WO2009104794A1 - 遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法 - Google Patents

遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法 Download PDF

Info

Publication number
WO2009104794A1
WO2009104794A1 PCT/JP2009/053232 JP2009053232W WO2009104794A1 WO 2009104794 A1 WO2009104794 A1 WO 2009104794A1 JP 2009053232 W JP2009053232 W JP 2009053232W WO 2009104794 A1 WO2009104794 A1 WO 2009104794A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
organ
gene
pluripotent stem
body part
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/053232
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
啓光 中内
小林　俊寛
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 東京大学 filed Critical 国立大学法人 東京大学
Priority to JP2009554423A priority Critical patent/JP5688788B2/ja
Priority to EP09712642A priority patent/EP2258166A4/en
Priority to US12/918,694 priority patent/US20110067125A1/en
Publication of WO2009104794A1 publication Critical patent/WO2009104794A1/ja
Priority to US16/363,152 priority patent/US20190282602A1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Definitions

  • the present invention relates to a breeding animal used for producing an organ derived from a desired cell in a living body and a production method thereof.
  • ES cells established from the inner cell mass of blastocyst stage fertilized eggs have pluripotency, are used for various cell differentiation studies, and differentiation control methods that induce differentiation into specific cell lineages in vitro Development of is a topic of regenerative medicine research.
  • the metanephros the adult mammalian kidney, develops from the middle mesoderm in the middle stage of embryonic development.
  • kidney development begins by the interaction of the two components of the metanephric mesenchymal cells and the ureteric bud epithelium.
  • Adult kidneys are completed by differentiation and the complex nephron structure centered on glomeruli and tubules. From the time of kidney development and the complexity of the process, it can be easily inferred that inducing the kidney from ES cells in vitro is a very laborious task and is considered impossible in practice. Yes.
  • the identification of somatic stem cells in organs such as the kidney is not yet definitive, and it has become clear that the contribution of bone marrow cells, which have been actively studied, to the process of repairing damaged kidneys is not so great. .
  • Patent Document 1 WO / 2008/102602
  • the method used here is only for one generation, and it is necessary to repeat complicated operations every time an organ is regenerated.
  • This invention makes it a subject to provide the technique of organ reproduction
  • the present invention provides a method for complementing defects in organs or body parts such as the pancreas and kidneys by injecting ES cells or induced pluripotent stem cells (iPS cells) into the generated blastocysts in the blastocyst complementation method.
  • ES cells or induced pluripotent stem cells iPS cells
  • transgenic animals supplemented with organs or body parts such as the pancreas and kidneys can also convey the phenotype to the next generation as a founder. It has been clarified that organ regeneration can be performed using such a founder, and the above problems have been solved.
  • pluripotent stem cells such as ES cells such as mice, iPS cells in knockout mice and transgenic animals (eg mice) characterized by defects in organs or body parts such as pancreas and kidney It was found that an offspring can be efficiently obtained as a founder by supplementing organs or body parts such as pancreas and kidneys.
  • KO mice become KO or heterozygous individuals with a probability of 1/2 according to the laws of Mendelian genetics for mating between KO and heterozygous mice that can convey their phenotype to the next generation as a founder As it should have been, I found out that it really was.
  • a conventional method for producing a transgenic (Tg) animal is to introduce a transgene that induces organ or kidney or other organ or body part defects into an egg cell, and then transplanted.
  • animals with a phenotype that lacks an organ die after birth if the organ is essential for survival.
  • pancreatic deficiency was compensated by injecting pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells into the generated blastocyst.
  • the present inventors have also found that a transgenic animal supplemented with a pancreas can transmit a phenotype to the next generation as a founder. Therefore, it became clear that organ regeneration can be performed using such a founder.
  • the organ can be applied with appropriate modifications based on successful cases.
  • the reason is as follows. If appropriate deficient animals exist, pluripotent stem cells such as ES cells or iPS cells labeled with fluorescence are used as shown in this specification, or labeled deficient animals are labeled. If pluripotent stem cells with no or other labeling are used and the same analysis method is applied, it is clear whether the constructed organ is derived from the host, ES cell, iPS cell, etc., and whether or not the organ can be constructed can be determined. This is because it is understood that the next generation animals can be reproduced with the same theory.
  • the present invention provides the following.
  • the present invention includes a defective causative gene encoding a defective cause of an organ or body part that cannot function or become difficult to survive, and the organ or body part is a blastocyst Provide animals that are complemented by Blastocyst Complementation.
  • the complemented organ or body part is labeled.
  • the method of producing an animal of the present invention comprises: A) a step of providing a first pluripotent stem cell having the defect-causing gene; B) growing the first pluripotent stem cell into a blastocyst; C) A step of producing a chimeric blastocyst by introducing into the blastocyst a second pluripotent stem cell having the ability to complement the defect caused by the defect-causing gene; D) A step of producing an individual from the chimeric blastocyst and selecting the organ or the body part thereof complemented by the second pluripotent stem cell is included.
  • the first pluripotent stem cell is an inner cell mass (ICM), a fertilized egg or an embryo.
  • ICM inner cell mass
  • the gene is a foreign gene
  • the step A) includes introducing the foreign gene into the first pluripotent stem cell.
  • the second pluripotent stem cell is an egg cell, an ES cell or an iPS cell.
  • the step D) includes returning the chimeric blastocyst to a temporary parent and provisional pregnancy to produce the individual.
  • the selection is accomplished by identifying an identifier derived from the second pluripotent stem cell.
  • the second pluripotent stem cell is labeled, and the selection includes identifying the label.
  • the present invention provides a method for producing a target organ or body part comprising: A) A step of providing the animal according to claim 1, wherein the deficient causative gene encodes a deficient cause of the target organ or body part; B) obtaining an egg from the animal and growing the egg into a blastocyst; C) introducing into the blastocyst a target pluripotent stem cell having a desired genome having the ability to complement a defect caused by the defect-causing gene to produce a chimeric blastocyst; and D) the chimera
  • a method comprising producing an individual from a blastocyst and obtaining the target organ or body part from the individual.
  • the step D) comprises generating the chimeric blastocyst in the maternal womb of the non-human host mammal to obtain a litter, and obtaining the target organ from the litter individual.
  • the target pluripotent stem cell is an ES cell or an iPS cell.
  • the target pluripotent stem cell is derived from a mouse.
  • the target organ or body part is a pancreas or a kidney.
  • the animal is a mouse.
  • the mouse is a Pdx-1 knockout mouse, a Pdx1-Hes1 transgenic mouse, a Sall1 knockout mouse, or the like.
  • the target organ or body part is completely derived from the target pluripotent stem cell.
  • the present invention includes a gene encoding a cause of a defect in an organ or body part that becomes non-viable or difficult to function when functioning, and the organ or body part is complemented Complementary uses for the manufacture of the organ or body part of an animal are provided.
  • a set for producing an organ or body part of interest wherein the set encodes a cause of a defect in an organ or body part that A) cannot function or is difficult to survive
  • a set comprising an animal comprising a gene and wherein the organ or body part is complemented by complement, and B) cells of the same type as the organ or body part of interest.
  • the present invention provides a pluripotent stem cell for producing the animal of the present invention, and a gene encoding a cause of a defective organ or body part that cannot function or become difficult to function when functioning Or a combination of a pluripotent stem cell having a gene encoding a cause of a defect in an organ or body part and a cell that does not have the gene, which is difficult to survive or difficult to function when functioning Of use.
  • the present invention provides an organ regeneration technique suitable for industrial use.
  • founder animal production technology enables efficient production of genetically modified (knockout or transgenic) animals that were difficult to maintain by conventional methods. Furthermore, by using the founder animal thus produced, manipulation (research aimed at organ regeneration) using genetically modified embryos or newborns can be performed more efficiently.
  • manipulation search aimed at organ regeneration
  • transgenic animals the analysis of animals with the same gene insertion position and copy number when a lethal phenotype appears in the first generation after gene transfer, despite the time and effort required for production. There was a drawback that it could only be done once. However, by applying this method, it is possible to survive the first generation, which should be lethal, and to propagate the same phenotype to the next generation. Can be done with completely clonal colonies. This made it possible to conduct experiments for analysis using the founder mouse. This can be said to be a technique that was completely impossible with the prior art.
  • a scheme of the birth of a knockout (KO) mouse in which the pancreas is supplemented by Blastocyst Complementation is shown.
  • the results of Genotyping indicate that knockout mice supplemented with pancreas were found to grow normally into adults.
  • the upper panel shows genotypic analysis using host-derived cells in peripheral blood. The results are shown in the lower left. The percentage of mice revealed by this method is shown, and in this data, 4 out of a total of 22 KO individuals could be founders. Shown on the right is the chimera rate for each individual. Analysis was performed by showing the percentage of GFP (+) cells in the peripheral blood. It shows that ES cell-derived pancreas expresses pancreatic function markers in vivo (analyzed in the neonatal period).
  • pancreatic function marker, GFP, and merged figure are shown from the top. From the left, the exocrine tissue marker ⁇ -amylase, the endocrine tissue markers insulin, glucagon, and somatostatin are shown, and the pancreatic duct marker DBA lectin is shown on the right. It shows that mice supplemented with pancreas can also regulate blood glucose levels normally. On the left, the blood glucose level in a steady state is shown. On the right, the blood glucose level after the glucose tolerance test is shown. Blood glucose levels were measured 15, 30, 60, and 120 minutes after glucose loading. This shows that knockout mice whose pancreas is supplemented with ES cells can transmit the phenotype to the next generation as a founder.
  • FIG. 2 shows pancreas regeneration by Blastocyst Complementation of Pdx1-Hes1 transgenic.
  • the upper panel shows the structure of the introduced vector.
  • the right side of the panel shows how to identify it.
  • transgenic mice supplemented with pancreas are shown.
  • ES cell-derived pancreas can be made using Pdx1-Hes1 transgenic mice (the table on the lower left shows the results).
  • the strategy scheme for founder transgenic mouse production combining the transgenic production technology and Blastocyst Complementation is shown. Mating is carried out with a female mouse in which superovulation has been induced to obtain an egg cell, and gene introduction into the pronuclear stage egg (here, transgene (Pdx1-Hes1) to be introduced) is performed, and culture is performed in vitro. ES cells are injected into surviving eggs, and embryo transfer into the temporary parent uterus is performed. A founder mouse is generated by performing Genotyping of the offspring.
  • Transgenic mice supplemented with pancreas can transmit the phenotype to the next generation as a founder.
  • An attempt to produce a founder transgenic mouse is shown. From the left, the number of pronuclear-injected eggs, the number of surviving eggs, the number of blastocysts, the number of embryos injected with ES cells, the number of transplanted embryos, the number of surviving pups, the number of transgenic individuals, and the ratio as necessary are shown. Chimeras were judged by hair color. Since donor ES cells are derived from 129 strain mice (Agouti) and host embryos are derived from C57BL6xBDF1 (black), it is possible to determine whether or not they are chimeric if their hairs grow.
  • transgenic mice supplemented with pancreas can transmit their phenotype to the next generation as a founder.
  • the produced transgenic and chimeric individuals are crossed with the wild type.
  • the mouse # 37 functions as a founder.
  • the transgene for analysis of the offspring is confirmed, and the lower panel shows the actual photograph. It is considered that # 37 showed normality after birth because the pancreas was supplemented at the production stage.
  • a founder that can efficiently produce a mouse that dies in the embryonic period and immediately after birth such as an organ-deficient mouse.
  • the treatment model using the pancreas construction derived from iPS cell by blastocyst complementation is shown.
  • a. Shows a strategy for establishing GFP mouse-derived iPS cells. After establishment of GFP mouse tail-derived fibroblasts (Tail tip fibroblast: TTF), 3 factors (reprogramming factors) were introduced, cultured in ES cell medium for 25-30 days, picked up iPS colonies and An iPS cell line was established.
  • the left shows GFP-iPS cell # 2 and the right shows # 3.
  • c Shows the measurement of alkaline phosphatase activity. iPS cells were photographed under a fluorescence microscope and stained with an alkaline phosphatase staining kit (Vector Cat. No. SK-5200). From the left, a bright-field image, a GFP fluorescence image, and alkaline phosphatase staining are shown.
  • d Indicates the identification of three introduced factors (reprogramming factors) by PCR using genomic DNA. It is the result of extracting genomic DNA from iPS cells and performing PCR. From the top, the expression of Klf4, Sox2, Oct3 / 4, c-Myc and Myog genes is shown.
  • FIG. 11A shows the morphology of the pancreas constructed by blastocyst complementation (5 days after birth).
  • FIG. 11B shows the histological analysis of the iPS cell-derived pancreas (5 days after birth).
  • frozen sections of pancreas derived from iPS cells were prepared, stained with DAPI, anti-GFP antibody, and anti-insulin antibody as nuclear staining, and observed and photographed with an upright fluorescence microscope and a confocal laser microscope. From the left, a bright field image, an image of GFP + DAPI, and the right side are stained with an anti-insulin antibody.
  • the upper panel shows the GFP-iPS cells introduced into the Pdx1 LacZ / LacZ of the present invention
  • the lower panel shows the GFP-iPS cells introduced into the control Pdx1 wt / LacZ . It shows that knockout mice whose pancreas is supplemented with iPS cells can transmit the phenotype to the next generation as a founder. As shown in the upper left, it was mated with wt / Pdx1-LacZ individuals. An analysis of the offspring and analysis of the Pdx1 allele are shown on the right.
  • FIG. 6 shows kidney regeneration by Blastocyst Complementation in a Sall1 knockout mouse. The genotyping results for the Sall1 allele are shown above.
  • the # 3 mouse was a Sall1 homo KO mouse.
  • the morphology of the kidney regenerated by blastocyst complementation with iPS cells using # 3 mouse as a host is shown (1 day after birth). It can be seen that in the homozygous KO mouse, the entire kidney is neatly composed of GFP positive cells. It became clear that it was possible to make iPS cell-derived kidneys using Sall1 knockout mice.
  • founder organism or founder animal refers to an organism or animal that can survive while maintaining a desired trait (particularly, a defect in an organ or the like) after the next generation.
  • being unable to survive or difficult to function means that if the factor functions, the host animal cannot die at all or can survive However, it means that subsequent survival is substantially impossible due to difficulty in growth or reproductive difficulty, and it can be understood using ordinary knowledge in the field.
  • an organ or body part that cannot function or become difficult to function when referring to a factor, causes the organ or body part to be deficient or dysfunctional (for example, If it is not normal, it means that it cannot survive or it is difficult to survive.
  • a foreign gene when the gene is introduced into an organism and the gene is normally expressed, it means that a defect occurs in a certain organ or body part, resulting in inability to survive or difficulty in survival. Difficulty includes not being able to leave offspring in the next generation.
  • the organ or body part include, but are not limited to, pancreas and kidney.
  • a gene that causes a defect in an organ or body part that cannot survive or difficult to function (deletion cause gene) or “deletion cause gene” is used interchangeably,
  • the factor or function of the factor eg, introduced and expressed in the case of a foreign gene, or exposed to conditions under which such a gene would function if endogenous
  • a gene that cannot survive or is difficult to survive if it becomes deficient or dysfunctional eg, not normal.
  • organ is used in the ordinary sense in the art, and generally refers to organs constituting the internal organs of animals.
  • the “body part” refers to any part of the body, and also includes those not generally called organs.
  • organs for example, in the case of the kidney, a complete kidney is generated when it has a normal gene, but if a gene is defective or abnormal, an organ like the kidney is formed, but part of it is abnormal or defective.
  • the part where such an abnormality or defect occurs is an example of this “body part”. Since gene deficiencies or abnormalities do not necessarily correspond to each organ, and some of them are often affected, it is better to consider the correspondence in the body part when considering the correspondence with genes. In some cases, such correspondences are also considered in this specification.
  • blastocyst complementation means that when a pluripotent stem cell such as ES cell or iPS cell having multipotency is injected into the lumen of a blastocyst stage fertilized egg, the producing individual is a chimeric mouse.
  • a technique for complementing a deficient organ or body part by using a phenomenon that forms the genus, and the basic technique of such a technique can be referred to Patent Document 1 and the like.
  • label refers to a factor used to identify a complemented organ from a host. Therefore, only the organ or the host may be labeled, or both may be labeled with another distinguishable item.
  • the “first pluripotent stem cell” refers to a pluripotent stem cell used as a source to be a founder animal host (also referred to herein as a host) or a cell mass derived therefrom, Preferably, a fertilized egg / embryo is used.
  • the “second pluripotent stem cell” refers to a pluripotent stem cell used for the purpose of producing an organ.
  • “having the ability to complement defects” refers to the ability to supplement an organ or body part when referring to factors or genes.
  • chimeric blastocyst refers to a blastocyst formed in a chimera state between a cell derived from the first pluripotent stem cell and a cell derived from the second pluripotent stem cell.
  • protein As used herein, “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic.
  • the amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid.
  • the term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is included.
  • amino acid may be natural or non-natural as long as the object of the present invention is satisfied.
  • nucleic acid is also used interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide.
  • Particular nucleic acid sequences also include “splice variants”.
  • a particular protein encoded by a nucleic acid implicitly encompasses any protein encoded by a splice variant of that nucleic acid.
  • a “splice variant” is the product of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (another) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The production mechanism of splice variants varies, but includes exon alternative splicing.
  • polypeptides derived from the same nucleic acid by read-through transcription are also encompassed by this definition. Any product of a splicing reaction (including recombinant forms of splice products) is included in this definition. Alternatively, allelic variants fall within this range.
  • polynucleotide As used herein, “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a nucleotide polymer of any length. The term also includes “oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives”. “Oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives” refer to oligonucleotides or polynucleotides that include derivatives of nucleotides or that have unusual linkages between nucleotides, and are used interchangeably.
  • oligonucleotide examples include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotide, an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide.
  • oligonucleotide derivatives in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond uracil in oligonucleotide is C— Oligonucleotide derivatives substituted with 5-propynyluracil, oligonucleotide derivatives wherein uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, cytosine in the oligonucleotide is C-5 propynylcytosine Substituted oligonucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is substituted with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which the ribose in DNA is substituted with 2'-
  • a particular nucleic acid sequence can also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as explicitly indicated sequences. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine base. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98). (1994)).
  • nucleotide may be natural or non-natural as long as the desired function is maintained.
  • search refers to finding another nucleobase sequence having a specific function and / or property using a nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods.
  • Electronic search includes BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-). 2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:44). -453 (1970)), but is not limited thereto.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization, etc. It is not limited to.
  • the genes used in the present invention should include the corresponding genes identified by such electronic and biological searches. Intended.
  • nucleic acid sequence that hybridizes to a specific gene sequence can also be used as long as it has a function.
  • stringent conditions for hybridization means that a complementary strand of a nucleotide strand having similarity or homology to the target sequence preferentially hybridizes to the target sequence, and similarity or homology. It means a condition in which a complementary strand of a nucleotide chain having no sex does not substantially hybridize.
  • complementary strand of a certain nucleic acid sequence refers to a nucleic acid sequence (for example, T for A and C for G) that pair based on hydrogen bonding between the bases of the nucleic acid.
  • Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. T m is the temperature at which 50% of the nucleotides complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in equilibrium under a defined ionic strength, pH, and nucleic acid concentration. “Stringent conditions” are sequence-dependent and depend on various environmental parameters.
  • stringent conditions are such that the salt concentration is less than about 1.0 M Na + , and typically about 0.01 to 1.0 M Na + concentration at pH 7.0 to 8.3 ( Or other salts) and the temperature is at least about 30 ° C. for short nucleotides (eg, 10-50 nucleotides) and at least about 60 ° C. for long nucleotides (eg, longer than 50 nucleotides).
  • Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.
  • Stringent conditions herein include hybridization in a buffer solution of 50% formamide, 1M NaCl, 1% SDS (37 ° C.), and washing at 60 ° C. with 0.1 ⁇ SSC. It is done.
