days)的生长情况对比结果。其结果显示：失水前，无论是MsLEA10转拟南芥株系和野生型生长状况基本一致；失水后，野生型明显比转基因株系生长情况要弱；复水后，野生型的存活率比转基因株系要低。故，本申请提供的方法能够增强拟南芥的抗旱能力，也即可延伸至该方法同样能够增强紫花苜蓿的抗旱能力。
承上，本申请提供了一种具有干旱耐受性功能的MsLEA10蛋白，首先通过qRT-PCR实验确定了MsLEA10基因的表达受到干旱胁迫的诱导，然后将MsLEA10基因在拟南芥中过表达后发现，转基因拟南芥比野生型拟南芥具有更强的抗旱性。由于拟南芥作为模式植物，其具有的作用可以认为等同于紫花苜蓿中MsLEA10调控植物响应干旱的分子机理。故，MsLEA10基因抗旱研究为紫花苜蓿抗旱分子设计育种提供了新的基因资源，对培育和获得具有抗旱植物及其功能增强新品种具有参考及借鉴意义。
综上所述，本申请从豆科植物紫花苜蓿中克隆得到的编码基因，在干旱、氯化钠和植物激素脱落酸的诱导下表达增加，编码的蛋白定位到细胞核、内质网和细胞膜上；编码基因转入植物后可以提高目的植物抗干旱能力。编码后得到的具有抗旱能力的蛋白质有利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。
本申请提供的抗逆性基因和具有抗旱能力的蛋白质对研究相关的抗旱相关调控基因提供思路和方法，对培育和获得具有抗旱性的植物(如拟南芥、烟草或豆科植物)具有重要的参考及借鉴意义，有利于培育具有或增强干旱耐受性的紫花苜蓿、扩大紫花苜蓿生产种植规模，加快畜牧产业发展。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州大学
<120> 一种具有抗逆能力的蛋白质、分离的核酸、重组载体、宿主细胞及其应用
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Arg Ser Phe Ala Asn Ala Lys Ala Phe Ser Ala Ile Val Leu
1 5 10 15
Lys Gly Phe Ser Asn Thr Leu Thr Arg Arg Gly Tyr Ala Ala Ala Arg
20 25 30
Gly Gly Val Val Ser Val Val Gly Asn Lys Met Gly Pro Thr Lys Ser
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ala Ser Thr Tyr Lys Val Ser Trp Val Pro Asp Pro
50 55 60
Val Thr Gly Tyr Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Asp Thr Asp Ala Ala
65 70 75 80
Asp Leu Arg Ala Lys Leu Leu Arg Lys Lys Phe Asn Asn
85 90
<210> 2
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggctcgtt ctttcgctaa cgctaaggct ttctctgcta ttgtccttaa aggattctcc 60
aacactctca caaggtaccg taacgtttct aattgttatt tgtgatatta ttattagtat 120
taatttgttt tgttatgctt atatcatatg gttttttaaa ataattaaac agacgtggtt 180
acgctgcggc aaggggagga gtggtgtctg ttgttggcaa caagatggga cccacaaaat 240
caggggaaga tggtgcttcg acttataagg tttcatgggt tccagatcct gtcactggtt 300
actataagcc tgagaatatt aaggatactg atgccgctga tttacgtgct aagcttctcc 360
gcaaaaaatt caacaactaa 380
<210> 3
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggctcgtt ctttcgctaa cgctaaggct ttctctgcta ttgtccttaa aggattctcc 60
aacactctca caagacgtgg ttacgctgcg gcaaggggag gagtggtgtc tgttgttggc 120
aacaagatgg gacccacaaa atcaggggaa gatggtgctt cgacttataa ggtttcatgg 180
gttccagatc ctgtcactgg ttactataag cctgagaata ttaaggatac tgatgccgct 240
gatttacgtg ctaagcttct ccgcaaaaaa ttcaacaact aa 282
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggctcgtt ctttcgctaa c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttgttgaat tttttgcgg 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctccaacac tctcacaaga cgt 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccatgaaacc ttataagtcg aagc 24
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgggatccat ggctcgttct ttcgctaac 29
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtgagctctt agttgttgaa ttttttgcgg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cggggtacca tggctcgttc tttcgctaac 30
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgcgtcgacg ttgttgaatt ttttgcgg 28
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatgacgcac aatcccacta tc 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtactggcag gctgaagtcc 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atgagcccag aacgacgcc 19
Claims (10)
1.一种具有抗逆能力的蛋白质，其特征在于，所述具有抗逆能力的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性；
优选地，所述具有抗逆能力的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述抗逆能力为抗旱性；
优选地，所述抗旱性为抗失水逆境的能力，所述失水逆境为与甘露醇终浓度为300-500mM的模拟逆境相同或等同的自然逆境。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列与SEQ ID NO.2所示的碱基序列至少具有90％的同一性；
优选地，所述核酸的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的核酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求4所述的重组载体或基因组中整合有外源的如权利要求2或3所述的核酸。
6.如权利要求1所述的具有抗逆能力的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括：采用权利要求2或3所述的核酸进行编码并通过生物表达和/或人工合成制备。
7.如权利要求1所述的具有抗逆能力的蛋白质或如权利要求2-3任一项所述的核酸在增强植物抗逆性中的应用。
8.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求2或3所述的核酸或所述核酸中具有SEQ ID NO.3所示的碱基序列的CDS区域导入目标植物基因组中，获得转基因植物种子；将所述转基因植物种子进行人工培育或使所述转基因植物种子自然生长。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸或所述CDS区域通过重组表达载体导入植物；
优选地，所述重组表达载体是将所述核酸或所述CDS区域插入酶切系统载体pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG的重组位点得到。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述植物包括拟南芥、烟草或豆科植物；
优选地，所述豆科植物为紫花苜蓿。
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| CN110408628A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-11-05 | 兰州大学 | 一种抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用 |
| CN110408627A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-11-05 | 兰州大学 | 抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用 |
| CN113388017A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-09-14 | 兰州大学 | 一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用 |
-
2022
- 2022-01-12 CN CN202210033250.XA patent/CN114369149A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110408628A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-11-05 | 兰州大学 | 一种抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YONGQIN BAI 等: "Isolation and functional characterization of a Medicago sativa L. gene, MsLEA3-1.", MOL BIOL REP . * |
| 马文雪: "紫花苜蓿MsLEA10基因的耐旱功能分析", 中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑 * |
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