WO2019073960A1 - 分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用 - Google Patents

分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the application of pluripotent stem cells with altered differentiation potential to animals.
  • Genetically modified animals are widely used to analyze the function of genes in vivo, and transgenic animals that introduce foreign genes and knockout animals that destroy endogenous genes are known.
  • Production of a genetically modified animal is carried out by introducing pluripotent cells having a target gene modification into a wild-type animal embryo, or directly introducing a target gene modification into the animal embryo.
  • An individual who develops from an animal embryo when it is generated by transferring an animal embryo into which a pluripotent cell having a desired gene modification has been introduced to the uterus of a pseudopregnant temporary parent is that some of the cells consist of wild type cells The part is in a chimera state consisting of cells with genetic modification.
  • Non-Patent Document 1 discloses that knockout mice of Prdm14 gene lack germ cells.
  • the knockout mice of Prdm14 gene can not be mated because germ cells are deleted.
  • the present invention provides applications to the generation of pluripotent stem cells with altered differentiation potential in animals.
  • the present inventors control the in vivo distribution of pluripotent cells in an animal obtained by growing the animal embryo by introducing into the animal embryo pluripotent cells of which differentiation potential has been modified in the present invention. Suggest.
  • the present inventors suppress or lose differentiation of target cells into target tissues, for example, by introducing genetically engineered cells (for example, knockout cells, knockdown cells or transgenic cells) into embryos Tissues other than the target tissue may be allowed to differentiate according to the inherent chimera forming ability of the genetically engineered cells themselves).
  • the target tissue consists essentially of embryo-derived cells while the other tissues are a chimeric state of embryo-derived cells and embryo-transfected cell-derived cells. It is a thing.
  • the present invention is an invention based on such a thought. That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
  • a method for producing a somatic chimera animal which comprises: Introducing pluripotent cells into embryos to obtain somatic chimera animals; Pluripotent cells are genetically engineered to not differentiate into specific types of cells, Method.
  • the method according to (1) above, wherein the pluripotent cell genetically engineered not to differentiate into a specific type of cell is a cell in which a gene essential for germ cells is disrupted.
  • the composition according to (2) above, wherein the pluripotent cell genetically engineered not to differentiate into a specific type of cell is a cell in which a gene essential for germ cells is disrupted.
  • the pluripotent cell genetically engineered not to differentiate into a specific type of cell is a knockout cell of Prdm14 gene, a knockout cell of Otx2 gene, or a double knockout cell of Prdm14 gene and Otx2 gene as described above ( 1) or the method described in (3).
  • the pluripotent cell genetically engineered not to differentiate into a specific type of cell is a knockout cell of Prdm14 gene, a knockout cell of Otx2 gene, or a double knockout cell of Prdm14 gene and Otx2 gene as described above ( 2) or the composition as described in (4).
  • the method according to (3) or (5) above, wherein the somatic chimeric animal and the pluripotent cell are male.
  • An animal that is a somatic chimeric non-human animal, and the specific type of cell consists of cells derived from a host animal.
  • somatic chimera animal whose chimera state is controlled.
  • the production of such a somatic chimera animal can be advantageously used for analysis of the information network of the introduced cells and the host animal.
  • FIG. 1 shows the chimera ratio of embryo-transfected cells in somatic chimera animals obtained by introducing wild-type or male or female Prdm14 gene knockout ES cells into wild-type embryos.
  • FIG. 2 shows the method of disrupting Prdm14 gene by CRISPR / Cas9 system and the disrupted Prdm14 gene.
  • FIG. 3A shows an example of a cell-specific cell death induction system.
  • FIG. 3B shows an example of a cell-specific cell death induction system.
  • FIG. 3C shows an example of a cell-specific cell death induction system.
  • FIG. 3D shows an example of a cell-specific cell death induction system.
  • FIG. 4 shows how to generate Otx2 knockout ES cells.
  • FIG. 5 shows pancreatic GFP of an individual (# 11) obtained by introducing GFP expressing ES cells that are Prdm14 knockout (Prdm14-/-) and Otx2 knockout (Otx2-/-) into Pdx1-/-embryo. Shows the expression of FIG. 7 shows that the # 11 individual pancreas has a normal function by glucose tolerance test. Also, the genotype of the Pdx1 gene of the offspring obtained as a result of the hybridization test between # 11 individual and a wild-type mouse is shown.
  • germ cells are cell types that are generated by differentiating from primordial germ cells as a specific cell population forming germ cells, and gametes such as sperm and eggs are formed from primordial germ cells. Refers to all germline cell types that arise during the differentiation process.
  • an "animal that is deficient in its own germ cells at the developmental stage” or an embryo thereof means an animal or embryo that does not give rise to its own germ cells at the developmental stage.
  • such animals include animals having cell-autonomous abnormalities that are deficient in their own germ cells at developmental stage.
  • differentiation potential means the ability of the pluripotent cells to differentiate into each tissue present in a fetus or an adult when used on pluripotent cells.
  • cell-autonomous abnormality means that the abnormality that a cell has has substantially only qualitatively or quantitatively the influence on the cell.
  • Cell-autonomous abnormality is preferably not an abnormality in the mechanism that acts on other cells.
  • the “cell-autonomous abnormality” is, for example, an abnormality that affects only cells having the abnormality. Therefore, when a normal cell is introduced, the cells are not affected by the abnormality from the host.
  • Cell-autonomous abnormalities include, for example, modifications that induce tissue-specific cell death, and modifications that are necessary for tissue differentiation and that lack cell-autonomous factors.
  • animal means mammals and birds.
  • Animals include, but are not limited to, for example, rodents such as mice and rats, domestic animals such as pigs and cattle, companion animals such as dogs and cats, birds such as chickens, and primates such as monkeys .
  • rodents such as mice and rats
  • domestic animals such as pigs and cattle
  • companion animals such as dogs and cats
  • birds such as chickens
  • primates such as monkeys .
  • an animal is a non-human animal.
  • homologous means allogeneic and allogeneic, and “heterologous” means that the species in animal taxonomy is different.
  • a somatic chimera animal refers to a cell of one individual and a cell of another individual (eg, an allogeneic cell, or an allogeneic cell or allogeneic cell to which one or more genetic manipulations have been added.
  • Cell refers to an animal having tissues or organs mixed at the cellular level.
  • a somatic chimera animal can be obtained by introducing a plurality of (for example, about 10) pluripotent cells into an embryo (for example, a morula or blastocyst). More specifically, as embryos, various embryos can be used from 8-cell embryos to blastocyst stage embryos, and methods for introducing pluripotent cells into such animal embryos are also suitable.
  • Pluripotent cells include pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells and pluripotent cells such as inner cell mass (ICM), which can be introduced into embryos in the present invention.
  • the number of pluripotent stem cells to be introduced into the embryo can also be appropriately determined, and is not particularly limited. For example, in the case of introduction into the embryo, the number can be about 3 to 10.
  • host animal means an embryo into which pluripotent cells are introduced when producing a somatic chimera animal.
  • embryo introduced cells mean cells that are introduced into embryos when producing somatic chimera animals.
  • pluripotent cells refer to pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and pluripotent cells such as inner cell mass (ICM). Pluripotent cells are known to be capable of differentiating into any fetal or adult cell.
  • genetic engineering refers to alteration of gene expression and genetic alteration.
  • alteration of gene expression means alteration that results in the enhancement or attenuation of gene expression.
  • Enhancement of gene expression may be achieved by operably linking the endogenous gene to one or more control sequences for strong expression in cells.
  • Attenuation of gene expression can be achieved by using an antisense nucleic acid to an endogenous gene, siRNA and its nucleic acid derivative (eg, crosslinked nucleic acid (BNA), locked nucleic acid (LNA), hybrid nucleic acid containing different types of nucleic acids, peptide nucleic acid (PNA), etc.) , And by knockdown techniques such as shRNA and its nucleic acid derivatives.
  • genetically modified means that the gene is different from wild-type, including natural and artificial modifications.
  • Representative examples of genetic modification include transgenics and knockouts.
  • crossing means to fertilize between two individuals of an organism to obtain the next generation, and to obtain offsprings with the two individuals as parents.
  • the mating includes mating by artificial insemination and mating of male and female for the purpose of reproduction.
  • a method for producing a somatic chimera animal which comprises introducing pluripotent cells with altered differentiation potential into embryos.
  • pluripotent cells with altered differentiation potential include, for example, pluripotent cells genetically engineered not to differentiate into specific types of cells.
  • the particular type of cell essentially consists of embryo-derived cells, and the other cells are embryo-derived cells and embryo-transfected cell-derived cells according to the chimera forming ability of embryo-transfected cells.
  • a method of producing the somatic chimera animal comprising the cells of
  • pluripotent cells with altered differentiation potential may preferably have cell autonomous defects.
