CN113416749B

CN113416749B - 谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中的应用

Info

Publication number: CN113416749B
Application number: CN202110726942.8A
Authority: CN
Inventors: 于静娟; 易飞; 张艺帆; 肖童
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113416749A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中的应用。本发明发现谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中存在关键作用，适当提高SimiR396d表达量，可以有效提高植物抗旱能力，在20％PEG模拟干旱处理条件下过表达转基因植株萌发系数高于野生型，根长明显大于野生型；苗期干旱处理时，过表达转基因植株长势明显优于野生型，复水后存活率明显高于野生型。本发明提供的谷子SimiR396d为培育抗旱植物新品种提供了资源，为研究植物应对干旱胁迫的机制奠定了一定的理论基础。

Description

谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中的应用。

背景技术

干旱直接影响作物产量，完善植物响应干旱胁迫的调控网络，明确参与植物干旱胁迫调控基因的功能，提高植物对干旱的耐受能力，对于提高干旱半干旱地区土地利用率及提高粮食产量具有非常重要的意义。

植物生长在自然环境中，从种子开始萌发到最后种子成熟的整个生育时期时刻都有可能遭受环境变化带来的非生物胁迫，植物体内存在一定的调控机制来应对不同的环境变化，但当非生物胁迫严重程度超出植物的调节能力时将影响作物的产量。植物对非生物胁迫的响应和调控简单总结如下：

1、非生物胁迫的信号转导。植物通过受体感受环境中的非生物胁迫信号，并将信号逐级传递，实现对环境变化的适应。非生物胁迫信号网络通常包括膜感受器、Ca²⁺、ROS、蛋白激酶和转录因子等。胁迫信号能够被细胞膜上的受体蛋白识别，经由信号分子(如Ca²⁺和ROS等)进行传递，通过磷酸化/去磷酸化作用激活相关转录因子，调控下游基因表达，最终通过调节细胞内内环境的平衡来适应干旱环境条件(Chinnusamy et al.,2004)。

Ca²⁺被称为“第二信使”，能够将细胞外信号转化为特定的胞内信号，在植物体内信号转导过程中起关键作用。外界环境出现胁迫时，植物细胞内钙离子浓度迅速升高，钙离子浓度达到一定值时将被细胞内的钙离子传感器蛋白(Ca²⁺sensors)识别使信号向下传递(Lee and Seo,2021)。蛋白磷酸化是植物响应外界信号、控制细胞功能的主要机制之一。MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号途径是真核细胞包括植物细胞中普遍存在的信号传递模式。MAP激酶在植物响应渗透胁迫信号传导过程中，通过调控蛋白的磷酸化和去磷酸化影响蛋白活性，进而将膜感受器上接收到的信号与细胞下游的应答通路联系起来(Jonak et al.,2002)。

2、转录水平调控。转录因子又称为反式作用因子，通过结合启动子区的顺式作用元件，调控基因的表达。植物转录因子在非生物胁迫调控通路中起着重要作用，它们通过调控下游响应基因的表达，进而影响整个信号通路的传递。植物中的干旱响应转录因子对干旱胁迫的响应包括依赖于ABA 信号途径和不依赖于ABA信号途径(Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki,2007)。目前响应胁迫功能研究较多的转录因子主要包括，AP2/ERF家族、bZIP家族、bHLH家族、MYB家族和NAC家族等。

