JP2021519108A - Gmpレベルの無血清懸濁液細胞を用いるレンチウイルスの大規模製造方法 - Google Patents
Gmpレベルの無血清懸濁液細胞を用いるレンチウイルスの大規模製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021519108A JP2021519108A JP2021501071A JP2021501071A JP2021519108A JP 2021519108 A JP2021519108 A JP 2021519108A JP 2021501071 A JP2021501071 A JP 2021501071A JP 2021501071 A JP2021501071 A JP 2021501071A JP 2021519108 A JP2021519108 A JP 2021519108A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- cell
- transfection
- cells
- liquid exchange
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000725 suspension Substances 0.000 title claims description 4
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 47
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 76
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 17
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000003570 air Substances 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123373 Adenovirus E1A gene Drugs 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/12—Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程であって、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106〜5×106細胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が3〜100Lである、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30〜38℃、溶存酸素35〜55%、CO2濃度2〜10%、pH6.9〜7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し;継代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6.9〜7.4に維持する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガ条件が
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは7.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記上清の排出前における前記培養物の体積をVq1とし、前記上清の排出後における前記培養物の体積をVh1とした場合に、Vq1/Vh1比が3〜15であり;次いで、前記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程;
(e) 工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である、該工程;
(f) トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が
(t1)総細胞量が0.05〜2×1011細胞であること;
(t2)細胞濃度が0.5〜5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;
(t4)総培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成することを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30〜37℃、溶存酸素35〜55%、CO2濃度2〜10%、pH6.9〜7.4の条件下で継代培養し;継代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6.9〜7.4に維持する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む:
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムpH値は依然として減少を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収することを含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をVq2とし、上清の回収後における培養物の体積をVh2とした場合に、Vq2/Vh2比が3〜15である、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程。
広範かつ詳細な研究の後、製造プロセスへの探索およびプロセスパラメータのスクリーニングを通して、本発明者らは、大規模なGMPレベルの無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方法を開発した。本発明により提供される方法は、50リットル以上の大規模生産に適しているだけでなく、極めて効率的な様式で高力価レンチウイルスを調製する。さらに、全プロセスが無血清培養条件を採用するので、この方法は、血清の使用による動物ベースのタンパク質および他の汚染物質の導入の危険性を回避する。さらに、本発明によって提供される方法によって産生されるレンチウイルスのバッチ間の変動は極めて小さく、これは産生品質のためのGMP産生の高い要件を満たし得る。これにより、本発明が完成する。
本明細書において、「本発明のパッケージング細胞」、「パッケージング細胞HEK293F」、および「本発明のパッケージング細胞HEK293F」という用語は、それぞれ交換可能に使用されることができ、本発明の第1の態様において記載され、レンチウイルスをパッケージングおよび産生するために使用される細胞を意味する。
本発明において、使用可能なレンチウイルスパッケージング系は特に限定されないが、好ましくは、3プラスミドおよび4プラスミド系を使用することができる。
(a)本発明の細胞は、自動制御システムを用いることでスケールアップすることができる懸濁培養細胞であり、それにより、組換えレンチウイルスベクター供給液を大規模に生産することができ、生産コストを制御下に置くことができる。
培地:明確な化学組成を有する無血清および無タンパク質培地
培養条件:CO23〜5%;温度30〜37℃
(1)トランスフェクション試薬の調製:
a) 1×HBS (pH7.4):8.76gのNaClを900mlの超純水に溶解し、20mlの1M HEPESを添加し、pH値を7.4に調整し、容量を1Lに設定し、濾過し(0.2μm濾過膜)、後の使用のために4℃で保存した;
b) PEI粉末125mgを量り、1×HBS(pH7.4)50mlに溶かし、0.2μmのろ過膜でろ過し、4℃で保存して使用した。
レンチウイルスの大規模生産方法:
本発明は、GMPレベルの無血清懸濁細胞を使用することによるレンチウイルスの大規模生産のための方法を提供するものである。
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程であって、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106〜5×106細胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が所定の大容量(例えば、3〜100L)である、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30〜38℃、溶存酸素35〜55%、CO2濃度2〜10%、pH6.9〜7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出すること;次いで、前記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程;