  • polynucleotide hybridizing under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art. Such a polynucleotide can be obtained by using colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method or the like using a polynucleotide selected from among the polynucleotides of the present invention as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA was immobilized, and then a 0.1 to 2-fold concentration was obtained. Means a polynucleotide that can be identified by washing the filter under the condition of 65 ° C.
  • hybridize refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions.
  • the hybridizable polynucleotide is a polynucleotide having at least 60% homology with the base sequence of DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention, preferably 80% Examples thereof include a polynucleotide having the above homology, a polynucleotide having a homology of 90% or more, and more preferably a polynucleotide having a homology of 95% or more.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by a generally recognized one letter code.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions.
  • the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous.
  • the comparison of similarity, identity, and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using default parameters using BLAST, which is a sequence analysis tool.
  • the identity search can be performed, for example, using NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12.).
  • the identity value usually refers to a value when the BLAST is used and aligned under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is set as the identity value. When identity is evaluated in a plurality of areas, the highest value among them is set as the identity value.
  • the “corresponding” gene refers to a gene having, or expected to have, the same action as that of a predetermined gene in a species as a reference for comparison in a certain species.
  • a gene corresponding to a gene eg, Sall1, Pdx-1
  • genes corresponding to human genes can be found in other animals (mouse, rat, pig, rabbit, guinea pig, cow, sheep, etc.). Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art.
  • the corresponding gene in an animal is the sequence of that animal (eg, mouse, rat, pig, rabbit, guinea pig, cow, sheep, etc.) using the sequence of the gene serving as the reference for the corresponding gene as a query sequence. It can be found by searching the database.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n ⁇ 1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). .
  • the length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose.
  • the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits obtain.
  • examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides.
  • Non-integer lengths may also be appropriate as a lower limit.
  • the lengths of polypeptides and polynucleotides can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above. However, the above numbers are not absolute and are limited as long as they have the same function. Alternatively, the above-mentioned number as the lower limit is intended to include a number above and below that number (or, for example, 10% above and below). In order to express such intention, in this specification, “about” may be added before the number. However, it should be understood herein that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of the value.
  • the length of a fragment useful herein can be determined by whether or not at least one of the functions of a full-length protein that serves as a reference for the fragment is retained.
  • the “variant” refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like.
  • An allele refers to genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant having an allelic relationship with a certain gene.
  • “Species homologue or homolog” means homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a certain species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology). The method for obtaining such species homologues will be apparent from the description herein.
  • amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides.
  • Amino acid substitution refers to substitution of one or more of the original peptide with, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids.
  • Addition of amino acid means adding one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids to the original peptide chain.
  • Deletion of amino acids refers to deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide.
  • Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like.
  • the amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method or a hybridization method.
  • substitution, addition and / or deletion of a polypeptide or polynucleotide refers to an amino acid or a substitute thereof, or a nucleotide or a substitute thereof, respectively, relative to the original polypeptide or polynucleotide.
  • Replacing, adding, or removing Such substitution, addition and / or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques.
  • the number of substitutions, additions or deletions may be any number, as long as it is one or more, and such numbers can be used for functions intended in variants having such substitutions, additions or deletions (eg, kidney defects, pancreas defects). Etc.) as long as it is retained. For example, such a number can be one or several, and preferably within 20%, within 15%, within 10%, within 5%, or less than 150, less than 100, less than 100, It can be 50 or less, 25 or less, and the like.
  • One aspect of the present invention includes a gene encoding a cause of a defect in an organ or body part that becomes non-viable or difficult to function, and the organ or body part comprises a blastocyst complement (Blastocyst) Complementation) relates to animals.
  • the next-generation animal is produced, so that the target organ is deficient, and an organ having a desired genomic type is produced for the organ. be able to. Moreover, since it has been found that organs can be produced in the next generation when produced by this method, the road to industrial application of the present invention has been greatly opened.
  • an organ or body part that does not survive or becomes difficult to function refers to a factor. Any device can be used as long as it cannot survive or becomes difficult to survive if it becomes insufficiency (for example, abnormal). For example, in the case of a foreign gene, when the gene is introduced into an organism and the gene is normally expressed, it means that a defect occurs in a certain organ or body part, resulting in inability to survive or difficulty in survival. Difficulty includes not being able to leave offspring in the next generation. Examples of the organ or body part include, but are not limited to, pancreas and kidney.
  • genes related to such an event include Pdx-1 (for the pancreas), Sall1 (for the kidney), and the like.
  • a gene that complements the organ and does not die after birth due to other factors should be selected.
  • An example of such a gene is Pdx-1.
  • the present invention can be carried out using a gene having such properties. For example, even if the phenotype is similar to pancreatic deficiency, the meaning differs greatly. Specifically, the knockout can improve the production efficiency, and the transgenic phenotype enables the clonal analysis of the lethal phenotype. There is a feature.
  • “being unable to survive or difficult to function” means that if the factor functions, the host animal cannot die at all or can survive However, it means that subsequent survival is substantially impossible due to difficulty in growth or reproductive difficulty, and it can be understood using ordinary knowledge in the field.
  • Such an example can be produced by introducing a gene having such a characteristic in addition to those having an organ having such a genetic characteristic.
  • organ is used in the ordinary sense in the art, and generally refers to organs constituting the internal organs of animals. As founder animals, organs that are not normally alive without the next generation, such as kidneys and pancreas, are envisaged, but it is understood that other founders fall within the scope of the present invention.
  • the “body part” refers to any part of the body, and also includes those not generally called organs.
  • organs for example, in the case of the kidney, a complete kidney is generated when it has a normal gene, but if a gene is defective or abnormal, an organ like the kidney is formed, but part of it is abnormal or defective.
  • the part where such an abnormality or defect occurs is an example of this “body part”. Since gene deficiencies or abnormalities do not necessarily correspond to each organ, and some of them are often affected, it is better to consider the correspondence in the body part when considering the correspondence with genes. In some cases, such correspondences are also considered in this specification.
  • the body part can include, but is not limited to, Langerhans Island, which is part of the pancreas, and glomerulus, which is part of the kidney.
  • blastocyst complementation means that when a pluripotent stem cell such as a multipotent ES cell is injected into the lumen of a blastocyst stage fertilized egg, the producing individual forms a chimeric mouse.
  • This is a technique for complementing a deficient organ or body part by utilizing a phenomenon.
  • the present inventors have proposed a plurality of types of blastocyst complementation, which has been considered difficult, such as kidney, pancreas, hair and thymus. It has been found that a mammalian organ having a complicated cell structure consisting of the above-mentioned cells can be produced in the living body of an animal, particularly a non-human animal (Patent Document 1). Can be used.
  • the “label” may be any factor as long as it is used to distinguish the complemented organ from the host. Therefore, only the organ or the host may be labeled, or both may be labeled with another distinguishable one.
  • a specific gene for example, a gene that expresses a fluorescent protein
  • the organ to be complemented by the property for example, fluorescence
  • the host can be similarly labeled, and cells corresponding to the complemented organ can be identified without another label or label. In this way, it is possible to distinguish whether cells derived from external cells have become complete animals due to complementation or cells from internal cells have been complemented to become complete animals.
  • the founder animal of the present invention can be easily selected. These cells may be incorporated in a state capable of expressing a fluorescent protein for specific detection before transplantation.
  • a fluorescent protein for such detection a genetic variant of DsRed, DsRed. T4 (Bevis B. J. and Glick BS, Nature Biotechnology Vol. 20, p. 83-87, 2002) is almost all systemic organs under the control of CAG promoter (cytomegalovirus enhancer and chicken triactin gene promoter).
  • the sequence can be designed to be expressed, and can be incorporated into pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells by electroporation (electroporation). By labeling such cells for transplantation with fluorescence, it is possible to easily detect whether or not the produced organ is composed only of transplanted cells.
  • fluorescent labels examples include, in addition to the above, for example, a green fluorescent protein (GFP) gene, a red fluorescent protein (RFP), a blue fluorescent protein (CFP), other fluorescent proteins, and LacZ.
  • GFP green fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • CFP blue fluorescent protein
  • LacZ LacZ
  • the present invention is a method for producing a founder animal of the present invention, comprising: A) providing a first pluripotent stem cell having the gene; B) embedding the first pluripotent stem cell A step of growing into a blastocyst; C) a step of producing a chimeric blastocyst by introducing a second pluripotent stem cell having the ability to complement a defect caused by the gene into the blastocyst; D) the chimera There is provided a method comprising the steps of producing an individual from a blastocyst and selecting the organ or a part thereof complemented by the second pluripotent stem cell.
  • a gene encoding a cause of a defect in an organ or body part that cannot survive or difficult to function (or “deficiency cause gene”) used in the method for producing a founder animal of the present invention Is due to the function of the factor (eg, introduced and expressed in the case of a foreign gene, or exposed to conditions under which such a gene functions in the case of an endogenous gene, etc.)
  • any gene can be used as long as it is unable to survive or become difficult to survive if it becomes dysfunctional (for example, abnormal).
  • Representative examples of such include Pdx-1 (the pancreas for this), Sall1 (the kidney for this), and the like.
  • the “pluripotent stem cells” used in the present invention are egg cells, embryonic stem cells (Embionic Stem cells; ES cells) or inducible pluripotent Stem cells (iPS cells), pluripotent germ stem cells. (Multipotent germ stem cell; mGS cell). This is because the founder animal production principle can be applied to other pluripotent stem cells once proven in ES cells. It is proved that the present invention has succeeded in producing founder animals and organs using the same using iPS cells using the same technique.
  • the “first pluripotent stem cell” used in the founder animal cell of the present invention is any cell as long as it is a pluripotent stem cell used as a source to be a founder animal host or a cell mass derived therefrom. Etc., and an inner cell mass (ICM), a fertilized egg or an embryo is preferably used.
  • ICM inner cell mass
  • the “second pluripotent stem cell” used in the present invention is a pluripotent stem cell used for the purpose of producing an organ, and forms a chimeric blastocyst with the first pluripotent stem cell. Any cell can be used as long as it can grow, and for example, pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells can be used.
  • any known factor or gene can be used as long as it is a factor or gene that can supplement an organ or body part. It is understood that
  • the “chimeric blastocyst” used in the present invention refers to a blastocyst formed in a chimera state between a cell derived from the first pluripotent stem cell and a cell derived from the second pluripotent stem cell,
  • the so-called “aggregation method” can be used to produce an embryo + embryo or a method of producing a chimeric blastocyst by bringing an embryo + cell into close contact in a petri dish.
  • the relationship between the recipient embryo and the cells to be transplanted may be the same or different.
  • a kidney derived from a non-human mammalian cell is produced in a mouse body
  • these conventionally known chimera production methods for example, transplanted cells are designated as recipients.
  • a heterogeneous organ is created in the recipient embryo. can do.
  • a first pluripotent stem cell having a gene encoding a cause of a defect in an organ or body part (or a gene causing the defect) that is difficult to survive or difficult to function when functioning is, for example, by procuring a pluripotent stem cell having the gene or by introducing the gene into a pluripotent stem cell to produce a pluripotent stem cell having the gene Can be implemented.
  • Such gene introduction methods are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select and implement such gene introduction.
  • electroporation is used. That is, by applying electrical pulses to the cell suspension to make a minute hole in the cell membrane and sending DNA into the cell, transformation, that is, introduction of the target gene causes less damage after that.
  • electroporation is used. That is, by applying electrical pulses to the cell suspension to make a minute hole in the cell membrane and sending DNA into the cell, transformation, that is, introduction of the target gene causes less damage after that.
  • transformation that is, introduction of the target gene causes less damage after that.
  • the step of growing a first pluripotent stem cell (eg, a fertilized egg, embryo, etc.) into a blastocyst is any known method for making a pluripotent stem cell into a blastocyst.
  • the growth method can be used.
  • Such conditions are well known in the art, according to Manipulating the Mouse Embryo, A LABORATORY MANUAL 3 rd Edition (Cold Spring Harbar Labolatory Press, Cold Spring Harbor, New York) ( incorporated by reference herein) Is done.
  • the step of producing a chimeric blastocyst by introducing a second pluripotent stem cell having the ability to complement the defect caused by the gene into the blastocyst Any method known in the art may be used as long as capable stem cells can be introduced into blastocysts. Examples of such a method include, but are not limited to, an injection method or an aggregation method.
  • a method known in the art can be used as a method for producing an individual from a chimeric blastocyst.
  • the chimera blastocyst is returned to the temporary parent, and is temporarily pregnant and grown in the womb of the temporary parent.
  • the present invention is not limited to this method.
  • selecting an organ or a body part thereof that has been complemented can be performed using any method that can confirm the complement of the organ or body part.
  • identifier refers to any factor that can identify an individual or species and identify the origin, and is also referred to as “ID” as an abbreviation.
  • ID can be, for example, a genomic sequence unique to the second pluripotent stem cell.
  • the second pluripotent stem cell is labeled or can be labeled (including those that are labeled by gene expression), and is selected in the method for producing a founder mouse of the present invention. , By identifying the label. In addition, it is understood that those skilled in the art can appropriately improve this method.
  • the present invention provides a method for producing a target organ or body part.
  • This method comprises the steps of A) providing a founder animal, wherein the deficient causative gene in the founder animal encodes the cause of deficiency in the target organ or body part; B) generating an egg from the animal Obtaining and growing into a blastocyst; C) producing a chimeric blastocyst by introducing a desired pluripotent stem cell having a desired genome having an ability to complement a defect caused by the gene into the blastocyst And D) producing an individual from the chimeric blastocyst and obtaining the target organ or body part from the individual.
  • step D the chimeric blastocyst is developed in the womb of the animal (ethically, preferably a non-human host mammal) to obtain a litter, and the object is obtained from the litter individual. This can be done by obtaining an organ.
  • pancreas formation The formation of the pancreas can be examined by performing macro- or micro-morphological analysis, gene expression analysis, etc. using methods such as macroscopic observation, microscopic observation after staining, or observation using fluorescence .
  • tissue after general tissue staining such as hematoxylin-eosin staining can be microscopically observed.
  • microscopic observation it is possible to examine the structure of various cells inside the specific pancreas.
  • iPS cells and mGS cells can be used.
  • iPS cells Okita K et al. , Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Reference can be made to Nature 448 (7151) 313-7 (2007) and the like.
  • Nanog-iPS produced based on this document, since marking is not made, there is no way of distinguishing it from the embryonic side of the host when it is used for chimera production, and organ replacement is performed. Cannot be identified.
  • Nanog-iPS cell line by introducing a fluorescent dye into the Nanog-iPS cell line, an experiment can be performed with the same protocol as in the case of the ES cell. If cells such as those described above are used, it is possible to create an organ with the same protocol as when ES cells are used, and to clarify the origin.
  • the target organ obtained in the present invention is characterized in that it is completely derived from the different individual host mammal.
  • a chimera was regenerated. I don't want to be bound by theory, but it is because it is a transcription factor that is essential for the function of the deficient gene development process, especially the differentiation / maintenance of stem / progenitor cells of each organ during the organ formation process. Conceivable.
  • ES cells, iPS cells, mGS cells and the like can be used, and can be labeled as described above.
  • the present invention also provides a mammal produced by the method of the present invention. Since an animal having such a target organ could not be produced conventionally, it is considered that the animal itself is also valuable as an invention. Although not wishing to be bound by theory, the reason that such animals could not be produced so far is that the defective organs indicated by genetic defects are essential for survival, and there are ways to rescue them. It is thought that the cause was not.
  • the present invention further provides the use of a non-human host mammal having an abnormality in which development of the target organ does not occur at the developmental stage for the production of the target organ.
  • the use of host cells for such purposes has not been sufficiently envisaged. Therefore, it is considered that such a host animal itself is also valuable as an invention. Although not wishing to be bound by theory, such animals have not been able to produce so far because the defective organs indicated by the gene deficiency are essential for survival, and until the age of sexual maturity is reached This is thought to be due to the inability to maintain the individual.
  • stem cells other than ES cells for example, iPS cells and mGS cells can be used.
  • iPS cells and mGS cells can be used to produce iPS cells.
  • Okita K et al. Ibid.
  • mGS cells a method known in the art (Mito Kanatsu-Shinohara et al., Generation of Pluripotent Stem from Neo Mouse Testis. Cell. Vol. 119, 1001-1012) can be used. . If the marking is not made, there is no way to distinguish it from the embryonic side of the host when it is used for chimera production, and it is impossible to distinguish whether the organ has been supplemented.
  • Nanog-iPS cell line by introducing a fluorescent dye into the Nanog-iPS cell line, an experiment can be performed with the same protocol as in the case of the ES cell. If cells such as those described above are used, it is possible to create an organ with the same protocol as when ES cells are used, and to clarify the origin.
  • iPS cells are obtained from Okita K et al. , Ibid can also be used for other methods. That is, iPS cells can be produced by inducing reprogramming by contacting somatic cells with a reprogramming factor (which can be a combination of one or more factors). Examples of such initialization and initialization factor include the following. For example, in the examples of the present invention, iPS cells are 3 factors (Klf4, Sox2, Oct3 / 4; these are representative “reprogramming factors” used in the present invention) from the tail of GFP transgenic mice.
  • human iPS cells have been successfully established by introducing four genes, Oct3 / 4, Sox2, Nanog, and Lin28, into fetal lung-derived fibroblasts and neonatal foreskin fibroblasts (Yu J, et al., (2007). Science 318: 1917-1920), which can also be utilized in the present invention.
  • Human iPS cells were derived from fibroblast-like synoviocytes and fibroblasts derived from neonatal foreskin using Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc, which are human homologous genes of the mouse gene used in the establishment of mouse iPS cells. It can also be produced (Takahashi K, et al., (2007). Cell 131: 861-872.). Human iPS cells can also be established using 6 genes obtained by adding hTERT / SV40 large T to 4 genes of Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Park IH, et al., (2007). Nature. 451: 141-146.).
  • iPS cells can be established in mice and humans with low efficiency using only the three factors Oct-4, Sox2 and Klf4 without introducing c-Myc gene. Since it has succeeded in suppressing the change to cancer cells, it can also be used in the present invention (Nakagawa M, et al., (2008). Nat Biotechnol 26: 101-106 .; Welling M , Et al., (2008). Cell Stem Cell 2: 10-12).
  • not only gene products but also low molecular weight compounds can produce iPS cells, and these can also be used in the present invention (Shi et al., A combined chemical and genetic approach for the induced pluripotent. cells.Cell Stem Cell.2008 Jun 5; 2 (6): 525-528).
  • the described method can be applied. It is practically possible to compensate for the lost organ of the deficient animal by using the inner cell mass as described above. That is, for example, any of the above cells can be cultured in vitro up to the blastocyst, the internal cell mass can be physically detached from the obtained blastocyst, and it can be injected into the blastocyst.
  • a chimera embryo can be produced by aggregating the 8-cell stage or morula in the middle.