  • a pluripotent cell having a cytotoxic gene operably linked to an enhancer and / or promoter of a gene induced upon differentiation to a specific type of cell is autonomous when it is intended to differentiate to a specific type of cell can be used as pluripotent cells with cell-autonomous abnormalities and altered differentiation potential.
  • cell autonomous cell death can also be induced.
  • the induction of cell death is carried out, for example, by combining cytotoxic gene such as Caspase-8, Caspase-9, Barnase, and diphtheria toxin by combining it with a drug-induced gene expression system (for example, a tetracycline-responsive expression induction system). It can be achieved by expression in specific cells (eg, germ cells) depending on the concentration of the drug (eg, doxycycline) in the womb.
  • FIG. 3A shows a system in which the drug-inducible gene expression system is the Tet-On system in a system that induces drug concentration-dependent cell death in a cell-specific manner in combination with a cell-specific promoter and a drug-inducible gene expression system.
  • a reverse tetracycline regulatory transactivator rtTA
  • a fetus into which this system has been incorporated expresses rtTA in a cell-specific manner.
  • a cytotoxic compound such as doxycycline (Dox) can induce a cytotoxic gene only in cells in which rtTA is expressed, and can induce cell death in a cell-specific manner.
  • Dox doxycycline
  • FIG. 3B illustrates a system that induces cell death in a cell specific manner using a tissue specific gene recombination system such as Cre-LoxP.
  • a physiologically insignificant gene dummy gene
  • a cytotoxic gene are linked downstream of the constitutively active promoter. In this state, cells do not induce cell death.
  • LoxP sequences are arranged upstream and downstream of the dummy gene.
  • the cell has a Cre operably linked to a cell specific promoter.
  • Cre driven by a cell-specific promoter is cell-specifically expressed and acts on the LoxP sequence to remove a dummy gene, thereby a constitutively activated promoter.
  • a cytotoxic gene can be operatively linked to, and the cytotoxic gene can be expressed in a cell-specific manner, resulting in the cell-specific induction of cells.
  • CreER activated by 4-hydroxy tamoxifen could be used. CreER is known as a fusion protein of Cre recombinase and a variant of the ligand binding region of the estrogen receptor and is activated by 4-hydroxy tamoxifen.
  • FIG. 3C incorporates into the cell a system in which a cytotoxic signal receptor is operably linked to a cell specific promoter.
  • cytotoxic signal receptors When cells differentiate into specific cells, cytotoxic signal receptors are expressed on the cell surface and cell death is induced in a ligand-dependent manner. Examples of cytotoxic signal receptors and their ligands include diphtheria toxin receptor and diphtheria toxin.
  • a compound-induced cytotoxicity system can be exemplified.
  • Examples of other compound-induced cytotoxicity systems include systems using the HSV-TK / GCV system (Moolten FL et al., Hum. Gene Ther. 1990; 1: 125-134), and inducible caspase-9 (Straathof KC). et al., Blood 2005; 105: 4247-4254).
  • FIG. 3D illustrates the HSV-TK / GCV system. Specifically, ganciclovir (GCV) is less cytotoxic in the non-phosphorylated form.
  • GCV ganciclovir
  • inducible caspase-9 is a protein in which CARD has been replaced by FKBP12 in caspase-9, and can be dimerized only in the presence of a tacrolimus derivative such as AP1903 and activated to cause cell death. It can be triggered.
  • a cell introduced with a system in which inducible caspase-9 is operably linked to a cell specific promoter differentiates into a specific cell cell death is induced specifically by the tacrolimus derivative.
  • cell autonomous abnormalities may be generated in germ cells.
  • a pluripotent cell having a gene that exhibits germ cell specific expression eg, a cytotoxic gene operably linked to an enhancer and / or promoter such as Prdm14, Nanos2, Nanos3, DDX4 and Sox17 It does not contribute to germ cells in somatic chimera animals as it will die autonomously when it tries to differentiate into cells.
  • a gene that exhibits germ cell specific expression can be, for example, a gene that is specifically expressed in germ cells for a single or long period.
  • pluripotent cells can be limited.
  • a gene that exhibits forebrain specific expression can be, for example, a gene that is specifically expressed in a forebrain region for a single period or a long period.
  • the sperm is formed when the Izumo gene that expresses sperm-specifically is deleted, the formed sperm does not have a fertilizing function, such a gene deletion May cause gametes to malfunction.
  • a spermatozoon-specific promoter / enhancer such as Izumo may be combined with a cytotoxic gene to remove gametes.
  • a gene specifically expressed in gametes such as Tpap, Acrosin, Tra 98 which is a gene specifically expressed in sperm, and a promoter / enhancer such as Gdf9, Zp1, Zp 3 which is a gene specifically expressed in eggs
  • the gamete can also be removed during the gametogenesis process by combining the cytopathic gene with
  • a gene involved in meiosis which is a phenomenon that occurs specifically in germ cells, such as a promoter / enhancer such as Dazl, Stra8, Taf71, or Sycp3, is also used to avoid germ cell formation. it can.
  • a cell in which a gene essential for differentiation into a germ cell has been disrupted can be used as an embryo transfer cell.
  • Prdm14 is a gene encoding PR domain-containing protein 14 (PR domain-containing protein 14). Prdm14 is also called PR domain zinc finger protein 14 (RP domain zinc finger protein 14). Prdm14 protein has an amino acid sequence registered under, for example, HPRD ID: 11457, and the gene is known to be located at 8q13.3 on the chromosome. In addition, in the Prdm14 gene knockout mice, it is known that germ cells are deficient in ovaries and testis (Yamaji M. et al., Nature Genetics, 40: 1016-1022, 2008). In one embodiment of the present invention, pluripotent cells which can not differentiate into germ cells by knocking out or knocking down the Prdm14 gene may be used as embryo transfer cells.
  • knockout of the Prdm14 gene can be performed, for example, by deletion of part or all of the gene, or introduction of a frame shift.
  • the knocked out Prdm14 gene has the sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • somatic chimera animal which is in a chimera state dependent on the inherent chimera forming ability of the transfected cells, and in which specific types of cells consist essentially of embryo-derived cells.
  • a somatic chimera other than the target tissue becomes a chimera state dependent on the inherent chimera forming ability of the embryo-transduced cells, and the target tissue essentially consists of cells derived from embryos. It is also possible to obtain animals.
  • pluripotent cells for example, ES cells and iPS cells
  • pluripotent cells which are Prdm14 knockout and Otx2 knockout
  • the present invention provides an invention using pluripotent cells genetically engineered not to differentiate into brain and gonads as pluripotent cells genetically engineered not to differentiate into a specific type.
  • embryo-transduced cells and host cells have high flexibility with which one can complement the other for non-differentiable tissues. It has become. That is, the cells into which the embryo introduced cells do not differentiate can be complemented by the cells of the host embryo, and as a result, the cells into which the embryo introduced cells can differentiate form a chimera state of the embryo introduced cells and the cells of the host embryo.
  • the cells into which the transfected cells do not differentiate consist of cells derived from the host embryo, and the differentiation defects of the embryo-transfected cells do not appear abnormal in somatic chimera animals because they are complemented by the host embryonic cells.
  • pluripotent cells for example, ES cells and iPS cells
  • pluripotent cells that are Prdm14 knockout and Otx2 knockout
  • embryos Pdx1-/-knockout embryos or Pdx1-Hes1 transgenic embryos
  • pluripotent cells for example, ES cells and iPS cells
  • embryo As, the Sal1 knockout embryo can be used.
  • pluripotent cells genetically engineered not to differentiate into specific types pluripotent cells genetically engineered not to differentiate into any of brain and gonads can be used.
  • Pluripotent cells genetically engineered not to differentiate into either the brain or gonads can be prepared by the above-mentioned genetic engineering for not differentiating to the brain and genetic engineering for not differentiating to the gonads.
  • a gene exhibiting germ cell specific expression for example a cytotoxic gene operably linked to an enhancer and / or promoter such as Prdm14, Nanos2, Nanos3, DDX4 and Sox17;
  • Pluripotent cells that have both forebrain (future cerebrum) specific expression genes such as cytotoxic genes operably linked to Otx1 and Otx2 enhancers and / or promoters, are of a specific type. It can be used as a pluripotent cell genetically engineered not to differentiate.
  • a gene specifically expressed in gametes such as Izumo, Tpap, Acrosin or Tra 98, which is a gene specifically expressed in sperm, or Gdf9, Zp1, or Zp3 which is a gene specifically expressed in eggs And / or a cell operably linked to an enhancer and / or promoter of a gene that exhibits specific expression
  • Pluripotent cells having both a damaging gene can be used as pluripotent cells genetically engineered not to differentiate into specific types.