(e)工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である、該工程;
(f)トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程であって、前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成することを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30〜37℃、溶存酸素35〜55%、CO2濃度2〜10%、pH6.9〜7.4の条件下で培養する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収することを含む、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程;
ここで、上記各工程で用いる培養液は、無血清細胞培養液である。
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは7.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること。
(t2)細胞濃度が0.5〜5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;および
(t4)総培養時間が72時間以上であること。
シード溶液の調製;
接種濃度1〜5×106細胞/mlの接種(25Lの培養液に接種);
パッケージング細胞の継代培養を行い(この間、pHおよび溶存酸素を用いて、溶存CO2、窒素、大気の通気比率、さらに液交換の開始様式が自動的に調整すされる)、pHを6.9〜7.4、好ましくは7.0〜7.3、より好ましくは7.1〜7.2に制御する;
第1の液体変化(pHが6.9以下、好ましくは7.0以下である場合、液体変化を開始することができる)、例えば、25L→2〜10L(好ましくは3〜7L);
無血清培養液を補充し、24〜96時間、好ましくは36〜72時間、より好ましくは40〜60時間培養し続け;300時間培養した後、細胞数は5×1010である;
プラスミドを添加し、パッケージング細胞に複数のプラスミドをトランスフェクトする;
任意選択的な工程:トランスフェクション後、2〜10時間、好ましくは4〜6時間培養し、再度、液体交換を行う(まず一定量の培養混合液を排出し、次に無血清培養液を添加する);
汎用工程:トランスフェクション後、培養を続ける;pHが≦6.9、好ましくは≦7.0の場合、トランスフェクション後に第1の液体交換を開始することができ、トランスフェクション後の液体交換中に、排出された液体培養混合物(無細胞ウイルス含有上清)を回収し、回収液R1として記録し、2〜8℃で保存する;
液体交換の後、培養を続ける;液体交換トリガー条件が満たされた場合、トランスフェクション後にi番目の液体交換が行われ(ここで、iは2、3、4または5であり)、各回の液体交換の間、排出された液体培養混合物の無細胞ウイルス含有上清が回収され、回収液Riとして記録される;この工程を1、2または3回繰り返す;
回収した各液体を混合し、混合ウイルス含有上清を得る;
混合ウイルス含有上清を精製して、1×108〜1×109 Tu/mLの力価を有する精製レンチウイルスベクターを得る。
以下の相違点を除いて、実施例1を繰り返した。初期pH値は6.9〜7.4であるが、継代培養プロセスにおいて、第1培養物のリアルタイムpH値はリアルタイムでモニターされず、代わりに、継代培養は24〜96時間で行った。
以下の相違点を除いて、実施例1を繰り返した:CO2含有量は調整しない。
Claims (10)
- 無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方法であって、以下の工程:
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程であって、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106〜5×106細胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が3〜100Lである、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30〜38℃、溶存酸素35〜55%、CO2濃度2〜10%、pH6.9〜7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し;継代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6.9〜7.4に維持する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガ条件が
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは7.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記上清の排出前における前記培養物の体積をVq1とし、前記上清の排出後における前記培養物の体積をVh1とした場合に、Vq1/Vh1比が3〜15であり;次いで、前記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程;
(e) 工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である、該工程;
(f) トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が
(t1)総細胞量が0.05〜2×1011細胞であること;
(t2)細胞濃度が0.5〜5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;
(t4)総培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成することを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30〜37℃、溶存酸素35〜55%、CO2濃度2〜10%、pH6.9〜7.4の条件下で継代培養し;継代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6.9〜7.4に維持する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む:
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムpH値は依然として減少を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収することを含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をVq2とし、上清の回収後における培養物の体積をVh2とした場合に、Vq2/Vh2比が3〜15である、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程;
を含み、上記各工程で用いられる培養液は、無血清細胞培養液である、該方法。 - 工程(c)および/または(h)において、培養が振盪条件下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)および/または(h)において、pH値が7.0〜7.35の範囲に維持される、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)および/または(i)において、Vq1/Vh1比が5:10である、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)、(d)および(e)の合計時間が72〜216時間である、請求項1に記載の方法。
- 工程(f)において、用いられるマルチプラスミドトランスフェクションが、3プラスミドトランスフェクションおよび4プラスミドトランスフェクションを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培養容器が使い捨て培養容器である、請求項1に記載の方法。
- 前記混合ウイルス含有上清に含まれるウイルスの総数が、1×1012 Tuである、請求項1に記載の方法。
- 前記パッケージング細胞が、ヒト胚性腎上皮細胞である、請求項1に記載の方法。