3、转录后调控。当植物遭受逆境胁迫时除了上述的转录水平响应外还存在转录后调控。在植株的转录后调控过程中主要是通过microRNA(miRNA)对其靶基因的调控。miRNA是一类长度在20～24nt的单链非编码小RNA，主要通过与靶基因结合行使转录后基因表达调控，参与调控基因组约三分之一基因的表达(Sumazin et al.,2011)。在植物发育，激素信号转导及病害、养分和胁迫响应等过程中起重要调控作用。大部分microRNA在细胞核内由RNA聚合酶II(RNA-pol II)转录(Ohler et al.,2004)，形成具有5’帽子结构(7mGpppG)和3’多聚腺苷酸尾巴(polyA)的初级转录本(pri-miRNA)(Bartel,2004)。Pri-miRNA的初级转录本形成的具有茎环结构的二级结构，在细胞核内由具有RNaseIII-type内切酶活性的Dicer-like(DCL)酶DCL1切割形成双链结构的miRNA/miRNA*复合体(Carrington andAmbros,2003)。双链结构的miRNA/miRNA*复合体由HUA ENHANCER 1(HEN1)将其3’端进行甲基化修饰来维持其结构的稳定，然后被HASTY识别结合转运出细胞核进入细胞质中(Parket al.,2005；Bollman et al.,2003)。运输至细胞质中的miRNA/miRNA*复合体由Helicase识别并解螺旋释放出单链的成熟miRNA。成熟的miRNA能够被ARGONAUTE(AGO)蛋白识别组装成沉默复合体(miRISC)(He and Hannon,2004)。该复合体能够通过miRNA特异识别并结合靶mRNA，对靶mRNA进行切割降解，进行转录后的调控。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中的应用，谷子小RNA SimiR396d可以有效提高植物抗旱能力。

第一方面，本发明提供谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中的应用。

进一步地，所述调控植物抗旱能力为正向调控植物抗旱能力。

本发明进一步提供谷子小RNA SimiR396d在抗旱植物育种或抗旱转基因植物制备中的应用。

进一步地，所述谷子小RNA SimiR396d的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为谷子。

本发明进一步提供用于转录谷子小RNA SimiR396d的DNA，所述DNA包括SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供一种调控植物抗旱能力的方法，包括：调控植物中谷子小RNA SimiR396d的表达水平，所述谷子小RNA SimiR396d序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，通过提高所述植物中所述谷子小RNA SimiR396d的表达水平，提高所述植物的抗旱能力；或，通过将所述谷子小RNA SiMIR396d过表达株系与其他株系杂交，培育抗旱株系。

进一步地，所述提高所述植物中所述谷子小RNA SimiR396d的表达水平包括如下流程：

构建含有用于转录谷子小RNA SimiR396d的DNA的重组质粒；

将所述重组质粒通过农杆菌转化法转导至所述植物中；所述用于转录谷子小RNASimiR396d的DNA如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种生物材料，所述生物材料包括所述DNA，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

本发明具备如下有益效果：

本发明提供一种和植物抗旱能力相关的谷子小RNA SimiR396d，利用本发明所提供的方法制备的SiMIR396d过表达转基因谷子萌发期抗旱能力明显增强，在20％PEG模拟干旱处理条件下过表达转基因植株萌发系数高于野生型，根长明显大于野生型；苗期干旱处理时，过表达转基因植株长势明显优于野生型，复水后存活率明显高于野生型。

本发明提供的谷子小RNA SimiR396d可用于抗旱植物育种中，在提高植物抗旱能力的领域具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的SiMIR396d的二级茎环结构。

图2为本发明实施例2提供的pSuper1300-SiMIR396d表达载体的示意图。

图3为本发明实施例2提供的MIM序列的示意图。

图4为本发明实施例2提供的pCambia1307(2×35S)-MIM396d干扰载体示意图。

图5为本发明实施例3提供的转基因谷子的分子检测结果；其中，A为部分过表达株系T0及T1代的PCR检测电泳图，图中，M为DNA Marker:D2000 plus；WT为YU1野生型谷子作为负对照，pSuper1300-SiMIR396d质粒作为正对照，H₂O作为空白对照；B为部分干扰株系T0代的PCR检测电泳图，图中，M为DNA Marker:D2000 plus；WT为Ci846野生型谷子作为负对照，pCambia1307(2×35S)-MIM396d质粒作为正对照，H₂O作为空白对照。

图6为本发明实施例4提供的Stem-loop RT PCR检测转基因谷子中SimiR396d表达量的检测结果；其中，A为过表达株系的RNA水平检测结果，B为MIM干扰株系RNA水平检测结果。

