JP2022091993A - iPS細胞とBLASTOCYST COMPLEMENTATIONを利用した臓器再生法 - Google Patents
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Abstract
Description
iPS細胞)でも、膵臓が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることも確認された。したがって、このようなファウンダーを用いて、誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)を用いても臓器再生を行うことができることが明らかになった。
a)該異個体哺乳動物由来の誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)を調製する工程;
b)該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該細胞を移植する工程;
c)該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程;および
d)該産仔個体から、該目的臓器を取得する工程
を含む、目的臓器を製造する方法を提供する。
る非ヒト哺乳動物であって、
a)該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のiPS細胞を調製する工程;
b)該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該iPS細胞を移植する工程;および
c)該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程
を含む方法によって生産された哺乳動物を提供する。
A)発生段階において該目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物と、
B)該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のiPS細胞または初期化因子および必要に応じて体細胞とを備える、セットを提供する。
A)機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完により補完される、動物を提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程;
B)該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程;
C)該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的iPS細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程;および
D)該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程
を包含する方法を提供する。
A)機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完(complement)により補完される、非ヒト動物と、
B)該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のiPS細胞または初期化因子と必要に応じて体細胞との組み合わせとを備える、セットを提供する。
nd Development,Vol.10,p.60-69,1996)の胚等を、それぞれ使用することができる。また、腎臓,肺など複数臓器の欠損を引き起こす、線維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター(FGFR)の細胞内ドメインの欠損型を過剰発現させるドミナントネガティブ型のトランスジェニック変異体動物モデル(Celli,G.,et al.,EMBO J.,Vol.17 pp.1642-655,1998)の胚を使用することもできる。あるいは、ヌードマウスを用いて、毛または胸腺の生産に使用することができる。
マウスなどの動物の生体内にてヒト以外の哺乳動物細胞由来の腎臓を製造するために、発生段階において腎臓の発生が生じない異常を有するマウスなどの動物を用意する。本発明の1つの実施形態においては、発生段階において腎臓の発生が生じない異常を有するマウスとして、Sall1ノックアウトマウス(Nishinakamura,R.et al.,Development,Vol.128,p.3105-3115,2001)を使用することができる。この動物は、Sall1(-/-)のホモ接合体ノックアウト遺伝子型の場合に、腎臓のみの発生が行われず、産仔個体に腎臓が存在しないという特徴を有する。あるいは本明細書において説明するファウンダー動物も使用することができる。
,Mechanisms of Development,Vol.121,p.547-557,2004)。このような蛍光タンパク質をノックインすることにより、この遺伝子の調節領域が活性化されると、Sall1の代わりにGFPの発現が生じ、Sall1遺伝子の欠損状態を蛍光検出により決定することができる。
次に、腎臓を例に移植される細胞を説明すると、哺乳動物細胞由来の腎臓を製造するた
めの、移植される細胞としてiPS細胞(非特許文献2などを参照)などを用意する。この細胞は、Sall1遺伝子に関して野生型の遺伝子型(Sall1(+/+))を有し、腎臓の全ての細胞に発生する能力を有している。
本発明において用いられる繁殖用のファウンダー動物は以下のような特徴を有する:機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完により補完される。この動物(本明細書において「ファウンダー動物」ともいう。)を用いて、次世代動物を生産することによって、目的の臓器を欠損させて、その臓器について、所望のゲノム型を有する臓器を生産することができる。しかも、この方法で生産すると、次世代においても臓器生産をすることができることが判明しており、iPS細胞でも使用可能であることがわかったことから、本発明の産業用の応用への道が大きく開けることになった。