  • Genes involved in meiosis a phenomenon that occurs specifically in germ cells, for example cytotoxic genes operably linked to a promoter and / or enhancer such as Dazl, Stra8, Taf71 or Sycp3; Pluripotent cells that have both forebrain (future cerebrum) specific expression, such as Otx1 and Otx2, both with cytotoxic genes operably linked to enhancers and / or promoters, are of a specific type It can be used as a pluripotent cell genetically engineered not to differentiate into
  • the present invention it is possible to freely control specific tissues to be composed of genetically engineered cells, to use specific tissues alone to be composed of wild-type cells, or to be in a chimera state, and Provides a technology to analyze the function of manipulated genes in specific tissues in comparison with each other. Then, according to the present invention, the chimera state control technology of somatic chimera animals also provides a new option to the conventional chimera state control technology.
  • a method of producing a somatic chimera animal comprising introducing pluripotent cells into an embryo to obtain a somatic chimera animal, the pluripotent cells being of a particular type
  • a method is provided that is genetically engineered not to differentiate into cells, and the embryo is genetically engineered to lack certain types of cells other than pluripotent cells. Examples of such genetic engineering of embryo include knockout of Pdx1 gene, or deletion of pancreas by Pdx1-Hes1 transgenic, and deletion of kidney by knockout of Sal1 gene.
  • genetic engineering to delete a particular type of cell in an embryo includes loading a cytotoxic gene operably linked to a specific type of cell specific promoter and / or enhancer.
  • the embryo may be genetically engineered by genetic modification (eg, knockout or transgenic) in which specific cells or tissues are found to be defective.
  • genetic modification eg, knockout or transgenic
  • the embryo has a cytotoxic gene operably linked to a specific type of cell specific promoter and / or enhancer, or such that the specific cell or tissue is deficient.
  • the gene may be altered.
  • embryos into which cells are introduced include vertebrate-derived embryos, for example, non-human mammalian embryos, for example, non-human primates such as chimpanzees, gorillas, orangutans, monkeys, marmosets and bonobos.
  • Embryos derived from non-human mammals such as pigs, rats, mice, cattle, sheep, goats, horses and dogs (eg carnivores, arthropods, metamorphosis and rodent embryos); Avian embryos such as chickens can be mentioned.
  • the embryo transfer cells include, but are not limited to, pluripotent cells of primates such as humans and monkeys, and pluripotent cells of mammals such as pigs, cattle, sheep and goats, etc. It can be mentioned.
  • the embryo transfer cell is a human pluripotent cell (eg, an ES cell or an iPS cell).
  • the embryo and the species of cells introduced into the embryo may be in the same kind or in the different kind (for example, it is made part of this specification by citation) WO 2010/087459).
  • the combination of embryo and embryo introduced cell species includes a combination of mouse and rat, and between mouse and rat, a chimera animal has been successfully produced by blastocyst complementation (quote) WO 2010/021390 and WO 2010/087459) which are hereby incorporated by reference.
  • the genetic distance between mouse and rat corresponds to the genetic distance between human and pig.
  • cross-species chimeric animals between mouse and rat means that cross-species chimera animals can be produced sufficiently between species which are closer in genetic distance than that. .
  • somatic chimera animals are obtained between human and mouse or between marmoset and mouse. Therefore, even if it is a combination of rodents and primates, it is possible to form chimeric animals. And, chimeric animals can be produced between different species among species that are considered to have small differences compared to rodents and primates.
  • combinations between embryos and embryo introduced cells that can be used in the present invention, for example, combinations of non-human mammals, combinations of birds, combinations of humans and non-human primates other than mice and rats Combination with animals, human-chicken combination, human-pig combination, human-bovine combination, human-goat combination, human-sheep combination, non-human primate combination, non-human primate combination, non-human primate combination
  • a combination of human primates and pigs, cows or sheep, a combination of cows and pigs, sheep, goats or horses, or a combination of pigs and sheep, goats or horses, and the like can be mentioned.
  • mice and rats may be a combination of a human and an animal belonging to any of carnivores, anthletoids or a metamorphosis, or a combination of animals belonging to the same genus, class or family.
  • mice and rats have different numbers of chromosomes, it is possible to produce chimeric animals between mice and rats. Therefore, even if the numbers of chromosomes are different, the possibility of producing chimeric animals is not denied.
  • pluripotent cells which can obtain a desired chimera state can be selected and used except for specific types of cells.
  • the chimera state depends on the chimera forming ability of pluripotent cells, and when the chimera forming ability is high, the proportion of cells derived from pluripotent cells increases, and when the chimera forming ability is weak, pluripotent cell derived
  • the percentage of cells in The ability to form a chimera can be determined by labeling embryo-transfected cells and / or embryos, preparing a somatic chimera animal, and using the percentage of cells having a label in the obtained somatic chimera animal as an indicator.
  • the present invention may include selecting pluripotent cells having the desired ability to form a chimera, and modifying the differentiation potential of the pluripotent stem cells obtained.
  • the index of the chimera forming ability includes the strength of the chimera forming ability or the balance of strength of the chimera forming ability for each tissue, and these may be used as an index to select pluripotent cells having the desired chimera forming ability. .
  • a somatic chimera animal can be implanted into the uterus of a pseudopregnant female temporary parent and can be allowed to grow into a fetus after introducing an embryonic transfer cell into the embryo. Somatic chimera animals may be obtained as a fetus, as offspring or as adults.
  • the germ cells when pluripotent cells that are genetically engineered not to differentiate into germ cells are introduced into embryos, the germ cells will consist essentially of cells on the host side. Then, when the genotypes of the host animal and the embryo-transfected cells are different, the germ cells of the resulting somatic chimera animal will have the genotype of the host animal, and a fetus obtained by mating the somatic chimera animals or The offspring will have the genotype of the host animal.
  • Example 1 Preparation of Prdm14 gene knockout pluripotent cells
  • knockout pluripotent cells in which the Prdm14 gene was disrupted were prepared.
  • an embryonic stem cell in which EGFP was expressed was used for measurement of the chimera rate.
  • Pluripotent cells were prepared as male and female cells, respectively. Specifically, male ES cell lines (SGE2) and female ES cell lines (SES2) were obtained from male and female embryos obtained by mating male EGFP transgenic mice with females of C57BL6 / N (all purchased from Japan SLC). SGE-F13) was established. In this example, these ES cells are referred to as wild type ES cells.
  • ES cells in which the Prdm14 gene was disrupted were produced from wild type ES cells.
  • ES cells (Prdm14-/-ESC-M) in which the male Prdm14 gene has been disrupted can be treated with a gRNA cloning vector (Addgene, Plasmid # 41824) in which Prdm14 gRNA has been incorporated as a Cas9 expression vector (Addgene, Plasmid #). (SEQ ID NO: 41) and transfected into SGE2 cells.
  • a female Prdm14 gene-disrupted ES cell (Prdm14-/-ESC-F) was prepared in the same manner as Prdm14-/-ESC-M except that SGE-F13 cells were used instead of SGE2 cells.
  • Example 2 Preparation of Chimeric Mouse
  • chimeric mice were prepared using the Prdm14 gene disruption pluripotent cells and wild type pluripotent cells prepared in Example 1, respectively.
  • ICR mice purchased from Japan SLC
  • embryos (fertile embryos) were collected on day 2.5.
  • Prdm14 gene disrupted pluripotent cells of male or female or wild type pluripotent cells were injected into the cavity of the embryo at a ratio of 10 cells per embryo using a micromanipulator under a microscope.
  • the fertilized eggs cultured for 1 day in KSOM-AA (Millipore) and made into blastocysts are transplanted to the uterus of a pseudopregnant ICR strain mouse at 2.5 days after mating, and 12 days after transplantation (fetal age 14; Caesarean section was taken on the 5th day and the fetus was taken out.
  • the obtained fetus was observed under a fluorescence microscope, and the chimera formation was determined using the fluorescence of EGFP as an index.
  • GFP-positive cells are obtained in individuals obtained from embryos, in all of brain, fibroblasts, blood (liver) and germ cells. Cells were observed at a constant rate. On the other hand, GFP positive cells were not observed in germ cells when using males of Prdm14 gene disrupting pluripotent cells and using females of Prdm14 gene disrupting pluripotent cells. From this, it became clear that Prdm14 gene disruption pluripotent cells do not contribute to either male or female germ cells.
  • Example 3 Chimera formation using Otx2 gene disruption pluripotent cells
  • pluripotent stem cells in which the Otx2 gene was disrupted were introduced into embryos.
  • the Otx2 locus of GFP-expressing mouse ES cells was extensively disrupted using CRISPR / CAS9. Specifically, a complex of crRNA and tracrRNA containing gRNA1 and gRNA2 sequences shown in FIG. 4 and CAS9 protein (all using Alt-R CRISPR-Cas9 system from Integrated DNA Technology) are introduced by electroporation, Among the cloned strains, a cell line in which extensive sequence defects occurred for both alleles from exon 3 to exon 4 was defined as 0 tx 2 ⁇ / ⁇ ES cell.