图7为本发明实施例5提供的T2代过表达转基因谷子萌发期的抗旱分析结果；其中，A为野生型和过表达谷子株系在MS培养基中培养7天后的表型；B为MS培养基中培养7天后野生型和过表达谷子株系的萌发指数统计结果；C为MS培养基中培养7天后野生型和过表达谷子株系的根长芽长统计结果；D为野生型和过表达谷子株系在20％PEG培养基中培养7天后的表型；E为20％PEG培养基中培养7天后野生型和过表达谷子株系的萌发指数统计结果；F为20％PEG培养基上7天后野生型和过表达谷子株系的根长芽长统计结果；图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(t检验)。

图8为本发明实施例5提供的T2代MIM干扰表达转基因谷子萌发期的抗旱分析结果；其中A为野生型和MIM干扰表达谷子株系在MS培养基中培养7天后的表型；B为MS培养基中培养7天后野生型和MIM干扰表达谷子株系的萌发指数统计结果；C为MS培养基中培养7天后野生型和MIM干扰表达谷子株系的根长芽长统计结果；D为野生型和MIM干扰表达谷子株系在20％PEG培养基中培养7天后的表型；E为20％PEG培养基中培养7天后野生型和MIM干扰表达谷子株系的萌发指数统计结果；F为20％PEG培养基中培养7天后野生型和MIM干扰表达谷子株系的根长芽长统计结果；图中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(t检验)。

图9为本发明实施例6提供的T2代转基因谷子苗期抗旱分析结果；其中，A为野生型和过表达谷子植株干旱处理及复水后的表型；B为野生型和MIM干扰表达谷子植株干旱处理及复水后的表型；C为野生型和过表达谷子植株干旱处理并复水后存活率统计结果；D为野生型和MIM干扰表达谷子植株干旱处理并复水后存活率统计结果；图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(t检验)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

在本发明实施例涉及的各种测定分析实验中，每个样品均被平行测定三次，结果被表示为平均值±标准差。通过双尾t-检验对各个样品与对照之间的差异进行显著性分析(*p<0.05；**p<0.01)。

实施例1基因SimiR396d的克隆

SimiR396d基因位于3号染色体1004708-1004800(-)，序列如SEQ ID NO.2所示，其二级茎环结构如图1所示，成熟miRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

设计克隆SimiR396d基因的引物，引物5′端引入HindⅢ酶切位点序列如SEQ IDNO.3所示，引物3′端引物引入Spe I酶切位点序列如SEQ ID NO.4所示。以谷子萌发5天的幼苗基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

PCR扩增条件如下：94℃，预变性5min；94℃，变性30s；60℃，退火30s；72℃，延伸20s；扩增循环数32；最后72℃，延伸10min；4℃保存。

将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，用庄盟小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带。取适量回收产物，与pTOPO-TA载体连接转化大肠杆菌感受态。经菌落PCR鉴定后提取阳性菌落质粒pTOPO-SiMIR396d，送公司进行测序。

实施例2用于谷子中过表达和干扰表达载体的构建

过表达载体中目的基因SiMIR396d的表达由Super启动子和胭脂碱合成基因nos的3′终止区域组成，选择标记基因为hpt基因，编码HYG蛋白。载体如图2所示，用HindⅢ和SpeI将SimiR396d基因从质粒pTOPO-SiMIR396d上酶切得到带有酶切位点的目的片段，用T4DNA连接酶将目的片段连接到pSuper1300载体骨架形成重组质粒pSuper1300-SiMIR396d。

同时利用已报道的MIM(target mimic)技术，在第7与第8位碱基间插入额外的4个碱基来降低microRNA表达(如图3所示，MIM396序列如SEQ ID NO.5所示)，构建由2×CaMV35S启动8×MIM(上海生工合成)序列和胭脂碱合成基因nos的3′转录终止区域组成的干扰载体，选择标记基因为hpt基因，编码HYG蛋白。载体示意图见图4，用Spe I和HindⅢ对pUC57-MIM396d进行酶切获得带有酶切位点的MIM396d片段，用T4 DNA连接酶将目的片段连接到pCambia1307(2×35S)载体骨架形成重组质粒pCambia1307(2×35S)-MIM396d。