  • Example 1 In this example, a mouse was selected as a founder animal, and a pancreas was selected as an organ to be deficient. In addition, the Pdx1 gene was used to create knockout mice characterized by pancreatic defects.
  • Pdx1 wt / LacZ and Pdx1 LacZ / LacZ were used as knockout mice characterized by pancreatic defects.
  • a blastocyst derived from a mouse (Pdx1-LacZ knock-in mouse) in which the LacZ gene was knocked into (also knocked out) the Pdx1 gene locus was used.
  • Pdx1-LacZ knock-in mouse Regarding the construction of the construct, it can be produced in detail based on a previously reported paper (Development 122, 983-995 (1996)). Briefly, it is as follows. As the arm of the homologous region, one cloned from a ⁇ clone containing the Pdx1 region can be used. In this example, the one provided by Prof. Yoshiya Kawaguchi, Department of Oncology, Kyoto University graduate School of Medicine was used.
  • Method of transgenic knock-in Pdx1-LacZ knock-in mouse
  • the constructs described above were introduced into ES cells by electroporation and positive / negative selection was performed, followed by screening by Southern blotting.
  • the resulting clones were injected with blastocysts to produce chimeric mice.
  • the germline can then be established and the genetic background can be backcrossed into the C57BL / 6 strain.
  • heterozygous mice thus established were mated and used (FIG. 1). Since the knock-in mice cannot be maintained in homozygous state (they die in about one week after birth), the heterozygous mice were mated to recover the embryos.
  • ES cells were injected into the blastocysts under a microscope using a micromanipulator.
  • a strain called G4.2 marked with EGFP was used as the ES cell (provided by RIKENCDB, Dr. Hitoshi Niwa). You may use the marked ES cell etc. equivalent to this.
  • the embryo after injection was transplanted into the womb of a temporary parent to obtain a litter.
  • FIG. 3 shows an image obtained by immunostaining a frozen section prepared from a mouse pancreas dissected during the neonatal period.
  • the antibody is an anti- ⁇ -amylase antibody (cat. # A8273 purchased from SIGMA) as an indicator of exocrine tissue, an anti-insulin antibody (cat. # 422421 purchased from Nichirei Biosciences) as an indicator of endocrine tissue, an anti-glucagon antibody (stock) Cat. # 422271) purchased from the company Nichirei Bioscience, anti-somatostatin antibody (cat. # 4222651 purchased from Nichirei Bioscience), and DBA-Lectin (cat. # RL-1032 purchased from Vector) as an index of the pancreatic duct. Dyed separately. All of these are positive, suggesting that the supplemented pancreas is functioning normally.
  • the blood glucose level is measured with an adult mouse as the next step to confirm whether or not the supplemented organ is functioning normally (FIG. 4).
  • FIG. 4 shows the results of pancreatic function evaluation in pancreatic complementation mice using blood glucose level as an index.
  • (1) is the blood glucose level in a steady state, and shows the mean and standard deviation of the values measured by Medisafe Mini GR-102 (purchased from TERUMO) for the blood glucose level of mature pancreatic complementation mice.
  • Medisafe Mini GR-102 purchased from TERUMO
  • the values of a chimeric mouse having a heterozygous Pdx1 allele and STZ-DM model with reduced pancreatic function are shown.
  • (2) shows the result of measuring the transition of blood glucose level after glucose load using the Medisafe Mini.
  • the blood glucose level once increased returns to the normal value as in the hetero (+/ ⁇ ) chimera used as a control, so that the produced KO chimera (founder) does not show symptoms such as diabetes, The possibility of long-term survival was shown.
  • FIG. 5 shows the process and results. Genomic DNA was extracted from the tail of the resulting litter, and PCR was performed using the primers used in the section (Mouse maintenance procedure and confirmation). The results revealed that only heterozygous or knockout individuals could be obtained, which strongly suggests that the founder is a knockout individual and can convey its phenotype to the next generation.
  • mice used As a transgenic mouse characterized by pancreatic deficiency, a mouse (Pdx1-Hes1 mouse) prepared by injecting a construct in which a Hes1 gene was linked under the Pdx1 promoter region into a mouse pronuclear stage egg was used. Inserting the Hes1 gene (mRNA of NCBI Accession No. NM_008235) into the Pax6 gene part of the construct containing the Pdx1 promoter region used in a previously published paper (Diabetologia 43, 332-339 (2000)) for construct production Can do.
  • Transgenic technique The above construct is injected into a pronuclear egg obtained by mating a C57BL6 mouse and a BDF1 mouse (purchased from Japan SLC Co., Ltd.) using a microinjector and transplanted to a foster parent to produce a transgenic mouse.
  • FIG. 6 shows an example of a mouse supplemented with a pancreas produced by blastocyst complementation.
  • FIG. 6 shows pancreas regeneration by Blastocyst Complementation of Pdx1-Hes1 transgenic. It is possible to make ES cell-derived pancreas using the same mouse.
  • ES cell line called G4.2 marked with EGFP (RIKEN CDB, provided by Prof. Hitoshi Niwa) was marked with EGFP as in the knockout section. You may use the marked ES cell etc. equivalent to this.
  • the embryo after injection was transplanted into the womb of a temporary parent to obtain a litter.
  • pancreas deficiency to the next generation.
  • the conventional method for producing a transgenic mouse is to introduce a gene into a pronuclear stage egg and then transplant it.
  • a mouse having a phenotype lacking the pancreas will die after birth. Therefore, the present invention provides a technique that cannot be achieved by the conventional method.
  • Fig. 8 shows a summary of the results of the production process.
  • chimeras were judged by their hair color. Since donor ES cells are derived from 129 strain mice (Agouti) and host embryos are derived from C57BL6xBDF1 (black), it is possible to determine whether or not they are chimeric if their hairs grow. Transgenicity was determined by detecting the transgene by PCR of genomic DNA extracted from the tail.
  • the forward primer used was prepared to hybridize to the nucleotide sequence corresponding to the Pdx1 promoter region, and the reverse primer hybridized to the nucleotide sequence of Hes1 cDNA (mRNA with accession number NM_008235). It is made as follows. Since the presence of such Pdx1 promoter and Hes1 cDNA in the vicinity cannot occur in wild-type mice, it is possible to efficiently detect the transgene by PCR using these primers.
  • FIG. 9 shows the steps and results of this example.
  • transgenic and chimeric individuals are crossed with the wild type. We will clarify whether the phenotype of pancreatic deficiency is transmitted to the next generation through morphological analysis of the pancreas of the litter or PCR of genomic DNA. If transgenic chimeras can be founders, the next generation of mice lacking the pancreas will be born. Of the founder candidates shown in FIG. 8, # 37 succeeded in deficient pancreas in the next generation. This indicates that # 37 showed normality after birth because the pancreas was supplemented at the production stage. Thus, even if transgenic is used, a founder that can efficiently produce a mouse that dies in the embryonic period and immediately after birth, such as an organ-deficient mouse, can be produced.
  • the death of organ-deficient animals can be rescued by complementation of the scutellum method, regardless of whether it is a mouse including those in which pancreas cannot be produced by forced expression of HES-1 or Pdx-1 knockout mice. It has been shown that it can be used as a founder.
  • Example 2 Example using iPS cells
  • Example 1 Example using iPS cells
  • the protocol performed in Example 1 can be carried out as it is. That is, it is understood that there is no difference in the culture method and the introduction method into the embryo, and the method described in Example 1 can be used.
  • iPS cell preparation Example of iPS cell preparation
  • the present inventors produced iPS cells using fibroblasts collected from the tail of GFP transgenic mice with 3 factors (Klf4, Sox2, Oct3 / 4).
  • the protocol is as follows. The scheme is shown in FIG. 10 and in detail in FIG. 11a.
  • TTF Tail tip fibroblast
  • the supernatant was collected from a virus-producing cell line (293 gp or 293GPG cell line) prepared by introducing the target gene and virus envelope protein, and the virus solution which had been cryopreserved after centrifugation and concentrated was 1 ⁇ 10 5 cells / 6 on the previous day. This was added to the culture solution of TTF cells passaged to form a well plate, and this was used as introduction of 3 factors (reprogramming factor).
  • mice (IPS colony pick-up and iPS cell line establishment) Newly prepared mice picked up iPS cell-like colonies that appeared after culture with a yellow chip (for example, available from Watson), disaggregated to single cells with 0.25% trypsin / EDTA (Invitrogen) They were plated on fetal fibroblasts (MEF).
  • a yellow chip for example, available from Watson
  • trypsin / EDTA Invitrogen
  • the iPS cell line established by the above method was proved to have the characteristics as iPS cells as shown in FIGS. 11b-f, that is, undifferentiated and totipotent.
  • FIG. 11 shows the results of the above experiment.
  • FIG. 11b the morphology of two established iPS cell lines was photographed with a microscope equipped with a camera.
  • the conditions are as follows.
  • iPS cells were photographed under a fluorescence microscope and stained with an alkaline phosphatase staining kit (Vector, Cat. No. SK-5200). The conditions are as follows.
  • the culture solution was removed and washed with phosphate-buffered saline (PBS) from 10% formalin and 90% methanol.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the fixative solution was added and subjected to a fixing treatment for 1-2 minutes. This was washed once with a washing solution (0.1 M Tris-HCl (pH 9.5)), and then the staining solution of the above kit was added and left still in the dark for 15 minutes. Then, after washing with a washing solution again, observation and photographing were performed.
  • the iPS cells produced in this example are derived from GFP mice, it is found that GFP is constitutively expressed and exhibits high alkaline phosphatase activity characteristic of undifferentiated cells. It was.
  • genomic DNA was extracted from iPS cells and PCR was performed in order to identify the three factors inserted on the genomic DNA when iPS cells were established.
  • the conditions are as follows.
  • Genomic DNA was extracted from 1 ⁇ 10 6 cells using DNA mini Kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol. PCR was performed using the DNA as a template and the following primers.
  • Oct3 / 4 Fw (mOct3 / 4-S1120): CCC TGG GGA TGC TGT GAG CCA AGG (SEQ ID NO: 6)
  • Rv (pMX / L3205): CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA (SEQ ID NO: 7)
  • Klf4 Fw Klf4-S1236): GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC (SEQ ID NO: 8)
  • Rv (pMXs-AS3200): TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG (SEQ ID NO: 9)
  • Sox2 Fw (Sox2-S768): GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG (SEQ ID NO: 10)
  • Rv
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • IVF In vitro fertilization
  • BDF1 strain mice ⁇ ⁇ ⁇ , 8 weeks old
  • spermatozoa derived from C57BL / 6 that had been subjected to superovulation induction by administration of PMSG and hCG hormone
  • a fertilized egg was obtained. It was cultured to the 8-cell stage / morula, then cryopreserved and awakened the day before blastocyst injection.
  • iPS cells which had become semi-confluent, were peeled off with 0.25% Trypsin / EDTA and suspended in ES cell culture medium for injection.
  • the blastocyst injection was performed using a micromanipulator under a microscope in the same manner as the method for blastocyst complementation, and after the injection, uterus transplantation was performed on the temporary parent uterus of the ICR strain.
  • observation and photographing were performed under a fluorescent stereomicroscope on the 13th day of embryonic day and on the first day after birth.
  • iPS cell-derived cells As shown in FIG. 11f, iPS cell-derived cells (GFP positive) can be confirmed in the fetal and neonatal period, suggesting that the established iPS cell line has high pluripotency.
  • Pdx1 wt / LacZ and Pdx1 LacZ / LacZ were used as knockout mice characterized by pancreatic defects.
  • a blastocyst derived from a mouse (Pdx1-LacZ knock-in mouse) in which the LacZ gene was knocked into (also knocked out) the Pdx1 gene locus was used.
  • Pdx1-LacZ knock-in mice were prepared according to the protocol described in Example 1 except that iPS cells were used instead of ES cells.
  • Founder mouse (Mouse used) As a transgenic mouse characterized by pancreatic deficiency, a mouse (Pdx1-Hes1 mouse) prepared by injecting a construct (Pdx1-Hes1 construct) in which the Hes1 gene was linked to the Pdx1 promoter region into a mouse pronuclear stage egg (Pdx1-Hes1 mouse) was used ( (See Example 1 for production of Pdx1-Hes1 transgenic mice, constructs).
  • FIG. 6 shows pancreas regeneration by blastocyst complementation of Pdx1-Hes1 transgenics. It is possible to produce a pancreas derived from iPS cells using the same mouse.
  • transgenic mouse produced in this way as well as the Pdx1 knockout mouse can also supplement the pancreas.
  • iPS cells were injected into the blastocysts under a microscope using a micromanipulator (FIG. 10 Blastocyst injection of iPS cells). In the conventional method, it was necessary to mark with GFP. However, since iPS cells were previously established from GFP mouse somatic cells, it was not necessary to mark them, and they were used as they were. Of course, other iPS cells marked with the same marking may be used. The embryo after injection was transplanted into the womb of a temporary parent to obtain a litter.
  • a litter is a knock-in mouse, the probability of being homozygous is 1 ⁇ 4. Therefore, it is necessary to determine which mouse is the target “pancreas-deficient + iPS cell-derived pancreas”. Therefore, in both cases, blood and tissue cells are collected, GFP-negative cells (cells derived from injected embryos, not from iPS cells) are collected using a flow cytometer, genomic DNA is extracted, and PCR is performed. The winning mouse was determined by detecting the genotype.
  • the primers used are as follows.
  • FIGS. 11A and 11B show a neonatal 5 days after birth dissected under a microscope and an exposed pancreas taken under a fluorescence microscope.
  • FIG. 11B shows an image obtained by immunostaining a frozen section prepared from a mouse pancreas dissected during the neonatal period.
  • An antibody dyed with an anti-insulin antibody catalog. # 422421 purchased from Nichirei Bioscience
  • an antibody dyed with an anti-insulin antibody catalog. # 422421 purchased from Nichirei Bioscience
  • anti- ⁇ -amylase antibody catalog. # A8273 purchased from SIGMA
  • anti-glucagon antibody catalog. # 422271 purchased from Nichirei Biosciences
  • anti-somatostatin antibody Naichirei Bio Inc.
  • Cat. # 422265 purchased from Science
  • DBA-Lectin catalog. # RL-1032 purchased from Vector
  • insulin is positive, it is understood that the complemented pancreas is functioning normally without staining with other antibodies.
  • blood glucose level is measured with an adult mouse as the next step to confirm whether the supplemented organ is functioning normally.
  • the blood glucose level once increased returns to the normal value as in the hetero (+/ ⁇ ) chimera used as a control, so that the produced KO chimera (founder) does not show symptoms such as diabetes, The possibility of long-term survival can be shown.
  • FIG. 12 shows the result. Genomic DNA was extracted from the tail of the resulting litter, and PCR was performed using the primers used in the section (Mouse maintenance procedure and confirmation). The results revealed that only heterozygous or knockout individuals could be obtained, which strongly suggests that the founder is a knockout individual and can convey its phenotype to the next generation.
  • Chimeras can be judged by hair color. Since donor iPS cells are derived from GFP transgenic mice and host embryos are derived from wild-type C57BL6xBDF1 (black), it can be determined by GFP fluorescence. Transgenic determination is performed by detecting the transgene by PCR of genomic DNA extracted from the tail.
  • the offspring is transgenic, the probability that the transgene will be transmitted to the next generation is halved, so it is necessary to determine which mouse is the target “pancreas-deficient + iPS cell-derived pancreas”. Therefore, it was mated with wild-type mice, and transgene propagation was confirmed by detecting the genotype by PCR using genomic DNA extracted from the tail of the offspring, and the pancreas morphology of the offspring was observed. The following primer sets are used for PCR.
  • the forward primer used was prepared to hybridize to the nucleotide sequence corresponding to the Pdx1 promoter region, and the reverse primer was hybridized to the nucleotide sequence of Hes1 cDNA (mRNA with Accession No. NM_008235). It has been made. The presence of such a Pdx1 promoter and Hes1 cDNA in the vicinity cannot occur in a wild type mouse, and therefore it is possible to detect a transgene efficiently by PCR using these primers. From the above experiment, the result suggesting that it is a founder mouse capable of causing pancreas deficiency in the next generation is obtained.
  • transgenic animals and knockout animals having a lethal phenotype should be able to be produced more efficiently.
  • transgenic and chimeric individuals are crossed with the wild type. We will clarify whether the phenotype of pancreatic deficiency is transmitted to the next generation through morphological analysis of the pancreas of the litter or PCR of genomic DNA. If transgenic chimeras can be founders, the next generation of mice lacking the pancreas will be born. Those that succeeded in deficient pancreas in the next generation can be selected. Such mice are shown to show normality after birth because the pancreas was supplemented at the production stage. As described above, organ regeneration can be realized together with iPS cells by using a founder that can efficiently produce a mouse that dies in the embryonic period and immediately after birth, such as an organ-deficient mouse, even if transgenic is used.
  • the death of organ-deficient animals can be determined by the scutellum method, regardless of whether the mouse contains a pancreas that cannot be produced by forced expression of HES-1 using iPS cells or a Pdx-1 knockout mouse. It has been shown that complementation can be rescued and used as a founder.
  • Example 3 Example using mGS cells
  • mGS cells were used in place of ES cells or iPS cells, and the same experiment as in Example 1 or 2 was performed (Mito Kanatsu-Shinohara et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Neo Mouse Test Cell. .Vol.119, 1001-1012 (2004)). Since mGS cells are basically pluripotent stem cell lines and have characteristics very similar to ES cells or iPS cells, the protocol used in Example 1 or 2 should be used as it is or after being appropriately modified. Can do. That is, it is understood that there is no difference in the culture method and the introduction method into the embryo, and the method described in Example 1 or 2 can be appropriately modified and used.
  • Example 4 Example using fertilized egg cell
  • fertilized egg cells Mintz experimental study of the developing egg: removal of the zona pelucida.Sci.
  • Example 138, 594, Example 138, 595 The same experiment as 1 or 2 is performed.
  • the fertilized egg cells are collected by artificial insemination or egg collection after natural mating, and removed by exposing the zona pellucida of these embryos to acidic Tyrode's solution in the same petri dish. It is possible to utilize a method for producing chimera blastocysts by agglutinating them by incubating in a close manner.
  • blastomere part of the fertilized egg cells treated in the same way (blastomere) or the inner cell mass of the embryo that has developed and reached the blastocyst is mechanically detached and injected into the genetically modified blastocyst.
  • a mouse is selected as the founder animal, and the Sall1 gene is used to produce a knockout mouse characterized by a kidney defect.
  • Sall1 knockout mouse (Mouse used) A Sall1 knockout mouse (provided by Dr. Ryuichi Nishinakamura, Kumamoto University Research Center for Developmental Medicine) was used as a knockout mouse characterized by kidney deficiency.
  • the Sall1 gene is a mouse homologue of the Drosophila anterior-posterior site-specific homeotic gene spalt (sal), and Xenopus prerenal duct induction experiments suggested that it is important for renal development, 1323 It is a 3969 bp gene encoding a protein of amino acid residues (Nishinakamura, R. et al., Development, Vol. 128, p. 3105-3115, 2001, Todai Asashima Laboratory).
  • this Sall1 gene has been reported to be expressed and localized in the central nerve, otocyst, heart, limb bud, and anus (Nishinakamura, R. et al., Development, Vol. 128). , P. 3105-3115, 2001).
  • This Sall1 gene knockout mouse (analyzed by backcrossing (backcrossing) to the C57BL / 6 strain) was deleted from exon 2 and later of the Sall1 gene, so that all 10 zinc-finger domains that existed in the molecule were detected. It is thought that as a result of the deficiency, ureteric bud invagination into the metanephric mesenchyme does not occur and abnormalities in the early stages of kidney formation occur.
  • embryos injected with the Sall1 knockout transgene are cultured up to blastocysts, and iPS cells are injected under a microscope using a micromanipulator to compensate for the deficiency of the kidneys.
  • iPS cells marked with GFP or the like prepared as described above are used.
  • An equivalent marked iPS cell or the like may be used.
  • the embryo after injection can be transplanted to the uterus of the surrogate parent to obtain a litter.
  • By applying the double embryo operation of injecting iPS cells into the embryo into which the transgene has been introduced in this way it becomes possible to supplement the kidney from the first generation of transgenics, and they are called kidney deficits to the next generation.
  • GFP-marked iPS cells were injected into the collected blastocyst-stage fertilized eggs under a microscope using a micromanipulator, and the injected embryos were transplanted into a foster mother's uterus to obtain offspring.
  • a litter is a knock-in mouse, the probability of being homozygous is 1 ⁇ 4. Therefore, it is necessary to determine which mouse is the target “kidney deficient + iPS cell-derived pancreas”. Therefore, bone marrow cells were collected from offspring, GFP- hematopoietic stem / progenitor cells (c-Kit +, Sca-1 +, Lineage marker-: KSL cells) were collected using a flow cytometer, and each cell was 96-well plate I dropped it. This was cultured for 12 days under cytokine addition conditions to form colonies, genomic DNA was extracted from them, and the genotype was detected from a single cell by PCR method to determine the winning mouse.
  • the primers used are as follows.
  • kidneys in the retroperitoneal region were strongly GFP positive when observed under a fluorescent stereomicroscope (FIG. 13). This indicates that in the homozygote (Sall1 ( ⁇ / ⁇ )), the kidney is derived only from mouse iPS cells transplanted into the lumen of the blastocyst stage fertilized egg.
  • the kidney is composed of chimera of cells derived from heterozygous (Sall1 (+/ ⁇ )) individuals and transplanted iPS cell-derived cells. Therefore, both GFP fluorescence and immunohistochemistry-derived fluorescence using an anti-GFP antibody could be confirmed by obtaining positive cell images.
  • the kidney formed in the offspring individual is the Sall1 knockout mouse (Sall1 ( ⁇ / ⁇ )) scutellum. It can be confirmed that the cells are formed from iPS cells transplanted into the lumen of the fertilized ovum.
  • Example 6 Example of using animals other than mice
  • organs can be produced.
  • Organ production can be performed.
  • rats Mayer, J. et al. R. Jr. & Fretz, H .; I. The culture of preimplantation rat embryos and the production of allo ratats. J. et al. Reprod. Fertil. 39, 1-10 (1974), a similar experiment can be performed.
  • mice for example, in the present example, the same applies to animal species (rat (transgenic), pig (transgenic, knockout)) and bovine (transgenic, knockout) that can produce genetically modified animals as examples other than mice. It is envisaged that experiments can be performed, and in these species, the use of fertilized egg cells as described in Example 4 is envisioned.
  • lethal genetically modified founder rats, pigs, cattle, etc. can be produced.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、より効率よい臓器再生を実現するためには、恒常的に臓器再生を可能にする技術を提供することを目的とする。本発明は、胚盤胞補完方法において、発生した胚盤胞にＥＳ細胞を注入することで、膵臓、腎臓等の臓器の欠損を補うと、次世代が誕生することを見出し、膵臓、腎臓が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることをも見出したことによって、このようなファウンダーを用いて、臓器再生を行うことができることが明らかにし、上記目的を達成した。