  • ES cells are established from embryos (B6 ⁇ BDF1) obtained by crossing B6 strain mice exhibiting black hair color and BDF1 strain mice, it is possible to synthesize melanin.
  • these cells were introduced into the embryo of a white gray normal mouse (ICR strain)
  • accumulation of melanin was observed in the retina although the transplanted cells were considered to be distributed throughout the body from the expression of GFP.
  • Bright field and whole-body GFP image in FIG. 5 Bright field and whole-body GFP image in FIG. 5. From this, it is considered that 0tx2 -/- ES cells had a high chimera contribution ability to the whole body, but 0tx2 -/- ES cells did not contribute to the forebrain-derived retinal pigment epithelium It became clear.
  • tissue sections of the forebrain area that will form the cerebrum in the future were prepared, and immunostaining was performed with an antibody (Abcam, ab18207) against the neuroepithelial cell marker b3tublin and an anti-GFP antibody (Abcam, Ab13970).
  • Abcam Ab18207
  • Ab13970 an anti-GFP antibody
  • Otx2 homo-knockout ES cells have lost the ability to differentiate into neuroepithelial cells in the forebrain region including cells that form the cerebral cortex in the future.
  • ES cells that are GFP-expressing Prdm14 knockout and Otx2 knockout were introduced into Pdx1 ⁇ / ⁇ knockout embryos to verify whether ES cell-derived pancreas could be formed.
  • the direct target of the Otx2 gene includes the Wnt antagonist Dkk1 and is known to regulate Wnt signaling (Kimura et al., Developmental Cell 2005), so it is possible for cells in which Otx2 has been knocked out. It was because it was unknown whether it could form an organ normally or an organ having a normal function. The results were as shown in FIG. As shown in FIG.
  • a pancreas (GFP-positive) derived from the transplanted ES cell is formed in a chimeric individual (# 11) of a Pdx1-/-knockout embryo and a GFP-expressing ES cell that is Prdm14 knockout and Otx2 knockout.
  • # 11 was 10 weeks old at the time of analysis supports that the transplant cell-derived pancreas has functioned for a long time after birth. In # 11 individuals, almost no GFP-positive cells were present in tissues other than the pancreas. It is considered that the reason is that the chimera forming ability of ES cells introduced into # 11 was weak.
  • FIG. 7 Prior to analysis of the laparotomy, the results of the glucose tolerance test for # 11 at age 8 weeks and its littermates (# 8, # 9) as a control are shown in FIG.
  • the glucose tolerance test 150 ⁇ g / ml of a glucose / saline solution was intraperitoneally injected with 10 ⁇ L per 1 g of mouse weight, and changes in blood glucose level over time were measured.
  • a Prdm14 knockout and an Otx2 knockout pancreas formed in the body of a Pdx1-/-knockout embryo has a normal hypoglycemic ability and functions. It was clear that it was a typical pancreas.
  • a # 11 mouse (female) was mated with a wild-type mouse to obtain an F1 individual.
  • the genotypes of all F1 individuals were Pdx1 +/ ⁇ . This means that all the cells that contributed to the germ cells had the Pdx ⁇ / ⁇ genotype, that is, ES cells (Pdx + / +), which are Prdm14 knockout and Otx2 knockout, became germ cells. Indicates that it did not contribute.
  • the LacZ gene etc. are inserted at the Pdx1 locus of the Pdx1 knockout mouse used here (Offield et al., Development 1996), a larger gene amplification band than the wild type (405 bp) is detected. Ru.
  • the contribution of the pluripotent stem cells to germ cells can be reduced or eliminated by preparing a somatic chimera animal using Prdm14 gene disruption pluripotent cells as embryo transfer cells.
  • the contribution of the pluripotent stem cells to the cerebral cortex can be reduced or eliminated by producing a somatic chimera animal using Otx2 gene disruption pluripotent cells as embryo transfer cells.
  • SEQ ID NO: 1 Prdm14 gene targeting sequence for gRNA (GAACCTCGCCCACCACCGAGG)
  • SEQ ID NO: 2 Prdm14 gene targeting sequence of gRNA (GTATGGAGCCATCGCTAGTC)
  • SEQ ID NO: 3 An example of the disrupted Prdm14 gene sequence (CTGCCCACCACCG GTCCGGAGCACCCAACCG)
  • SEQ ID NO: 4 An example of the disrupted Prdm14 gene sequence (CTCGCACCACCACCG CAGTATTAAAACATGGATGTA)
  • Sequence number 6 Otx2 gene targeting sequence (gTATGGAGCCATCGCTAGTC) of gRNA2
  • SEQ ID NO: 8 Rivers primer for amplification of Pdx1 wild type (TTCAT

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Abstract

本発明は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている多能性細胞を用いて体細胞キメラを作製する方法を提供する。本発明は、特に、多能性細胞が、体細胞キメラ動物において、脳や生殖腺に寄与することを防ぐ方法を提供する。

Description

分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用
　本発明は、分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用に関する。
　遺伝子改変動物は、遺伝子の生体内での機能を解析するために多用されており、外来遺伝子を導入するトランスジェニック動物、および、内在性遺伝子を破壊するノックアウト動物が知られている。
　遺伝子改変動物の作製は、野生型の動物胚に目的の遺伝子改変を有する多能性細胞を導入すること、または動物胚に直接目的の遺伝子改変を導入することにより行われる。目的の遺伝子改変を有する多能性細胞を導入した動物胚を偽妊娠仮親の子宮に移植して発生させると動物胚から発生する個体は、細胞の一部は野生型の細胞からなり、他の部分は遺伝子改変を有する細胞からなるというキメラ状態となる。
　非特許文献１は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスが生殖細胞を欠失することを開示する。Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスは、生殖細胞が欠失するので交配させることができない。
