CN117327716A - 小麦耐旱基因TaXTH-2D、表达盒及其应用 - Google Patents
小麦耐旱基因TaXTH-2D、表达盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117327716A CN117327716A CN202311111206.7A CN202311111206A CN117327716A CN 117327716 A CN117327716 A CN 117327716A CN 202311111206 A CN202311111206 A CN 202311111206A CN 117327716 A CN117327716 A CN 117327716A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- drought
- taxth
- wheat
- gene
- expression cassette
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract description 56
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 30
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 claims 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims 1
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 3
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000025469 response to water deprivation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 229920002000 Xyloglucan Polymers 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003012 network analysis Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01207—Xyloglucan:xyloglucosyl transferase (2.4.1.207)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01151—Xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase (3.2.1.151), i.e. endoxyloglucanase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明申请公开了一种小麦耐旱基因TaXTH‑2D、表达盒、表达载体及其应用，旨在解决小麦耐旱基因相对较少的问题。本申请小麦耐旱基因TaXTH‑2D具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者是在SEQ ID NO.1的基础上经过一个或几个碱基的取代、缺失或/和添加所衍生的能够增强小麦耐旱性的核苷酸序列。本申请研究确认了TaXTH‑2D基因能够调控植物的干旱胁迫，其在提高植物耐旱性、耐旱植物品种培育等方面有着广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明申请涉及生物技术领域，具体涉及一种小麦耐旱基因TaXTH-2D、表达盒、表达载体及其应用。
背景技术
干旱会严重降低农作物的产量和品质，随着全球气候变暖、淡水资源短缺，干旱越发成为限制农业和社会发展的重要因素。因此，培育高产优质耐旱的作物新品种业已成为农业生产中的一个十分迫切的任务。
而依靠传统育种方式已经越来越难完成迫切的育种任务，转基因育种被认为是农业的未来发展方向，具有广阔的应用前景。转基因是利用生物工程技术将具有某种功能的外源基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改良目的生物体性状的目的。我国高度重视农业转基因技术，目前，我国在水稻、玉米、大豆、棉花、番木瓜等农作物转基因技术研发上，已经取得了一些突破性进展。
植物在应对干旱胁迫时会产生一系列的应对机制，会诱导一些干旱相关基因的表达，近年来，随着基因组学和分子生物学的发展，研究人员克隆了许多抗旱相关的基因，研究表明将这些基因通过转基因技术转入植物中，可以提高植物的耐旱性。然而小麦属于异源六倍体，基因组十分庞大而复杂，并且小麦遗传转化较困难，使得小麦功能基因研究相对滞后，已报道的小麦耐旱基因鲜见。
公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
目前，国内外研究人员也已克隆并鉴定了一些小麦抗旱基因，但有关木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶影响小麦耐旱性的报道非常少，尤其是还未见有关小麦耐旱基因TaXTH- 2D及其应用的报道。
发明人前期对所发现的耐旱和节水能力有差异的两个高产小麦品种衡观35（耐旱性与水分利用效率相对较高）和石4185（耐旱性与水分利用效率相对较低），进行了比较详细的转录组与生理机制分析。通过基因共表达网络分析发现在衡观35高表达的基因模块中，关键节点基因包括TaXTH-2D，同时该模块还显著富集了众多参与水分胁迫的其它基因。因此，推测TaXTH-2D很可能在小麦耐旱性调控过程中发挥作用。TaXTH-2D基因编码木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶，属于糖苷水解酶16（glycoside hydrolase 16,GH16）家族。为了对TaXTH-2D响应干旱胁迫的表达谱有更准确的认识，利用实时定量PCR的方法，对该基因在干旱胁迫下的衡观35（HG35）和石4185（S4185）中的表达情况进行了分析，结果表明，在两个品种中，水分胁迫24hTaXTH-2D均被显著诱导表达，水分恢复后表达量下降，进一步证实TaXTH-2D为干旱诱导基因（图1）。