Description

遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法
　本発明は、生体内で所望の細胞由来の臓器を作製するために用いられる繁殖用の動物およびその作製方法に関する。
　細胞移植あるいは臓器移植といった形での再生医療を論じる上で、多分化能を有する幹細胞への期待は大きい。胚盤胞期受精卵の内部細胞塊より樹立されたＥＳ細胞は、多分化能を持ち、種々の細胞分化の研究に用いられ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでそれを特定の細胞系譜に分化誘導する分化制御法の開発は再生医学研究のトピックである。
　胚性幹（ＥＳ）細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化研究では胚発生初期に分化してくる血球、血管、心筋、神経系などの中胚葉、外胚葉系へは分化しやすい。しかしながら、胚発生中期以降に細胞間相互作用を通じて複雑な組織形成へと向かう器官への分化は難しいという一般的な傾向が知られている。
　例えば、哺乳類の成体腎臓である後腎は胚発生中期に中間部中胚葉より発生する。具体的には後腎間葉細胞と尿管芽上皮という２つのコンポーネントの相互作用により腎臓発生は始まり、最終的に数十種類という他臓器には見られない程の多種類の機能細胞への分化とそれらによる糸球体・尿細管を中心とした複雑なネフロン構造の構成により、成体腎臓が完成する。腎臓の発生時期とその過程の複雑さから、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＥＳ細胞から腎臓を誘導することが非常に手間のかかる難仕事であることは容易に推察でき、事実上不可能であると考えられている。また、腎臓などの臓器では体性幹細胞の同定はいまだ確定的なものではなく、一時盛んに研究された骨髄細胞の障害腎臓修復過程への寄与もさほど大きいものではないということが判明しつつある。
　多分化能を有するＥＳ細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すれば産生個体はキメラマウスを形成する。Ｔ細胞、Ｂ細胞系譜を欠損するＲａｇ－２ノックアウトマウスに対して、この技術を応用した胚盤胞補完作用（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によるＴ細胞、Ｂ細胞系譜のレスキュー実験が過去に報告されている（非特許文献１）。このキメラマウス・アッセイは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ系の存在しないＴ細胞系譜の分化を確認するｉｎ　ｖｉｖｏアッセイ系として用いられている。
　本発明者らは、上記技術に関連して臓器再生方法として、ＰＣＴ／ＪＰ２００８／　５１１２９を出願した（特許文献１：ＷＯ／２００８／１０２６０２）。しかし、ここで用いられている方法は、一代限りのものであり、臓器を再生するごとに、煩雑な作業を繰り返す必要がある。
　したがって、より効率よい臓器再生を実現するためには、恒常的に臓器再生を可能にする技術を開発する必要がある。
国際出願公開２００８／１０２６０２パンフレット Ｃｈｅｎ　Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．４５２８－４５３２，１９９３
　本発明は、産業用に適する臓器再生の技術を提供することを課題とする。
　本発明は、胚盤胞補完方法において、発生した胚盤胞にＥＳ細胞または誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を注入することで、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分の欠損を補うと、次世代が誕生することを見出し、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることをも見出したことによって、このようなファウンダーを用いて、臓器再生を行うことができることを明らかにし、上記課題を解決するに至った。
　本発明においては、例えば、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分の欠損を特徴とするノックアウトマウスおよびトランスジェニック動物（例えば、マウス）中に、多能性幹細胞としてたとえばマウスなどのＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を移植して、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分を補いファウンダーとして効率的に産仔を得ることができることを見出した。
　本発明においては、遺伝子型決定（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の結果より膵臓が補われたノックアウトマウスは正常に成体へと育つことがわかった。補われたノックアウト（ＫＯともいう。）マウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられるＫＯとヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであるところ、実際にそのようになったことを見出した。
　このことから、例えば、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析が顕著に行いやすくなると思われる。
　臓器、腎臓などの臓器または身体部分欠損を誘発する導入遺伝子を卵細胞に入れ、この後、移植するのが従来のトランスジェニック（Ｔｇ）動物作製法である。この手法では、臓器を欠損する表現型を持つ動物は、その臓器が生存に必須である場合は出生後死んでしまう。そこで、発生した胚盤胞にＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を注入することで、膵臓の欠損を補うと、次世代が誕生することを見出した。しかも、膵臓が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることをも見出した。したがって、このようなファウンダーを用いて、臓器再生を行うことができることが明らかになった。
　いったんある臓器について、本発明の方法が適用することができることがわかると、その臓器については、成功した事例に基づいて適宜変更を加えて応用することができることが理解される。その理由は以下のとおりである。適切な欠損動物が存在すれば、本明細書に示されるように蛍光などで標識されたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を用い、あるいは、標識がなされた欠損動物と標識がされていないまたは別の標識がされた多能性幹細胞を用い、同様の解析方法を適用すれば構築された臓器がホスト由来かＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞等由来かは明らかとなり、臓器構築の可否を判定でき、同様の理論で、次世代の動物を再生産させることができることが理解されるからである。
　したがって、本発明は、以下を提供する。
　１つの局面において、本発明は、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物を提供する。
　１つの実施形態において、前記補完された臓器または身体部分は標識されたものである。
　１つの実施形態において、本発明の動物を生産する方法は、
　Ａ）前記欠損原因遺伝子を有する第一多能性幹細胞を提供する工程；
　Ｂ）該第一多能性幹細胞を胚盤胞に成長させる工程；
　Ｃ）該胚盤胞中に、前記欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；
　Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性幹細胞により、前記臓器またはその身体部分が補完されたものを選択する工程
を包含する。
　１つの実施形態において、前記第一多能性幹細胞は、内部細胞塊(ICM)、受精卵または胚である。
　１つの実施形態において、前記遺伝子は外来遺伝子であり、前記Ａ）工程は、前記第一多能性幹細胞に該外来遺伝子を導入することを包含する。
　１つの実施形態において、前記第二多能性幹細胞は、卵細胞、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
　１つの実施形態において、前記Ｄ）工程は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて前記個体を生産することを包含する。
　１つの実施形態において、前記選択は、前記第二多能性幹細胞に由来する識別子を識別することによって達成される。
　１つの実施形態において、前記第二多能性幹細胞は標識されたものであり、前記選択は、該標識を同定することを包含する。
　別の局面において、本発明は、目的の臓器または身体部分を生産する方法であって、
　Ａ）請求項１に記載の動物を提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；
　Ｂ）該動物から卵子を得、該卵子を胚盤胞に成長させる工程；
　Ｃ）該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；および
　Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程を包含する方法を提供する。
　１つの実施形態において、前記Ｄ）工程は、前記キメラ胚盤胞を該非ヒト宿主哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することを包含する。
　１つの実施形態において、前記目的多能性幹細胞はＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
　１つの実施形態において、前記目的多能性幹細胞はマウス由来である。
　１つの実施形態において、前記目的の臓器または身体部分は膵臓または腎臓である。
　１つの実施形態において、前記動物はマウスである。
　１つの実施形態において、前記マウスはＰｄｘ－１ノックアウトマウスまたはＰｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスなどである。
　１つの実施形態において、前記目的の臓器または身体部分は、完全に前記目的多能性幹細胞由来のものである。
　別の局面において、本発明は、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物の、該臓器または身体部分の製造のための使用を提供する。
　別の局面において、目的の臓器または身体部分を製造するためのセットであって、該セットは、Ａ）機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）により補完される、動物と、Ｂ）該目的の臓器または身体部と同種の細胞とを備える、セットを提供する。
　さらに別の局面では、本発明は、本発明の動物を生産するための、多能性幹細胞と、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子をコードする核酸との組み合わせ、あるいは、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を有する多能性幹細胞と該遺伝子を有しない細胞との組み合わせの、使用を提供する。
　本発明により、産業用に適する臓器再生の技術が提供された。
　例えば、ファウンダー動物生産技術の確立により、従来の方法では維持が困難であった遺伝子改変（ノックアウトもしくはトランスジェニック）動物の効率的な生産が可能となる。さらに、作製されたファウンダー動物を用いることで、遺伝子改変された胚もしくは新生児を用いた操作（臓器再生等を目的とした研究）がより一層効率的に行えるようになる。あるいは、トランスジェニック動物では作製に煩雑な手間がかかるのにも拘らず、遺伝子導入を行った一世代目において致死性の表現型が現れると同様の遺伝子挿入位置、コピー数をもつ動物の解析は１回しか行えないという欠点があった。しかし、この方法を適用することで、本来致死であるはずの一世代目の生存が可能となり、次世代へ全く同様の表現型を伝搬できるため、致死のメカニズムを明らかにするというような解析を完全にクローナルなコロニーで行うことができる。これにより、作製されたファウンダーマウスを用いた解析を目的とした実験が可能となった。これは、従来技術ではまったく不可能であった技術であるといえる。
Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎにより膵臓が補われたノックアウト（ＫＯ）マウスの誕生のスキームを示す。 Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇの結果より膵臓が補われたノックアウトマウスは正常に成体へと育つことがわかったことを示す。上パネルには、末梢血中のホスト由来の細胞を用いた遺伝子型の解析を示す。左下にはその結果を示す。この方法により明らかにされたマウスの割合が示されており、このデータでは計２２匹中ファウンダーとなりうるＫＯ個体は４匹いた。右に示したのはそれぞれの個体についてのキメラ率である。末梢血中のＧＦＰ（＋）細胞の割合を示すことによって分析した。 ＥＳ細胞由来膵臓は生体内で膵臓の機能マーカーを発現している（新生児期に解析）ことを示す。上から膵臓の機能マーカー、ＧＦＰ、併合図（Ｍｅｒｇｅｄ）を示す。左から順番に外分泌組織マーカーのαアミラーゼ、内分泌組織マーカーのインスリン、グルカゴン、ソマトスタチンを示し、右には、膵管マーカーのＤＢＡレクチンを示す。 膵臓が補われたマウスは血糖値の調節も正常に行えることを示す。左には、定常状態における血糖値を示す。右には、糖負荷試験後の血糖値の変遷を示す。糖負荷後１５，３０，６０，１２０分後に血糖値測定した。 ＥＳ細胞により膵臓を補われたノックアウトマウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられることを示す。左上に示すように、ｗｔ／Ｐｄｘ１－ＬａｃＺ個体と交配させた。これの産仔の解析を行い、Ｐｄｘ１対立遺伝子の解析を行ったものを右に示す。下には、実際の解剖写真を示す。 Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジェニックのＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　による膵臓再生を示す。上パネルには、導入したベクターの構造を示す。パネルの右には、見分け方を記載する。Ｐｄｘ１（特に胎生期の膵臓で発現）のプロモーター下で発現するＨｅｓ１の発現量に依存して膵臓の形成度合が異なる。発現が高い（＝コピー数が多い）と膵臓の欠損を示す。右下には、膵臓が補われたトランスジェニックマウスを示す。Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジェニックマウスを用いてＥＳ細胞由来の膵臓を作ることが可能であることが明らかになった（左下の表は結果を示す。）。 トランスジェニック作製技術とＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを組み合わせたファウンダートランスジェニックマウス作製への戦略スキームを示す。過排卵誘起したメスマウスとの交配をおこなって卵細胞を得、前核期卵への遺伝子導入（ここでは、導入するトランスジーン（Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１））を行い、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの培養を行う。生存卵子へのＥＳ細胞の注入を行い、仮親子宮への胚移植を行う。出生産仔のＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行い、ファウンダーマウスが生成される。膵臓が補われたトランスジェニックマウスはファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能である。 ファウンダートランスジェニックマウスの作製への試みを示す。左から、前核注入卵子、生存卵子数、胚盤胞数、ＥＳ細胞注入胚数、移植胚数、生存産仔数、トランスジェニックの個体数および必要に応じて割合を示す。キメラは毛の色で判断した。ドナーのＥＳ細胞は１２９系統マウス（アグーチ）由来、ホストの胚はＣ５７ＢＬ６ｘＢＤＦ１（黒）由来のため体毛が生えそろえばキメラかどうかは判断可能である。 膵臓を補われたトランスジェニックマウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられることを示す。作製したトランスジェニックかつキメラであった個体を野生型と交配する。産仔の膵臓の形態解析、あるいはＧｅｎｏｍｅ　ＤＮＡのＰＣＲにより、膵欠損という表現型が次世代に伝わるかを明らかにする。もしトランスジェニック－キメラがファウンダーになりうるなら次世代で膵臓を欠損したマウスが産まれてくるはずであるからである。ここでは、＃３７のマウスがファウンダーとして機能することを示す。右には産仔の解析の導入遺伝子の確認を行い、下パネルには、実際の写真を掲載する。＃３７は作製段階で膵臓を補われたため出生後の正常性を示したと考えられる。このようにトランスジェニックを用いても臓器欠損マウスのような胎生期および出生直後に死んでしまうようなマウスを効率的に生産できるファウンダーが作製可能である。 胚盤胞補完によるｉＰＳ細胞由来の膵臓構築を用いた治療モデルを示す。 ａ．はＧＦＰマウス由来ｉＰＳ細胞樹立のストラテジーを示す。ＧＦＰマウス尻尾由来繊維芽細胞（Ｔａｉｌ　ｔｉｐ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＴＴＦ）の樹立を行った後、３因子（初期化因子）を導入し、２５～３０日間ＥＳ細胞用培地にて培養し、ｉＰＳコロニーのピックアップおよびｉＰＳ細胞株を樹立した。ｂ．は、樹立されたｉＰＳ細胞の形態をその形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影したものを示す。左は、ＧＦＰ－ｉＰＳ細胞＃２のものを、右には＃３を示す。ｃ．は、アルカリフォスファターゼ活性の測定を示す。ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社　Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ－５２００）により染色を施した。左から明視野像、ＧＦＰ蛍光像およびアルカリフォスファターゼ染色を示す。ｄ．は、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによる導入された３因子（初期化因子）の特定を示す。ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った結果である。上からＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏｇの遺伝子の発現を示す。左から、ＧＦＰ－ｉＰＳ細胞＃２、＃３、Ｎａｎｏｇ－ｉＰＳ（４因子のもの）、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）のものを示す。一番右には蒸留水での結果を示す。本発明において用いたｉＰＳ細胞における３因子の挿入が確認された。ｅ．は、ＲＴ－ＰＣＲによる本発明で用いた細胞におけるＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンの解析と導入遺伝子の発現確認を示す。上からＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃである。Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｇａｐｄｈの遺伝子の発現を示す。一番下には、ネガティブコントロール（ＲＴ（－））を示す。Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４については、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡとトランスジェニック（Ｔｇ）とを分けて発現を確認した。左から、ＧＦＰ－ｉＰＳ細胞＃２、＃３、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）およびさらにコントロールとしてのＴＴＦ（ネガティブコントロール）の発現の様子を示す。一番右には蒸留水での結果を示す。ｆ．は、ｉＰＳ細胞を用いたキメラマウス作製を示す。樹立されたｉＰＳ細胞をＣ５７ＢＬ６とＢＤＦ１系統のマウスの交配により得られた胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した結果を示す。上には、胎生１３．５日目の明視野像（左）ＧＦＰ蛍光像（右）を示す。下には、新生児期のものを示す。ＮＣと記載しているのはネガティブコントロールである。 図１１Ａは、胚盤胞補完により構築された膵臓の形態（出生後５日目）を示す。Ｈｏｍｏのマウスでは膵臓の辺縁がきれいにＧＦＰ陽性細胞で構成されているが、ｈｅｔｅｒｏマウス膵臓ではドット状のキメラになっている。 図１１Ｂは、ｉＰＳ細胞由来膵臓の組織学的な解析（出生後５日目）を示す。ここでは、ｉＰＳ細胞由来の膵臓の凍結切片標本を作製し、核染色としてＤＡＰＩおよび抗ＧＦＰ抗体、抗インスリン抗体による染色を施し、正立蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡により観察、撮影した。左から明視野像、ＧＦＰ＋ＤＡＰＩの像、および右側には抗インスリン抗体による染色を示す。上パネルは、本発明のＰｄｘ１ＬａｃＺ／ＬａｃＺにＧＦＰ－ｉＰＳ細胞を導入したものを示し、下パネルにはコントロールであるＰｄｘ１ｗｔ／ＬａｃＺにＧＦＰ－ｉＰＳ細胞を導入したものを示す。 ｉＰＳ細胞により膵臓を補われたノックアウトマウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられることを示す。左上に示すように、ｗｔ／Ｐｄｘ１－ＬａｃＺ個体と交配させた。これの産仔の解析を行い、Ｐｄｘ１対立遺伝子の解析を行ったものを右に示す。 Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスのＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎによる腎臓再生を示す。Ｓａｌｌ１対立遺伝子の遺伝子型判定結果を上に示す。＃３のマウスがＳａｌｌ１ホモＫＯマウスであったことが分かる。下には、＃３マウスをホストとしてｉＰＳ細胞による胚盤胞補完を行い再生された腎臓の形態（生後１日目）を示す。ホモのＫＯマウスでは、腎臓全体がきれいにＧＦＰ陽性細胞で構成されていることが分かる。Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスを用いてｉＰＳ細胞由来の腎臓を作ることが可能であることが明らかになった。
配列番号１　注入された胚由来の細胞同定用のフォワード（Ｆｗ）プライマー：ＴＴＣ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　ＡＡＣ
配列番号２　注入された胚由来の細胞同定用のリバース１（Ｒｖ１）プライマー：ＴＴＣ　ＡＡＣ　ＡＴＣ　ＡＣＴ　ＧＣＣ　ＡＧＣ　ＴＣＣ
配列番号３　注入された胚由来の細胞同定用のリバース（Ｒｖ２）プライマー：ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＣ
配列番号４　トランスジーン検出用フォワード（Ｆｗ）プライマー：ＴＧＡ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＡＧＡ　ＧＧ
配列番号５　トランスジーン検出用リバース（Ｒｖ）プライマー：ＣＡＡ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡ
配列番号６　Ｏｃｔ３／４検出用Ｆｗプライマー（ｍＯｃｔ３／４－Ｓ１１２０）：ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＴＧＣ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ
配列番号７　Ｏｃｔ３／４検出用Ｒｖプライマー（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）：ＣＣＣ　ＴＴＴ　ＴＴＣ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ
配列番号８　Ｋｌｆ４検出用Ｆｗプライマー（Ｋｌｆ４－Ｓ１２３６）：ＧＣＧ　ＡＡＣ　ＴＣＡ　ＣＡＣ　ＡＧＧ　ＣＧＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣ
配列番号９　Ｋｌｆ４・Ｓｏｘ２・ｃ－Ｍｙｃ検出用Ｒｖプライマー（ｐＭＸｓ－ＡＳ３２００）：ＴＴＡ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＣ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ
配列番号１０　Ｓｏｘ２検出用Ｆｗプライマー（Ｓｏｘ２－Ｓ７６８）：ＧＧＴ　ＴＡＣ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＣＴＣ　ＣＣＡ　ＣＴＣ　ＣＡＧ
配列番号１１　ｃ－Ｍｙｃ検出用ＦＷプライマー（ｃ－Ｍｙｃ－Ｓ１０９３）：ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＡＡＣ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＧＣ
配列番号１２　注入された胚由来の細胞（ｍｕｔａｎｔ）検出用フォワードプライマー：ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＧ
配列番号１３　注入された胚由来の細胞（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）検出用フォワードプライマー：ＧＴＡ　ＣＡＣ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＡＣ
配列番号１４　注入された胚由来の細胞（ｍｕｔａｎｔ）リバースプライマー：ＡＴＡ　ＴＣＡ　ＣＧＧ　ＧＡＴ　ＧＣＣ　ＡＡＣ　ＧＣ
配列番号１５　注入された胚由来の細胞（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）検出用リバースプライマー：ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＴＧＡ　ＧＴＴ　ＣＴＣ　ＴＣＧ
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　本明細書において「ファウンダー」生物または「ファウンダー」動物とは、次世代以降に所望の形質（特に、臓器等の欠損）を維持したまま生存させることができる生物または動物をいう。
　本明細書において「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる」とは、ある要因について、その要因が機能すると、ホストである動物がまったく生存できずに死ぬか、あるいは、生きることはできるが、成長困難であるとか生殖困難であるなどの理由で、その後の生存が実質的に不可能になることをいい、当該分野において通常の知識を用いて理解することができる。