Yamaji, M. et al., Nature Genetics, 40(8):1016-1022, 2008
　本発明は、分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用を提供する。
　本発明者らは、本発明において分化ポテンシャルを改変した多能性細胞を動物胚に導入することにより、当該動物胚を成長させて得られる動物において、多能性細胞の体内分布を制御することを提案する。
　本発明者らは、例えば、遺伝子操作細胞（例えば、ノックアウト細胞、ノックダウン細胞やトランスジェニック細胞）を胚に導入することによって、当該細胞を標的組織への分化を抑制または喪失させるものである（標的組織以外の組織には遺伝子操作細胞自体の本来的に有するキメラ形成能に従って分化を許してもよい）。
　これにより、本発明者らは、例えば、標的組織は胚由来の細胞から本質的になるが、その他の組織は胚由来細胞と胚導入細胞由来細胞のキメラ状態である動物を創出させようとするものである。
　本発明は、このような思想に基づく発明である。すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）体細胞キメラ動物を作製する方法であって、
　多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ること
を含み、
　多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、
方法。
（２）体細胞キメラ動物を作製することに用いるための組成物であって、多能性細胞を含み、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、組成物。
（３）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、上記（１）に記載の方法。
（４）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、上記（２）に記載の組成物。
（５）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、上記（１）または（３）に記載の方法。
（６）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、上記（２）または（４）に記載の組成物。
（７）体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雌である、上記（３）または（５）に記載の方法。
（８）体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雄である、上記（３）または（５）に記載の方法。
（９）体細胞キメラ動物の製造における多能性細胞の使用であって、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、使用。
（１０）体細胞キメラ非ヒト動物であって、特定の種類の細胞は宿主動物由来の細胞からなる、動物。
（１１）生殖細胞が宿主動物由来の細胞からなる、上記（１０）に記載の体細胞キメラ非ヒト動物。
　本発明によれば、キメラ状態が制御された体細胞キメラ動物を作製する際に有用である。このような体細胞キメラ動物の作製は、導入細胞と宿主動物との情報ネットワークの解析に有利に用いることができる。
図１は、野生型または雄若しくは雌のＰｒｄｍ１４遺伝子ノックアウトＥＳ細胞を野生型胚に導入して得られた体細胞キメラ動物における、胚導入細胞のキメラ率を示す。 図２は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる破壊方法と破壊されたＰｒｄｍ１４遺伝子を示す。 図３Ａは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図３Ｂは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図３Ｃは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図３Ｄは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図４は、Otx2ノックアウトES細胞の作製法を示す。 図５は。Otx2ノックアウトであるES細胞を野生型胚に導入して得られた個体における、全体的な移植細胞の分布および脳の組織切片の免疫化学染色の結果を示す。 図６は、Prdm14ノックアウト（Prdm14-/-）かつOtx2ノックアウト（Otx2-/-）であるGFP発現ES細胞を、Pdx1-/-胚に導入して得られた個体（#11）の膵臓のGFPの発現を示す。 図７は、耐糖能試験により#11個体の膵臓が正常な機能を有することを示す。また、#11個体と野生型マウスとの交雑試験の結果得られた産仔のPdx1遺伝子の遺伝子型を示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「生殖細胞」とは、生殖細胞を形成する特異な細胞集団として始原生殖細胞から分化して生じる細胞種であって、始原生殖細胞から精子および卵などの配偶子が形成されるまでの分化過程で生じるすべての生殖細胞系列の細胞種を指す。
　本明細書では、「発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物」またはその胚とは、発生段階において自己の生殖細胞を生じない動物またはその胚を意味する。例えば、そのような動物としては、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的（cell-autonomous）な異常を有する動物が挙げられる。
　本明細書では、「分化ポテンシャル」とは、多能性細胞に対して用いられるとき、当該多能性細胞が胎児や成体に存在する各組織への分化の能力を意味する。
　本明細書では、「細胞自律的な異常」とは、細胞が有する異常が当該細胞に対する影響しか質的にまたは量的に実質的に有しないことを意味する。「細胞自律的な異常」は、好ましくは他の細胞に働きかける機構の異常ではない。「細胞自律的な異常」は、例えば、その異常を有する細胞にのみ影響が生じる異常であるから、正常な細胞を導入すると、その細胞は、当該宿主からは異常の影響を受けない。「細胞自律的な異常」としては、例えば、組織特異的な細胞死を誘発する改変、および、組織分化に必要でかつ細胞自律的な因子を欠損した改変が挙げられる。
　本明細書では、「動物」とは、哺乳動物および鳥類を意味する。動物としては、特に限定されないが、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類、ブタおよびウシなどの家畜動物、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ニワトリなどの鳥類、並びにサルなどの霊長類が挙げられる。本明細書では、動物は非ヒト動物である。
　本明細書では、「同種」とは、同種同系および同種異系を意味し、「異種」とは、動物分類学上の種が異なることを意味する。
　本明細書では、「体細胞キメラ動物」とは、ある個体の細胞と別の個体の細胞（例えば、同種異系の細胞、または１以上の遺伝子操作が加えられた同種同系細胞若しくは同種異系細胞）とが細胞レベルで混在した組織または臓器を有する動物を言う。本発明では、体細胞キメラ動物は、胚（例えば、桑実胚や胚盤胞）に複数個（例えば、１０個程度）の多能性細胞を導入することにより得ることができる。より具体的には、胚としては、８細胞期の胚から胚盤胞期の胚まで様々な胚を用いることができ、また、このような動物胚に多能性細胞を導入する方法は当業者に周知である。胚盤胞期の胚に細胞を導入する場合には、例えば、卵割腔に細胞を導入することができる。桑実胚期までの初期胚であれば、細胞を接触させることにより集合させてもよい。多能性細胞としては、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞が挙げられ、本発明において胚に導入することができる。胚に導入する多能性幹細胞の数も、適宜決定することができ、特に限定されないが例えば、胚に導入する場合には３個～１０個程度とすることができる。
　本明細書では、「宿主動物」とは、体細胞キメラ動物を作製する際に多能性細胞を導入する胚を意味する。
　本明細書では、「胚導入細胞」とは、体細胞キメラ動物を作製する際に胚に導入する細胞を意味する。
　本明細書では、「多能性細胞」（pluripotent cell）とは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、並びに、内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞を意味する。多能性細胞は、胎児または成体のあらゆる細胞に分化できることで知られる。
　本明細書では、「遺伝子操作」とは、遺伝子発現の改変および遺伝子改変を意味する。
　本明細書では、遺伝子発現の改変は、遺伝子発現の増強または減弱を生じる改変を意味する。遺伝子発現の増強は、内因性遺伝子を１以上の制御配列に作動可能に連結して細胞内で強く発現させることにより行われ得る。遺伝子発現の減弱は、内因性遺伝子に対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよびその核酸誘導体（例えば、架橋核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、異なる種類の核酸を含むハイブリッド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）、並びにｓｈＲＮＡおよびその核酸誘導体などのノックダウン技術により行われ得る。
　本明細書では、「遺伝子改変」とは、遺伝子が野生型と異なることを意味し、天然の改変および人工の改変が含まれる。遺伝子改変の代表的な例としては、トランスジェニックおよびノックアウトが挙げられる。
　本明細書では、「交配」とは、次世代を得るために生物の二個体間で受精を行って当該二個体を親とする産仔を得ることを意味する。交配としては、人工授精により交配すること、および生殖を目的として雄と雌とを対合させることが挙げられる。
　本発明によれば、体細胞キメラ動物の作製において、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞を胚に導入することを含む、方法が提供される。
　本発明のある態様では、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞としては、例えば、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が挙げられる。これにより、本発明では、当該特定の種類の細胞は、胚由来の細胞から本質的になり、それ以外の細胞は、胚導入細胞のキメラ形成能に応じて胚由来の細胞と胚導入細胞由来の細胞とからなる体細胞キメラ動物およびその作製方法が提供されることとなる。
　本発明のある態様では、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞としては、好ましくは細胞自律的な異常（cell autonomous defect）を有し得る。例えば、特定の種類の細胞に分化する際に誘導される遺伝子のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を有する多能性細胞は、特定種類の細胞に分化しようとすると自律的に死滅するため、細胞自律的な異常を有し、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞として用いることができる。