ミルクが摂取できない等)により出生後死んだりするようなことのない遺伝子を選択すべ
きである。そのような遺伝子としては、Pdx-1を挙げることができる。このような性
質を有する遺伝子を用いて、本願発明を実施することができる。そして、たとえば、表現型が膵臓の欠損と同様であっても意味合いは大きく異なり、具体的にはノックアウトでは生産効率の向上、トランスジェニックではそれに加えて、致死表現型のクローナルな解析を可能にするという特徴がある。
A)前記遺伝子を有する第一多能性細胞を提供する工程;B)該第一多能性細胞を胚盤胞に成長させる工程;C)該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程;D)該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性細胞により、前記臓器またはその一部が補完されたものを選択する工程。
せキメラ胚盤胞を作製する方法などを利用することによって生産することができる。また、本発明においてはレシピエントとなる胚と移植される細胞との関係は、同種の関係であっても異種の関係であってもよい。このような異種間でのキメラ動物作成は、従来より当該技術分野において多数の報告がなされており、例えばラット-マウス間のキメラ作出(Mulnard,J.G.,C.R.Acad.Sci.Paris.276,379-381(1973);Stern,M.S.,Nature.243,472-473(1973);Tachi,S.&Tachi,C.Dev.Biol.80,18-27(1980);Zeilmarker,G.,Nature,242,115-116(1973))、ヒツジ-ヤギ間のキメラ作出(Fehilly,C.B.,et al.,Nature,307,634-636(1984))など、近縁の動物種間での胚胞キメラ動物が実際に報告されている。したがって、本発明において、例えばヒト以外の哺乳動物細胞由来の腎臓をマウスの生体内で作成する場合には、これらの従来から知られているキメラ作出方法(例えば、移植する細胞を、レシピエントとなる胚盤胞中に挿入する
方法(Fehilly,C.B.,et al.,Nature,307,634-636(1984)))に基づいて、異種のある臓器をレシピエントとなる胚中で作成することができる。
別の局面において、本発明は、ファウンダー動物を用いて、誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)を利用して目的の臓器または身体部分を生産する方法を提供する。この方法は、ファウンダー動物を提供する工程であって、ファウンダー動物における欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程;B)該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程;C)該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性細胞である誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程;およびD)該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程を包含する。
膵臓の形成については、肉眼的所見、染色後の顕微鏡観察、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
腎臓の形成については、肉眼的所見、染色後の顕微鏡観察、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
毛の形成については、肉眼的所見、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
胸腺の形成については、肉眼的所見、顕微鏡写真、FACSあるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
たiPS細胞を注入するとiPS細胞の寄与が認められる個体の多くが蛍光を呈する胸腺を持つという特徴を有する。このような特質を利用して、目的とする臓器または臓器を構成する細胞が、どのような遺伝子型であるかを簡便に調べることができる。
iPS細胞は他の方法によっても作製することができる。すなわち、iPS細胞は、体細胞に初期化因子(単数または複数の因子の組み合わせでありうる)を接触させることによって初期化を誘導させて生産することができる。そのような初期化および初期化因子の例としては以下のようなものを挙げることができる。たとえば、本発明の実施例では、iPS細胞は3因子(Klf4、Sox2、Oct3/4;これらは本発明において使用される代表的な「初期化因子」である。)でGFPトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って本発明者らが独自に作製したが、このほかの組み合わせ、たとえば、Yamanaka因子とも呼ばれるOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycの4因子を用いることもでき、その改良法を用いることもできる。c-Mycの代わりにn-Mycを用い、レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いてもiPS細胞の樹立は可能である(Blelloch R et al.,(2007).Cell Stem Cell 1:245-247)。また、Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28の4遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトiPS細胞の樹立に成功している(Yu J,et al.,(2007).Science 318:1917-1920)。