　本明細書において、「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分」とは、ある因子について言及するとき、その因子により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となるものをいう。例えば、外来遺伝子の場合、その遺伝子が生物に導入され、その遺伝子が正常に発現すると、ある臓器または身体部分に欠損が生じ、その結果生存し得ないまたは生存困難となることをいう。生存困難とは、次世代に子孫を残せないことを含む。臓器または身体部分としては、例えば、膵臓、腎臓などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　本明細書において「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする（欠損原因）遺伝子」または「欠損原因遺伝子」は、交換可能に用いられ、ある遺伝子について言及するとき、その因子が機能（例えば、外来遺伝子の場合、導入され発現されるか、あるいは内因性の場合そのような遺伝子が機能する条件にさらされることなど）により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となる遺伝子をいう。
　本明細書において「臓器」とは、当該分野において通常の意味で用いられ、動物の内臓を構成する器官一般を指す。
　本明細書において「身体部分」とは、身体のいずれかの部分を指し、一般に臓器と称されないものをも含む。例えば、腎臓を例に取ると、正常な遺伝子を有するときには完全な腎臓が生成されるが、ある遺伝子が欠損または異常を有すると、腎臓のような器官はできるものの、その一部に異常ないし欠損が生じるようなことがあり、そのような異常ないし欠損が生じる部分がこの「身体部分」の例であるといえる。遺伝子の欠損ないし異常が必ずしも臓器ごとに対応しておらず、その一部に影響があることが頻繁にあることから、遺伝子との対応関係を考える場合は、身体部分での対応を考慮したほうがよいこともあり、本明細書においてもそのような対応関係をも考慮することとする。
　本明細書において「胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とは、多分化能を有するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すると産生個体はキメラマウスを形成する現象を利用して、欠損している臓器または身体部分を補完させる技術をいう。このような技術の基本的手法については、特許文献１などを参照することができる。
　本明細書において「標識」とは、補完された臓器を宿主から識別するために使用される因子をいう。したがって、臓器のみ、宿主のみを標識してもよく、両方を別の峻別可能なもので標識してもよい。
　本明細書において「第一多能性幹細胞」とは、ファウンダー動物の宿主（本明細書中ホストともいう。）となるべき起源として使用される多能性幹細胞またはそれに由来する細胞塊をいい、好ましくは、受精卵・胚が使用される。
　本明細書において「第二多能性幹細胞」とは、生産すべき臓器を目的として使用される多能性幹細胞をいう。
　本明細書において「欠損を補完する能力を有する」とは、因子または遺伝子等について言及するとき、臓器または身体部分を補うことができる能力をいう。
　本明細書において「キメラ胚盤胞」とは、第一多能性幹細胞由来の細胞と、第二多能性幹細胞由来の細胞とがキメラ状態となって形成される胚盤胞をいう。
　（分子生物学）
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
　本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ－５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン塩基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１－９８（１９９４））。
　本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでも目的とする機能が保持される限りいずれでもよい。
　本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８５：２４４４－２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子（例えば、Ｓａｌｌ１、Ｐｄｘ－１など）には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　本明細書において、特定の遺伝子配列にハイブリダイズする核酸配列も、機能を有する限り使用することができる。ここで、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメータによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ　Ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｗｉｔｈ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｐａｒｔ　Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に見出される。
　代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ　Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０～５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
　本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１～３８、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
　本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ　２．２．９（２００４．５．１２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
　本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、Ｓａｌｌ１、Ｐｄｘ－１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
　本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１～ｎ－１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
　本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。
　本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
　このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
　本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、腎臓欠損、膵臓欠損など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、腎臓欠損、膵臓欠損など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
　本発明の実施の形態を具体的に説明することを目的として、以下に例示的な実施形態を記載する。
　（繁殖用のファウンダー動物の生産方法）
　本発明の一つの局面は、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物に関する。
　この動物（本明細書において「ファウンダー動物」ともいう。）を用いて、次世代動物を生産することによって、目的の臓器を欠損させて、その臓器について、所望のゲノム型を有する臓器を生産することができる。しかも、この方法で生産すると、次世代においても臓器生産をすることができることが判明していることから、本発明の産業用の応用への道が大きく開けることになった。
　本発明のファウンダー動物において使用される「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分」とは、ある因子について言及するとき、その因子により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となるものであれば任意のものを使用することができる。例えば、外来遺伝子の場合、その遺伝子が生物に導入され、その遺伝子が正常に発現すると、ある臓器または身体部分に欠損が生じ、その結果生存し得ないまたは生存困難となることをいう。生存困難とは、次世代に子孫を残せないことを含む。臓器または身体部分としては、例えば、膵臓、腎臓などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　そのような事象に関連する遺伝子としては、例えば、Ｐｄｘ－１（これに対する膵臓）、Ｓａｌｌ１（これに対する腎臓）、などを挙げることができる。
　なお、臓器生産用とするには、臓器を補完し、かつ、それ以外の要因（母親マウスからミルクが摂取できない等）により出生後死んだりするようなことのない遺伝子を選択すべきである。そのような遺伝子としては、Ｐｄｘ－１を挙げることができる。このような性質を有する遺伝子を用いて、本願発明を実施することができる。そして、例えば、表現型が膵臓の欠損と同様であっても意味合いは大きく異なり、具体的にはノックアウトでは生産効率の向上、トランスジェニックではそれに加えて、致死表現型のクローナルな解析を可能にするという特徴がある。
　本明細書において「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる」とは、ある要因について、その要因が機能すると、ホストである動物がまったく生存できずに死ぬか、あるいは、生きることはできるが、成長困難であるとか生殖困難であるなどの理由で、その後の生存が実質的に不可能になることをいい、当該分野において通常の知識を用いて理解することができる。このような例は、もともとそのような遺伝的特徴を有する臓器等を有するもののほか、そのような特徴を有する遺伝子を導入することによって、生産することができる。
　本明細書において「臓器」とは、当該分野において通常の意味で用いられ、動物の内臓を構成する器官一般を指す。ファウンダー動物としては、特に、存在しないと次世代が通常は生存しないような臓器、たとえば、腎臓、膵臓などが想定されるが、これら以外も本発明の範囲に入ることが理解される。
　本明細書において「身体部分」とは、身体のいずれかの部分を指し、一般に臓器と称されないものをも含む。例えば、腎臓を例に取ると、正常な遺伝子を有するときには完全な腎臓が生成されるが、ある遺伝子が欠損または異常を有すると、腎臓のような器官はできるものの、その一部に異常ないし欠損が生じるようなことがあり、そのような異常ないし欠損が生じる部分がこの「身体部分」の例であるといえる。遺伝子の欠損ないし異常が必ずしも臓器ごとに対応しておらず、その一部に影響があることが頻繁にあることから、遺伝子との対応関係を考える場合は、身体部分での対応を考慮したほうがよいこともあり、本明細書においてもそのような対応関係をも考慮することとする。たとえば、身体部分とは、膵臓の一部であるランゲルハンス島、腎臓の一部である糸球体などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　本明細書において「胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とは、多分化能を有するＥＳ細胞などの多能性幹細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すると産生個体はキメラマウスを形成する現象を利用して、欠損している臓器または身体部分を補完させる技術をいう。本発明者らは、困難と考えられていた胚盤胞補完について、腎臓、膵臓、毛および胸腺などの複数種の細胞からなる複雑な細胞構成を有する哺乳動物の臓器を、動物、特に非ヒト動物の生体中で作製することができることを見出しており（特許文献１）、この技術は、本発明において全面的に利用することができる。
　本明細書において「標識」とは、補完された臓器を宿主から識別するために使用される限りどのような因子でもよい。したがって、臓器のみ、宿主のみを標識してもよく、両方を別の峻別可能なもので標識してもよく、例えば、補完されるべき臓器にのみ特定の遺伝子（例えば、蛍光タンパク質を発現する遺伝子など）を発現するようにすることにより、その特定の遺伝子に起因する性質（例えば、蛍光）によって補完されるべき臓器を、補完の宿主から識別することができる。あるいは、宿主のみを同様に標識し、補完された臓器に対応する細胞については別の標識または標識なしで識別することもできる。このようにして、外部の細胞由来の細胞が補完によって完全な動物となったのか、内部の細胞由来の細胞が補完されて完全な動物になったのかを区別することができ、これにより、より簡単に本発明のファウンダー動物を選択することができる。この細胞は、移植する前に、特異的に検出するための蛍光タンパク質を発現可能な状態で組み込んでもよい。例えば、その様な検出用の蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄの遺伝子変異体、ＤｓＲｅｄ．Ｔ４（Ｂｅｖｉｓ　Ｂ．Ｊ．ａｎｄ　Ｇｌｉｃｋ　Ｂ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３－８７，２００２）を、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリアクチン遺伝子プロモーター）の制御によりほぼ全身臓器に発現するように配列設計し、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）によりＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に組み込むことができる。この様な移植用の細胞に対する蛍光による標識を行うことにより、製造された臓器が移植された細胞のみから構成されているか否かを容易に検出することができる。
　そのような標識の例としては、上記の他、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、その他蛍光タンパク質およびＬａｃＺなどを挙げることができる。
　別の局面では、本発明は、本発明のファウンダー動物を生産する方法であって、Ａ）前記遺伝子を有する第一多能性幹細胞を提供する工程；Ｂ）該第一多能性幹細胞を胚盤胞に成長させる工程；Ｃ）該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性幹細胞により、前記臓器またはその一部が補完されたものを選択する工程を包含する方法を提供する。
　本発明のファウンダー動物の生産方法において使用される「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする（欠損原因）遺伝子」（または「欠損原因遺伝子」）は、その因子が機能すること（例えば、外来遺伝子の場合、導入され発現されるか、あるいは内因性の場合そのような遺伝子が機能する条件に晒されることなど）により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となる遺伝子であれば、任意のものを使用することができる。そのようなものの代表例としては、例えば、Ｐｄｘ－１（これに対する膵臓）、Ｓａｌｌ１（これに対する腎臓）などを挙げることができる。
　本発明において使用される「多能性幹細胞」とは、卵細胞、胚性幹細胞（Ｅｍｂｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）または誘導型多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ｍＧＳ細胞）などを挙げることができる。ファウンダー動物の生産の原理は、いったんＥＳ細胞において証明されたならば、他の多能性幹細胞においても応用可能であるからである。それが証拠に、本発明においては、同様の手法を用いてｉＰＳ細胞を用いてファウンダー動物生産およびそれを用いた臓器生産の方法に成功したことが証明されている。
　本発明のファウンダー動物細胞において使用される「第一多能性幹細胞」は、ファウンダー動物のホストとなるべき起源として使用される多能性幹細胞またはそれに由来する細胞塊であれば、どのような細胞等を使用してもよく、好ましくは、内部細胞塊(ICM)、受精卵または胚などが使用される。
　本発明において使用される「第二多能性幹細胞」とは、生産すべき臓器を目的として使用される多能性幹細胞であって、第一多能性幹細胞とキメラ胚盤胞を形成して成長することができる細胞である限りどのような細胞であってもよく、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を用いることができる。
　本発明において使用される「欠損を補完する能力を有する」「因子」または「遺伝子」等は、臓器または身体部分を補うことができる因子または遺伝子等であれば、いかなる公知のものを使用してもよいことが理解される。
　本発明において使用される「キメラ胚盤胞」は、第一多能性幹細胞由来の細胞と、第二多能性幹細胞由来の細胞とがキメラ状態となって形成される胚盤胞をいい、例えば、注入法のほか、いわゆる「凝集法」といった胚＋胚、もしくは胚+細胞をシャーレ内で密着させキメラ胚盤胞を作製する方法などを利用することによって生産することができる。また、本発明においてはレシピエントとなる胚と移植される細胞との関係は、同種の関係であっても異種の関係であってもよい。このような異種間でのキメラ動物作成は、従来より当該技術分野において多数の報告がなされており、例えばラット－マウス間のキメラ作出（Ｍｕｌｎａｒｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ．２７６，３７９－３８１（１９７３）；Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２４３，４７２－４７３（１９７３）；Ｔａｃｈｉ，Ｓ．＆Ｔａｃｈｉ，Ｃ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８０，１８－２７（１９８０）；Ｚｅｉｌｍａｒｋｅｒ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４２，１１５－１１６（１９７３））、ヒツジ－ヤギ間のキメラ作出（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４－６３６（１９８４））など、近縁の動物種間での胚胞キメラ動物が実際に報告されている。したがって、本発明において、例えばヒト以外の哺乳動物細胞由来の腎臓をマウスの生体内で作成する場合には、これらの従来から知られているキメラ作出方法（例えば、移植する細胞を、レシピエントとなる胚盤胞中に挿入する方法（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４－６３６（１９８４）））に基づいて、異種のある臓器をレシピエントとなる胚中で作成することができる。
　本発明のファウンダー動物の生産方法において、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子（または、欠損原因遺伝子）を有する第一多能性幹細胞を提供する工程は、例えば、その遺伝子を持っている多能性幹細胞を調達するか、あるいは、多能性幹細胞中に、その遺伝子を導入してその遺伝子を有する多能性幹細胞を生産することによって実施することができる。このような遺伝子の導入方法は、当該分野において周知であり、当業者は、適宜選択してこのような遺伝子導入を実施することができる。好ましくは、エレクトロポレーションを用いるとよい。それは、細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、ＤＮＡを細胞内部に送り込むことで、形質転換すなわち目的遺伝子の導入を起こすことから、その後のダメージが少ないなどということが理由として挙げられるが、それに限定されない。
　本発明のファウンダー動物の生産方法において、第一多能性幹細胞（例えば、受精卵、胚など）を胚盤胞に成長させる工程は、多能性幹細胞を胚盤胞にするための任意の公知の成長方法により実施することができる。そのような条件は当該分野において周知であり、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ、Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（本明細書において参考として援用される）に記載される。
　本発明のファウンダー動物の生産方法において、胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程は、第二多能性幹細胞を胚盤胞に導入することができる限り、当該分野において公知のどのような方法を用いてもよい。そのような手法としては、例えば、注入法もしくは凝集法が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明のファウンダー動物の生産方法において、キメラ胚盤胞から個体を生産する方法は、当該分野において公知の手法を用いることができる。通常は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて仮親の胎内で成長させるがこの手法に限定されない。
　本発明のファウンダー動物の生産方法において、臓器またはその身体部分が補完されたものを選択することは、その臓器または身体部分の補完を確認しうる任意の手法を用いて実施することができる。
　そのような手法の例としては、第二多能性幹細胞に由来する識別子を識別することを挙げることができる。本明細書において「識別子」とは、ある個体または種などを特定し、由来を同定することができる任意の因子をいい、略称として「ＩＤ」とも称される。そのような識別子は、例えば、第二多能性幹細胞に特有のゲノムの配列であり得る。あるいは、このような選択は、第二多能性幹細胞として、標識されたものまたは標識されうるもの（遺伝子発現によって標識となるものも含む）を用い、本発明のファウンダーマウスの生産方法における選択を、該標識を同定することによって実施することができる。このほかにも、適宜当業者は、この手法を改善して実施することができることが理解される。
　（ファウンダー動物を用いた臓器再生方法）
　別の局面において、本発明は、目的の臓器または身体部分を生産する方法を提供する。この方法は、Ａ）ファウンダー動物を提供する工程であって、ファウンダー動物における欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；Ｂ）該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程；Ｃ）該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；およびＤ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程を包含する。
　ここで、このＤ）工程は、前記キメラ胚盤胞を該動物（倫理上好ましくは、非ヒト宿主哺乳動物）の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することによって実施することができる。
　（膵臓の形成）
　膵臓の形成については、肉眼的所見、染色後の顕微鏡観察、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
　例えば、肉眼的所見を行うことにより、実際に臓器が存在するか否か、臓器の外観などの特徴を調べることができる。この様なマクロの形態学的解析とあわせて、ヘマトキシリン－エオジン染色などの一般的組織染色後の組織を顕微鏡によりミクロ的に観察することもできる。このようなミクロ的な観察により、具体的な膵臓内部の様々な細胞の構成まで含めて調べることができる。
　さらに、条件に応じて蛍光を発する様に蛍光を使用した遺伝子発現解析を行うことも可能である。例えば、本明細書中の実施例において記載されるＰｄｘ１遺伝子ローカスにＬａｃＺ遺伝子をノックイン（ノックアウトでもある）したマウス（Ｐｄｘ１－ＬａｃＺノックインマウス）由来胚盤胞の場合、野生型（＋／＋）あるいはヘテロ（＋／－）の個体では蛍光標識されたＥＳ細胞を使用した場合その寄与が見られたとしてもまだらのキメラ状態の蛍光を示すが、ホモ（－／－）個体では膵臓が完全にＥＳ細胞由来の細胞により構築されるため、まんべんなく一様の蛍光を呈するという特徴を有する。このような特質を利用して、目的とする臓器または臓器を構成する細胞が、Ｐｄｘ１遺伝子に関してどのような遺伝子型であるかを簡便に調べることができる。ｉＰＳ細胞およびｍＧＳ細胞を使用することができる。例えば、ｉＰＳ細胞を作製するには、Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ　４４８（７１５１）３１３－７（２００７）等を参照することができる。この文献に基づいて作製されたＮａｎｏｇ－ｉＰＳと呼ばれるｉＰＳ細胞株の場合は、マーキングがなされていないことから、キメラ作製に用いた場合ホストの胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、このＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、上記ＥＳ細胞の場合と同様のプロトコールで実験をすることができる。そして、以上のような細胞を用いれば、ＥＳ細胞を用いた場合と同様のプロトコールで臓器を作り、その由来を明らかにすることが可能となる。
　本発明で得られる目的臓器は、完全に前記異個体宿主哺乳動物由来のものであることが特徴である。従来の方法では、キメラのものが再生されていた。理論に束縛されることは望まないが、欠損する遺伝子の発生過程における機能、特に臓器形成過程における各臓器の幹／前駆細胞の分化・維持に必須な転写因子であったことが原因であると考えられる。本発明では、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞およびｍＧＳ細胞等を使用することができ、上記のように標識を付すことができる。
　本発明はまた、本発明の方法によって生産された哺乳動物を提供する。このような目的臓器を有する動物は、従来生産することができなかったことから、動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、遺伝子欠損により示される欠損臓器が生存に必須であり、それらを救済する方法が存在しなかったことが原因であると考えられる。
　本発明はさらに、発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト宿主哺乳動物の、目的臓器の製造のための使用も提供する。このような用途で宿主細胞を使用することは従来十分に想定されていなかった。したがって、このような宿主動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、遺伝子欠損により示される欠損臓器が生存に必須であり、性成熟に達する週齢まで目的個体の維持が不可能であったことが原因であると考えられる。
　（他の幹細胞の場合）
　ＥＳ細胞以外の幹細胞として、例えばｉＰＳ細胞およびｍＧＳ細胞などを使用することができる。例えば、ｉＰＳ細胞を作製するには、Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，ｉｂｉｄを参照することができる。ｍＧＳ細胞についても同様に、当該分野において公知の手法（Ｍｉｔｏ　Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｍｏｕｓｅ　Ｔｅｓｔｉｓ．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．１１９，１００１－１０１２（２００４））を用いることができる。マーキングがなされていない場合は、キメラ作製に用いた場合ホストの胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、このＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、上記ＥＳ細胞の場合と同様のプロトコールで実験をすることができる。そして、以上のような細胞を用いれば、ＥＳ細胞を用いた場合と同様のプロトコールで臓器を作り、その由来を明らかにすることが可能となる。