　本発明のある態様では、細胞自律的な細胞死を誘導することもできる。細胞死の誘導は、例えば、薬剤誘導性遺伝子発現システム（例えば、テトラサイクリン応答性発現誘導システム）と組み合わせることで、Ｃａｓｐａｓｅ－８、Ｃａｓｐａｓｅ－９、Ｂａｒｎａｓｅ、およびジフテリアトキシンなどの細胞障害性遺伝子を、胎内の薬物（例えば、ドキシサイクリン）濃度依存的に特定細胞（例えば、生殖細胞）で発現させることによって達成され得る。以下、細胞特異的に細胞傷害性を発生させる方法の例を図３Ａ～Ｄを参照して説明する。
　図３Ａは、細胞特異的プロモーターと薬剤誘導性遺伝子発現システムと組み合わせて細胞特異的に薬物濃度依存的な細胞死を誘導する系において、薬剤誘導性遺伝子発現システムがＴｅｔ－Ｏｎシステムである系を例示する。図３Ａでは、細胞特異的プロモーターに作動可能にリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が連結されている。この系が組込まれた胎児は、細胞特異的にｒｔＴＡを発現している。ここで、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのテトラサイクリン系化合物により、ｒｔＴＡが発現する細胞でのみ、細胞傷害性遺伝子が誘導され、細胞特異的に細胞死を誘発させることができる。
　同じ目的の他の方法としては、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰなどの遺伝子組換えシステムによって細胞特異的に細胞障害性遺伝子を発現させる方法が挙げられる。図３Ｂは、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰなどの組織特異的遺伝子組換えシステムを用いて細胞特異的に細胞死を誘導する系を例示する。図３Ｂでは、構成的活性化型プロモーターの下流に、生理学的に意味の無い遺伝子（ダミー遺伝子）と細胞傷害性遺伝子とを連結させている。この状態では、細胞が細胞死を誘発することがない。しかし、上記においてダミー遺伝子の上流と下流にＬｏｘＰ配列を配置されている。また、この細胞は、細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅを有する。この系では、細胞が特定細胞に分化すると、細胞特異的プロモーターにより駆動されるＣｒｅが細胞特異的に発現し、ＬｏｘＰ配列に作用してダミー遺伝子を除去し、これにより、構成的活性化型プロモーターに作動可能に細胞傷害性遺伝子を連結し、細胞特異的に細胞傷害性遺伝子を発現させ、結果として細胞特異的に細胞を誘発することができる。この系において、Ｃｒｅリコンビナーゼに代えて、４－水酸化タモキシフェンにより活性化されるＣｒｅＥＲを用いてもよいであろう。ＣｒｅＥＲは、Ｃｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体のリガンド結合領域の変異体との融合タンパク質として知られ、４－水酸化タモキシフェンにより活性化される。
　同じ目的のさらに他の方法としては、細胞特異的に細胞障害性シグナルのレセプターを発現させたのちに任意のタイミングでリガンドを作用させて細胞特異的に細胞死を誘導する方法が挙げられる。この場合、細胞傷害性シグナルのレセプターを発現しない細胞は、リガンドに非感受性であることが好ましい。図３Ｃは、細胞特異的プロモーターに作動可能に細胞傷害性シグナルレセプターを連結した系を細胞に組込んでいる。細胞が特定細胞に分化すると、細胞表面に細胞傷害性シグナルレセプターが発現し、リガンド依存的に細胞死が誘発される。細胞傷害性シグナルレセプターとそのリガンドの例としては、ジフテリアトキシンレセプターとジフテリアトキシンが挙げられる。
　同じ目的のさらに他の方法としては、化合物誘導性細胞障害システムが例示できる。他化合物誘導性細胞傷害システムの例としては、HSV-TK/GCVシステム(Moolten FL et al., Hum. Gene Ther. 1990; 1: 125-134) を用いる系や、inducible caspase-9 (Straathof KC et al., Blood 2005; 105: 4247-4254)を用いる系が挙げられる。
図３Ｄは、HSV-TK/GCVシステムを例示する。具体的には、ガンシクロビル（ＧＣＶ）は、非リン酸化形態では細胞傷害性が弱い。しかしながら、ヘルペスウイルス属が有するチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ＴＫ）を作用させると、ＧＣＶはリン酸化され、ＧＣＶ三リン酸に変換され、細胞傷害性を獲得する。従って、ＨＳＶ－ＴＫを細胞特異的プロモーターに作動可能に連結し、ＨＳＶ－ＴＫを細胞特異的に発現させることにより、細胞特異的に細胞死を誘発できる。また、inducible caspase-9は、caspase-9において、ＣＡＲＤがＦＫＢＰ１２により置き換えられたタンパク質であり、ＡＰ１９０３などのタクロリムス誘導体存在下でのみ二量体化することができ、活性化して細胞に細胞死を誘発させることができる。inducible caspase-9を細胞特異的プロモーターに作動可能に連結した系を導入した細胞が特定細胞に分化すると、タクロリムス誘導体により細胞特異的に細胞死が誘発される。
　本発明においては、これらの方法をさらに組み合わせて用いてもよい。当業者であれば、本明細書の内容および技術常識に基づいて細胞特異的な細胞死の誘導を実現することができるであろう。
　本発明のある態様では、例えば、細胞自律的な異常は、生殖細胞において発生させうる。例えば、生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子、例えば、Ｐｒｄｍ１４、Ｎａｎｏｓ２、Ｎａｎｏｓ３、ＤＤＸ４、およびＳｏｘ１７などのエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を有する多能性細胞は、生殖細胞に分化しようとすると自律的に死滅するため、体細胞キメラ動物において生殖細胞には寄与しない。本発明のある態様では、生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子は、例えば、生殖細胞に一時期または長期に特異的に発現する遺伝子とすることができる。
　本発明のある態様では、例えば、多能性細胞の大脳皮質への寄与を制限することができる。例えば、前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２、のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を有する多能性細胞は、前脳に規定された細胞が死滅するため、体細胞キメラ動物において大脳皮質には寄与しない。本発明のある態様では、前脳特異的な発現を示す遺伝子は、例えば、前脳領域に一時期または長期に特異的に発現する遺伝子とすることができる。このようにすることで、胚導入細胞が脳に寄与することの不都合、例えば、脳の高次機能における障害の発生等を回避し得る。
　また、ある態様では、精子特異的に発現するＩｚｕｍｏ遺伝子を欠損させると精子は形成されるものの、形成された精子は受精する機能を有さないことが知られているが、このような遺伝子欠損を用いて配偶子を機能不全にしてもよい。
　また、ある態様では、Ｉｚｕｍｏのような精子特異的なプロモーター／エンハンサーに細胞傷害性遺伝子を組みあわせ、配偶子を除去してもよい。同様に、配偶子に特異的に発現する遺伝子、例えば精子に特異的に発現する遺伝子であるＴｐａｐ、Ａｃｒｏｓｉｎ、Ｔｒａ９８、卵に特異的に発現する遺伝子であるＧｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ３などのプロモーター／エンハンサーに細胞障害遺伝子を組み合わせることで、配偶子形成過程において配偶子を除去することもできる。
　さらに別のある態様では、生殖細胞特異的に起る現象である減数分裂に関わる遺伝子、例えばＤａｚｌ、Ｓｔｒａ８、Ｔａｆ７ｌ、またはＳｙｃｐ３などのプロモーター／エンハンサーを利用して、生殖細胞の形成を避けることもできる。
　また、本発明のある態様では、胚導入細胞としては、生殖細胞への分化に必須の遺伝子が破壊された細胞を用いることができる。
　Ｐｒｄｍ１４は、ＰＲドメイン含有タンパク質１４（PR domain-containing protein 14）をコードする遺伝子である。Ｐｒｄｍ１４は、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１４（RP domain zinc finger protein 14）とも呼ばれる。Ｐｒｄｍ１４タンパク質は、例えば、ＨＰＲＤ　ＩＤ：１１４５７で登録されたアミノ酸配列を有し、その遺伝子は、染色体上の８ｑ１３．３に位置することが知られている。また、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスでは、卵巣および精巣において生殖細胞が欠損することが知られている（Yamaji M. et al., Nature Genetics, 40: 1016-1022, 2008）。
　本発明のある態様では、Ｐｒｄｍ１４遺伝子をノックアウトまたはノックダウンして生殖細胞に分化できない多能性細胞を胚導入細胞として用いてもよい。本発明のある態様では、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトは、例えば、遺伝子の一部若しくは全部の欠損、またはフレームシフトの導入等により行うことができる。本発明のある態様では、ノックアウトされたＰｒｄｍ１４遺伝子は、配列番号３または配列番号４の配列を有する。
　このようにして、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞を胚導入細胞として胚に導入して体細胞キメラ動物を作製することによって、特定の種類の細胞以外は、胚導入細胞の固有のキメラ形成能に依存したキメラ状態となり、特定の種類の細胞は胚由来の細胞から本質的になる、体細胞キメラ動物を得ることができる。例えば、このようにして、本発明によれば、標的組織以外は、胚導入細胞の固有のキメラ形成能に依存したキメラ状態となり、標的組織は胚由来の細胞から本質的になる、体細胞キメラ動物を得ることもまたできる。
　本発明によれば、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、Ｐｒｄｍ１４ノックアウトかつＯｔｘ２ノックアウトである多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を用い得る。このように、本発明は、脳および生殖腺に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞を、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用いる発明を提供する。
　興味深いことに、生体では、胚導入細胞と宿主細胞とは、一方が分化し得ない組織に対しては他方が補完することができる高い柔軟性を有していることが後述する実施例から明らかとなっている。すなわち、胚導入細胞が分化しない細胞は、宿主胚の細胞が補完することかでき、結果として、胚導入細胞が分化できる細胞は、胚導入細胞と宿主胚の細胞のキメラ状態を形成し、胚導入細胞が分化しない細胞は、宿主胚由来の細胞からなることとなり、胚導入細胞の分化欠陥は宿主胚細胞により補われるため体細胞キメラ動物においては異常としては表れない。
　また、臓器欠損動物の胚盤胞補完では、欠損臓器が胚導入細胞からなる臓器により補完されることが実証されている（例えば、引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/087459）。