al.,(2007).Cell 131: 861-872.)。Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの4遺伝子にhTERT・SV40 large Tを加えた6遺伝子を用いてヒトiPS細胞の樹立することもできる(Park IH,et al.,(2007).Nature 451:141-146.)。また、c-Mycの遺伝子導入をせずにOct-4、Sox2およびKlf4の3因子だけでも、低効率ながらマウスおよびヒトにおいてiPS細胞の樹立が可能であることが示されており、iPS細胞が癌細胞に変化するのを抑えるのに成功していることから、本発明においてこれを利用することもできる(Nakagawa M,et al.,(2008).Nat Biotechnol 26:101-106.;Wering M,et al.,(2008).Cell Stem Cell 2:10-12)。
れまで作製することができなかったのは、遺伝子欠損により示される欠損臓器が生存に必須であり、それらを救済する方法が存在しなかったことが原因であると考えられる。
マウス以外の動物を使用する場合は、以下の点に留意することで、本明細書の実施例に記載した手法を応用して実施することができる。たとえば、他種の動物におけるキメラ作製に関して、マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりは、胚もしくは胚の中でもES細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告(ラット:(Mayer,J.R.Jr.&Fretz,H.I.The culture of preimplantation rat embryos and the production of allophenic rats.J.Reprod.Fertil.39,1-10(1974));ウシ:(Brem,G.et al.Production of cattle chimerae through embryo microsurgery.Theriogenology.23,182(1985));ブタ:(Kashiwazaki N et al.,Production of chimeric pigs by the blastocyst injection method,Vet.Rec.130,186-187(1992)))が多いが、内部細胞塊を注入したキメラを用いても、本明細書に記載した方法を応用することができる。これらのように内部細胞塊を用いることで欠損動物の失われた臓器を補うことは事実上可能である。すなわち、たとえば、上記細胞をいずれも胚盤胞までin vitroで培養し、得られた胚盤胞から内部細胞塊を物理的に一部剥離し、それを胚盤胞へインジェクションすることができる。途中の8細胞期あるいは桑実胚同士を凝集させキメラ胚を作製することができる。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et
al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1
995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional
Genomics,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman&Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques,Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本発明者らは、誘導型多能性幹(iPS)細胞は3因子(Klf4、Sox2、Oct3/4)でGFPトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って生産した。そのプロトコールは以下のとおりである。そのスキームは図1および詳細には図2aに示した。
GFPトランスジェニックマウスより尻尾を約1cm採取し、皮を剥ぎ2~3片に刻んだ。それをMF-start medium(TOYOBO,日本)中に置き、5日間培養した。そこで出現してきた繊維芽細胞を新たな培養皿に撒きなおし数継代し、これを尻尾由来繊維芽細胞(TTF)とした。
目的遺伝子およびウイルスエンベロープタンパク質を導入し作製したウイルス産生細胞株(293gpもしくは293GPG細胞株)より上清を回収し、遠心濃縮後凍結保存しておいたウイルス液を前日に1×105細胞/6ウェルプレートになるよう継代したTTF細胞の培養液中に加え、これを3因子(初期化因子)の導入とした。
3因子(初期化因子)導入後、翌日ES培養用の培養液に置換し25~30日間培養した。この際、毎日培養液の置換を行った。
培養後出現してきたiPS細胞様コロニーをイエローチップ(たとえば、Watsonから入手可能)にてピックアップし、0.25%トリプシン/EDTA(Invitrogen社)で単一細胞にまでバラバラにし、新たに用意したマウス胎児繊維芽細胞(MEF)上に撒いた。
上記方法により樹立されたiPS細胞株は図2b-fに示したようなiPS細胞としての特徴すなわち未分化性と全能性とを有していることが証明された。
Oct3/4
Fw(mOct3/4-S1120): CCC TGG GGA TGC TGT GAG CCA AGG(配列番号1)
Rv(pMX/L3205): CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA(配列番号2)