　（ｉＰＳ細胞）
　ｉＰＳ細胞はＯｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，ｉｂｉｄ以外の他の方法によっても作製することができる。すなわち、ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子（単数または複数の因子の組み合わせでありうる）を接触させることによって初期化を誘導させて生産することができる。そのような初期化および初期化因子の例としては以下のようなものを挙げることができる。たとえば、本発明の実施例では、ｉＰＳ細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４；これらは本発明において使用される代表的な「初期化因子」である）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って本発明者らが独自に作製したが、このほかの組み合わせ、たとえば、Ｙａｍａｎａｋａ因子とも呼ばれるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子を用いることもでき、その改良法を用いることもできる。ｃ－Ｍｙｃの代わりにｎ－Ｍｙｃを用い、レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いてもｉＰＳ細胞の樹立は可能である（Ｂｌｅｌｌｏｃｈ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　１：２４５－２４７）。また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功しており（Ｙｕ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，（２００７）．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８：１９１７－１９２０）、これらも本発明において利用することができる。
　マウスｉＰＳ細胞樹立で使用されたマウス遺伝子のヒト相同遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃを用いて線維芽様滑膜細胞、および新生児包皮由来の線維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞を生産することもできる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２．）。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃの４遺伝子にｈＴＥＲＴ・ＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔを加えた６遺伝子を用いてヒトｉＰＳ細胞の樹立することもできる（Ｐａｒｋ　ＩＨ，ｅｔ　ａｌ．，（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４５１：１４１－１４６．）。また、ｃ－Ｍｙｃの遺伝子導入をせずにＯｃｔ－４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の３因子だけでも、低効率ながらマウスおよびヒトにおいてｉＰＳ細胞の樹立が可能であることが示されており、ｉＰＳ細胞が癌細胞に変化するのを抑えるのに成功していることから、本発明においてこれを利用することもできる（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，（２００８）．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２６：１０１－１０６．；Ｗｅｒｉｎｇ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，（２００８）．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２：１０－１２）。また、遺伝子産物のみならず、低分子化合物でもｉＰＳ細胞を生産することができ、これらも本発明において利用することができる（Ｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ａ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００８　Ｊｕｎ　５；２（６）：５２５－５２８を参照）。
　（種々の動物を使用する場合の留意点）
　マウス以外の動物を使用する場合は、以下の点に留意することで、本明細書の実施例に記載した手法を応用して実施することができる。例えば、他種の動物におけるキメラ作製に関して、マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりは、胚もしくは胚の中でもＥＳ細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告（ラット：（Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｒａｔ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ　ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１－１０（１９７４））；ウシ：（Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｔｌｅ　ｃｈｉｍｅｒａｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｅｍｂｒｙｏ　ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５））；ブタ：（Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｉｇｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６－１８７（１９９２）））が多いが、内部細胞塊を注入したキメラを用いても、本明細書に記載した方法を応用することができる。これらのように内部細胞塊を用いることで欠損動物の失われた臓器を補うことは事実上可能である。すなわち、例えば、上記細胞をいずれも胚盤胞までｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養し、得られた胚盤胞から内部細胞塊を物理的に一部剥離し、それを胚盤胞へインジェクションすることができる。途中の８細胞期あるいは桑実胚同士を凝集させキメラ胚を作製することができる。
　ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞の代わりに内部細胞塊を注入したキメラを用いた場合、本明細書に記載した実施例において、以下の点を変更ないし修正して使用する必要があることに留意すべきであるが、これらは当該分野における周知技術の範囲内の技術であることが理解される。
　ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞の代わりに内部細胞塊を注入したキメラを用いる場合は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞と異なり細胞株ではないので別途胚を作製する過程（自然交配後の採卵、あるいは人工授精）が必要となる。そのようなプロトコールは、上記各文献（ラット：（Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｒａｔ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ　ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１－１０（１９７４））；ウシ：（Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｔｌｅ　ｃｈｉｍｅｒａｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｅｍｂｒｙｏ　ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５））；ブタ：（Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｉｇｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６－１８７（１９９２））に記載されており、必要に応じてこれらの文献を参考として援用する。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　（実施例１）
　本実施例では、ファウンダー動物としてマウスを選び、欠損させるべき臓器として膵臓を選択した。さらに、膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスを作製するためにＰｄｘ１遺伝子を用いた。
　（使用したマウス）
　膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｐｄｘ１ｗｔ／ＬａｃＺおよびＰｄｘ１ＬａｃＺ／ＬａｃＺ（ファウンダー）を使用した。Ｐｄｘ１遺伝子ローカスにＬａｃＺ遺伝子をノックイン（ノックアウトでもある）したマウス（Ｐｄｘ１－ＬａｃＺノックインマウス）由来胚盤胞を使用した。
　（Ｐｄｘ１－ＬａｃＺノックインマウス）
　コンストラクト作製に関しては詳しくは既報の論文（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２２，９８３－９９５（１９９６））に基づいて作製することができる。簡単には、以下のとおりである。相同領域のアームはＰｄｘ１領域を含むλクローンよりクローニングしたものを使用することができる。本実施例では、京都大学大学院医学研究科腫瘍外科学研究室川口義弥先生より供与されたものを使用した。
　（トランスジェニック・ノックインの手法：Ｐｄｘ１－ＬａｃＺノックインマウス）
　上記のコンストラクトをＥＳ細胞にエレクトロポレーションで導入しポジティブ／ネガティブ選択後、サザンブロティングによりスクリーニングし、得られたクローンを胚盤胞注入しキメラマウスを作製した。その後生殖系列にのったラインを確立し、遺伝的な背景をＣ５７ＢＬ／６系統にバッククロスさせて作製することができる。
　（交配）
　次に、本実施例では、こうして樹立されたマウスのヘテロマウス同士を交配し、使用した（図１）。上記ノックインマウスに関してはホモでの維持ができない（出生後１週間程度で死んでしまう）ため、ヘテロマウス同士を交配し胚を回収することとした。
　（マウスの維持手順および確認）
　胚盤胞にＥＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した。この際のＥＳ細胞にはＥＧＦＰでマーキングされたＧ４．２という株を使用した（ＲＩＫＥＮＣＤＢ，丹羽仁史先生より供与）。これと同等のマーキングされたＥＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。
　産仔はノックインマウスであればホモになる確率が１／４となるため目的の“膵臓欠損＋ＥＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため、両者とも血液および組織の細胞を採取し、フローサイトメーターによりＥＧＦＰ陰性を示す細胞（ＥＳ細胞由来ではなく、注入された胚由来の細胞）を分取し、ゲノムＤＮＡを抽出、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで当たりのマウスを判定した（図２）。用いたプライマーは以下の通りである。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＴＣ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　ＡＡＣ（配列番号１）
リバース１（Ｒｖ１）：ＴＴＣ　ＡＡＣ　ＡＴＣ　ＡＣＴ　ＧＣＣ　ＡＧＣ　ＴＣＣ（配列番号２）
リバース（Ｒｖ２）：ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＣ（配列番号３）。
　この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるためその仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように末梢血中のホスト由来の細胞を用いた遺伝子型の解析を行いその遺伝子型を特定する。
　補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する最初のステップとして膵臓の形態観察が容易な新生児期において機能マーカーの発現解析を行った。
　図３に、新生児期で解剖したマウス膵臓より作製した凍結切片に免疫染色を施した像を示す。抗体は外分泌組織の指標として抗α－アミラーゼ抗体（ＳＩＧＭＡ社より購入ｃａｔ．＃Ａ８２７３）、内分泌組織の指標として抗インスリン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２４２１）、抗グルカゴン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２２７１）、抗ソマトスタチン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２６５１）、膵管の指標としてＤＢＡ－Ｌｅｃｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社より購入ｃａｔ．＃ＲＬ－１０３２）をそれぞれ染め分けた。こられがすべて陽性であることから、補われた膵臓は正常に機能していることが示唆される。
　この結果からほぼすべての機能マーカーの発現が認められ、生存に事足りる正常な機能を持っていると考えられる。
　次に、補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する次のステップとして成体マウスにて血糖値の測定を行う(図４）。
　図４には、血糖値を指標とした膵臓補完マウスにおける膵機能評価の結果を示す。（１）は定常状態における血糖値で、成熟した膵臓補完マウスの血糖値をメディセーフミニＧＲ－１０２（ＴＥＲＵＭＯ社より購入）により測定した値の平均および標準偏差を示す。コントロールとしてＰｄｘ１アレルをヘテロにもつキメラマウスおよび、膵臓機能の低下したＳＴＺ－ＤＭモデルの値を示す。また（２）は糖負荷後の血糖値の変遷を同メディセーフミニにより測定した結果を示す。これらの結果は血糖調節能の正常性を示し、作製された膵臓補完マウスがファウンダーとして用いる際にも長期に生存可能であることを示唆している。
　すなわち、糖負荷後、一度上昇した血糖値もコントロールとして用いたヘテロ（＋／－）キメラと同様に正常値に戻ることから、作製されたＫＯキメラ（ファウンダー）は糖尿病などの症状を示さず、長期生存の可能性が示された。
　次に、ファウンダーマウスとして次世代にその表現型を伝搬することが可能かどうかを、ヘテロ個体との交配により得られた産仔より明らかにしようと試みた。図５はその工程および結果を示す。得られた産仔の尻尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、（マウスの維持手順および確認）の項で用いたプライマーを使ったＰＣＲを行った。その結果ヘテロもしくはノックアウト個体しか得られないことが明らかとなり、このことはファウンダーがノックアウト個体で、次世代にその表現型を伝えることができるということを強く示唆している。
　すなわち、ノックアウト（ＫＯ）とヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであり、そのとおりの結果が示された。
　このことから例えば膵臓を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。
　（使用したマウス）
　膵臓欠損を特徴とするトランスジェニックマウスとして、Ｐｄｘ１プロモーター領域下にＨｅｓ１遺伝子を繋げたコンストラクトをマウス前核期卵に注入し作製したマウス（Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１マウス）を用いた。コンストラクト作製に関して既報の論文（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　４３，３３２－３３９（２０００））で使用されたＰｄｘ１プロモーター領域を含むコンストラクトのＰａｘ６遺伝子部にＨｅｓ１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）を挿入し作製することができる。
　（トランスジェニックの手法）
　上記のコンストラクトをＣ５７ＢＬ６マウスおよびＢＤＦ１マウス（日本ＳＬＣ株式会社より購入）を交配して得られた前核期卵にマイクロインジェクターを用いて注入し、仮親へ移植してトランスジェニックマウスを作製する。図６に胚盤胞補完作用によって生産した膵臓が補われたマウスの例を示す。
　Ｐｄｘ１（特に胎生期の膵臓で発現）のプロモーター下で発現するＨｅｓ１の発現量に依存して膵臓の形成度合が異なる。発現が高い（＝コピー数が多い）と膵臓の欠損を示す。Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジェニックのＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎによる膵臓再生を示す。同マウスを用いてＥＳ細胞由来の膵臓を作ることが可能である。
　このことからＰｄｘ１ノックアウトマウス同様にこのようにして作製されたトランスジェニックマウスも膵臓を補うことが可能であることが実証された。
　（ファウンダートランスジェニックマウスの作製）
　上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製するため図７に示したストラテジーを適用した。
　簡単に説明すると、Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジーンを注入した胚を胚盤胞まで培養し、そこにマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下でＥＳ細胞等を注入することで、膵臓の欠損を補った。この際のＥＳ細胞にはノックアウトの項と同様にＥＧＦＰでマーキングされたＧ４．２というＥＳ細胞株（ＲＩＫＥＮ　ＣＤＢ，丹羽仁史先生より供与）。これと同等のマーキングされたＥＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。このようにトランスジーンを導入した胚にＥＳ細胞を注入するという二重の胚操作を適用することで、１世代目のトランスジェニックから膵臓を補うことが可能となり、それらが次世代へ膵臓欠損という表現型を伝搬できるファウンダー動物となり得る。
　従来の方法では、前核期卵に遺伝子を導入した後、移植するのが従来のトランスジェニックマウス作製法であるが、それだと膵臓を欠損する表現型を持つマウスは出生後死んでしまう。したがって、本発明は、従来の方法では達成し得なかった技術を提供することになる。
　図８にはその生産過程における結果を表にまとめたものを示す。
　この生産過程では、キメラは毛の色で判断した。ドナーのＥＳ細胞は１２９系統マウス（アグーチ）由来、ホストの胚はＣ５７ＢＬ６ｘＢＤＦ１（黒）由来のため体毛が生えそろえばキメラかどうかは判断可能である。トランスジェニックの判定は、尻尾から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲによりトランスジーンを検出することによって行った。
　産仔はトランスジェニックであればトランスジーンが次世代に伝わる確率は１／２となるため目的の“膵臓欠損＋ＥＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため図９に示すように野生型マウスと交配させ、トランスジーンの伝搬を産仔の尻尾から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで確認するとともに、それら産仔の膵臓の形態を観察した。ＰＣＲには以下のプライマーセットを用いた。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＧＡ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＡＧＡ　ＧＧ（配列番号４）
リバース（Ｒｖ）：ＣＡＡ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡ（配列番号５）。
　使用したフォワードプライマーはＰｄｘ１プロモーター領域に対応するヌクレオチド配列に対してはハイブリダイズするように作製されており、リバースプライマーはＨｅｓ１　ｃＤＮＡ（アクセッションＮｏ．がＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されている。このようなＰｄｘ１プロモーターとＨｅｓ１　ｃＤＮＡが近傍に存在することは野生型マウスでは起こり得ないため、これらのプライマー用いたＰＣＲにより、トランスジーンを効率的に検出することが可能である。
　以上の実験より、図８中の＃３７が次世代で膵臓欠損を起こすことが可能であるファウンダーマウスであることが示唆される結果が得られた。
　このような方法をマウスに限らずその他大型動物等に適用することで、致死性の表現型を持つトランスジェニック動物およびノックアウト動物をより効率的に生産可能となると思われる。
　図９には、本実施例の工程および結果を示す。
　作製したトランスジェニックかつキメラであった個体を野生型と交配する。産仔の膵臓の形態解析、あるいはゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、膵欠損という表現型が次世代に伝わるかを明らかにする。もしトランスジェニック－キメラがファウンダーになりうるなら次世代で膵臓を欠損したマウスが産まれてくることになる。図８に示したファウンダー候補のうち＃３７が次世代で膵臓を欠損させることに成功した。このことから＃３７は作製段階で膵臓を補われたため出生後の正常性を示したことが示される。このようにトランスジェニックを用いても臓器欠損マウスのような胎生期および出生直後に死んでしまうようなマウスを効率的に生産できるファウンダーが作製可能であることになる。
　以上から、ＨＥＳ－１の強制発現により膵臓ができなくなるようにしたものを含むマウスであっても、Ｐｄｘ－１ノックアウトマウスであっても、臓器不全動物の死を胚盤法補完によりレスキューしてファウンダーとして使用することができることが示されたことになる。
　（実施例２：ｉＰＳ細胞を用いる例）
　本実施例では、ＥＳ細胞に代えてｉＰＳ細胞を用いて、実施例１と同様の実験を行った。なお、ｉＰＳ細胞は基本的に多能性幹細胞株であり、ＥＳ細胞に非常に酷似した特徴をもつため、実施例１において行ったプロトコールをそのまま実施することができる。すなわち、培養方法、胚への導入方法に相違はなく、実施例１に記載のものを用いて実施することができることが理解される。
　（ｉＰＳ細胞の調製例）
　本発明者らは、ｉＰＳ細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って生産した。そのプロトコールは以下のとおりである。そのスキームは図１０および詳細には図１１ａに示した。
　（ＧＦＰマウス尻尾由来繊維芽細胞（Ｔａｉｌ　ｔｉｐ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＴＴＦ）の樹立）
　ＧＦＰトランスジェニックマウスより尻尾を約１ｃｍ採取し、皮を剥ぎ２～３片に刻んだ。それをＭＦ－ｓｔａｒｔ　ｍｅｄｉｕｍ（ＴＯＹＯＢＯ，日本）中に置き、５日間培養した。そこで出現してきた繊維芽細胞を新たな培養皿に撒きなおし数継代し、これを尻尾由来繊維芽細胞（ＴＴＦ）とした。
　（＋３因子（初期化因子）の導入）
　目的遺伝子およびウイルスエンベロープタンパク質を導入し作製したウイルス産生細胞株（２９３ｇｐもしくは２９３ＧＰＧ細胞株）より上清を回収し、遠心濃縮後凍結保存しておいたウイルス液を前日に１×１０５細胞／６ウェルプレートになるよう継代したＴＴＦ細胞の培養液中に加え、これを３因子（初期化因子）の導入とした。
　（２５～３０日間のＥＳ細胞用培地での培養）
　３因子（初期化因子）導入後、翌日ＥＳ培養用の培養液に置換し２５～３０日間培養した。この際、毎日培養液の置換を行った。
　（ｉＰＳコロニーのピックアップおよびｉＰＳ細胞株の樹立）
　培養後出現してきたｉＰＳ細胞様コロニーをイエローチップ（たとえば、Ｗａｔｓｏｎから入手可能）にてピックアップし、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で単一細胞にまでバラバラにし、新たに用意したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）上に撒いた。
　（結果）
　上記方法により樹立されたｉＰＳ細胞株は図１１ｂ－ｆに示したようなｉＰＳ細胞としての特徴すなわち未分化性と全能性とを有していることが証明された。
　図１１に上記実験の結果を示す。図１１ｂに示すように、樹立されたｉＰＳ細胞株２株について、その形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影した。その条件は以下のとおりである。
　ピックアップ後のｉＰＳ細胞を継代後、ディッシュ上でセミコンフルエントになった段階で観察および撮影を行った。
　形態的にＥＳ細胞様の未分化コロニーを形成することがわかった。
　図１１ｃに示すように、ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社　Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ－５２００）により染色を施した。その条件は以下のとおりである。
　明視野像、ＧＦＰ蛍光像をカメラを付属した顕微鏡にて観察・撮影後、培養液を除きリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したｉＰＳ細胞の培養ディッシュに１０％ホルマリン・９０％メタノールからなる固定液を、添加し、１～２分固定処理を施した。これを洗浄液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５））で一度洗浄した後、上記キットの染色液を添加し、暗所にて１５分間静置した。その後、再び洗浄液で洗浄後、観察・撮影した。
　図１１ｃに示されるように、本実施例で作製したｉＰＳ細胞は、ＧＦＰマウス由来であるため、ＧＦＰを恒常的に発現し、未分化細胞に特徴的である高いアルカリフォスファターゼ活性を示すことがわかった。
　図１１ｄに示すように、ｉＰＳ細胞樹立の際にゲノムＤＮＡ上に挿入された３因子の同定のため、ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った。その条件は以下のとおりである。
　ゲノムＤＮＡはＤＮＡ　ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い製造業者のプロトコールに従い、１ｘ１０６個の細胞からＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いＰＣＲを行った。
Ｏｃｔ３／４
Ｆｗ（ｍＯｃｔ３／４－Ｓ１１２０）：　ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＴＧＣ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ（配列番号６）
Ｒｖ（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）：　ＣＣＣ　ＴＴＴ　ＴＴＣ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ（配列番号７）