- 工程(l)において、前記精製が、限外濾過およびクロマトグラフィーを含む、請求項1に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810273392.7A CN110317791A (zh) | 2018-03-29 | 2018-03-29 | Gmp级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法 |
CN201810273392.7 | 2018-03-29 | ||
PCT/CN2019/080215 WO2019184996A1 (zh) | 2018-03-29 | 2019-03-28 | Gmp级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2024051544A Division JP2024075766A (ja) | 2018-03-29 | 2024-03-27 | Gmpレベルの無血清懸濁液細胞を用いるレンチウイルスの大規模製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021519108A true JP2021519108A (ja) | 2021-08-10 |
JPWO2019184996A5 JPWO2019184996A5 (ja) | 2022-03-31 |
Family
ID=68058573
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021501071A Pending JP2021519108A (ja) | 2018-03-29 | 2019-03-28 | Gmpレベルの無血清懸濁液細胞を用いるレンチウイルスの大規模製造方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11845962B2 (ja) |
EP (1) | EP3778880A4 (ja) |
JP (1) | JP2021519108A (ja) |
KR (1) | KR20200136463A (ja) |
CN (1) | CN110317791A (ja) |
AU (1) | AU2019241301A1 (ja) |
SG (1) | SG11202009826PA (ja) |
WO (1) | WO2019184996A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110894494B (zh) * | 2019-11-22 | 2022-09-27 | 广西梧州制药(集团)股份有限公司 | 一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法 |
CN113832112A (zh) * | 2020-06-24 | 2021-12-24 | 重庆精准生物技术有限公司 | 一种制备慢病毒的混合方法及混合系统 |
CN113265425A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-08-17 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 基于悬浮细胞的car-cd19慢病毒制备工艺 |
CN114990077A (zh) * | 2022-08-01 | 2022-09-02 | 深圳市先康达生命科学有限公司 | 一种慢病毒包装与纯化方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014533516A (ja) * | 2011-11-24 | 2014-12-15 | ジェネトン | 工業的な医薬用途に適合する拡張可能なレンチウイルスベクター製造システム |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2002348151A1 (en) | 2001-11-05 | 2003-05-19 | Genvec, Inc. | Viral vector production methods and compositions |
US20030175688A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-18 | Rukmini Pennathur-Das | Method for the purification and production of oncolytic adenoviruses |
US20080026448A1 (en) | 2006-02-15 | 2008-01-31 | Lydersen Bjorn K | Production of HIV |
PL2007883T3 (pl) | 2006-04-20 | 2012-07-31 | Wyeth Llc | Sposób oczyszczania do izolacji oczyszczonego wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej z hodowli komórkowej |
KR20110004354A (ko) | 2007-12-21 | 2011-01-13 | 와이어쓰 엘엘씨 | 유전자 변형된 약독화 수포성 구내염 바이러스, 이의 조성물 및 사용 방법 |
DK2350268T3 (en) | 2008-11-03 | 2015-03-23 | Crucell Holland Bv | PROCEDURE FOR PRODUCING ADENOVIRUS VECTORS |
EP2682168A1 (en) | 2012-07-02 | 2014-01-08 | Millipore Corporation | Purification of biological molecules |
CN103881984A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-06-25 | 深圳市赛百诺基因技术有限公司 | 无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法及其药品制剂生产方法 |
FR3014901B1 (fr) | 2013-12-17 | 2017-06-09 | Genethon | Procede de purification de virus ou vecteurs viraux enveloppes |
CN104371982A (zh) | 2014-10-21 | 2015-02-25 | 武汉维诺赛生物技术有限公司 | 一种慢病毒的纯化方法 |
EP3054007A1 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an immuno-affinity purification step |
CN107043784A (zh) * | 2016-02-05 | 2017-08-15 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 一种慢病毒载体的制备方法 |
CN107523555A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-12-29 | 武汉光谷人福生物医药有限公司 | 获得病毒的方法 |
CN107841482B (zh) * | 2016-09-21 | 2021-07-27 | 上海倍谙基生物科技有限公司 | Mdck细胞无血清悬浮培养技术生产h9亚型流感疫苗 |
CN106434571A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-02-22 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种wave无血清培养悬浮细胞制备重组腺病毒的方法 |
CN106474466B (zh) | 2016-12-07 | 2018-04-13 | 申联生物医药(上海)股份有限公司 | 一种口蹄疫疫苗的制备方法 |
CN107384877B (zh) | 2017-08-18 | 2020-09-08 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种慢病毒的纯化方法 |
CN107630037A (zh) | 2017-10-19 | 2018-01-26 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 一种获得高纯度腺相关病毒载体的纯化工艺 |