Klf4
Fw(Klf4-S1236): GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC(配列番号3)
Rv(pMXs-AS3200): TTA TCG TCG ACC ACT GTG
CTG CTG(配列番号4)
Sox2
Fw(Sox2-S768): GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG(配列番号5)
Rv(pMX-AS3200): 上記と同じ(配列番号4)
c-Myc
FW(c-Myc-S1093): CAG AGG AGG AAC GAG CTG
AAG CGC(配列番号6)
Rv(pMX-AS3200): 上記と同じ(配列番号4)
その結果図2dに示されるように、3因子の挿入が確認された。
K & Yamanaka Sの報告(Cell 2006 Aug 25;126(4):652-5.)等に基づきプライマーを合成したものを用いた。
本実施例では、ファウンダー動物としてマウスを選び、欠損させるべき臓器として膵臓を選択した。さらに、膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスを作製するためにPdx1遺伝子を用いた。
膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Pdx1wt/LacZおよびPdx1LacZ/LacZ(ファウンダー)を使用した。Pdx1遺伝子ローカスにLacZ遺伝子をノックイン(ノックアウトでもある)したマウス(Pdx1-LacZノックインマウス)由来胚盤胞を使用した。
コンストラクト作製に関しては詳しくは既報の論文(Development 122,983-995(1996))に基づいて作製することができる。簡単には、以下のとおりである。相同領域のアームはPdx1領域を含むλクローンよりクローニングしたものを使用することができる。本実施例では、京都大学大学院医学研究科腫瘍外科学研究室川口義弥先生より供与されたものを使用した。
上記のコンストラクトを上記のように調製したiPS細胞にエレクトロポレーションで導入しポジティブ/ネガティブ選択後、サザンブロティングによりスクリーニングし、得られたクローンを胚盤胞注入しキメラマウスを作製した。その後生殖系列にのったラインを確立し、遺伝的な背景をC57BL/6系統にバッククロスさせて作製することができる。
(使用したマウス)
膵臓欠損を特徴とするトランスジェニックマウスとして、Pdx1プロモーター領域下にHes1遺伝子を繋げたコンストラクトをマウス前核期卵に注入し作製したマウス(Pdx1-Hes1マウス)を用いる。コンストラクト作製に関して既報の論文(Diabetologia 43,332-339(2000))で使用されたPdx1プロモーター領域を含むコンストラクトのPax6遺伝子部にHes1遺伝子(NCBIアクセッションNo.NM_008235のmRNA)を挿入し作製することができる。
上記のコンストラクトをC57BL6マウスおよびBDF1マウス(日本SLC株式会社より購入)を交配して得られた前核期卵にマイクロインジェクターを用いて注入し、仮
親へ移植してトランスジェニックマウスを作製する。
上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製する。
次に、本実施例では、こうして樹立されたマウスのヘテロマウス同士を交配し、使用した。上記ノックインマウスに関してはホモでの維持ができない(出生後1週間程度で死んでしまう)ため、Pdx1wt/LacZおよびPdx1LacZ/LacZ(ファウンダー)同士を交配し胚を回収することとした。
胚盤胞に上記iPS細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した(図1 iPS細胞の胚盤胞注入)。従来の方法では、GFPでのマーキングすることが必要であったが、今回はあらかじめGFPマウスの体細胞からiPS細胞を樹立したのであとからマーキングする必要はなく、そのまま使用した。もちろん、これと同等のマーキングされた他のiPS細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。
フォワード(Fw):ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG(配列番号7)
リバース1(Rv1):TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC(配列番号8)
リバース(Rv2):TGT GAG CGA GTA ACA ACC(配列番号9)。
得ることが可能となり、KO個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。
キメラは毛の色で判断することができる。ドナーのiPS細胞はGFPトランスジェニックマウス由来、宿主の胚は野生型であるC57BL6xBDF1(黒)由来であるので、GFPの蛍光により判断することができる。トランスジェニックの判定は、尻尾から抽出したゲノムDNAのPCRによりトランスジーンを検出することによって行う。
フォワード(Fw):TGA CTT TCT GTG CTC AGA GG(配列番号10)
リバース(Rv):CAA TGA TGG CTC CAG GGT AA(配列番号11)。
cDNA(アクセッションNo.がNM_008235のmRNA)ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されている。このようなPdx1プロモーターとHes1 cDNAが近傍に存在することは野生型マウスでは起こり得ないため、これらのプライマー用いたPCRにより、トランスジーンを効率的に検出することが可能である。
図3には、膵臓の再生を示す。ここでは、出生後5日目の新生児を顕微鏡下で解剖し、