为验证TaXTH-2D基因的功能，采用水稻Actin基因启动子和Nos终止子构建含TaXTH-2D基因的表达盒，其中TaXTH-2D基因和GFP（绿色荧光蛋白）形成融合蛋白（图2）。利用基因枪将该表达盒与含有筛选标记Bar基因的表达盒（图2）共转化小麦品种科农199，获得T0代转基因苗。利用PCR对T0代转基因苗进行PCR鉴定，获得含有TaXTH-2D基因的阳性植株（图3A）。利用T2种子筛选纯系后，选择OE7和OE8两个纯系进行功能分析。首先利用实时定量PCR的方法对两个纯系的表达进行了分析，结果如图3B所示，转基因植株中TaXTH-2D基因的表达量显著高于受体对照（WT）中的表达量，说明转化的TaXTH-2D基因能够在转基因小麦中表达。对转基因株系进行耐旱性鉴定，结果发现在正常浇水条件下，转基因株系与WT植株在表型上无明显差异。但在干旱胁迫后转基因株系较WT植株萎焉较轻，复水后转基因株系比对照具有更高的存活率（图4），表明TaXTH-2D基因能够提高小麦的耐旱性。
鉴于以上技术问题中的至少一项，本公开提供了一种小麦耐旱基因TaXTH-2D，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示或者是由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸经过一个或几个碱基的取代、缺失、添加所衍生的能够增强小麦耐旱性的核苷酸序列。
根据本公开的另一个方面，提供一种包含所述小麦耐旱基因TaXTH-2D的表达盒，所述表达盒能够增强小麦的耐旱性。
根据本公开的另一个方面，将所述小麦耐旱基因TaXTH-2D或包含小麦耐旱基因TaXTH-2D的表达盒应用在培育耐旱植物当中。相关应用中：所述植物优选是小麦，所述小麦抗旱基因TaXTH-2D的植物遗传转化表达盒优选是采用Actin启动子，Nos终止子，所述应用方法是将克隆得到的小麦抗旱基因TaXTH-2D通过基因枪介导的方法将该基因转入小麦，获得耐旱能力明显提高的转基因小麦。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
研究确认了TaXTH-2D基因能够调控植物的干旱胁迫，其在提高植物耐旱性、耐旱植物品种培育等方面有着广泛的应用前景。
附图说明
图1为本申请一实施例中TaXTH-2D基因在小麦中响应干旱的实时定量PCR结果；横坐标是处理的不同时间点，纵坐标是相对表达量；HG35，衡观35小麦品种；S4185，石4185小麦品种；0、D24、D48、R24和R48分别代表干旱处理0h、24h、48h、复水24h和复水48h。
图2为本申请一实施例中转化小麦的表达盒的制备；A，表达盒示意图；Actinpromoter为所用启动子，Bar为筛选标记基因，Tnos为所用终止子，GFP为绿色荧光蛋白基因，SP6 primer和T7 primer 为扩增表达盒所用的引物；B，PCR扩增Bar表达盒结果；C，PCR扩增TaXTH-2D表达盒结果。
图3为本申请一实施例中TaXTH-2D转基因小麦植株的鉴定；A，PCR鉴定，其中M为DNA ladder，1-12为转基因植株；B，实时定量PCR检测，横坐标为WT和转基因株系，纵坐标为相对表达量。
图4为本申请一实施例中TaXTH-2D转基因植株的耐旱性鉴定；A，正常浇水和干旱处理后的植株生长状态，WT为受体对照，OE7和OE8为转基因株系；B，干旱后植株的存活率，WT为受体对照，OE7和OE8为转基因株系。
具体实施方式
为了更好的理解本申请技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
实施例一 TaXTH-2D基因响应干旱胁迫的表达模式
衡观35和石4185种子（市场上购得，由本实验室保存）萌发6d后，4℃春化28d，然后放入生长箱正常水培28d。之后用13% PEG6000处理，在处理0h、24h、48h，以及解除胁迫复水24h、48h取叶片用于提取RNA及cDNA合成。
小麦叶片总RNA提取采用ROCHE公司的TRIPURE试剂盒。
①样品经液氮冷冻后，充分研磨，取 100 mg 粉末于 2.0 mL Eppendorf 管中。
②加 1 mL Tripure 试剂，混匀，室温静置 5 min，确保核蛋白完全释放出来。
③加入 200 μL 氯仿，剧烈振荡 15 s，室温放置 2～3 min。
④4℃，12000 rpm，离心 15 min。
⑤取上清到新的 1.5 mL Eppendorf 管中，加入 500 μL 异丙醇，轻轻上下混匀，室温放置 10 min。
⑥ 4℃，12000 rpm，离心 10 min。
⑦弃上清，用 70%乙醇洗涤沉淀 2 次，并于室温干燥。
⑧加入 50 μL RNase-Free 水。
⑨检测 RNA 的质量和浓度。提取的 RNA 备后续试验使用，或在-80℃存放。
cDNA合成使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司（Vazyme）的HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit。
在RNase-free离心管中按照如下表1所示的体系配置混合液，42℃，2 min。
表1 反应体系
。
按照下表2配制第一条链cDNA合成反应液，55℃，15 min，85℃，2 min。
表2 cDNA合成反应液
。
扩增前cDNA模板稀释10倍。选用小麦Actin基因为内参基因，使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行实时定量PCR。
TaXTH-2D基因实时定量PCR的引物为：
引物1：5'-GCGACATGGACCAGCTCCAGCT-3'；
引物2：5'-CGACCTAGCAGGCTACGCTA-3'。
Actin引物为：