　従って、ある態様では、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、Ｐｒｄｍ１４ノックアウトかつＯｔｘ２ノックアウトである多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を用い得、かつ、胚としては、Pdx1-/-ノックアウト胚、またはPdx1-Hes1トランスジェニック胚を用いることができる。ある態様では、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、Ｐｒｄｍ１４ノックアウトかつＯｔｘ２ノックアウトである多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を用い得、かつ、胚としては、Sal1ノックアウト胚を用いることができる。
　本発明によれば、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、脳および生殖腺のいずれにも分化しないように遺伝子操作された多能性細胞を用いることができる。脳および生殖腺のいずれにも分化しないように遺伝子操作された多能性細胞は、上記の脳に分化させないための遺伝子操作と、生殖腺に分化させないための遺伝子操作によって作製され得る。
　例えば、
　生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子、例えば、Ｐｒｄｍ１４、Ｎａｎｏｓ２、Ｎａｎｏｓ３、ＤＤＸ４、およびＳｏｘ１７などのエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と、
　前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
　また、例えば、
　配偶子に特異的に発現する遺伝子、例えば精子に特異的に発現する遺伝子である、Ｉｚｕｍｏ、Ｔｐａｐ、Ａｃｒｏｓｉｎ、もしくはＴｒａ９８、または、卵に特異的に発現する遺伝子であるＧｄｆ９、Ｚｐ１、もしくはＺｐ３などのプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
　前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２、のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
　また、例えば、
　生殖細胞特異的に起る現象である減数分裂に関わる遺伝子、例えばＤａｚｌ、Ｓｔｒａ８、Ｔａｆ７ｌ、またはＳｙｃｐ３などのプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と、
　前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２、のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
　このようにすることで、得られる個体中の特定種類の細胞のみを胚導入細胞由来とすることもできるし、得られる個体中の特定種類の細胞のみを宿主胚細胞由来とすることもできる。従って、本発明は、特定組織のみを遺伝子操作細胞からなるものとすること、特定組織のみを野生型細胞からなるものとすること、またはキメラ状態にすることを自在に制御する技術、およびこれらを相互に比較して特定組織における操作遺伝子の機能を解析する技術を提供する。そうすると、本発明により、体細胞キメラ動物のキメラ状態制御技術は、これまでのキメラ状態制御技術に新しい選択肢を与えるものでもある。
　従って、本発明のある態様では、体細胞キメラ動物を作製する方法であって、多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ることを含み、多能性細胞は、特定種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されており、胚は、多能性細胞とは別の特定種類の細胞を欠損するように遺伝子操作されている、方法が提供される。このような胚の遺伝子操作としては、Pdx1遺伝子のノックアウト、またはPdx1-Hes1トランスジェニックによる膵臓の欠損、および、Sal1遺伝子のノックアウトによる腎臓の欠損等が挙げられる。
　本発明のある態様では、胚において特定種類の細胞を欠損する遺伝子操作としては、特定種類の細胞に特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞障害性遺伝子を搭載させることが挙げられる。いくつかの態様では、特定細胞または組織が欠損するとしられている遺伝子改変（例えば、ノックアウトまたはトランスジェニック）によって、胚を遺伝子操作してもよい。従って、本発明のある態様では、胚は、特定種類の細胞に特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞障害性遺伝子を有するか、または、特定細胞または組織が欠損するように遺伝子が改変されていてもよい。
　本発明のある態様では、細胞を導入する胚としては、脊椎動物由来の胚、例えば、非ヒト哺乳動物由来の胚、例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットおよびボノボなどの非ヒト霊長類由来の胚；ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびイヌなどの非ヒト哺乳動物由来の胚（例えば、食肉類、偶蹄類、奇蹄類およびげっ歯類の胚）；並びに、ニワトリなどの鳥類の胚が挙げられる。
　本発明のある態様では、胚導入細胞としては、特に限定されないが、ヒトおよびサルなどの霊長類の多能性細胞、並びに、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳類の多能性細胞などを挙げることができる。本発明のある態様では、胚導入細胞は、ヒト多能性細胞である（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）。
　本発明では、胚と、胚に導入される細胞の種は、同種の関係であってもよいし、異種の関係であってもよい（例えば、引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/087459）。本発明では、胚と胚導入細胞の種の組み合わせとしては、マウスとラットとの組み合わせが挙げられ、マウスとラット間では胚盤胞補完によるキメラ動物の作製にも成功している（引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/021390およびWO2010/087459）。マウス－ラット間の遺伝的な距離は、ヒト－ブタ間の遺伝的距離に相当する。従って、マウス－ラット間での異種間キメラ動物の作製が成功するということは、それよりも遺伝的な距離の近い種間であれば十分に異種間キメラ動物を作製することができることを意味する。WO2014119627では、ヒトとマウス間、またはマーモセットとマウス間で体細胞キメラ動物が得られている。従って、仮にげっ歯類と霊長類との組合せであったとしてもキメラ動物を形成させることは可能である。そして、げっ歯類と霊長類との相違と比べて小さな相違を有すると考えられる種間では異種間でキメラ動物を作製することができる。これらのことから、本発明で用いられ得る胚と胚導入細胞の異種間の組み合わせとしては、マウス－ラット以外では、例えば、非ヒト哺乳動物同士の組み合わせ、鳥類同士の組み合わせ、ヒトと非ヒト霊長類動物との組み合わせ、ヒトとニワトリの組み合わせ、ヒトとブタとの組み合わせ、ヒトとウシとの組み合わせ、ヒトとヤギとの組み合わせ、ヒトとヒツジとの組み合わせ、非ヒト霊長類動物同士の組み合わせ、非ヒト霊長類動物とブタ、ウシまたはヒツジとの組み合わせ、ウシとブタ、ヒツジ、ヤギ若しくはウマとの組み合わせ、または、ブタとヒツジ、ヤギ若しくはウマとの組み合わせなどを挙げることができる。また、ヒトと、食肉類、偶蹄類または奇蹄類のいずれかに属する動物との組み合わせとしてもよいし、同じ属、類または科に属する動物同士の組み合わせとしてもよいであろう。マウスとラットは染色体数が異なるが、マウス－ラット間ではキメラ動物の作製が可能であることから、染色体数が異なっていたとしても、キメラ動物の作製の可能性が否定されるものではない。
　多能性細胞のキメラ形成能は、細胞毎に異なると考えられる（例えば、図１の「野生型」パネル参照）。従って、特定の種類の細胞以外では、所望のキメラ状態が得られる多能性細胞を選択して用いることができる。キメラ状態は、多能性細胞のキメラ形成能に依存し、キメラ形成能が高い場合には多能性細胞由来の細胞の割合が増え、キメラ形成能が弱い場合には、多能性細胞由来の細胞の割合が減る。キメラ形成能は、胚導入細胞および／または胚を標識し、体細胞キメラ動物を作製して、得られた体細胞キメラ動物中の標識を有する細胞の割合を指標として決定することができる。
　従って、本発明は、ある態様では、所望のキメラ形成能を有する多能性細胞を選択することと、得られた多能性幹細胞の分化ポテンシャルを改変することとを含んでいてもよい。キメラ形成能の指標としては、キメラ形成能の強さ、または組織毎のキメラ形成能の強弱のバランスが挙げられ、これらを指標として所望のキメラ形成能を有する多能性細胞を選択すればよい。
　体細胞キメラ動物は、胚に胚導入細胞を導入した後は、偽妊娠の雌仮親の子宮に着床させ、胎児に成長させることができる。体細胞キメラ動物は、胎児として、産仔として、または成体として得てもよい。
　本発明によれば、生殖細胞に分化しないように遺伝子操作されている多能性細胞を胚に導入すると、生殖細胞は宿主側の細胞から本質的になることとなる。すると、宿主動物と胚導入細胞との遺伝子型が異なる場合には、得られる体細胞キメラ動物の生殖細胞が宿主動物の遺伝子型を有することとなり、体細胞キメラ動物を交配させて得られる胎児または産仔は、宿主動物の遺伝子型を有することとなる。このようにすると、体細胞キメラ動物を交配させて得られる胎児または産仔の遺伝子型を宿主動物の遺伝子型と一致させることができる（または、少なくともその確率が高まる）点で有利である。
実施例１：Ｐｒｄｍ１４遺伝子ノックアウト多能性細胞の作製
　本実施例では、Ｐｒｄｍ１４遺伝子を破壊したノックアウト多能性細胞を作製した。
　キメラ率の測定のため、多能性細胞としてはＥＧＦＰを発現させた胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた。多能性細胞は、雄と雌の細胞をそれぞれ用意した。具体的には、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの雄とＣ５７ＢＬ６／Ｎ（すべて日本ＳＬＣから購入）の雌を交配させ得られた雄および雌の胚からそれぞれ雄性ES細胞株（SGE2）と雌性ES細胞株（SGE-F13）を樹立した。本実施例では、これらのＥＳ細胞を野生型ＥＳ細胞と呼ぶこととする。
　次に、野生型ＥＳ細胞からＰｒｄｍ１４遺伝子を破壊したＥＳ細胞を作製した。具体的には、雄のＰｒｄｍ１４遺伝子を破壊したＥＳ細胞（Prdm14-/- ESC-M）は、Prdm14 gRNAを組込んだgRNA cloningベクター（Addgene, Plasmid #41824）をCas9発現ベクター（Addgene, Plasmid #41815）と共にＳＧＥ２細胞にトランスフェクションして作製した。雌のＰｒｄｍ１４遺伝子を破壊したＥＳ細胞（Prdm14-/- ESC-F）は、SGE2細胞を用いる代わりにＳＧＥ－Ｆ１３細胞を用いる以外はPrdm14-/- ESC-Mと同様に作製した。
実施例２：キメラマウスの作製
　本実施例では、実施例1で作製したPrdm14遺伝子破壊多能性細胞と野生型多能性細胞とをそれぞれ用いてキメラマウスを作製した。