采用电激法将质粒pSuper1300-SiMIR396d和pCambia1307(2×35S)-MIM396d直接转入农杆菌菌株EHA105中，获得分别含有重组质粒pSuper1300-SiMIR396d、pCambia1307(2×35S)-MIM396d的农杆菌EHA105。农杆菌转化谷子愈伤由中国农业科学院作物科学研究所转基因平台完成。

实施例3转基因谷子基因组DNA的提取及PCR检测

1、CTAB法小提植物基因组DNA

(1)取谷子新鲜叶片约1cm于2.0mL离心管中，加入直径6mm清洗干净的钢珠，放入液氮中预冷，然后用打样机1400rpm打样40s；

(2)加入600μL CTAB提取缓冲液，充分震荡，65℃温育30min；

(3)冷却至室温，加入500μL氯仿：异戊醇(24:1)，混匀脱色摇床上轻混5min；

(4)混匀后室温12,000rpm，离心10min，吸取上清至新的1.5mL离心管中，加入0.7倍体积(400-420μL)的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min；

(5)室温12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL 70％乙醇漂洗；

(6)室温12,000rpm离心5min，超净工作台或风扇吹5-10min；

(7)加入50-100μL ddH₂O，溶解后4℃保存。

2、PCR扩增外源SiMIR396d基因的部分序列

(1)引物为：

p1300(Myc)-F：5’-TGGTCGTTTATTTCGGCGTGTA-3’(SEQ ID NO.6)，

miR-R：5’-CCACCTCTCCTCATCGGCTGTC-3’(SEQ ID NO.7)。

(2)PCR反应体系如下：

表1 PCR反应体系

(3)扩增程序如下：

表2 PCR扩增程序

(4)取10μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度约494bp。其余产物-20℃保存。

结果表明共有5个T0代株系检测出了SiMIR396d基因，而野生型植株未检测出。T1代以及后代均应用此方法进行目的基因的PCR检测，结果如图5中的A所示。

3、PCR扩增外源MIM396d的部分序列

(1)引物为：

p1307-1F：5’-ACGATAGCCATGGGCGAGCTC-3’(SEQ ID NO.8)，

p1307-2R：5’-CTGGGAACTACTCACACATT-3’(SEQ ID NO.9)。

(2)PCR反应体系如下：

表3 PCR反应体系

(3)扩增程序如下：

表4 PCR扩增程序

(4)取10μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度约474bp。其余产物-20℃保存。

结果表明共有10个T0代株系检测出了MIM396的插入，而野生型植株未检测出，结果如图5中的B所示。T1代以及后代均用此方法进行目的基因的PCR检测。

实施例中主要试剂：

CTAB提取缓冲液：20g CTAB，81.9g NaCl放入烧杯中加入600mL去离子水溶解，再加入100mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)，40mL 0.5M EDTA(pH 8.0)，最后去离子水定容至1L。

实施例4转基因谷子总RNA的提取及RT-PCR检测

(一)植物组织总RNA的提取

1、取一定量植物组织约1g，加入液氮预冷的的研钵中(提前180℃处理4h去除RNase)，视材料情况提前预冷时加入适量石英砂，待液氮量适宜时用研棒快速研磨成粉末，分装至新的1.5mL RNase-free离心管中每管约100-200mg(提取用的材料于液氮中保存待用，其余材料保存于-80℃冰箱)；

2、取出4℃保存的Trizol，将上述材料取出置于冰上，每管加入1mL Trizol用Vortex振荡混匀，室温放置5min使植物组织充分裂解；

3、向上述离心管中加入200μL预冷的氯仿，Vortex剧烈振荡15sec,室温静置5min；

4、提前预冷4℃离心12,000rpm离心15min；

5、小心吸取上清(约600μL)至一新的RNase-free离心管中，加入等体积提前预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min；