引物3：5'-CAACGAGCTCCGTGTCGCA-3'；
引物4：5'-GAGGAAGCGTGTATCCCTCATAG-3'。
配制如表3所示的实时定量PCR反应液。
表3 实时定量PCR反应体系
。
反应程序：95℃变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，68℃延伸20 s，共40个循环。
结果如图1所示，在衡观35（HG35）和石4185（S4185）两个品种中，TaXTH-2D基因在干旱胁迫处理24h（D24）表达量显著上升，在复水后表达量降低，说明TaXTH-2D基因是干旱响应基因。
实施例二 转基因表达盒制备及小麦转化
以前期构建好的pActin-TaXTH-2D载体为模板，通过 PCR 扩增 (引物为SP6和T7)获得含TaXTH-2D表达盒片段，同时以pActin-bar载体为模板，通过PCR扩增获得筛选标记Bar基因的表达盒片段 (图2)，利用基因枪将含TaXTH-2D的表达盒与含有筛选标记 Bar基因的表达盒共转化小麦品种科农199，获得含TaXTH-2D基因的转基因苗。在此共转化实验中，Bar基因表达盒提供除草剂抗性，用于筛选转基因植株。
SP6引物：5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3'；
T7引物：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'。
进行 PCR 反应时，使用 TaKaRa 公司的PrimerStar高保真酶。PCR 反应程序：95℃ 预变性 4 min； 98℃ 变性 10 s、55℃ 退火 15 s、72℃延伸 3.5 min，35 个循环。具体反应体系如表4所示。
表4 PCR 反应体系
。
利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，结果如图2所示，扩增Bar基因表达盒得到一条2357 bp条带（图2B），扩增TaXTH-2D表达盒得到一条3408 bp条带（图2C），表明成功扩增得到了用于遗传转化的表达盒。
实施例三 TaXTH-2D转基因小麦的PCR检测
采用 CTAB 法提取小麦叶片基因组DNA。
①65℃预热CTAB提取液 (2% CTAB, 2% PVP 4000, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA(pH 8.0), 100 mMTris-HCl (pH8.0), 2% β- mercaptoethanol)。
②将100 mg小麦叶片剪碎后置于放有钢珠的2 mL Eppendorf 管中，在液氮中磨碎叶片。
③加入800 µL预热的提取液，剧烈震荡，立即放回65℃水浴。
④孵育1～2 h甚至更长时间，时间越长，沉淀出来的DNA越干净。
⑤加入等体积的氯仿：异戊醇 (24 : 1)，摇床上摇10～20 min，12000 rpm，离心10 min。
⑥取上清至一新的1.5 mL Eppendorf 管中，加入0.7体积预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置30 min。
⑦12000 rpm，离心10 min；弃去上清，用70%酒精清洗沉淀两次。
⑧轻柔离心，弃去酒精，吸干残余液体，DNA沉淀室温吹干至透明，加入100μL灭菌水溶解沉淀。
⑨待DNA 充分溶解后，用NanoDrop 2000 核酸浓度仪(NanoDropTechnologies,Wilmington, USA) 测定 DNA 浓度和质量。取部分 DNA 溶液稀释至 50～100 ng/μL用于PCR 反应，其余储存于-20℃ 冰箱备用。
PCR检测所用正向引物：5'- TCCAGGAGCGCACCATCTT-3'；反向引物：5'-TCGTCCATGCCGTGAGTGA-3'。
PCR反应体系如表5所示，反应程序如表6所示。
表5 PCR反应体系
| 成分 | 体积 |
| 2×Rapid Taq Master Mix | 5 µl |
| 正向引物 | 0.2 µl |
| 反向引物 | 0.2 µl |
| DNA | 1 μl |
| ddH2O | 3.6 μl |
表6 PCR反应程序
。
PCR结果如图3A所示，转基因植株可扩增出427 bp的DNA片段，表明TaXTH-2D成功转化到小麦中。
实施例四 TaXTH-2D转基因小麦的实时荧光定量检测
取转基因和WT植株的叶片用于RNA提取。RNA提取，cDNA合成及实时荧光定量PCR所用的引物、体系，程序及仪器同实施例一。结果如图3B所示，转基因株系OE7和OE8中TaXTH- 2D的表达量约是对照中的6～7倍，说明TaXTH-2D基因能够在转基因株系中过量表达。
实施例五 TaXTH-2D转基因小麦的耐旱性鉴定
将TaXTH-2D转基因株系和WT的种子消毒后于4℃放置3天后，将种子于培养皿中发芽。发芽后3～5天将大小及生长状态一致的幼苗移栽于塑料盒中，于生长箱中正常浇水生长至3叶期，然后停止浇水至植株严重萎焉且转基因及WT植株存在明显差异时复水，复水约1周统计存活率。结果如图4所示，正常浇水条件下，TaXTH-2D转基因株系与对照无明显差异，但在干旱条件下，转基因株系较对照萎焉较轻，复水后转基因株系比对照具有更高的存活率，表明TaXTH-2D基因能够提高小麦的耐旱性。
尽管已描述了本申请的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离其发明的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1. 一种小麦耐旱基因TaXTH-2D，其特征在于，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或者是在SEQ ID NO. 1的基础上经过一个或几个碱基的取代、缺失或/和添加所衍生的能够增强小麦耐旱性的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述的小麦耐旱基因TaXTH-2D的基因表达盒。