　ICRマウス(日本SLCより購入)を交配し、2.5日目に胚（桑実胚）を採取した。顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて１個の胚に対して10細胞の割合で、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞の雄若しくは雌または野生型多能性細胞を胚の腔へ注入した。その後、KSOM-AA（Millipore）で１日培養し胚盤胞にした受精卵を交配後２．５日目の偽妊娠ＩＣＲ系統マウスの子宮へと移植し、移植後１２日目（胎齢１４．５日目）に帝王切開し胎仔を取り出した。得られた胎仔を蛍光顕微鏡下で観察し、EGFPの蛍光を指標としてキメラ形成の判定を行った。
　蛍光が確認された個体（n=4）について、臓器別にキメラ率の測定を行った。具体的には、蛍光が確認されたＥ１４．５のキメラマウスそれぞれについて、表皮（ＭＥＦ）、肝臓、脳および生殖堤を回収した。ＭＥＦ、生殖堤、および脳はハサミで細切後０．０２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（invitrogen）で１０分間、３７℃で処理して細胞懸濁液とした。肝臓はピペッティングにより崩し細胞懸濁液とした。
　肝臓の懸濁液にマウスＣＤ４５－ＡＰＣ（ｅＢｉｏ）を０．５μｌ加え、生殖堤の細胞懸濁液にＳＳＥＡ１－ＡＰＣ（ｅＢｉｏ）抗体を０．５μｌ加え、遮光した氷上で３０分間静置した。肝臓、ＭＥＦ、生殖堤、および脳それぞれをリン酸緩衝食塩水（ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ；ＳＭ）で洗浄後、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含んだリン酸緩衝食塩水で再懸濁し、FACSAria II（BD Biosciences）と解析ソフトウェアFlow-joを使用し解析した。キメラ率は、全細胞に対するGFP陽性細胞の割合により測定した。結果は図１に示される通りであった。
　図１に示されるように、野生型多能性細胞を胚に導入した場合には、胚から得られる個体では、脳、線維芽細胞、血液（肝臓）および生殖細胞のいずれにおいても、GFP陽性細胞が一定の割合で観察された。これに対して、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞の雄を用いた場合およびPrdm14遺伝子破壊多能性細胞の雌を用いた場合には、生殖細胞においてはGFP陽性細胞が観察されなかった。このことから、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞は雄の生殖細胞にも雌の生殖細胞にも寄与しないことが明らかとなった。
実施例３：Otx2遺伝子破壊多能性細胞を用いたキメラ形成
　本実施例では、Otx2遺伝子を破壊した多能性幹細胞を胚に導入した。
　GFPを発現するマウスES細胞のＯｔｘ２遺伝子座をＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いて広範囲に破壊した。具体的には図４に示すｇＲＮＡ１、およびｇＲＮＡ２配列をそれぞれ含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの複合体、ＣＡＳ９タンパク質（全てＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＡｌｔ－Ｒ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを利用）をエレクトロポレーションにより導入し、クローニングした株のうち、exon3からexon4にかけて広範囲の配列欠損が両アレルについて起こっている細胞株を０ｔｘ２-／-ES細胞とした。なお、ES細胞は黒毛色を呈するB6系統マウスとBDF1系統マウスの交配によって得られた胚(B6xBDF1)から樹立されているため、メラニンを合成できる。この細胞を白毛色である正常なマウス（ICR系統）の胚に導入したところ、GFPの発現から移植細胞は全身に分布していると考えられたにも関わらず、網膜にメラニンの蓄積が認められなかった（図５の明視野および全身GFP像）。このことから、０ｔｘ２-／-ES細胞は、全身への高いキメラ寄与能を有していたと考えられるが、前脳由来の網膜色素上皮には０ｔｘ２-／-ES細胞が寄与しなかったことが明らかとなった。また、将来大脳を形成する前脳領域の組織切片を作製し、神経上皮細胞のマーカーであるb3tublinに対する抗体（Abcam, ab18207）と抗GFP抗体（Abcam, Ab13970）で免疫染色を行った。その結果、図５に示されるように、GFPを発現する０ｔｘ２-／-ES細胞由来細胞はその他の組織には高い割合で存在するにも関わらず、前脳神経上皮（βIIIチューブリン陽性）には全く寄与が認められなかった。
　図５に示されるように、Otx2ホモノックアウトES細胞には将来的に大脳皮質を形成する細胞を含む前脳領域の神経上皮細胞に分化する能力が失われていることがわかった。
　次に、GFPを発現するPrdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるES細胞をPdx1-/-ノックアウト胚に導入して、ES細胞由来の膵臓が形成できるかを検証した。Ｏｔｘ２遺伝子の直接のターゲットにはWntアンタゴニストであるDkk1が含まれ、Wntシグナルを調節していることが知られている（Kimura et al., Developmental Cell 2005）ことから、Ｏｔｘ２がノックアウトされた細胞が正常に臓器形成できるか、また正常な機能を有する臓器となるかが不明だったためである。結果は、図６に示される通りであった。図６に示されるように、Pdx1-/-ノックアウト胚とPrdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるGFP発現ES細胞のキメラ個体（#11）において、移植したES細胞由来の膵臓（GFP陽性）が形成されていた。この膵臓の切片を作製し、抗GFP抗体（Abcam, Ab13970）と抗インスリン抗体（Abcam, Ab7842）を用いて免疫染色を行ったところ、インスリン産生細胞を含む組織標本上の全ての膵島が移植細胞由来であることが確認できた。＃１１は解析時点で生後１０週であったことから、移植細胞由来の膵臓が出生後に長期に渡って正常に機能していたことが裏付けられる。なお、＃１１の個体では、膵臓以外の組織においては、ほとんどGFP陽性の細胞が存在しなかった。＃１１に導入したES細胞のキメラ形成能が弱かったことがその理由であると考えられる。
　開腹しての解析に先立ち、生後８週の段階で＃１１および対照としてその同腹仔（＃８，＃９）について耐糖能試験を行った結果を図７に示す。耐糖能試験では150mg/mlのグルコース/生理食塩水溶液をマウスの体重１gあたり10μLを腹腔内注射し、時間経過に伴う血糖値の変化を測定した。耐糖能試験の結果、図７に示されるように、Pdx1-/-ノックアウト胚の体内で形成されたPrdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるES細胞由来の膵臓は、正常な血糖低下能を有し、機能的な膵臓であることが明らかであった。
　＃11のマウス（雌）を野生型のマウスと交配させてF1個体を得た。F1個体（n=8）においてPdx1の遺伝子型を決定した。その結果、図７に示されるように、いずれのF1個体の遺伝子型も、Pdx1+/-であった。このことは、生殖細胞に寄与した細胞は、全てPdx-/-の遺伝子型を有していたことを意味し、すなわち、Prdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるES細胞（Pdx+/+）が生殖細胞に寄与しなかったことを示す。なお、ここで用いたPdx1ノックアウトマウスのPdx1遺伝子座には、LacZ遺伝子等が挿入されている(Offield et al., Development 1996)ため、野生型(405bp)よりも大きな遺伝子増幅のバンドが検出される。
　このようにして、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞を胚導入細胞として用いて体細胞キメラ動物を作製することにより、当該多能性幹細胞の生殖細胞への寄与を低減させる、または消失させることができる。また、Ｏｔｘ２遺伝子破壊多能性細胞を胚導入細胞として用いて体細胞キメラ動物を作製することにより、当該多能性幹細胞の大脳皮質への寄与を低減させる、または消失させることができる。
配列表
配列番号１：gRNAのPrdm14遺伝子標的化配列（GAACCTCGCCACCACCGAGG）
配列番号２：gRNAのPrdm14遺伝子標的化配列（GTATGGAGCCATCGCTAGTC）
配列番号３：破壊されたPrdm14遺伝子配列の一例（CTCGCCACCACCG GTCCGGAGCACCCAACCG）
配列番号４：破壊されたPrdm14遺伝子配列の一例（CTCGCCACCACCG CAGTATTAAAACATGGATGTA）
配列番号５：gRNA1のOtx2遺伝子標的化配列（GAGTCTGACCACTTCGGGTA）
配列番号６：gRNA2のOtx2遺伝子標的化配列（GTATGGAGCCATCGCTAGTC）
配列番号７：Pdx1の増幅用フォワードプライマー(ATTGAGATGAGAACCGGCATG)
配列番号８：Pdx1野生型の増幅用リバーズプライマー（TTCATGCGACGGTTTTGGAAC）
配列番号９：Pdx1変異型の増幅用リバーズプライマー（TGTGAGCGAGTAACAACC）

Claims (11)

  1. 　体細胞キメラ動物を作製する方法であって、
    　多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ること
    を含み、
    　多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、
    方法。
  2. 　体細胞キメラ動物を作製することに用いるための組成物であって、多能性細胞を含み、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、組成物。
  3. 　特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. 　特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、請求項２に記載の組成物。
  5. 　特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、請求項１または３に記載の方法。
  6. 　特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、請求項２または４に記載の組成物。
  7. 　体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雌である、請求項３または５に記載の方法。
  8. 　体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雄である、請求項３または５に記載の方法。
  9. 　体細胞キメラ動物の製造における多能性細胞の使用であって、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、使用。
  10. 　体細胞キメラ非ヒト動物であって、特定の種類の細胞は宿主動物由来の細胞からなる、動物。
  11. 　生殖細胞が宿主動物由来の細胞からなる、請求項１０に記載の体細胞キメラ非ヒト動物。
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