6、4℃,12,000rpm离心15min，弃上清；

7、加入1mL预冷的70％乙醇(DEPC-ddH₂O配制)轻弹混匀，4℃,12,000rpm离心5min，弃上清；

8、开盖置于冰上吹5min使剩余液体挥发，加入34.5μL DEPC-ddH₂O溶解；

9、用DNase I消化处理,按下表配制反应体系：

(1)消化

表5消化液体系

轻轻混匀后,瞬时离心，置于37℃反应30min；

(2)在上述反应中补加150μL DEPC-ddH₂O，扩大体积至200μL；

(3)依次加入100μL水饱和酚，100μL氯仿Vortex震荡抽提；

(4)用提前预冷的离心机4℃，12,000rpm，离心10min；

(5)吸取上清至新的RNase-free离心管中，加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2)约20μL和2.5倍体积预冷的无水乙醇约500μL，颠倒混匀，-80℃沉淀1h以上或过夜；

(6)预冷的4℃离心机，12,000rpm，离心15min；

(7)弃上清，用70％乙醇洗涤去除盐离子，冰上开盖吹5min，加入30μL RNase-freeH₂O溶解；

(8)取适量RNA进行电泳检测，备用的置于冰上，其余于-80℃冰箱保存。

(二)Stem-loop RT-PCR

对miRNA表达水平进行定量检测，参照已发表的实验方法(Chen et al.,2005)。miRNA 能够被Stem-loop RT引物识别结合miRNA的3’端形成发夹结构，经过反转录成较长的cDNA，使其能够用miRNA特异的Forward primer以及茎环通用引物Reverse primer进行定量PCR检测。Stem-loop反转录所用引物如下：

miR396d-Stem-loop RT primer：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGTTC-3’(SEQ IDNO.10)

U6-Stem-loop RT primer：

5’-GTGCAGGGTCCGAGGTTTTGGACCATTTCTCGAT-3’(SEQ ID NO.11)

1、配置如下反应体系200μL:

表6反应体系

2、混匀后瞬时离心，PCR仪中65℃变性5min，立即置于冰上2min。依次加入以下成分:

表7反应体系附加成分

3、混匀后瞬时离心,按如下步骤进行反转录反应，反应结束后反转产物保存于-20℃冰箱。

表8反转录程序

4、用上述反转产物作为模板，miRNA特异的正向引物和通用反向引物进行实时定量PCR分析，用U6作为内参进行实验。RT-qPCR所用引物如下：

Universal Reverse primer：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO.12)，

miR396d–F：5’-GCGGCGTCCACAGGCTTTCTT-3’(SEQ ID NO.13)，

U6-F：5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGCA-3’(SEQ ID NO.14)。

(三)实时荧光定量PCR

步骤如下，首先在冰上配置如下体系：

1、反应体系(20μL):

表9荧光定量PCR反应体系

2、按如下程序进行

表10荧光定量PCR程序

以2^-ΔΔCt计算各株系间基因表达水平的相对差异，结果如图6所示过表达株系OEL1/2/3中SimiR396d表达量明显高于野生型,见图6中的A，MIM干扰株系MIML13/14/18中SimiR396d表达量较野生型相比明显降低，见图6中的B。

实施例5 T2代转基因谷子萌发期抗旱分析

本实施例对T2代转基因谷子萌发期进行抗旱性观测分析，具体流程如下：

1、将野生型(过表达材料为YU1，MIM干扰材料为Ci846)和转基因谷子种子去除种皮后置于2.0mL离心管中，加入1mL 70％乙醇洗涤2min其间轻柔颠倒摇晃。

2、吸出乙醇加入1mL 15％NaClO脱色摇床轻摇5min，在超净工作台中吸去多余的NaClO，用无菌水清洗5-6次，超净工作台中吹5-10min去除多余的NaClO。

3、将处理好的种子分别铺种在提前准备好的MS培养基以及含20％PEG的MS培养基上，25℃正常培养7天，统计萌发系数(发芽率(GR)、发芽势(GP)以及发芽指数(GI))，发现在MS培养基上生长时，过表达及干扰株系萌发系数与野生型相比无明显差异(如图7中的B和图8中的B所示)；20％PEG处理培养基上生长时过表达株系萌发指数优于野生型(如图7中的E所示)；MIM干扰株系萌发弱于野生型(如图8中的E所示)。