3.根据权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，含有Actin启动子、Nos终止子。
4.一种含有权利要求1所述的小麦耐旱基因TaXTH-2D的表达载体。
5.权利要求1所述小麦耐旱基因TaXTH-2D、权利要求2所述基因表达盒或权利要求4所述表达载体在培育耐旱植物中的应用。
6.权利要求1所述小麦耐旱基因TaXTH-2D、权利要求2所述基因表达盒或权利要求4所述表达载体在提高植物耐旱性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使所述小麦耐旱基因TaXTH-2D在植物中上调表达。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311111206.7A CN117327716A (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 小麦耐旱基因TaXTH-2D、表达盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311111206.7A CN117327716A (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 小麦耐旱基因TaXTH-2D、表达盒及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117327716A true CN117327716A (zh) | 2024-01-02 |
Family
ID=89290918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311111206.7A Pending CN117327716A (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 小麦耐旱基因TaXTH-2D、表达盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117327716A (zh) |
-
2023
- 2023-08-31 CN CN202311111206.7A patent/CN117327716A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113549635B (zh) | 大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物或蔬菜抗病性中的用途 | |
| CN110004156A (zh) | 与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用 | |
| AU2014333405B2 (en) | A method for production of transgenic cotton plants | |
| CN110004154B (zh) | 茶树CsJAZ1基因的应用 | |
| CN109180791B (zh) | 一种与植物耐旱相关的基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN108588041B (zh) | 海岛棉细胞色素p450基因、其编码蛋白和应用 | |
| CN102250949B (zh) | 水稻miR166在提高植物镉胁迫耐受性中的应用 | |
| CN115851821B (zh) | Bbx16基因在提高植物盐耐受性中的应用 | |
| CN109852634B (zh) | 一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法 | |
| CN110373417A (zh) | 棉花GhMADS41-A04基因在促进植物开花中的应用 | |
| CN108795927A (zh) | 普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用 | |
| CN114907465A (zh) | 水稻孕穗期耐冷性相关的OsLEA9蛋白及其相关生物材料与应用 | |
| CN117327716A (zh) | 小麦耐旱基因TaXTH-2D、表达盒及其应用 | |
| CN106978499A (zh) | 转基因大豆事件gc1‑1外源插入片段旁侧序列及其应用 | |
| CN111635906A (zh) | 海岛棉GbCYP72A2基因、其编码蛋白和应用 | |
| CN104962563A (zh) | 白桦BpMYB106基因、其氨基酸序列及应用 | |
| CN113637679B (zh) | 一种抗逆植物基因及应用 | |
| CN110964729A (zh) | 一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法 | |
| CN116121298B (zh) | 抑制hsrp1基因的表达在提高植物耐热性中的应用 | |
| CN115960952B (zh) | 过表达玉米ZmHB53基因的表达载体和构建方法及其在提高植物耐旱性中的应用 | |
| CN114085838B (zh) | 马铃薯stu-miRn220及其应用 | |
| CN105695462B (zh) | 大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的应用 | |
| CN114214325B (zh) | 光皮桦miR156a前体基因及在促进植物分枝形成中的应用 | |
| CN114591984B (zh) | OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用 | |
| CN116897961B (zh) | 一种植物分枝调节剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |