CN109414002A - 使用体细胞核移植(scnt)和囊胚补足的器官再生方法 - Google Patents

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Abstract

本申请揭示，通过将体细胞核移植细胞(SCNT细胞)注射入非人类第一哺乳动物的成熟囊胚中，从而补足导致该非人类第一哺乳动物的该目标器官发育的缺失，因此可再生如肾脏的目标器官。本申请还揭示，使用SCNT细胞在具有与发育期中目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物的活体内生产目标器官的方法，其中所生产的目标器官源自第二哺乳动物，且该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体。

Description

使用体细胞核移植(SCNT)和囊胚补足的器官再生方法
相关申请
基于35U.S.C.§119(e)，本申请主张2016年6月14日递交的美国临时申请US 62/350,005的优先权，前述临时申请的公开内容通过引用而并入本文。
技术领域
通常，本公开涉及使用SCNT细胞生产所希望的原子细胞的体内器官的方法。
背景技术
在对细胞移植或器官移植形式的再生医学的论述中，当将诱导多能干细胞(iPS细胞)注射入囊胚的内部空间中时，所导致的个体形成嵌合体小鼠。先前已报导了通过囊胚补足进行的T细胞和B细胞世系拯救实验，使用这一技术，对具有T细胞和B细胞世系缺陷的Rag-2敲除鼠进行了该拯救实验。这一嵌合小鼠试验作为用于验证该T细胞世系分化的体内试验系统，而T细胞世系分化无法使用体外试验系统验证。
另外，关于器官的再生，Nakauchi和合作者(US 2011/0258715)报导了通过将iPS细胞注射入成熟的囊胚中而补足了Pdx1LacZ/LacZ小鼠胰腺的缺陷，并进一步揭示，经如是补足的具有该胰腺的转基因动物可作为始祖(founder)将其表型遗传至下一代。这些发现已经表明，可通过使用这一始祖完成器官再生。
但是，Nakauchi等人实践的技术需要通过培养具有重编程因子的体细胞并自该体细胞构建iPS细胞而将多能性引入该体细胞内。选择适宜的重编程因子、确保推定iPS细胞的所引入的多能性、以及构建该iPS细胞，代表了在改善人类或动物健康的临床中挑战Nakauchi的成果的机遇。
其它再生器官的尝试从胚胎干细胞(ES细胞)而非iPS细胞开始。但是，即便是同一物种，来自给定物种的第一胚胎的ES细胞在遗传学上与可能希望得到再生器官的第二个体截然不同。因此，从来自第一胚胎的ES细胞生产的再生器官的移植物，可能需要该第二个体进行免疫抑制治疗，以预防可能令该第二个体免疫功能低下的对该再生器官的排异。另外，多方人士可能发现，使用来自第一人类胚胎的ES细胞是不道德的。
本公开可解决及/或至少减少上述先前技术所生产的一个或多个问题，及/或提供上文所列的一种或多种所希望的特征下文显示。
发明内容
为了提供对本公开一些方面的基本理解，下文呈现对本公开的简要概括。这一概括并非对本公开的详尽概览。其并非意在确认本公开的关键要素或描绘本公开的范畴。其唯一目的为以作为后文所论述的更详细的说明书的前奏的简化形式呈现一些概念。
通常，本公开提出使用容易制备的体细胞核移植细胞(SCNT细胞)进行器官再生的技术，该技术适用于工业应用。具体而言，本公开可提供从个体的一种体细胞如皮肤细胞再生“自身器官”的技术，该技术没有使用iPS细胞时可能出现的挑战性。
附图说明
可参考下述说明书和附图理解本公开，其中，相似的附图标记表示相似的元件，以及：
图1A表示用于再生性克隆的体细胞核移植(SCNT)过程的示意图，该图作为提供相关背景而包括在本文中；
图1B表示体细胞核移植(SCNT)过程的示意图，通过该过程，根据本文中的具体例，能够生产囊胚补足的SCNT细胞；
图2表示根据本文中的具体例，使用SCNT细胞的囊胚补足的示意图；
图3提供关于根据本文中的具体例的第一方法的流程图；以及
图4提供关于根据本文中的具体例的第二方法的流程图。
尽管本文中揭示的主题易受各种修饰和变更形式的影响，但其具体具体例已经通过在附图中示例的方式显示并在本文中详细揭示。但应理解，本文中对于具体具体例的说明并非意在将本公开限制为所揭示的特定形式，且正相反，本发明意在覆盖落入如权利要求书所界定的公开范畴内的所有修饰、等价物和变更。
具体实施方式
本公开的多种例示性具体例揭示于下。为清楚起见，并非所有的实际实施的特征均揭示于本说明书中。当然应知晓，在任何此真实具体例的研发中，必须做出大量的明确实施决断以实现研发者的既定目标，如遵守系统相关和业务相关的约定，而这些约定在不同的实施中不同。而且应知晓，这一研发尝试可能是复杂且耗时的，但尽管如此，在在本公开获益之下，该尝试对于该领域技术人员来说仍是常规任务。
现在，将参考附图揭示本发明主题。附图中示意性地描述了多种结构、系统和装置，其仅用于解释说明并因此而不掩盖该领域技术人员所周知的本公开的细节。然而，附图仅用来揭示并解释本公开的例示性实施例。本文中使用的词汇和短语应理解并演绎为具有与相关领域技术人员所理解的那些词汇和短语一致的意义。通过在本文中一贯地使用术语或短语，没有暗示对该术语或短语的特殊定义，即不同于该领域技术人员所理解的普通和习惯意义的定义。就术语或短语倾向于具有特殊意义即不同于技术人员所理解的意义来说，这一特殊定义以直接且明确提供地对于该术语或短语的特殊定义的定义方式详述于说明书中。
一种具体例中，在囊胚补足方法中，当通过将体细胞核移植细胞(SCNT细胞)注射入囊胚中而补足如肾脏的器官的缺陷时，下一代出生以获得嵌合体胚胎，且具有如是补足的肾脏的转基因动物可作为始祖将其表型遗传至下一代。换言之，可通过使用这一始祖实施器官再生。
一种具体例中，本公开提供在具有与发育期中目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物活体内生产目标器官的方法，所生产的模板器官源自第二哺乳动物，且该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体，该方法包含：
a)制备源自第二哺乳动物的体细胞核移植细胞(SCNT细胞)；
b)将该细胞移植入该非人类第一哺乳动物的囊胚中，以获得嵌合体胚胎；
c)令该嵌合体胚胎在非人类第三哺乳动物的子宫内发育，以获得至少一个包含该目标器官的后代；以及
d)从该至少一个后代获得该目标器官。
一种具体例中，该SCNT细胞源自人类、大鼠、和小鼠的一种或多种。
一种具体例中，该SCNT细胞源自大鼠和小鼠的一种或多种。
一种具体例中，待生产的器官选自胰腺、肾脏、胸腺、和毛发。
一种具体例中，该非人类第一哺乳动物是小鼠。
一种具体例中，该小鼠是Sall1敲除的小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠、Pdx1敲除的小鼠、和裸小鼠的一种或多种。
一种具体例中，该目标器官完全源自该第二哺乳动物。
一种具体例中，该方法可进一步包含将该第二哺乳动物的体细胞的细胞核转移至去除细胞核的卵子内，以获得该SCNT细胞。一种具体例中，该去除细胞核的卵子可以是与该第二哺乳动物相同的物种的卵子。
一种具体例中，该SCNT细胞与该非人类第一哺乳动物可以是异种异体(xenogeneic)的关系，即，该第二哺乳动物与该非人类第一哺乳动物可以来自不同的物种。
一种具体例中，该SCNT细胞源自大鼠，且该非人类第一哺乳动物是小鼠。
另一方面，本公开提供具有与发育期中目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物，该哺乳动物通过包括下述步骤的方法生产：
a)制备源自第二哺乳动物的SCNT细胞，其中该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体；
b)将该SCNT细胞移植入该非人类第一哺乳动物的囊胚内，以获得嵌合体胚胎；以及
c)令该嵌合体胚胎在非人类第三哺乳动物的子宫内发育，以获得至少一个包含该目标器官的后代。
另一方面，本公开涉及具有与发育期中目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物，其用于使用SCNT细胞生产该目标器官。
另一方面，本公开提供用于制备目标器官的试剂盒，该试剂盒包含：
A)具有与发育期中该目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物；以及
B)源自第二哺乳动物的SCNT细胞，其中该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体。
另一方面，本公开提供生产目标器官和目标身体部位中的一者或多者的方法，该方法包含：
A)提供一种包括编码因子的缺陷负责基因的动物，当该因子起作用时，该基因造成器官和身体部位中的一者或多者的缺陷并给出无存活可能和存活困难中的一者或多者，其中，该器官和身体部位中的一者或多者通过囊胚补充而得以补足，该编码因子的缺陷负责基因造成器官和身体部位中的一者或多者的缺陷；
B)令从该动物获得的卵子生长为囊胚；
C)将目标SCNT细胞引入该囊胚中以生产嵌合体囊胚，该目标SCNT细胞具有所希望的能补足由该缺陷负责基因造成的缺陷的基因组；以及
D)从该嵌合体囊胚生产一个体，随后从该个体获得目标器官和目标身体部位的一者或多者。
一种具体例中，该方法进一步包含将该第二哺乳动物的体细胞的细胞核转移至去除细胞核的卵子，以获得该SCNT细胞。一种具体例中，该去除细胞核的卵子可以来自与该第二哺乳动物相同的物种。一种具体例中，步骤D)包括令该嵌合体囊胚在非人类第三哺乳动物的子宫内发育，以获得至少一个包含该目标器官的后代，以及从该至少一个后代获得该目标器官。
另一具体例中，该目标SCNT细胞源自大鼠和小鼠的一种或多种。
另一具体例中，目标器官和目标身体部位的一者或多者选自胰腺、肾脏、胸腺、和毛发。
又一具体例中，该动物是小鼠。
另一具体例中，该小鼠是Sall1敲除的小鼠、Pdx1敲除的小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠、和裸小鼠的一种或多种。
又一具体例中，目标器官和目标身体部位的一者或多者完全源自该SCNT细胞。
又一具体例中，该SCNT细胞与该非人类第一哺乳动物是异种异体的关系。
又一具体例中，该SCNT细胞源自大鼠，而该非人类第一哺乳动物是小鼠。
另一方面，本公开提供一种用于生产目标器官和目标身体部位中的一者或多者的试剂盒，该试剂盒包含：
A)一非人类动物，其包括编码一因子的基因，当该因子起作用时，该基因造成器官和身体部位中的一者或多者的缺陷并给出无存活可能和存活困难中的一者或多者，其中，该器官和身体部位中的一者或多者通过囊胚补充而得以补足以及
B)源自第二哺乳动物的SCNT细胞，其中该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体。
一种具体例中，该非人类动物与该SCNT细胞是异种异体的关系。
图1A提供关于在所谓繁殖性克隆情境中的体细胞核移植(SCNT)技术的一般背景。通过以精子(单倍体或1n)令卵子(也是单倍体或1n)受精以获得受精卵(二倍体或2n)，之后令该受精卵发育为囊胚，将其移植入雌性的子宫内，妊娠，出生，以及产后发育以获得成年小鼠。受精和移植可通过传统的交配或体外受精(IVF)技术执行。该成年小鼠在基因上与该受精卵相同。
继续通过图1A，可通过例如来自该成年小鼠的皮肤或颊腔(颊内)的细胞拭片提供该成年小鼠的二倍体或2n体细胞(即，非生殖细胞)。可使用已知技术分离该体细胞的细胞核。同样，亦可通过已知技术提供卵子并移除其细胞核。随后，可将该体细胞的细胞核转移至去除细胞核的卵子内，以获得SCNT受精卵。该SCNT受精卵在基因上与该成年小鼠相同(即，成年小鼠的克隆体)。可令该SCNT受精卵发育为SCNT囊胚，且可通过IVF技术将其移植入雌性的子宫内。该SCNT囊胚可在妊娠过程中发育，出生，并在产后发育为作为该成年小鼠的克隆体的成熟个体。每一步骤所需的技术是周知的。
图1B示意性地说明根据本文具体例所使用的SCNT技术。提供来自患者如希望再生目标器官的患者的体细胞(二倍体，2n)。移除该体细胞的细胞核，并将该细胞核转移至去除细胞核的卵子内，以获得SCNT受精卵。该SCNT受精卵在基因上与该患者相同(即，该患者的克隆体)。该SCNT受精卵可发育为SCNT囊胚和SCNT胚胎。并非将该SCNT囊胚或胚胎移植入雌性的子宫内，而是将该SCNT囊胚或胚胎在不出现妊娠发育的条件下保持在体外。但是，即使在体外，干细胞也可发育为SCNT囊胚或胚胎。该干细胞可从该SCNT囊胚或胚胎分离，以获得可根据本文具体例使用的SCNT细胞。
图2示意性地说明进一步的技术，由此，可生产包含源自第二哺乳动物的器官(如，在所说明的具体例中是肾脏)的动物如非人类哺乳动物(如，在所说明的具体例中是小鼠)。例如，可饲养其各自Sall1基因座为杂合的雄性和雌性(Sall1(+/-))，并回收囊胚。所回收囊胚中的大约1/4将具有Sall1(-/-)基因型，其导致成年小鼠借而缺失肾脏的表型。但是，如果Sall1(-/-)囊胚接受SCNT细胞(如可通过图1B中说明的技术生产的SCNT细胞)，则该SCNT细胞(假设它们是Sall1(+/-)、Sall1(+/+)、或具有肾脏发育可借而正常进行的相当的基因型)可令该成年Sall1(-/-)小鼠体内生成肾脏。
尽管图2涉及小鼠和该Sall1基因座，该领域技术人员在从本公开获益之下将意识到，所使用的技术将可用于小鼠体内的其它基因座或其它动物体内的任何基因座。另一具体例中，通过使用所谓的“基因驱动”(如，CRISPR)技术)，可无需饲养性成熟的Sall1(+/-)杂合动物而制备纯合Sall1(-/-)胚胎。例如，CRISPR技术可用来在基因上将卵子和精子修饰为Sall1(-)，随后可通过体外受精技术获得纯合Sall1(-/-)胚胎。
图3呈现根据本发明具体例的第一方法300的流程图。该方法300可包含：制备源自第二哺乳动物的体细胞核移植细胞(SCNT细胞)
(310)；将该SCNT细胞移植入非人类第一哺乳动物的囊胚内，以获得嵌合体胚胎(320)；令该嵌合体胚胎在非人类哺乳动物的子宫内发育，以获得至少一个包含目标器官的后代(330)；以及从该至少一个后代获得该目标器官(340)。通过实施该方法300，可在具有与发育期中该目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物活体内生产该目标器官，所生产的目标器官源自第二哺乳动物，而该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体。
图4提供根据本文具体例的第二方法400的流程图。如图中所示，该方法400可包含：提供一非人类动物(410)，其包括编码因子的缺陷负责基因，若该因子起作用，则该基因造成器官和身体部位中的一者或多者的缺陷且给出无存活可能和存活困难中的一种或多种，其中，器官和身体部位中的一者或多者通过囊胚补足而得以补充，该编码因子的缺陷负责基因造成目标器官和目标身体部位的一者或多者的缺陷。该方法400还可包含令从该非人类动物获得的卵子生长为囊胚(420)。该方法400可进一步包含将目标体细胞核移植细胞(SCNT细胞)引入该囊胚内，从而生产嵌合体囊胚(430)，该目标SCNT细胞具有所希望的能够补足由该缺陷负责基因造成的缺陷的基因组。该方法400还可包含从该嵌合体囊胚生产个体(440)。该方法400可额外包含从该个体获得目标器官和目标身体部位中的一者或多者(450)。
该方法400可用来生产该目标器官和该目标身体部位中的一者或多者。
本公开中，根据用于待生产器官的动物物种制备待移植入的SCNT细胞。例如，当待生产者是人类器官时，之别包含源自人类体细胞的细胞核的SCNT细胞。当待申城者是除人类以外的哺乳动物器官时，制备源自该哺乳动物的细胞。
本公开的方法中待生产的器官可以是任何具有固定形状的实质器官，如肾脏、心脏、胰腺、小脑、肺、甲状腺、毛发、和胸腺。其优选实例包括肾脏、胰腺、毛发、和胸腺。通过令SCNT细胞在用作接纳者的嵌合体胚胎内发育，在至少一个包含目标器官的后代体内生产此类实质器官。通过在胚胎内发育，该SCNT细胞可形成所有种类的器官。据此，依据待使用的SCNT细胞种类可生产的实质器官并无限制。
同时，本公开的特征为，在至少一个源自非人类胚胎且包含该目标器官的用作接纳者的个体后代体内形成仅以所移植细胞作为起源的器官。因此，不希望具有所移植细胞的嵌合体细胞组合物以及源自该接纳者非人类胚胎的细胞。因此，作为接纳者的非人类胚胎，希望使用源自具有与发育期中待生产器官的发育缺失相关的畸形的动物的胚胎，且该动物之后代具有该器官的缺陷。只要该动物发展出这一器官缺陷，可使用具有作为特定基因缺陷的结果的器官缺陷的敲除动物或具有作为并入特定基因的结果的器官缺陷的转基因动物。或者，可使用本文中揭示的“始祖”动物。
一种具体例中，当肾脏作为待生产的器官时，具有与发育期中肾脏发育缺失相关的畸形的Sall1敲除动物的胚胎(Nishinakamura,R.et al,Development,Vol.128,p.3105-3115,2001)等，可用作该接纳者非人类胚胎。同时，当胰腺作为待生产的器官时，具有与发育期中胰腺发育缺失相关的畸形的Pdx1敲除动物的胚胎(Offield,M.F.,et al.,Development,Vol.122,p.983-995,1996)可用作该接纳者非人类胚胎。当小脑作为待生产的器官时，具有与发育期中小脑发育缺失相关的畸形的Wnt-1(int-1)敲除动物的胚胎(McMahon,A.P.and Bradley,A.,Cell,Vol.62,p.1073-1085,1990)可用作该接纳者非人类胚胎。当肺和甲状腺作为待生产的器官时，具有与发育期中肺和甲状腺发育缺失相关的畸形的T/ebp敲除动物的胚胎(Kimura,S.,et al,Genes and Development,Vol.10,p.60-69,1996)等，可用作该接纳者非人类胚胎。此外，可使用过表达纤维母细胞生长因子(FGF)受体(FGFR)的胞内域缺陷并造成多个器官如肾脏和肺缺陷的显性阴性型转基因突变动物模型的胚胎(Celli,G.,et al,EMBO J.,Vol.17pp.1642-655,1998)。或者，可使用裸小鼠来生产毛发或胸腺。
本公开中，源自该接纳者胚胎的非人类动物可以是除人类之外的任何动物，如猪、大鼠、小鼠、牛、绵羊、山羊、马、狗、狒狒、黑猩猩、大猩猩、猩猩、猴、狨猴、和倭黑猩猩。优选从成年体积与待生产器官的动物物种相似的非人类动物采集胚胎。
同时，用作被移植入接纳者囊胚的细胞和用于形成待生产的器官的细胞原始来源的哺乳动物，可以是人类或除人类之外的哺乳动物，例如，株、大鼠、小鼠、牛、绵羊、山羊、马、狗、狒狒、黑猩猩、大猩猩、猩猩、猴、狨猴、和倭黑猩猩。
该接纳者胚胎与该待移植的SCNT细胞之间的关系可以是同种异体(相同物种)的关系或异种异体(不同物种)的关系。
通过将如上文所述制备的SCNT细胞移植入接纳者囊胚的内部空间中，可在该囊胚的内部空间中形成该源自囊胚的内部细胞与所移植的SCNT细胞的嵌合混合物。
可将具有如上文所述移植的SCNT细胞的囊胚或胚胎移植入代孕母体的子宫中，该代孕母体是例如该囊胚所来源的物种的假孕或怀孕雌性动物。该囊胚可在该代孕母体的子宫中发育，以获得至少一个包含目标器官的后代。随后，可从这一窝中获得作为源自哺乳动物细胞的目标器官的目标器官。
根据本公开，提供用于器官再生的技术，该技术适用于工业应用。本公开还提供，依据个体境况，用于从体细胞如皮肤再生“自身器官”的技术。通过可能在基因上与该器官接纳者相同的可移植器官提供的对于人类健康的益处，对于该领域技术人员来说是显而易见的。
此外，使用源自各种基因组的器官实施研究和研发变为可能，通过以从具有目标基因组的细胞生产SCNT细胞的途径完成本公开而提供该器官。
为了具体揭示本公开的具体例，将在后文中揭示例示性的具体例。作为实例，将在下文中揭示在小鼠活体内生产源自哺乳动物细胞的肾脏的方法。应理解，可通过这一方法生产胰腺、毛发、和胸腺。
(非人类动物)
为了在动物如小鼠活体内生产源自除人类以外的哺乳动物细胞的肾脏，可制备具有与发育期中肾脏发育缺失相关的畸形的动物如小鼠。在本公开的一种具体例中，Sall1敲除小鼠(Nishinakamura,R.et al.,Development,Vol.128,p.3105-3115,2001)可用作具有与发育期中肾脏发育缺失相关的畸形的小鼠。如果这一动物具有Sall1(-/-)的纯合敲除基因型，该动物的特征在于其肾脏并不发育，且至少一个后代没有肾脏。或者，也可使用本文中揭示的始祖动物。
如果这一小鼠的Sall1基因缺陷处于纯合状态(Sall1(-/-))，则该小鼠不形成肾脏且无法存活。因此，Sall1基因缺陷在杂合状态(Sall1(+/-))下得以保留。令各自处于杂合状态下的小鼠彼此繁殖(Sall1(+/-)×Sall1(+/-))，并从子宫中采集受精卵。就概率而言，令受精卵以Sall1(+/+):Sall1(+/-):Sall1(-/-)＝1:2:1的概率比发育。本公开中，使用以25％概率发育的Sall1(-/-)胚胎。但是，难以确定早期胚胎阶段的基因型，因此，在出生后确定至少一个包含该目标器官的后代的基因型并在后续步骤中仅使用具有所希望的Sall1(-/-)基因型的个体是实际的。
这一敲除小鼠可能具有在制备阶段即被敲除的Sall1基因，且具有在表达阶段被敲入该Sall1基因区域的用于检测的荧光蛋白或绿色荧光蛋白(GFP)的基因(Takasato,M.et al,Mechanisms of Development,Vol.121,p.547-557,2004)。当通过敲入这一荧光蛋白而激活这一基因的调节区域时，出现替代Sall1的GFP表达，且该Sall1基因的缺陷状态可通过荧光检测得以确定。
再者，本公开中接纳者胚胎与待移植的细胞之间的关系可以是同种异体的关系或异种异体的关系。迄今为止，该领域中已有大量关于制备这一异种异体关系的嵌合体动物的报导。例如，实际上已经报导了密切相关的动物物种之间的囊胚嵌合体动物，如制备大鼠和小鼠的嵌合体(Mulnard,J.G,C.R.Acad.Sci.Paris.276,379-381(1973)；Stern,M.S.,Nature.243,472-473(1973)；Tachi,S.&Tachi,C.Dev.Biol.80,18-27(1980)；Zeilmarker,G,Nature,242,115-116(1973))，以及制备绵羊和山羊的嵌合体(Fehilly,C.B.,et al,Nature,307,634-636(1984))。因此，本公开中，例如，在小鼠活体内制备源自除人类以外的哺乳动物细胞的肾脏的情形中，可基于这些传统已知的嵌合体创建方法(例如，将待移植的细胞插入接纳者囊胚中的方法(Fehilly,C.B.,et al,Nature,307,634-636(1984))，在接纳者胚胎中制备某些异种异体器官。
本文中使用的术语“非人类第一哺乳动物”指的是一种副本哺乳动物，使用SCNT细胞从该哺乳动物生产嵌合体动物、嵌合体胚胎、嵌合体囊胚等。
本文中使用的术语“第二哺乳动物”指的是任何作为不同于该非人类第一哺乳动物的个体的哺乳动物，且可以是同种异体的个体或异种异体的个体。
本文中使用的术语“非人类第三哺乳动物”指的是一种哺乳动物，其中，通过将源自作为不同于非人类第一哺乳动物的个体的第二哺乳动物的细胞移植入该囊胚内而形成的嵌合体胚胎在该非人类第三哺乳动物(用作代孕母体)的子宫内发育。
注意，尽管术语“非人类第一哺乳动物”与“非人类第三哺乳动物”有时称为“非人类宿主哺乳动物”或“宿主”，但该“非人类第一哺乳动物”和该“非人类第三哺乳动物”可以是彼此不同的动物。在本公开的语境中，应理解为所指示的动物对于该领域技术人员是显而易见的。
当待生产器官是胰腺时，具有与发育期中胰腺发育缺失相关的畸形的Pdx1敲除动物的胚胎(Offield,M.F.,et al,Development,Vol.122,p.983-995,1996)或本文中揭示的始祖动物的胚胎可用作该接纳者非人类胚胎。
当待生产器官是毛发时，无毛的裸小鼠的胚胎可用作该接纳者非人类胚胎。
当待生产器官是胸腺时，裸小鼠的胚胎可用作该接纳者非人类胚胎。
(待移植的细胞)
之后，将揭示待移植入例如肾脏内的细胞。为了生产源自哺乳动物细胞的肾脏，制备SCNT细胞。关于Sall1基因，该细胞具有野生型基因型(Salll(+/+))，且具备发育为肾脏中全部种类细胞的能力。
一种具体例中，在移植之前，这一细胞可进一步并入用于在表达状态下进行特异性检测的荧光蛋白。例如，作为用于该检测的荧光蛋白，可设计作为DsRed基因突变体的DsRed.T4序列(Bevis B.J.and Glick B.S.,Nature Biotechnology Vol.20,p.83-87,2002)，从而令其在CAG启动子(巨细胞病毒增强剂和鸡肌动蛋白基因启动子)的控制下在几乎全身器官中被表达，且随后通过电穿孔被并入SCNT细胞内。可使用该领域中已知的荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)。通过在用于移植的这一细胞上实施荧光标记，可容易地检测所生产的器官是否仅由所移植的细胞构成。
将该SCNT细胞移植入具有前述Sall1(-/-)基因型的囊胚的内部空间中，以制备具有嵌合体内部细胞团块的囊胚。令这一具有嵌合体内部细胞团块的囊胚在代孕母体的子宫内发育，以获得至少一个包含该目标器官的后代。在使用不表达标记物如GFP的SCNT细胞的情形中，该细胞无法与在嵌合体生产中使用的宿主胚胎区分，且无法辨别是否实现了该器官的补足。因此，为了解决该问题，可将荧光染料引入这一细胞系中，从而能够以与实施例等中揭示者相同的策略进行实验。
(生产用于繁殖的始祖动物的方法)
本公开中使用的用于繁殖的始祖动物具有下述特征：该动物包括编码一因子的基因，如果该因子起作用，则该基因造成器官和身体部位中一者或多者的缺陷且给出无存活可能和难以存活中的一种或多种，其中，器官和身体部位的一者或多者通过囊胚补足而得以补充。通过使用这一动物(本文中亦称为“始祖动物”)，可能造成目标器官有缺陷，并且生产具有所希望的关于该缺陷器官的基因组类型。此外，已经表明使用这一生产方法同样能在下一代体内生产器官，还表明该方法可与SCNT细胞合用。
本文中使用的术语“器官和身体部位中的一者或多者，如果该因子起作用，则给出无存活可能或难以存活中的一种或多种”，是指某些因子，当该因子造成器官和身体部位的一者或多者缺陷或失能(例如，不正常)时，该因子给出无存活可能性和难以存活中的一者或多者。例如，在外源基因的情形中，当将该基因引入动物体内并正常表达时，在某些器官或身体部位内出现缺陷，导致该动物不能存活或难以存活。难以存活包括不能繁殖下一代，和在人类的情形中难以进行社交生活。该器官或身体部位可以是，例如，胰腺、肝脏、毛发、胸腺等，但不限于这些。
牵涉入此类事件的基因的实例包括Pdx-1(关于胰腺)、Sall1(关于肾脏)等。
顺便提及，待用于器官再生的基因应选择为，器官可使用其得以补足并导致幼崽出生后不会由于其它因素(例如，不能从母鼠吸奶)死亡的基因。该基因的一个实例是Sall。通过使用具有此类性质的基因，可实践本申请的公开内容。此外，即使使用相同的表型例如胰腺缺陷，显着性变化极大。具体而言，敲除课题具有改善生产能力的特征，而转基因个体则除了具有改善生产能力的特征之外，还具有能进行致死表型的克隆分析的特征。
本文中使用的术语“如果该因子起作用，则给出无存活可能和难以存活中的一种或多种”指的是，关于某些因子，条件是如果该因子起作用，则作为宿主的动物完全不能存活并造成死亡；或可以存活，但由于各种原因，基本上不可能存活太久，如难以生长和繁殖。可通过使用该领域中一般知识理解该术语。
本文中使用的术语“器官”具有该领域中的通常意义，且是指通常构成动物内脏的器官。
本文中使用的术语“身体部位”指的是身体的任何部位，且还包括通常不称之为器官的部位。例如，当以肾脏为例时，若基因正常，则创建完整的肾脏。但若一些基因存在缺陷或不正常，尽管可能创建一个类似肾脏的器官，但该器官的一部分可能具有畸形或缺陷。具有此类畸形或缺陷的部位可称为这一“身体部位”的实例。基因缺陷或畸形不一定与各器官对应，但其一部分受影响的情况时有出现。据此，当考虑到与基因的对应关系时，认为其与身体部位对应可能是更好的选择。因此，本文中也考虑到这一对应关系。
本文中使用的术语“囊胚补足”指的是，通过使用下述现象补足缺陷器官或身体部位的技术，该现象中，通过将例如SCNT细胞注射入囊胚的内部空间中所得的个体形成嵌合体胚胎(以及，在产前和产后发育后形成嵌合体成年个体)。可在动物尤其是非人类动物活体内生产具有由多种细胞形成的复杂细胞组成的哺乳动物器官，如肾脏、胰腺、毛发、和胸腺。
本文中使用的术语“标记”可以是任何因子，只要其用于区分被补足的器官即可。例如，通过创建仅在待补足的器官内表达的特异性基因(例如，用于表达荧光蛋白的基因)，待补足的器官可通过源自该特异性基因的性质(例如，荧光性)而与补足宿主区分开来。如上文所述，可区分动物是否通过以源自异种异体细胞的细胞补足而变得完整，或区分动物是否通过以源自内源细胞的细胞补足而变得完整。因此，选择本公开中使用的始祖动物可能更容易达成这一目的。在移植之前，这些细胞可合并有用于特异性检测的可表达状态的荧光蛋白。例如，作为用于该检测的荧光蛋白，可设计作为DsRed基因突变体的DsRed.T4序列(Bevis B.J.and Glick B.S.,Nature Biotechnology Vol.20,p.83-87,2002)，从而令其可在CAG启动子(巨细胞病毒增强剂和鸡肌动蛋白基因启动子)的控制下在几乎整个身体的器官中被表达，并随后通过电穿孔被并入SCNT细胞中。通过在这一用于移植的细胞上实施荧光标记，可容易地检测所生产的器官是否仅有所移植的细胞构成。
该标记的实例包括：绿色荧光蛋白(GFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、其它荧光蛋白、LacZ等。
一种具体例中，本公开中使用的生产始祖动物的方法可包含：A)提供具有一基因的第一受精卵；B)令该第一受精卵生长为囊胚；C)将SCNT细胞引入该囊胚内以生产嵌合体胚胎，该SCNT细胞具有补足由该基因造成的缺陷的能力；以及D)从该嵌合体囊胚生产个体，随后选择其体内一个或多个器官及其部位已经被该SCNT细胞补足的个体。
本文中使用的关于某些基因的术语“编码一因子的(缺陷负责)基因，若该因子起作用，则造成器官和身体部位的一者或多者的缺陷并给出无存活可能和难以存活中的一种或多种”和“缺陷负责基因”可互换使用且指的是，当该因子起作用时，给出无存活可能性和难以存活中的一种或多种(例如，在外源基因的情形中，当该基因被引入并表达时；在内在基因的情形中，当该基因被表达至该基因起作用的条件；或其它情形)以造成器官和身体部位中的一者或多者缺陷或失能(例如，不正常)的基因。
本文中，SCNT细胞可以成为“多能细胞”。
本文中使用的关于因子、基因等的术语“具有补足缺陷的能力”指的是，能补足器官或身体部位的能力。
本文中使用的术语“嵌合体囊胚”或“嵌合体胚胎”指的是包含SCNT细胞的处于嵌合体状态的囊胚或胚胎。该嵌合体囊胚或胚胎除了通过注射方法生产以外，还可使用例如所谓“凝集方法”生产，在该“凝集方法”中，令胚胎+胚胎、或胚胎+细胞在有盖培养皿中彼此紧密粘附，以生产嵌合体囊胚。再者，本公开中的接纳者囊胚或胚胎与待移植的细胞之间的关系可以是同种异体关系或异种异体关系。
在根据本文具体例生产始祖动物的方法中，该生长囊胚的步骤可通过任何公众已知的用于将卵子或受精卵生长为囊胚的方法进行。这一步骤的条件是该领域中周知的，且揭示于2002年出版的《小鼠胚胎操作：实验室手册(第三版)》(Manipulating the MouseEmbryo,A LABORATORY MANUAL 3rd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.))中(通过引用并入本文)。
在根据本文具体例生产始祖动物的方法中，将具有补足由该基因造成的缺陷的能力的体细胞核移植细胞(SCNT细胞)引入该囊胚内以生产嵌合体囊胚的步骤，可采取该领域中任何公众已知的方法进行，只要可将该体细胞核移植细胞(SCNT细胞)引入该囊胚中即可。此类方法的实例包括注射方法和凝集方法，但该方法并不限于这些。
在根据本文具体例生产始祖动物的方法中，从该嵌合体囊胚生产个体的方法可采取该领域中公众已知的任何技术。通常，可将该嵌合体囊胚返还至代孕母体的体内，随后可造成该代孕母体的假孕以令所得个体在该代孕母体的子宫内生长。但是，该方法并不限于这一技术。
在根据本文具体例生产始祖动物的方法中，选择其体内器官和其身体部位的一者或多者被补足的个体，可通过能够证实该器官或身体部位被补足的任何技术进行。
其实例为鉴别源自该细胞核移植细胞(SCNT细胞)的标识符。本文中使用的术语“标识符”指的是，允许指定某些个体、物种等并鉴别其起源的任何因子，也简称为“ID”。此类标识符可以是，例如，该体细胞核移植细胞(SCNT细胞)所特有的基因组序列、表型等。或者，关于使用被标记或可以被标记(包括通过基因表达标记)的SCNT细胞进行的这一选择，在生产始祖动物的方法中的选择可通过鉴别该标记物而进行。此外，应理解，该领域中，可通过按照需要修正这一技术而进行该选择。
(使用始祖动物进行器官再生的方法)
另一方面，本公开提供使用始祖动物并使用体细胞核移植细胞(SCNT细胞)生产目标器官和目标身体部位的一者或多者的方法。该方法包含：提供始祖动物，在该动物体内，编码一因子的缺陷负责基因造成目标器官和目标身体部位的一者或多者的缺陷；令从该动物获得的卵子生长为囊胚；将体细胞核移植细胞(SCNT细胞)引入该囊胚内，以获得嵌合体胚胎；以及，从该嵌合体胚泡生产个体，随后从该个体获得目标器官和身体部位中的一者或多者。该SCNT细胞可具有所希望的能补足由该基因造成的缺陷的基因组。
该嵌合体囊胚的发育可在非人类第三哺乳动物的子宫内进行，以获得至少一个包含该目标器官的后代，并从该至少一个后代获得该目标器官。
(胰腺的形成)
可通过使用例如目测、在染色后用显微镜观察、以及使用荧光进行观察的方法实施宏观或微观形貌分析、基因表达分析等，研究胰腺的形成。
例如，通过实施目测，可研究该器官的实际存在或不存在以及该器官的特征如外观。在进行这一宏观形貌分析的同时，可使用显微镜对在通常的组织染色如苏木精-曙红染色后获得的组织进行显微观察。通过这一显微观察，即便对于胰腺内各种混成细胞组合物的研究亦可以被实施。
此外，亦可根据条件实施以此途径发射荧光而使用荧光进行的基因表达分析。例如，通过敲入Pdx1-Lac-Z而获得的敲除小鼠可具有下述特征。当将荧光标记的ES细胞用于野生型(+/+)个体或杂合(+/-)个体时，即使观察到该ES细胞的荧光，但仍有嵌合体状态的杂色荧光显现。另一方面，在纯合(-/-)个体中，因为该胰腺由完全源自该ES细胞的细胞构建，显示均匀的荧光。使用这些特征，可便利地检查构建该目标器官的目标器官或细胞具有哪一种基因型的Pdx1基因。如果使用未标记的SCNT细胞，则当用于生产嵌合体时，该细胞无法与宿主胚胎区分开来，并且不能辨别是否实现了该器官的补足。因此，可将荧光染料引入该SCNT细胞系内，从而能使用与上述相同的策略进行实验。通过使用上述的细胞，可使用与使用该SCNT细胞的情形相同的策略生产器官并明确其起源。
(肾脏的形成)
可通过使用例如目测、在染色后用显微镜观察、以及使用荧光进行观察的方法实施宏观或微观形貌分析、基因表达分析等，研究肾脏的形成。
例如，通过实施目测，可研究该器官的实际存在或不存在以及该器官的特征如外观。在进行这一宏观形貌分析的同时，可使用显微镜对在通常的组织染色如苏木精-曙红染色后获得的组织进行显微观察。通过这一显微观察，即便对于肾脏内各种混成细胞组合物的研究亦可以被实施。
此外，亦可根据条件实施以此途径发射荧光而使用荧光进行的基因表达分析。例如，上述Sall1基因敲除小鼠可具有下述特征。当Sall1基因的缺陷处于杂合状态(Sall1(+/-))时，荧光仅出现于一个等位基因中，与之相比，当该Sall1基因的缺陷处于纯合状态(Sall1(-/-))时的荧光强度较低，而此时的GFP荧光来自两个等位基因处。使用这些特征，可便利地检查构建该目标器官的目标器官或细胞具有哪一种基因型的Sall1基因。如果使用未标记的SCNT细胞，则当用于生产嵌合体时，该细胞无法与宿主胚胎区分开来，并且不能辨别是否实现了该器官的补足。因此，可将荧光染料引入该SCNT细胞系内，从而能明确其起源。
(毛发的形成)
可通过使用例如目测以及使用荧光进行观察的方法实施宏观或微观形貌分析、基因表达分析等，研究毛发的形成。
例如，通过实施目测，可研究毛发的实际存在或不存在以及该器官的特征如外观。在进行这一宏观形貌分析的同时，可使用显微镜对在通常的组织染色如苏木精-曙红染色后获得的组织进行显微观察。通过这一显微观察，即便对于毛发内各种混成细胞组合物的研究亦可以被实施。
此外，亦可根据条件实施以此途径发射荧光而使用荧光进行的基因表达分析。例如，在上述裸小鼠的情形中，因为毛发的自身荧光强烈，使用肉眼在荧光显微镜下观察难以确定所生产的毛发是否源自该裸小鼠或源自该SCNT细胞。但是，亦可通过用于适宜地观察该荧光的手段实施该观察。使用这些特征，可便利地检查构建该目标器官的目标器官或细胞具有哪一种基因型。如果使用未标记的SCNT细胞，则当用于生产嵌合体时，该细胞无法与宿主胚胎区分开来，并且不能辨别是否实现了该器官的补足。因此，可将荧光染料引入该SCNT细胞系内，从而能使用与上述相同的策略进行实验。通过使用上述的细胞，可使用与使用该SCNT细胞的情形相同的策略生产器官并明确其起源。
(胸腺的形成)
可通过使用例如目测、显微照片、FACS、以及使用荧光进行观察的方法实施宏观或微观形貌分析、基因表达分析等，研究胸腺的形成。
例如，通过实施目测，可研究该器官的实际存在或不存在以及该器官的特征如外观。在进行这一宏观形貌分析的同时，可使用显微镜对在通常的组织染色如苏木精-曙红染色后获得的组织进行显微观察。通过这一显微观察，即便对于胸腺内各种混成细胞组合物的研究亦可以被实施。
此外，亦可根据条件实施以此途径发射荧光而使用荧光进行的基因表达分析。例如，上述裸小鼠具有下述特征。该裸小鼠传统上没有胸腺，但这并不影响其存活。据此，无胸腺的裸小鼠自然地出生并存活。如果通过囊胚补足将荧光标记的SCNT细胞注射入该裸小鼠体内，则在大量已经证实其体内有SCNT细胞的个体具有显示荧光的胸腺。使用这些特征，可便利地检查构建该目标器官的目标器官或细胞具有哪一种基因型。
根据本文中具体例获得的目标器官的特征可能在于，其完全源自该第二哺乳动物。
本公开还提供通过根据本文中具体例的方法生产的哺乳动物。此外，本公开还提供具有与发育期中目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物在该目标器官的生产中的用途。
(当使用各种动物时需记住的要点)
在使用除小鼠以外的动物的情形中，注意下述各点，即可实施对本文实施例中所揭示技术的应用。例如，关于在其它物种特别是除小鼠以外的物种的动物体内生产嵌合体，对于其内部注射有作为胚胎的一部分或ES细胞的起源的胚胎或内部细胞团块的嵌合体的报导，多于对构建具有形成嵌合体的能力的多能干细胞的报导(大鼠：(Mayer,J.R.Jr.&Fretz,H.I.The culture of preimplantation rat embryos and the production ofallophenic rats.J.Reprod.Fertil.39,1-10(1974))；牛：(Brem,G.et al.Production ofcattle chimerae through embryo microsurgery.Theriogenology.23,182(1985))：猪：(Kashiwazaki N et al,Production of chimeric pigs by the blastocyst injectionmethod,Vet.Rec.130,186-187(1992))。但是，即使当使用其内部注射有内部细胞团块的嵌合体时，仍可应用本文中揭示的方法。通过使用上文所述的内部细胞团块，基本上可补足缺陷动物的缺陷器官。换言之，例如，培养上述各细胞以令其在体外生长为囊胚，从如是获得的囊胚中物理分离一部分内部细胞团块，随后，可将该部分注射入囊胚内。通过凝集8细胞阶段的囊胚或中途桑椹胚，可生产嵌合体胚胎。
(一般技术)
本文中使用的分子生物学、生物化学和微生物学技术是该领域中周知的和常用的技术，揭示于，例如：《分子克隆：实验室手册》(Sambrook J.et al.(1989).MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring.Harbor,及其第3版(2001))；《当代分子生物学技术》(Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience)；《分子生物学中的简单方法：当代分子生物学技术纲要》(Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience)；《PCR技术：方法和应用指南》(Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press)；《分子生物学中的简单方法：当代分子生物学方法纲要》(Ausubel,F.M.(1992).ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Pub.Associates)；《分子生物学中的简单方法：当代分子生物学方法纲要》(Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates)；《分子生物学中的简单方法：当代分子生物学方法纲要》(Innis,M.A.etal.(1995).PCR Strategies,Academic Press)；《分子生物学中的简单方法：当代分子生物学方法纲要》(Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,及年度更新)；《PCR应用：功能基因组学方法》(Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press)；《基因转移和表达分析》(Experimental technique for gene transfer&expression analysis,Yodosha,1997)的实验室医学分卷等等中。这些文献的与本说明书相关的部分通过引用并入本文。
用于生产人工合成基因的DNA合成技术和核酸化学记录于，例如：《寡核苷酸合成：实用方法》(Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress)；《寡核苷酸合成：实用方法》(Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,IRL Press)；《寡核苷酸及类似物》(Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press)；《核酸生物化学》(Adams,R.L.et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman&Hall)；《现代核酸有机化学》(Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistryof Nucleic Acids,Weinheim)；《化学和生物学中的核酸》(Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press)；《生物共轭体技术》(Hermanson,G.T.(1996).Bioconjugate Techniques,Academic Press)等等中。这些文献的与本说明书相关的部分通过引用并入本文。
本文中引用的参考文献，如科学文献、专利和专利申请，通过引用而以其各自具体揭示的程度整体并入本文。
为了易于理解本公开，已经揭示了优选的具体例。本文中，本公开基于实施例而得以揭示，但上述说明和实施例仅提供用于例示性目的，而非提供用于限制本公开的目的。因此，本公开的范畴并非限制于本文中具体揭示的实施例，而仅由权利要求书予以限制。
上文揭示的特定具体例仅用于示例，而在本文中教导之下，以不同但等效的方式修饰和实践本公开对于该领域技术人员是显而易见的。例如，上文详述的过程步骤可以不同的顺序实施。此外，在权利要求书所揭示者之外，对于本文中显示的架构或设计的细节没有限制。因此，上文揭示的特定具体例明显可变更或修饰，且所有这些变更均视为在本公开的范畴和精神范围内。据此，本文所寻求的保护如权利要求书中所详述。

Claims (21)

1.一种用于在具有与发育期中目标器官发育缺失相关的畸形的非人类第一哺乳动物活体内生产该目标器官的方法，所生产的目标器官源自第二哺乳动物，该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体，该方法包含：a)制备源自该第二哺乳动物的体细胞核移植细胞(SCNT细胞)；b)将该SCNT细胞移植入该非人类第一哺乳动物的囊胚中，以获得嵌合体胚胎；c)令该嵌合体胚胎在非人类第三哺乳动物的子宫内发育，以得到至少一个包含该目标器官的后代；以及d)从该至少一个后代获得该目标器官。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该第二哺乳动物是人类、大鼠、或小鼠。
3.如权利要求1所述的方法，其中，该第二哺乳动物是人类。
4.如权利要求1所述的方法，其中，该待生产的器官选自胰腺、肾脏、胸腺、和毛发。
5.如权利要求1所述的方法，其中，该非人类第一哺乳动物是小鼠、大鼠、猴、或猪。
6.如权利要求5所述的方法，其中，该非人类第一哺乳动物是小鼠，且该小鼠是Sall1敲除小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠、Pdx1敲除小鼠、和裸小鼠的一种或多种。
7.如权利要求1所述的方法，其中，该目标器官完全源自该第二哺乳动物。
8.如权利要求1所述的方法，其中，该第二哺乳动物和该非人类第一哺乳动物是异种异体的关系。
9.一种非人类第一哺乳动物，其具有与发育期中目标器官的发育缺失相关的畸形，该哺乳动物通过包含下述步骤的方法生产：a)制备源自第二哺乳动物的SCNT细胞，该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体；b)将该SCNT细胞移植入该非人类第一哺乳动物的囊胚中，以获得嵌合体胚胎；以及c)令该嵌合体胚胎在非人类第三哺乳动物的子宫中发育，以得到至少一个包含该目标器官的后代。
10.一种用于生产目标器官的试剂盒，该试剂盒包含：A)一种非人类第一哺乳动物，其具有与发育期中目标器官的发育缺失相关的畸形；以及B)源自第二哺乳动物的SCNT细胞，该第二哺乳动物是不同于该非人类第一哺乳动物的个体。
11.一种用于生产目标器官和目标身体部位的一者或多者的方法，该方法包含：
提供非人类动物，其包括编码因子的缺陷责任基因，若该因子起作用，该基因造成器官和身体部位缺陷中的一者或多者，且给出无存活可能性和存活困难中的一种或多种，其中该器官和身体部位中的一者或多者通过囊胚补足而得以补足，该编码因子的缺陷责任基因造成器官和身体部位缺陷中的一者或多者；
令从该非人类哺乳动物获得的卵子生长为囊胚；
将目标体细胞核移植细胞(SCNT细胞)引入该囊胚中，以生产嵌合体囊胚，该目标SCNT细胞具有所希望的能补足由该缺陷责任基因所造成缺陷的基因组；
从该嵌合体囊胚生产个体；以及
从该个体获得目标器官和目标身体部位中的一者或多者。
12.如权利要求11所述的方法，其中，生产该个体进一步包含，令该嵌合体囊胚在非人类第三哺乳动物的子宫内发育，以获得至少一个包含该目标器官的后代，并从该至少一个后代获得该目标器官。
13.如权利要求11所述的方法，其中，该目标SCNT细胞源自人类。
14.如权利要求11所述的方法，其中，该目标器官和目标身体部位中的一者或多者选自胰腺、肾脏、胸腺、和毛发。
15.如权利要求11所述的方法，其中，该非人类哺乳动物是小鼠、大鼠、猴、或猪。
16.如权利要求15所述的方法，其中，该非人类第一哺乳动物是小鼠，且该小鼠是Sall1敲除小鼠、Pdx1敲除小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠、和裸小鼠的一种或多种。
17.如权利要求11所述的方法，其中，该目标器官和目标身体部位中的一者或多者完全源自该目标SCNT细胞。
18.如权利要求11所述的方法，进一步包含制备该SCNT细胞，其中，该SCNT细胞源自第二哺乳动物。
19.如权利要求18所述的方法，其中，该第二哺乳动物与该非人类动物是异种异体的关系。
20.一种用于生产目标器官和目标身体部位中的一者或多者的试剂盒，该试剂盒包含：A)非人类动物，其包括编码一因子的缺陷责任基因，若该因子起作用，则该基因造成器官和身体部位缺陷中的一者或多者，并给出无存活可能性和存活困难中的一种或多种，且该器官和身体部位中的一者或多者的缺陷通过补充得以补足；以及B)源自第二哺乳动物的SCNT细胞，该第二哺乳动物是不同于该非人类动物的个体。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中，该非人类动物与该第二哺乳动物是异种异体的关系。
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