膵臓を露出した。それを蛍光顕微鏡下で観察および撮影した。その結果の写真が図3に示されている。
図4には、iPS細胞由来膵臓の形態を示す。ここでは、iPS細胞由来の膵臓の凍結切片標本を作製し、核染色としてDAPIおよび抗GFP抗体、抗インスリン抗体による染色を施し、正立蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡により観察、撮影した。
以上のように、iPS細胞は3因子(Klf4、Sox2、Oct3/4)でGFPトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って独自に作製したものでの臓器再生が実証された。Pdx1ノックアウトマウスはhomoとheteroを掛け合わせたので50%の確立でhomoの膵臓欠損マウスが生まれてくるはずであり、これが実証されたことになる。そして、図4に示すiPS細胞由来膵臓の形態、および図5に示すようにGFP陽性細胞、GFP陰性細胞を分離回収してPCRを行った結果から、50%の確立でhomoの膵臓欠損マウスが生まれてくるはずであり、これが実証されたといえる。
(使用したマウス)
使用したC57BL/6マウス、BDF1マウス、DBA2マウスおよびICRマウスは、日本SLC株式会社より購入した。Pdx1ヘテロ接合性(Pdx1(+/-))マウス(京都大学大学院医学研究科川口義弥先生およびVanderbilt UniversityのDr.Wrightより供与)を、DBA2マウスまたはBDF1マウスと交配させた。C57BL/6マウスは、ストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病モデルのドナーに使用した。16~20時間の絶食の後にSTZ(200mg/kg)を静脈内投与し、そして、このSTZ注射から1週間後に、血中グルコースレベルが400mg/dLを超えたマウスを高血糖糖尿病マウスとみなした。
未分化のマウス胚性幹(mES)細胞(G4.2)を、ゼラチンコートディッシュにおいて、10%胎仔ウシ血清(FBS;ニチレイバイオサイエンス製)、0.1mM 2-メルカプトエタノール(Invitrogen,San Diego,CA)、0.1mM 非必須アミノ酸(Invitrogen)、1mM ピルビン酸ナトリウム(Inv
itrogen)、1% L-グルタミン ペニシリン ストレプトマイシン(Sigma)および1000U/mlの白血病抑制因子(LIF;Millipore,Bedford,MA)を補充したGlasgow改変イーグル培地(GMEM;Sigma,St.Louis,MO)中で、フィーダー細胞なしで維持した。このG4.2細胞(RIKEN CDBの丹羽仁史先生より供与)は、EB3 ES細胞に由来し、そして、CAG発現ユニットの制御下で改良型緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を持つ。EB3
ES細胞は、E14tg2a ES細胞(Hooper M.et al.,1987)に由来する下位系統の細胞であり、Oct-3/4プロモーター制御下で薬剤耐性遺伝子であるブラストサイジンを発現するように構築したOct-3/4-IRES-BSD-pAベクターの組み込みを、Oct-3/4対立遺伝子に標的化することによって樹立されたものである(Niwa H.et al.,2000)。
Pdx1ヘテロ接合性(Pdx1(+/-))の異種交配胚の調製は、既報のプロトコール(Nagy A.et al.,2003)に従って行った。簡単に述べると、マウスの8細胞/桑実胚期の胚を、Pdx1異種接合性マウスの交配後2.5日の卵管および子宮から、M2培地(Millipore)中に採卵した。これらの胚をKSOM-AA培地(Millipore)滴中に移し、そして、胚盤胞期まで24時間培養した。
コラゲナーゼ消化によって、iPS由来の膵臓を持つマウスから膵島を単離し、そして、フィコール勾配にて遠心分離を行ってこれらを分離した。簡単に述べると、10~12週齢の成体マウスを屠殺し、27Gのバタフライ針を用いて、胆管から、ハンクス平衡塩溶液(HBSS:Invitrogen)中2mg/mlのコラゲナーゼ(ヤクルト社製)による膵臓の灌流を行った。灌流した膵臓を切開し、37℃にて20分間インキュベートした。消化した画分をHBSSで2回洗浄し、そして、ストレーナーを用いて消化されなかった組織を除いた。HBSS中のFicoll PM400(GE-Healthcare,Stockholm,Sweden)を用いた密度勾配遠沈によって画分を分離し、そして、膵島が濃縮された画分を、10%FCSを含むRPMI培地(Invitr
ogen)中に回収した。直径がほぼ150μmを超える膵島を、ガラス製のマイクロピペットを用いて、顕微鏡下でチューブ内に回収した。
膵島移植から2ヶ月後に、GFPの発現(移植された膵島を示す)を観察した。腎臓切片のHE染色およびDAPIによるGFP染色を行い、移植された膵島の存在を確認した。
絶食を行わなかったマウスの血糖値を、mAbを投与した時点、そして、膵島の移植から2ヶ月後まで、1週間おきに血液サンプルを採取して、血糖値をモニタリングした。血糖値は、メディセーフミニGP-102(TERUMO社より購入)を用いて測定した。また、膵島の移植から2ヶ月後にグルコース耐性試験(GTT)を行った。
実施例1に準じて、腎臓の臓器再生を行った。
子spalt(sal)のマウスホモローグであり、アフリカツメガエルの前腎管誘導実験から、腎発生に重要であることが示唆された、1323アミノ酸残基のタンパク質をコードする3969bpの遺伝子である(Nishinakamura,R.et al.,Development,Vol.128,p.3105-3115,2001、東大浅島研究室)。このSall1遺伝子は、マウスにおいて、腎臓のほか、中枢神経、耳胞、心臓、肢芽、肛門において発現局在していることが報告された(Nishinakamura,R.et al.,Development,Vol.128,p.3105-3115,2001)。
注入された胚由来(すなわち宿主)同定用のフォワードプライマー:
mutant検出用:AAG GGA CTG GCT GCT ATT GG(配列番号12)
wild type検出用:GTA CAC GTT TCT CCT CAG GAC(配列番号13)
注入された胚由来(すなわち宿主)同定用のリバースプライマー:
mutant検出用:ATA TCA CGG GAT GCC AAC GC(配列番号14)
wild type検出用:TCT CCA GTG TGA GTT CTC TCG(配列番号15)。
できる。
毛に関してはヌードマウス由来の胚盤胞を使用して、多能性幹細胞として上記で生産したマウスiPS細胞を移植して、毛発生が生じるか否かを検討した。
使用したマウスは、ヌードマウスであり、日本SLC株式会社より入手した。使用したヌードマウスは近交系DDD/1系統マウスにBALB/cヌードのnu遺伝子を導入した際に作られた繁殖効率良かつ丈夫なヌードマウスである。
以上から、本発明の方法を用いて、マウスiPS細胞でも毛を再生することができることが示された。
胸腺に関してはヌードマウス由来の胚盤胞を使用して、多能性細胞として上記で生産したマウスiPS細胞を移植して、胸腺発生が生じるか否かを検討した。
使用したマウスは、ヌードマウスであり、日本SLC株式会社より入手した。使用したヌードマウスは近交系DDD/1系統マウスにBALB/cヌードマウスのnu遺伝子を導入した際に作られた繁殖効率良かつ丈夫なヌードマウスである。
胚盤胞にマウスiPS細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した。このマウスiPS細胞はGFPを導入されている。これと同等のマーキングされたマウスiPS細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。本実施例では、実施例3において記載したように、ヌードマウスを使用したので、PCRによる確認は不要である。
以上から、本発明の方法を用いて、マウスiPS細胞でも胸腺を再生することができることが示された。
本実施例では、ホスト動物として膵臓欠損を特徴とするPdx1ノックアウトマウスを、ドナー細胞として、上記調製例に準じて作製したラットのiPS細胞(EGFP+)を用い、異種間の胚盤胞補完を検討した。
膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、実施例1と同様に、Pdx1遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ接合個体(Pdx1(+/-))、およびマウスiPS細胞により膵臓が補われたホモ接合個体(Pdx1(-/-):ファウンダー)を使用した。
1)ラットiPS細胞作製のためのベクターの構築
レンチウイルスベクターCS-CDF-CG-PREのマルチクローニングサイトにpTRE-Tight(clontech)由来のTRE、ユビキチンCプロモーター、pTet-on advanced(clontech)由来のtTA、pIRES2EGFP(clontech)由来のIRES2EGFPを5’側から順に組み込んだ。マウスOct4、Klf4およびSox2はそれぞれウイルス由来のF2A、T2Aで連結し、上記レンチウイルスベクターのTREとユビキチンCプロモーターの間に挿入し作製した(LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G)。
継代数5以内のウイスターラット胎児繊維芽細胞(E14.5)細胞を0.1%ゼラチンコーテイングしたディッシュに撒き、DMEM、15% FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(SIGMA)にて培養した。播種翌日、LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G ベクターを使用し作成したレンチウイルスを培養液に加え、細胞へのウイルス感染を行った。24時間後に培地交換し、マイトマイシンC処理をしたMEFに撒き直し、1μg/ml ドキシサイクリン、1000U/ml ラットLIF(Millipore)添加DMEM、15% FCS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミンで培養した。翌日培地を交換し、無血清培地N2B27メディウム(GIBCO)に1μg/ml ドキシサイクリン、1000U/ml ラットLIF(Millipore)添加とした培地を1日おきに交換し、7日目からインヒビター(2i;3mM CHIR99021(Axon)、1mM PD0325901(Stemgent)、3i;2i+2mM SU5402(CalbioChem))を添加した。10日目以降に出現したコロニーをピックアップし、MEFフィーダー上に撒きなおした。このようにして樹立したriPS細胞は、3~4日に一度トリプシン-EDTAを用いて継代維持を行い、非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移入した。
雄性のPdx1(-/-)マウスと雌性のPdx1(+/-)マウスとを交配させ、受精卵を子宮還流法により採取した。採取した受精卵をin vitroで胚盤胞期まで発生させ、得られた胚盤胞に、上述のEGFPマーキングされたラットiPS細胞を、1胚盤胞あたり10細胞、顕微鏡下でマイクロインジェクションにより注入した。これを擬似妊娠仮親(ICRマウス、日本エスエルシー株式会社より購入)の子宮に移植し、妊娠満期で開腹し、得られた新生児を解析した。
5陽性細胞が認められることから、それらは宿主マウスとラットiPS細胞由来の細胞が混在したマウス-ラット異種間キメラ個体であることが確認された。さらに、ラットCD45陽性細胞分画中の細胞はほぼすべてがEGFP蛍光を呈することから、ラットCD45陽性細胞はEGFPでマーキングしたラットiPS細胞由来の細胞である(図10)。
注入された胚由来の細胞同定用フォワードプライマー:
mutant、wild type共通:ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG(配列番号16)
注入された胚由来の細胞同定用リバースプライマー:
mutant検出用:TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC(配列番号17)
wild type検出用:TGT GAG CGA GTA ACA ACC(配列番号18)。
本実施例では、マウス以外の動物を使用する場合でも、臓器を製造することができることを実証する。マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立は、同様に、上記調製例に基づいてiPS細胞を生産し、キメラを生産することによって実施例1に準じて実施することができる。
、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
配列番号2:Oct3/4用リバースプライマー、Rv(pMX/L3205):CCC
TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA
配列番号3:Klf4用フォワードプライマー、Fw(Klf4-S1236):GCG
AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC
配列番号4:Klf4、Sox2、c-Myc用リバースプライマー、Rv(pMXs-AS3200):TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG
配列番号5:Sox2用フォワードプライマー、Fw(Sox2-S768):GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG
配列番号6:c-Myc用フォワードプライマー、FW(c-Myc-S1093):CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC
配列番号7 注入された胚由来の細胞同定用のフォワード(Fw)プライマー:ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG
配列番号8 注入された胚由来の細胞同定用のリバース1(Rv1)プライマー:TTC
AAC ATC ACT GCC AGC TCC
配列番号9 注入された胚由来の細胞同定用のリバース(Rv2)プライマー:TGT GAG CGA GTA ACA ACC
配列番号10 トランスジーン検出用フォワード(Fw)プライマー:TGA CTT TCT GTG CTC AGA GG
配列番号11 トランスジーン検出用リバース(Rv)プライマー:CAA TGA TGG CTC CAG GGT AA
配列番号12 注入された胚由来の細胞(mutant)検出用フォワードプライマー:AAG GGA CTG GCT GCT ATT GG
配列番号13 注入された胚由来の細胞(wild type)検出用フォワードプライマー:GTA CAC GTT TCT CCT CAG GAC
配列番号14 注入された胚由来の細胞(mutant)リバースプライマー:ATA TCA CGG GAT GCC AAC GC
配列番号15 注入された胚由来の細胞(wild type)検出用リバースプライマー:TCT CCA GTG TGA GTT CTC TCG
配列番号16 注入された胚由来の細胞検出用フォワードプライマー(mutant wild type共通):ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG
配列番号17 注入された胚由来の細胞(mutant)検出用リバースプライマー:TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC
配列番号18 注入された胚由来の細胞(wild type)検出用リバースプライマー:TGT GAG CGA GTA ACA ACC
Claims (22)
- 発生段階において目的臓器または身体部分の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物の生体内において、該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の該目的臓器または身体部分を製造する方法であって、
a)該異個体哺乳動物由来の誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)を調製する工程;
b)該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該細胞を移植する工程;
c)該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程;および
d)該産仔個体から、該目的臓器または身体部分を取得する工程
を含み、
前記iPS細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである、
目的臓器または身体部分を製造する方法。 - 前記iPS細胞が、ヒト、ラットまたはマウス由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記iPS細胞がラットまたはマウス由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記製造すべき臓器または身体部分が膵臓、腎臓、胸腺および毛から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項1に記載の方法。
- 前記マウスがSall1ノックアウトマウス、Pdx1-Hes1トランスジェニックマウス、Pdx-1ノックアウトマウスまたはヌードマウスである、請求項5に記載の方法。
- 前記目的臓器が、完全に前記異個体哺乳動物由来のものである、請求項1に記載の方法。
- 前記iPS細胞を、体細胞に初期化因子を接触させることによって得る工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記iPS細胞がラット由来であり、前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項1に記載の方法。
- 発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有し、かつ、異なる個体の異個体哺乳動物由来の該目的臓器または身体部分を有する非ヒト哺乳動物であって、
a)該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のiPS細胞を調製する工程{ここで、前記iPS細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである};
b)発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該iPS細胞を移植する工程;および
c)該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程
を含む方法によって生産された哺乳動物。 - 発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物の、iPS細胞を用いた該目的臓器の製造のための使用であって、前記iPS細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである、使用。
- 目的臓器を製造するためのセットであって、該セットは、
A)発生段階において該目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物と、
B)該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のiPS細胞、または初期化因子および必要に応じて該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の体細胞を備え、
前記iPS細胞および体細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである、
セット。 - 目的の臓器または身体部分を生産する方法であって、
A)機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完(blastocyst complementation)により補完される、非ヒト哺乳動物を
提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程;
B)該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程;
C)該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的iPS細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程{ここで、前記iPS細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである};および
D)該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程
を包含する方法。 - 前記iPS細胞を、体細胞に初期化因子を接触させることによって得る工程をさらに包含する、請求項13に記載の方法。
- 前記D)工程は、前記キメラ胚盤胞を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することを包含する、請求項13に記載の方法。
- 前記目的iPS細胞がラットまたはマウス由来である、請求項13に記載の方法。
- 前記目的の臓器または身体部分が膵臓、腎臓、胸腺および毛から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記動物がマウスである、請求項13に記載の方法。
- 前記マウスがSall1ノックアウトマウス、Pdx-1ノックアウトマウス、Pdx1-Hes1トランスジェニックマウスまたはヌードマウスである、請求項18に記載の方法。
- 前記目的の臓器または身体部分が、完全に前記目的iPS細胞由来のものである、請求項13に記載の方法。
- 前記iPS細胞がラット由来であり、前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項13に記載の方法。
- 目的の臓器または身体部分を製造するためのセットであって、該セットは、
A)機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完(complement)により補完される、非ヒト哺乳動物と、
B)該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のiPS細胞、または初期化因子および必要に応じて該非ヒト動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の体細胞と
の組み合わせとを備え、
前記iPS細胞および体細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係にある、
セット。
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