统计生长7天后各株系根长和芽长发现，过表达株系在MS培养基上生长时根长略长于野生型(如图7中的C所示)，该表型在20％PEG处理后更为明显(如图7中的F所示)；MIM干扰株系不论是在MS培养基上正常生长或者20％PEG处理时根长均明显短于野生型(如图8中的C和F所示)。说明SimiR396d能够通过影响谷子根发育影响植株萌发期抗旱性。

实施例6 T2代转基因谷子株系苗期抗旱分析

本实施例对T2代转基因谷子生长两周的幼苗进行干旱处理后进行观测分析，具体流程如下：

将吸胀8-10h的野生型(过表达材料为YU1，MIM干扰材料为Ci846)和转基因谷子种子种于直径7.5cm的小方盆中(保证每盆中土量一致，且提前在同等条件下吸水)，每盆中种植9棵，置于16h(day)/8h(night)人工培养室内正常条件生长两周。生长两周的幼苗提前1天给予充足的水分，保证处理前每盆的含水量一致，将水倒掉开始干旱处理并拍照记录干旱处理前幼苗生长状态。干旱处理10天后开始关注记录表型，干旱处理14天时表型最为明显拍照记录，并开始复水，复水5天后拍照记录并统计植株存活率。

结果显示:干旱处理的转基因幼苗，过表达株系干旱处理后长势优于野生型(如图9中的A所示)，复水后存活率均显著高于野生型(如图9中的C所示)；MIM干扰株系干旱处理后长势弱于野生型(如图9中的B所示)，存活率低于野生型(如图9中的D所示)；说明提高SimiR396d的表达量可以提高谷子苗期干旱胁迫的耐受能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 谷子小RNA SimiR396d在调控植物抗旱能力中的应用

<130> KHP211114175.3

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 1

uccacaggcu uucuugaacg a 21

<210> 2

<211> 163

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attgccttag cgttgatggt gtaatggagc aagagcgtgg ccatgctctc cacaggcttt 60

cttgaacgac aggtctgaat tccactgtaa ttttggcgcc agtcgttcaa gaaagttcat 120

ggagaccatg gcacatcttt ggacagccga tgaggagagg tgg 163

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagctta ttgccttagc gttgatggtg ta 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggactagtc cacctctcct catcggctgt c 31

<210> 5

<211> 206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgttcaaga tgtactgtgg aacactcgtt caagatgtac tgtggaacac tcgttcaaga 60

tgtactgtgg aacactcgtt caagatgtac tgtggaacac tctagttcgt tcaagatgta 120

ctgtggaaca ctcgttcaag atgtactgtg gaacactcgt tcaagatgta ctgtggaaca 180

ctcgttcaag atgtactgtg gaacac 206

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtcgttta tttcggcgtg ta 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccacctctcc tcatcggctg tc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgatagcca tgggcgagct c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgggaacta ctcacacatt 20

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcgttc 50

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgcagggtc cgaggttttg gaccatttct cgat 34

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggcgtcca caggctttct t 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggaacgatac agagaagatt agca 24

Claims

1.谷子小RNA SimiR396d在调控谷子抗旱能力中的应用；

所述谷子小RNA SimiR396d的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控谷子抗旱能力为正向调控谷子抗旱能力。

3.谷子小RNA SimiR396d在抗旱谷子育种或抗旱转基因谷子制备中的应用；

所述谷子小RNA SimiR396d的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种调控植物抗旱能力的方法，其特征在于，包括：

调控植物中谷子小RNA SimiR396d的表达水平，所述谷子小RNA SimiR396d序列如SEQID NO.1所示；

所述植物为谷子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过提高所述植物中所述谷子小RNASimiR396d 的表达水平，提高所述植物的抗旱能力；或，通过将所述谷子小RNA SimiR396d过表达株系与其他株系杂交，培育抗旱株系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高所述植物中所述谷子小RNASimiR396d的表达水平包括如下流程：

构建含有SimiR396d基因的重组质粒；

将所述重组质粒通过农杆菌转化法转导至所述植物中；所述SimiR396d基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。