CN110317832B (zh) | 2018-03-28 | 2022-07-05 | 西比曼生物科技(香港)有限公司 | Gmp级规模化制备重组慢病毒载体的纯化制剂的方法 |
-
2018
- 2018-03-29 CN CN201810273392.7A patent/CN110317791A/zh active Pending
-
2019
- 2019-03-28 KR KR1020207030733A patent/KR20200136463A/ko unknown
- 2019-03-28 EP EP19775992.1A patent/EP3778880A4/en active Pending
- 2019-03-28 WO PCT/CN2019/080215 patent/WO2019184996A1/zh active Application Filing
- 2019-03-28 US US17/041,578 patent/US11845962B2/en active Active
- 2019-03-28 JP JP2021501071A patent/JP2021519108A/ja active Pending
- 2019-03-28 AU AU2019241301A patent/AU2019241301A1/en active Pending
- 2019-03-28 SG SG11202009826PA patent/SG11202009826PA/en unknown
-
2023
- 2023-10-31 US US18/498,879 patent/US20240060053A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014533516A (ja) * | 2011-11-24 | 2014-12-15 | ジェネトン | 工業的な医薬用途に適合する拡張可能なレンチウイルスベクター製造システム |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 98, no. 4, JPN6023007080, 2007, pages 789 - 799, ISSN: 0005001173 * |
EXPERT OPIN. BIOL. THER., vol. 13, no. 7, JPN6023007081, 2013, pages 987 - 1011, ISSN: 0005001171 * |
HUMAN GENE THERAPY, vol. 23, JPN6023007079, 2012, pages 243 - 249, ISSN: 0005001174 * |
MOLECULAR THERAPY, vol. 16, no. 3, JPN6023007078, 2008, pages 500 - 507, ISSN: 0005001175 * |
THE JOURNAL OF GENE MEDICINE, vol. 11, JPN7023000774, 2009, pages 868 - 876, ISSN: 0005001172 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SG11202009826PA (en) | 2020-11-27 |
AU2019241301A1 (en) | 2020-10-22 |
US20240060053A1 (en) | 2024-02-22 |
WO2019184996A1 (zh) | 2019-10-03 |
US11845962B2 (en) | 2023-12-19 |
US20210363497A1 (en) | 2021-11-25 |
CN110317791A (zh) | 2019-10-11 |
EP3778880A1 (en) | 2021-02-17 |
KR20200136463A (ko) | 2020-12-07 |
EP3778880A4 (en) | 2021-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220235371A1 (en) | Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications | |
JP2021519108A (ja) | Gmpレベルの無血清懸濁液細胞を用いるレンチウイルスの大規模製造方法 | |
US5910434A (en) | Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant | |
JP6212039B2 (ja) | 真核細胞の形質導入に有用なウイルスベースのベクター組成物 | |
US20220056477A1 (en) | Foamy viral vector compositions and methods for the manufacture of same | |
US20210062220A1 (en) | Methods and constructs for production of lentiviral vector | |
EP4273236A1 (en) | Hek293t cell strain having high dispersibility and screening method therefor | |
Totsugawa et al. | Lentiviral transfer of the LacZ gene into human endothelial cells and human bone marrow mesenchymal stem cells | |
WO2022262206A1 (zh) | Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用 | |
JP2024075766A (ja) | Gmpレベルの無血清懸濁液細胞を用いるレンチウイルスの大規模製造方法 | |
KR20230006553A (ko) | 충전층 생물반응기에서의 렌티바이러스 벡터 제조 공정 | |
JP2023507554A (ja) | レンチウイルスベクターの一過性産生のための方法および構築物 | |
AU2012352394B2 (en) | Large commercial scale lentiviral vector production system and vectors produced thereby | |
WO2023242783A1 (en) | Methods of producing an enveloped virus | |
Accordino | Lentiviral Vector Production at High Cell Density by Transient Transfection of Suspended Culture HEK Cells | |
CN112714790A (zh) | 用于生产vsv-g假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒颗粒的ldlr阴性包装细胞系 | |
Yasemin van Heuvel | Optimization of retroviral packaging cells for scale-up of vector production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220322 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220322 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20221021 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20221021 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230228 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230530 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230828 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20231128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240327 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20240527 |