Ｋｌｆ４
Ｆｗ（Ｋｌｆ４－Ｓ１２３６）：　ＧＣＧ　ＡＡＣ　ＴＣＡ　ＣＡＣ　ＡＧＧ　ＣＧＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣ（配列番号８）
Ｒｖ（ｐＭＸｓ－ＡＳ３２００）：　ＴＴＡ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＣ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ（配列番号９）

Ｓｏｘ２
Ｆｗ（Ｓｏｘ２－Ｓ７６８）：　ＧＧＴ　ＴＡＣ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＣＴＣ　ＣＣＡ　ＣＴＣ　ＣＡＧ（配列番号１０）
Ｒｖ（ｐＭＸ－ＡＳ３２００）：　上記と同じ（配列番号９）

ｃ－Ｍｙｃ
ＦＷ（ｃ－Ｍｙｃ－Ｓ１０９３）：　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＡＡＣ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＧＣ（配列番号１１）
Ｒｖ（ｐＭＸ－ＡＳ３２００）：　上記と同じ（配列番号９）
　その結果図１１ｄに示されるように、３因子の挿入が確認された。
　図１１ｅに示すように、ＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンおよび導入された遺伝子の発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法により確認した。その条件は以下のとおりである。
　１ｘ１０５個のＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメーターを用いＴｒｉｚｏｌ－ＬＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に分取し、そこから抽出したｍＲＮＡよりＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い付属のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成をおこなった。合成されたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーはトランスジーンの発現（図中Ｔｇと表記）は上記図１１ｄと同様のプライマー、それ以外の遺伝子発現についてはＴａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ　＆　Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓの報告（Ｃｅｌｌ　２００６　Ａｕｇ　２５；１２６（４）：６５２－５．）等に基づきプライマーを合成したものを用いた。
　図１１ｅに示すように、いずれの株もＥＳ細胞とほぼ同様の発現パターンを示し、また導入された遺伝子（Ｔｇ）はｉＰＳ細胞の高い遺伝子サイレンシング活性によりその発現が抑えられていることがわかった。
　図１１ｆに示すように、樹立されたｉＰＳ細胞を胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した。その条件は以下のとおりである。
　ＰＭＳＧおよびｈＣＧホルモンの投与により過排卵誘起処理を施したＢＤＦ１系統のマウス（♀，８週齢）より採取した卵子とＣ５７ＢＬ／６由来の精子を用いインビトロ受精（ＩＶＦ；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｉｔｏｎ）を行い、受精卵を得た。それを８細胞期／桑実胚まで培養した後、凍結保存し、胚盤胞注入を行う前日に起こした。ｉＰＳ細胞はセミコンフルエントになったものを０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより剥がし、注入用にＥＳ細胞培養液に縣濁した。胚盤胞注入は胚盤胞補完での手法同様に顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて行い、注入後の培養を経て、ＩＣＲ系統の仮親子宮に子宮移植を施した。解析では、胎生１３日目および出生後１日目に蛍光実体顕微鏡下で観察および撮影した。
　図１１ｆに示されるように、胎児期および新生児期でｉＰＳ細胞由来の細胞（ＧＦＰ陽性）が確認でき、樹立されたｉＰＳ細胞株が高い多分化能を有していることが示唆される。
　（使用したマウス）
　膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｐｄｘ１ｗｔ／ＬａｃＺおよびＰｄｘ１ＬａｃＺ／ＬａｃＺ（ファウンダー）を使用した。Ｐｄｘ１遺伝子ローカスにＬａｃＺ遺伝子をノックイン（ノックアウトでもある）したマウス（Ｐｄｘ１－ＬａｃＺノックインマウス）由来胚盤胞を使用した。
　（Ｐｄｘ１－ＬａｃＺノックインマウス）
　ＥＳ細胞の代わりにｉＰＳ細胞を用いた以外は、実施例１に記載されるプロトコールに従って、Ｐｄｘ１－ＬａｃＺノックインマウスを作製した。
　（ファウンダーマウス）
　（使用したマウス）
　膵臓欠損を特徴とするトランスジェニックマウスとして、Ｐｄｘ１プロモーター領域下にＨｅｓ１遺伝子を繋げたコンストラクト（Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１コンストラクト）をマウス前核期卵に注入し作製したマウス（Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１マウス）を用いた（Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、コンストラクトの作製については実施例１を参照のこと）。
　上記のように作製したトランスジェニックマウスは、Ｐｄｘ１（特に胎生期の膵臓で発現）のプロモーター下で発現するＨｅｓ１の発現量に依存して膵臓の形成度合が異なる。発現が高い（＝コピー数が多い）と膵臓の欠損を示す。Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジェニックの胚盤胞補完による膵臓再生を示す。同マウスを用いてｉＰＳ細胞由来の膵臓を作ることが可能である。
　このことからＰｄｘ１ノックアウトマウス同様にこのようにして作製されたトランスジェニックマウスも膵臓を補うことが可能であることが実証される。
　（ファウンダートランスジェニックマウスの作製）
　上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製した。
　簡単に説明すると、Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジーンを注入した胚を胚盤胞まで培養し、そこにマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下でｉＰＳ細胞を注入することで、膵臓の欠損を補った。この際のｉＰＳ細胞には上記のように調製したＧＦＰでマーキングされたものを使用した。これと同等のマーキングされたｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。このようにトランスジーンを導入した胚にｉＰＳ細胞を注入するという２重の胚操作を適用することで、１世代目のトランスジェニックから膵臓を補うことが可能となり、それらが次世代へ膵臓欠損という表現型を伝搬できるファウンダー動物となり得る。
　（交配）
　次に、本実施例では、こうして樹立されたマウスのヘテロマウス同士を交配し、使用した。上記ノックインマウスに関してはホモでの維持ができない（出生後１週間程度で死んでしまう）ため、Ｐｄｘ１ｗｔ／ＬａｃＺおよびＰｄｘ１ＬａｃＺ／ＬａｃＺ（ファウンダー）同士を交配し胚を回収することとした。
　（マウスの維持手順および確認）
　胚盤胞に上記ｉＰＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した（図１０　ｉＰＳ細胞の胚盤胞注入）。従来の方法では、ＧＦＰでのマーキングすることが必要であったが、今回はあらかじめＧＦＰマウスの体細胞からｉＰＳ細胞を樹立したのであとからマーキングする必要はなく、そのまま使用した。もちろん、これと同等のマーキングされた他のｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。
　産仔はノックインマウスであればホモになる確率が１／４となるため目的の“膵臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため、両者とも血液および組織の細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ陰性を示す細胞（ｉＰＳ細胞由来ではなく、注入された胚由来の細胞）を分取し、ゲノムＤＮＡを抽出、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで当たりのマウスを判定した。用いたプライマーは以下の通りである。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＴＣ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　ＡＡＣ（配列番号１）
リバース１（Ｒｖ１）：ＴＴＣ　ＡＡＣ　ＡＴＣ　ＡＣＴ　ＧＣＣ　ＡＧＣ　ＴＣＣ（配列番号２）
リバース（Ｒｖ２）：ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＣ（配列番号３）。
　この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるためその仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように末梢血中の宿主由来の細胞を用いた遺伝子型の解析を行いその遺伝子型を特定する。
　このようにして作製したファウンダーマウスに由来する再生した臓器（膵臓）が機能的であることは、上記のように、ファウンダーマウス（♂）とpdx-1＋/－ヘテロタイプ（♀）をかけあわせて、生まれたpdx-1-/－仔マウスの由来のもので確認した。すなわち、補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する最初のステップとして膵臓の形態観察が容易な新生児期において機能マーカーの発現解析を行った。その結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。図１１Ａは、出生後５日目の新生児を顕微鏡下で解剖し、露出した膵臓を蛍光顕微鏡下で撮影したものを示す。
　図１１Ｂは、新生児期で解剖したマウス膵臓より作製した凍結切片に免疫染色を施した像を示す。抗体として内分泌組織の指標として抗インスリン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２４２１）を用いて染めたものを示す。このほかに、外分泌組織の指標として抗α－アミラーゼ抗体（ＳＩＧＭＡ社より購入ｃａｔ．＃Ａ８２７３）、抗グルカゴン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２２７１）、抗ソマトスタチン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２６５１）、膵管の指標としてＤＢＡ－Ｌｅｃｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社より購入ｃａｔ．＃ＲＬ－１０３２）をそれぞれ染め分けることもできる。インスリンが陽性であることから、他の抗体での染色をしなくても補われた膵臓は正常に機能していることが理解される。
　この結果からほぼすべての機能マーカーの発現が認められ、生存に事足りる正常な機能を持っていると考えられる。
　次に、補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する次のステップとして成体マウスにて血糖値の測定を行う。
　血糖値を指標とした膵臓補完マウスにおける膵機能評価の結果を参酌することができる。定常状態における血糖値で、成熟した膵臓補完マウスの血糖値をメディセーフミニＧＲ－１０２（ＴＥＲＵＭＯ社より購入）により測定した値の平均および標準偏差を参酌することができる。コントロールとしてＰｄｘ１アレルをヘテロにもつキメラマウスおよび、膵臓機能の低下したＳＴＺ－ＤＭモデルの値を使用しうる。また糖負荷後の血糖値の変遷を同メディセーフミニにより測定した結果を参酌することができる。これらの結果は血糖調節能の正常性を示し、作製された膵臓補完マウスがファウンダーとして用いる際にも長期に生存可能であることを示唆している。
　すなわち、糖負荷後、一度上昇した血糖値もコントロールとして用いたヘテロ（＋／－）キメラと同様に正常値に戻ることから、作製されたＫＯキメラ（ファウンダー）は糖尿病などの症状を示さず、長期生存の可能性が示すことができる。
　次に、ファウンダーマウスとして次世代にその表現型を伝搬することが可能かどうかを、ヘテロ個体との交配により得られた産仔より明らかにしようと試みた。図１２はその結果を示す。得られた産仔の尻尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、（マウスの維持手順および確認）の項で用いたプライマーを使ったＰＣＲを行った。その結果ヘテロもしくはノックアウト個体しか得られないことが明らかとなり、このことはファウンダーがノックアウト個体で、次世代にその表現型を伝えることができるということを強く示唆している。
　すなわち、ノックアウト（ＫＯ）とヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであり、そのとおりの結果が示された。
　このことから例えば膵臓を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。
　（キメラの確認）
　キメラは毛の色で判断することができる。ドナーのｉＰＳ細胞はＧＦＰトランスジェニックマウス由来、宿主の胚は野生型であるＣ５７ＢＬ６ｘＢＤＦ１（黒）由来であるので、ＧＦＰの蛍光により判断することができる。トランスジェニックの判定は、尻尾から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲによりトランスジーンを検出することによって行う。
　産仔はトランスジェニックであればトランスジーンが次世代に伝わる確率は１／２となるため目的の“膵臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため野生型マウスと交配させ、トランスジーンの伝搬を産仔の尻尾から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで確認するとともに、それら産仔の膵臓の形態を観察した。ＰＣＲには以下のプライマーセットを用いる。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＧＡ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＡＧＡ　ＧＧ（配列番号４）
リバース（Ｒｖ）：ＣＡＡ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡ（配列番号５）
　使用したフォワードプライマーはＰｄｘ１プロモーター領域に対応するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されており、リバースプライマーはＨｅｓ１ｃＤＮＡ（アクセッションＮｏ．がＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されている。このようなＰｄｘ１プロモーターとＨｅｓ１ｃＤＮＡが近傍に存在することは野生型マウスでは起こり得ないため、これらのプライマー用いたＰＣＲにより、トランスジーンを効率的に検出することが可能である。
以上の実験より、次世代で膵臓欠損を起こすことが可能であるファウンダーマウスであることが示唆される結果が得られる。
　このような方法をマウスに限らずその他大型動物等に適用することで、致死性の表現型を持つトランスジェニック動物およびノックアウト動物をより効率的に生産可能となるはずである。
　作製したトランスジェニックかつキメラであった個体を野生型と交配する。産仔の膵臓の形態解析、あるいはゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、膵欠損という表現型が次世代に伝わるかを明らかにする。もしトランスジェニック－キメラがファウンダーになりうるなら次世代で膵臓を欠損したマウスが産まれてくることになる。次世代で膵臓を欠損させることに成功したものを選択することができる。このようなマウスは作製段階で膵臓を補われたため出生後の正常性を示したことが示される。このようにトランスジェニックを用いても臓器欠損マウスのような胎生期および出生直後に死んでしまうようなマウスを効率的に生産できるファウンダーを用いてｉＰＳ細胞とともに臓器再生を実現することができる。
　以上から、ｉＰＳ細胞を用いてＨＥＳ－１の強制発現により膵臓ができなくなるようにした物を含むマウスであっても、Ｐｄｘ－１ノックアウトマウスであっても、臓器不全動物の死を胚盤法補完によりレスキューしてファウンダーとして使用することができることが示されたことになる。
　（実施例３：ｍＧＳ細胞を用いる例）
　本実施例では、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に代えてｍＧＳ細胞を用いて、実施例１または２と同様の実験を行う（Ｍｉｔｏ　Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｍｏｕｓｅ　Ｔｅｓｔｉｓ．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．１１９，１００１－１０１２（２００４）を参照）。なお、ｍＧＳ細胞は基本的に多能性幹細胞株であり、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に非常に酷似した特徴をもつため、実施例１または２において行ったプロトコールをそのまままたは適宜改変して実施することができる。すなわち、培養方法、胚への導入方法に相違はなく、実施例１または２に記載のものを適宜改変して用いて実施することができることが理解される。
　（実施例４：受精卵細胞を用いる例）
　本実施例では、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に代えて受精卵細胞（Ｍｉｎｔｚ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｅｇｇ：ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１３８，５９４－５９５（１９６２）を参照）を用いて、実施例１または２と同様の実験を行う。
　受精卵細胞を用いる場合は目的の遺伝子改変胚に合わせ、受精卵細胞を人工授精あるいは自然交配後の採卵により回収し、それら胚の透明帯を酸性タイロード溶液中に晒すことで除去し、同一シャーレ内で密接して培養することで凝集させ、キメラ胚盤胞を作製する方法を利用することができる。
　同様に処理した受精卵細胞の一部（割球）あるいは発生させ胚盤胞にまで達した胚の内部細胞塊を機械的に剥離し、遺伝子改変胚盤胞内へ注入する方法も利用可能である。
　（実施例５：腎臓の場合のファウンダー動物の生産）
　次に、この実施例では、腎臓欠損の場合もファウンダー動物を生産することができることを実証した。
　本実施例では、ファウンダー動物としてマウスを選び、さらに、腎臓欠損を特徴とするノックアウトマウスを作製するためにＳａｌｌ１遺伝子を用いる。
　（使用したマウス）
　腎臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（熊本大学発生医学研究センター、西中村隆一先生より供与）を使用した。Ｓａｌｌ１遺伝子は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の前後方部位特異的ホメオティック遺伝子ｓｐａｌｔ（ｓａｌ）のマウスホモローグであり、アフリカツメガエルの前腎管誘導実験から、腎発生に重要であることが示唆された、１３２３アミノ酸残基のタンパク質をコードする３９６９　ｂｐの遺伝子である（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５－３１１５，２００１、東大浅島研究室）。このＳａｌｌ１遺伝子は、マウスにおいて、腎臓のほか、中枢神経、耳胞、心臓、肢芽、肛門において発現局在していることが報告された（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５－３１１５，２００１）。
　このＳａｌｌ１遺伝子のノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統にバッククロス（戻し交配）し解析）は、Ｓａｌｌ１遺伝子のエキソン２以降を欠損することにより、分子内に存在していた１０個全てのｚｉｎｃ－フィンガードメインを欠損しており、その欠損の結果、後腎間葉への尿管芽の陥入が起こらず、腎臓形成初期の異常が生じていると考えられている。
　（ファウンダートランスジェニックマウスの作製）
　上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製する。
　簡単に説明すると、Ｓａｌｌ１ノックアウトトランスジーンを注入した胚を胚盤胞まで培養し、そこにマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下でｉＰＳ細胞を注入することで、腎臓の欠損を補う。この際のｉＰＳ細胞には上記のようにして調製されるＧＦＰ等でマーキングしたものを使用する。これと同等のマーキングされたｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得ることができる。このようにトランスジーンを導入した胚にｉＰＳ細胞を注入するという２重の胚操作を適用することで、１世代目のトランスジェニックから腎臓を補うことが可能となり、それらが次世代へ腎臓欠損という表現型を伝搬できるファウンダー動物となり得る。
　（交配）
　次に、Ｓａｌｌ１遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ接合体個体（Ｓａｌｌ１（＋／－））のオスとメスとを交配し、胚盤胞期受精卵を子宮還流法により採取した。
　（マウスの維持手順および確認）
　採取した胚盤胞期受精卵にＧＦＰマーキングされたｉＰＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入し、注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。
　産仔はノックインマウスであればホモになる確率が１／４となるため、目的の“腎臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため、産仔から骨髄細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ－の造血幹／前駆細胞（ｃ－Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ－１＋，Ｌｉｎａｇｅ　ｍａｒｋｅｒ－：ＫＳＬ細胞）を分取し、１細胞ずつ９６ウェルプレートに落とした。これをサイトカイン添加条件下で１２日間培養しコロニーを形成させ、それらからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により単一細胞から遺伝子型を検出することで当たりのマウスを判定した。用いたプライマーは以下の通りである。
注入された胚由来（すなわちホスト）同定用のフォワードプライマー：
ｍｕｔａｎｔ検出用：ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＧ（配列番号１２）
ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ検出用：ＧＴＡ　ＣＡＣ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＡＣ（配列番号１３）
注入された胚由来（すなわちホスト）同定用のリバースプライマー：
ｍｕｔａｎｔ検出用：ＡＴＡ　ＴＣＡ　ＣＧＧ　ＧＡＴ　ＧＣＣ　ＡＡＣ　ＧＣ（配列番号１４）
ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ検出用：ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＴＧＡ　ＧＴＴ　ＣＴＣ　ＴＣＧ（配列番号１５）。
　この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるため、その仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように骨髄細胞を用いた遺伝子型の解析を行い、その遺伝子型を特定した（図１３）。＃３のマウスがＳａｌｌ１ホモＫＯマウスであったことが分かる。
　補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認するために、腎臓の形態観察を行った。上記遺伝子型決定にてホモ接合体（Ｓａｌｌ１（－／－））であることが確認できた新生仔のキメラ個体には、腎臓が後腹膜領域に存在していた。これらの形成された腎臓は、蛍光実体顕微鏡下で観察すると、ＧＦＰ強陽性であった（図１３）。これは、ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（－／－））では、腎臓が胚盤胞期受精卵の内腔に移植したマウスｉＰＳ細胞のみに由来していることを示す。一方、ヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／－））の個体では、腎臓がヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／－））の個体由来の細胞と移植したｉＰＳ細胞由来の細胞のキメラにより構成されているため、ＧＦＰの蛍光並びに抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学由来の蛍光の両方ともに陽性の細胞像が得ることによって確認することができた。
　ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（－／－））胚盤胞期受精卵にｉＰＳ細胞を移植した結果得られた腎臓の組織学的解析では、係蹄腔内に赤血球を含む成熟機能糸球体、成熟尿細管構造が観察でき、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学解析でそれら成熟細胞のほとんどがＧＦＰ陽性であることを確認することができる。
　これらの結果から、上述した方法により作出されたキメラＳａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｓａｌｌ１（－／－））において、産仔個体中で形成された腎臓が、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｓａｌｌ１（－／－））胚盤胞期受精卵の内腔に移植されたｉＰＳ細胞から形成されたものであることを確認することができる。
　このような腎臓を補ったＫＯ同士を交配させると１００％の確率で次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。
　（実施例６：マウス以外の動物を使用する例）
　本実施例では、マウス以外の動物を使用する場合でも、ファウンダー動物を生産することができ、臓器を製造することができることを実証する。マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりも、胚もしくは胚の中でもＥＳ細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告が多く、この情報を用いて、臓器製造を行うことができる。ラットの場合は、Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｒａｔ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ　ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１－１０（１９７４）に記載される情報を用いて、同様の実験を行うことができる。ウシについては、Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｔｌｅ　ｃｈｉｍｅｒａｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｅｍｂｒｙｏ　ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５）に記載される情報を用いて、同様の実験を行うことができる。ブタについては、Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｉｇｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６－１８７（１９９２）に記載される情報を用いて、同様の実験を行うことができる。
　例えば、本実施例では、マウス以外の例として遺伝子改変動物の作製が可能とされる動物種（ラット（トランスジェニック）、ブタ（トランスジェニック、ノックアウト）、ウシ（トランスジェニック、ノックアウト）、でも同様の実験を行うことができると想定される。これらの種では、実施例４において記載した受精卵細胞の利用が想定される。
　これにより、致死性遺伝子改変ファウンダーラット、ブタ、ウシ等の製造をすることができる。
　このように、ラット、ブタ、ウシを用いた場合でも、実施例１～３に準じて同様の実験を行うことができる。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

Claims (20)

  1. 機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物。
  2. 補完される前記臓器または身体部分が標識される、請求項１に記載の動物。
  3. 請求項１に記載の動物を生産する方法であって、
    　Ａ）前記欠損原因遺伝子を有する第一多能性幹細胞を提供する工程；
    　Ｂ）該第一多能性幹細胞を胚盤胞に成長させる工程；
    　Ｃ）該胚盤胞中に、前記欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；
    　Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性幹細胞により、前記臓器または前記身体部分が補完されたものを選択する工程
    を包含する、方法。
  4. 前記第一多能性幹細胞は、内部細胞塊(ICM)、受精卵または胚である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記遺伝子は外来遺伝子であり、前記Ａ）工程は、前記第一多能性幹細胞に該外来遺伝子を導入することを包含する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記第二多能性幹細胞は、卵細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項３に記載の方法。
  7. 前記Ｄ）工程は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて前記個体を生産することを包含する、請求項３に記載の方法。
  8. 前記選択は、前記第二多能性幹細胞に由来する識別子を識別することによって達成される、請求項３に記載の方法。
  9. 前記第二多能性幹細胞は標識されたものであり、前記選択は、該標識を同定することを包含する、請求項３に記載の方法。
  10. 目的の臓器または身体部分を生産する方法であって、
    　Ａ）請求項１に記載の動物を提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；
    　Ｂ）該動物から卵子を得、該卵子を胚盤胞に成長させる工程；
    　Ｃ）該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；および
    　Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程
    を包含する方法。
  11. 前記Ｄ）工程は、前記キメラ胚盤胞を前記動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することを包含する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記目的多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記目的多能性幹細胞がマウス由来である、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記目的の臓器または身体部分が膵臓または腎臓である、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記動物がマウスである、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記マウスがＰｄｘ－１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、またはＳａｌｌ１ノックアウトマウスである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記目的の臓器または身体部分が、完全に前記目的多能性幹細胞由来のものである、請求項１０に記載の方法。
  18. 機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物の、該臓器または身体部分の製造のための使用。
  19. 目的の臓器または身体部分を製造するためのセットであって、該セットは、
    Ａ）機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）により補完される、動物と、
    Ｂ）該目的の臓器または身体部分と同種の細胞とを備える、セット。
  20. 請求項１に記載の動物を生産するための、多能性幹細胞と、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子をコードする核酸との組み合わせ、あるいは、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を有する多能性幹細胞と該遺伝子を有しない細胞との組み合わせの、使用。
PCT/JP2009/053232 2008-02-22 2009-02-23 遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法 WO2009104794A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009554423A JP5688788B2 (ja) 2008-02-22 2009-02-23 遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法
EP09712642A EP2258166A4 (en) 2008-02-22 2009-02-23 METHOD FOR PRODUCING FOUNDER ANIMAL FOR REPRODUCTIVE ANIMALS HAVING LETHAL PHENOTYPE DUE TO GENE MODIFICATION
US12/918,694 US20110067125A1 (en) 2008-02-22 2009-02-23 Method for producing founder animal for reproducing animal having lethal phenotype caused by gene modification
US16/363,152 US20190282602A1 (en) 2008-02-22 2019-03-25 Method for producing founder animal for reproducing animal having lethal phenotype caused by gene modification

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-042243 2008-02-22
JP2008042243 2008-02-22
JP2008-214711 2008-08-22
JP2008214711 2008-08-22

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/918,694 A-371-Of-International US20110067125A1 (en) 2008-02-22 2009-02-23 Method for producing founder animal for reproducing animal having lethal phenotype caused by gene modification
US16/363,152 Continuation US20190282602A1 (en) 2008-02-22 2019-03-25 Method for producing founder animal for reproducing animal having lethal phenotype caused by gene modification

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009104794A1 true WO2009104794A1 (ja) 2009-08-27

Family

ID=40985667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/053232 WO2009104794A1 (ja) 2008-02-22 2009-02-23 遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20110067125A1 (ja)
EP (1) EP2258166A4 (ja)
JP (1) JP5688788B2 (ja)
WO (1) WO2009104794A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2010021390A1 (ja) * 2008-08-22 2012-01-26 国立大学法人 東京大学 ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
WO2014119627A1 (ja) 2013-01-29 2014-08-07 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
WO2016163386A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 全国農業協同組合連合会 異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類の作出方法
KR20170121262A (ko) * 2015-03-03 2017-11-01 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 Etv2 및 그의 용도
CN108882696A (zh) * 2015-10-27 2018-11-23 明尼苏达大学评议会 通过遗传互补对人源化肾脏的工程改造
US10246679B2 (en) 2015-03-02 2019-04-02 The University Of Tokyo Method for producing pluripotent stem cell having improved chimera forming ability from primed pluripotent stem cell, and composition and combination therefor
US12089574B2 (en) 2015-06-30 2024-09-17 Regents Of The University Of Minnesota Humanized skeletal muscle

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108472318A (zh) 2015-06-30 2018-08-31 明尼苏达大学校董会 人源化心脏肌肉
MX2018015194A (es) * 2016-06-14 2020-01-20 Riddle Inst For Regenerative Medicine Metodo de regeneracion de organos que usa complementacion de celulas de transferencia nuclear de celulas somaticas (scnt) y blastocitos.
SG11202002118XA (en) 2017-09-19 2020-04-29 Univ Meiji Method for developing organ that lacks specific functional cell

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008102602A1 (ja) * 2007-02-22 2008-08-28 The University Of Tokyo Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030079240A1 (en) * 1997-12-18 2003-04-24 Newman Stuart A. Chimeric embryos and animals containing human cells
US20010044937A1 (en) * 1999-12-17 2001-11-22 Gerald Schatten Methods for producing transgenic animals
US20040221326A1 (en) * 2001-05-11 2004-11-04 Philip Babij Transgenic animal model of bone mass modulation
CA2498711C (en) * 2002-09-19 2013-11-12 Ximerex, Inc. Growth of foreign cells in fetal animals facilitated by conditional and selective destruction of native host cells
EP1726640B1 (en) * 2004-03-04 2016-01-13 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Rat embryonic stem cell
US8048999B2 (en) * 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
EP2120544A4 (en) * 2007-03-09 2010-12-15 Univ Missouri INDUCIBLE AND CONDITIONAL TRANSGENIC EXPRESSION METHODS FOR DIRECTING THE DEVELOPMENT OF STEM CELLS
US20090191160A1 (en) * 2007-08-10 2009-07-30 University Of Dayton Methods of producing pluripotent stem-like cells
GB2475656B (en) * 2008-08-22 2013-04-24 Univ Tokyo Organ regeneration method utilizing ips cell and blastocyst complementation
WO2010087459A1 (ja) * 2009-01-30 2010-08-05 国立大学法人東京大学 幹細胞を用いた異種間胚胞キメラ動物の作製法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008102602A1 (ja) * 2007-02-22 2008-08-28 The University Of Tokyo Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法

Non-Patent Citations (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Molecular Biology", 1995, OXFORD UNIVERSITY PRESS, article "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach", pages: 1 - 38
"Experimental technique for gene transfer & expression analysis", 1997, YODOSHA
ADAMS, R. L. ET AL.: "The Biochemistry of the Nucleic Acids", 1992, CHAPMAN & HALL
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
AUSUBEL, F. M.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, GREENE PUB. ASSOCIATES AND WILEY-INTERSCIENCE
AUSUBEL, F. M.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1992, GREENE PUB. ASSOCIATES, article "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods"
AUSUBEL, F. M.: "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", 1989, GREENE PUB. ASSOCIATES AND WILEY-INTERSCIENCE
AUSUBEL, F. M.: "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", 1995, GREENE PUB. ASSOCIATES
AUSUBEL, F. M.: "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", 1999, WILEY
BATZER ET AL., NUCLEIC ACID RES., vol. 19, 1991, pages 5081
BEVIS B. J.; GLICK B. S., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 20, 2002, pages 83 - 87
BLACKBURN, G. M. ET AL.: "Nucleic Acids in Chemistry and Biology", 1996, OXFORD UNIVERSITY PRESS
BLELLOCH R ET AL., CELL STEM CELL, vol. 1, 2007, pages 245 - 247
BREM, G. ET AL.: "Production of cattle chimerae through embryo microsurgery", THERIOGENOLOGY, vol. 23, 1985, pages 182, XP023190553, DOI: doi:10.1016/0093-691X(85)90088-3
CHEN J. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 4528 - 4532
CHEN,J ET AL.: "RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development.", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 90, no. 10, 15 May 1993 (1993-05-15), pages 4528 - 4532, XP002962993 *
DEVELOPMENT, vol. 122, 1996, pages 983 - 995
DIABETOLOGIA, vol. 43, 2000, pages 332 - 339
ECKSTEIN, F.: "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approac", 1991, IRL PRESS
FEHILLY, C. B. ET AL., NATURE, vol. 307, 1984, pages 634 - 636
GAIT, M. J.: "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1985, IRLPRESS
GAIT, M. J.: "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1990, IRL PRESS
HERMANSON, G. T.: "Bioconjugate Techniques", 1996, ACADEMIC PRESS
INNIS, M. A. ET AL.: "PCR Strategies", 1995, ACADEMIC PRESS
INNIS, M. A.: "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", 1990, ACADEMIC PRESS
JOICHI USUI ET AL.: "Jinzo Kesson Model Mouse to blastocyst complementation o Kumiawaseta Mouse ES Saibo Yurai Jinzo no Sakusei", JAPANESE JOURNAL OF TRANSPLANTATION, DAI 42 KAI SOKAI RINJIGO, 2007, pages 367, XP008140838 *
KASHIWAZAKI N ET AL.: "Production of chimeric pigs by the blastocyst injection method", VET. REC., vol. 130, 1992, pages 186 - 187, XP002043528
LIEGEOIS,N ET AL.: "Lens complementation system for the genetic analysis of growth, differentiation, and apoptosis in vivo.", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 93, no. 3, 6 February 1996 (1996-02-06), pages 1303 - 1307, XP002962991 *
MAYER, J. R. JR.; FRETZ, H. I.: "The culture of preimplantation rat embryos and the production of allophenic rats", J. REPROD. FERTIL., vol. 39, 1974, pages 1 - 10
MINTZ: "Experimental study of the developing mammalian egg: removal of the zona pellucida", SCIENCE, vol. 138, 1962, pages 594 - 595
MITO KANATSU-SHINOHARA ET AL.: "Generation of Pluripotent Stem Cells from Neonatal Mouse Testis", CELL, vol. 119, 2004, pages 1001 - 1012, XP055085900
MULNARD, J. G., C. R. ACAD. SCI. PARIS., vol. 276, 1973, pages 379 - 381
NAKAGAWA M ET AL., NAT BIOTECHNOL, vol. 26, 2008, pages 101 - 106
NEEDLEMAN; WUNSCH, J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 443 - 453
NISHINAKAMURA, R. ET AL.: "Development", vol. 128, 2001, ASASHIMA LAB, pages: 3105 - 3115
NISHINAKAMURA, R., DEVELOPMENT, vol. 128, 2001, pages 3105 - 3115
NISHINAKAMURA,R ET AL.: "Essential roles of Sall family genes in kidney development.", J PHYSIOL SCI., vol. 56, no. 2, April 2006 (2006-04-01), pages 131 - 136, XP008140841 *
OHTSUKA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 260, 1985, pages 2605 - 2608
OKITA K ET AL.: "Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells", NATURE, vol. 448, no. 7151, 2007, pages 313 - 7, XP002555950, DOI: doi:10.1038/nature05934
PARK IH ET AL., NATURE, vol. 451, 2007, pages 141 - 146
PEARSON; LIPMAN, PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 85, 1988, pages 2444 - 2448
ROSSOLINI ET AL., MOL. CELL. PROBES, vol. 8, 1994, pages 91 - 98
SAMBROOK J. ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed.", 1989, COLD SPRING HARBOR
See also references of EP2258166A4 *
SHABAROVA, Z. ET AL.: "Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids", 1994, WEINHEIM
SHI ET AL.: "A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells", CELL STEM CELL, vol. 2, no. 6, 5 June 2008 (2008-06-05), pages 525 - 528, XP002564353, DOI: doi:10.1016/j.stem.2008.05.011
SMITH; WATERMAN, J. MOL. BIOL., vol. 147, 1981, pages 195 - 197
SNINSKY, J. J. ET AL.: "PCR Applications: Protocols for Functional Genomics", 1999, ACADEMIC PRESS
STERN, M. S., NATURE, vol. 243, 1973, pages 472 - 473
TACHI, S.; TACHI, C., DEV. BIOL., vol. 80, 1980, pages 18 - 27
TAKAHASHI K ET AL., CELL, vol. 131, 2007, pages 861 - 872
TAKAHASHI K; YAMANAKA S, CELL, vol. 126, no. 4, 25 August 2006 (2006-08-25), pages 652 - 5
TAKAHASHI,Y ET AL.: "Trophoblast stem cells rescue placental defect in SOCS3-deficient mice.", J BIOL CHEM., vol. 281, no. 17, 28 April 2006 (2006-04-28), pages 11444 - 11445, XP008140840 *
TIJSSEN: "Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology - Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I", 1993, ELSEVIER, article "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay"
WANG,ZQ ET AL.: "Generation of completely embryonic stem cell-derived mutant mice using tetraploid blastocyst injection.", MECH DEV., vol. 62, no. 2, March 1997 (1997-03-01), pages 137 - 145, XP002049675 *
WERING M ET AL., CELL STEM CELL, vol. 2, 2008, pages 10 - 12
YU J ET AL., SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1917 - 1920
ZEILMARKER, G., NATURE, vol. 242, 1973, pages 115 - 116

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017018133A (ja) * 2008-08-22 2017-01-26 国立大学法人 東京大学 ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴ ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
JP2019030310A (ja) * 2008-08-22 2019-02-28 国立大学法人 東京大学 ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴ ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
JP2014230552A (ja) * 2008-08-22 2014-12-11 国立大学法人 東京大学 ｉＰＳ細胞などの多能性細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
JP5688800B2 (ja) * 2008-08-22 2015-03-25 国立大学法人 東京大学 ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
JPWO2010021390A1 (ja) * 2008-08-22 2012-01-26 国立大学法人 東京大学 ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
JP2018046833A (ja) * 2013-01-29 2018-03-29 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
US10645912B2 (en) 2013-01-29 2020-05-12 The University Of Tokyo Method for producing chimeric animal
US11844336B2 (en) 2013-01-29 2023-12-19 The University Of Tokyo Method for producing chimeric animal
JPWO2014119627A1 (ja) * 2013-01-29 2017-01-26 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
JP6279141B1 (ja) * 2013-01-29 2018-02-14 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
WO2014119627A1 (ja) 2013-01-29 2014-08-07 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
JP2018082716A (ja) * 2013-01-29 2018-05-31 国立大学法人 東京大学 キメラ動物の作製方法
US10246679B2 (en) 2015-03-02 2019-04-02 The University Of Tokyo Method for producing pluripotent stem cell having improved chimera forming ability from primed pluripotent stem cell, and composition and combination therefor
KR20170121262A (ko) * 2015-03-03 2017-11-01 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 Etv2 및 그의 용도
KR102684690B1 (ko) 2015-03-03 2024-07-15 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 Etv2 및 그의 용도
WO2016163386A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 全国農業協同組合連合会 異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類の作出方法
KR20170133380A (ko) * 2015-04-08 2017-12-05 내셔날 페더레이션 오브 애그리컬쳐 코오퍼레이티브 어소우시에이션스 이개체 유래의 배우자를 생산하는 비인간 대형 포유 동물 또는 어류의 작출 방법
KR102636332B1 (ko) 2015-04-08 2024-02-14 내셔날 페더레이션 오브 애그리컬쳐 코오퍼레이티브 어소우시에이션스 이개체 유래의 배우자를 생산하는 비인간 대형 포유 동물 또는 어류의 작출 방법
US12089574B2 (en) 2015-06-30 2024-09-17 Regents Of The University Of Minnesota Humanized skeletal muscle
CN108882696A (zh) * 2015-10-27 2018-11-23 明尼苏达大学评议会 通过遗传互补对人源化肾脏的工程改造

Also Published As

Publication number Publication date
EP2258166A1 (en) 2010-12-08
JP5688788B2 (ja) 2015-03-25
US20110067125A1 (en) 2011-03-17
EP2258166A4 (en) 2013-04-03
US20190282602A1 (en) 2019-09-19
JPWO2009104794A1 (ja) 2011-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220192164A1 (en) ORGAN REGENERATION METHOD UTILIZING iPS CELL AND BLASTOCYST COMPLEMENTATION
US20220338452A1 (en) Organ regeneration method utilizing blastocyst complementation
JP5688788B2 (ja) 遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法
JP2020043864A (ja) 幹細胞を用いた異種間胚胞キメラ動物の作製法
JP4845073B2 (ja) 再構築受精卵の作製方法及びそれを用いたトランスジェニック胚の作製方法
US20190327945A1 (en) Regeneration method using somatic cell nuclear transfer (scnt) cell and blastocyst complementation

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09712642

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009554423

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009712642

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12918694

Country of ref document: US