JP6830674B2 - キメラ動物における出生後の炎症の発見とその治療 - Google Patents
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Description
異種間キメラ動物の作製においても、免疫成立前から異種細胞を胚盤胞に導入するため、原則として異種細胞は自己として認識され、免疫系による攻撃を加えられることがない。そして、これまでのところ、上記理論通りに、異種間キメラ動物においては、免疫拒絶や炎症反応は一切報告されていなかった。
(1)出生した異種間または同種異系間のキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)において生じる免疫反応または炎症を抑制することに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、組成物。
(2)免疫反応または炎症が、皮膚において生じる免疫反応または炎症または補完された臓器若しくは組織において生じる免疫反応または炎症である、上記(1)に記載の組成物。
(3)抑制が、予防的に行われる、上記(1)に記載の組成物。
(4)抗炎症剤または免疫抑制剤が、ステロイドを含む、上記(1)または(2)に記載の組成物。
(5)出生した異種間または同種異系間のキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)から成体を得る方法であって、出生した胚盤胞補完キメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、方法。
(6)抗炎症剤または免疫抑制剤が、キメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)に免疫反応または炎症が生じる前に投与される、上記(5)に記載の方法。
(7)出生したキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)の表皮に免疫反応または炎症が生じたことを確認することと、
免疫反応または炎症が確認されたらキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、上記(6)に記載の方法。
(8)出生した異種間または同種異系間のキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)を飼育するまたは成長させる方法であって、当該キメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
(9)出生した異種間または同種異系間のキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)から成体を得る方法であって、当該キメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
(10)免疫不全である、異種間または同種異系間のキメラ動物。
(11)免疫不全である、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する動物、またはその着床前胚。
(12)臓器が、膵臓および腎臓からなる群から選択される臓器である、上記(11)に記載の動物、またはその着床前胚。
(13)特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する動物が、Pdx1遺伝子のノックアウト動物、Pdx1−Hes1遺伝子のトランスジェニック動物、およびSall1遺伝子のノックアウト動物、Flk1遺伝子のノックアウト動物、Hex遺伝子のノックアウト動物、Foxa1/Foza2遺伝子のダブルノックアウト動物、Otx2遺伝子のノックアウト動物、およびFoxn1遺伝子のノックアウト動物;これらの遺伝子のプロモーターに駆動される細胞死誘導因子をコードする遺伝子を有する動物;並びに、臓器または細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターに駆動される細胞死誘導因子をコードする遺伝子を有する動物から選択される遺伝子改変を有する動物である、上記(11)または(12)に記載の動物。
(14)免疫不全が、IL2Rg、RAG1、RAG2、Foxn1、PRKDC、MHCおよびSIRPaから選択されるいずれか1以上の遺伝子改変または異常を伴う、上記(11)〜(13)のいずれかに記載の動物。
(15)特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法であって、
哺乳動物の多能性細胞を当該非ヒト哺乳動物の着床前胚に移植して、キメラ胚を得ることを含み、
前記多能性細胞および前記着床前胚のいずれかまたは両方は、免疫不全となる遺伝子改変または異常を有し、
前記多能性細胞と前記着床前胚とが、同種異系または異種の関係である、
方法。
(16)免疫不全となる遺伝子改変または異常を有する多能性細胞を含む組成物であって、キメラ動物を作製することに用いるための組成物。
(17)上記(16)に記載の組成物であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製することに用いるための組成物。
(18)免疫不全の原因となる遺伝子改変または遺伝子異常を有する、臓器。
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)において、出生後に生じる免疫反応または炎症を予防および/または治療する方法であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を該動物に投与することを含む、方法が提供される。
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)のための飼料であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、飼料が提供される。
抗炎症剤としては、特に限定されないが例えば、ステロイド系抗炎症薬(SAIDs)、非ステロイド系抗炎症薬(NSAIDs)等が挙げられ、本発明で用いることができる。ステロイドとしては、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾンが挙げられ、本発明で用いることができる。その他、抗炎症剤としては、抗炎症性サイトカイン抗体、例えば抗TNF−α抗体や、可溶化型サイトカイン抗体、例えば可溶化型TNF受容体などの炎症性サイトカイン阻害薬が挙げられ、本発明で用いることができる。
本発明のある態様では、免疫抑制剤としての機能と抗炎症剤としての機能を有するステロイド系抗炎症剤が好ましく用いられ得る。また、本発明のある態様では、異種間または同種異系間のキメラ動物(例えば、胚盤胞補完キメラ動物)に対して出生後に生じる免疫反応および炎症反応を抑制するために免疫抑制剤と抗炎症剤との組合せを投与してもよいであろう。但し、本発明では、免疫反応または炎症のどちらかを抑制するだけでも、十分な効果が得られると期待できる。
本発明では、異種間の胚盤胞補完キメラ動物の体内にドナー細胞から実質的になる臓器を製造する方法であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有するレシピエント動物の胚盤胞にドナー多能性細胞を導入することと、胚盤胞を偽妊娠仮親雌の子宮に移植することと、胚盤胞補完キメラ動物を出産させることと、出産した動物を抗炎症剤または免疫抑制剤で処理することとを含む、方法が提供される。
本発明では、異種間の胚盤胞補完キメラ動物の体内にドナー細胞から実質的になる臓器を製造する方法であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有するレシピエント動物の胚盤胞にドナー多能性細胞を導入することと、胚盤胞を偽妊娠仮親雌の子宮に移植することと、胚盤胞補完キメラ動物を出産させることと、出産した動物を抗炎症剤または免疫抑制剤で処理することとを含む、方法{ここで、レシピエントの臓器形状が、ドナーの臓器形状とは異なる}が提供される。
本明細書では、「レシピエントの臓器形状が、ドナーの臓器形状とは異なる」とは、形態分類学的に臓器形状(大きさおよび/または形)が異なることを意味する。
特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法であって、
哺乳動物の多能性細胞を当該非ヒト哺乳動物の着床前胚に移植して、キメラ胚を得ることを含み、
前記多能性細胞および前記着床前胚のいずれかまたは両方は、免疫不全となる遺伝子改変または異常を有し、
前記多能性細胞と前記着床前胚とが、同種異系または異種の関係である、
方法
が提供される。多能性細胞が免疫不全となる遺伝子改変または異常を有する場合は、得られる臓器は、免疫不全の原因となる遺伝子改変または異常を有する。
これらの態様において、多能性細胞は、キメラ形成能を有する多能性細胞である。ある態様では、多能性細胞は、哺乳動物(例えば、ヒト)のES細胞やiPS細胞などの多能性細胞であり得る。ある態様では、キメラ動物の作製法は上述の通りである。ある態様では、多能性細胞は、免疫不全となる遺伝子改変または異常に加えて更なる遺伝子改変または異常を有しうる。ある態様では、多能性細胞は、当該免疫不全となる遺伝子改変または異常の他に更なる遺伝子改変および異常を有しない。ある態様では、多能性細胞は、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞であり得る。ある態様では、多能性細胞は、ヒト内部細胞塊(ヒトICM)であり得る。ある態様では、多能性細胞は、アポトーシス抑制処理がなされた細胞であり得る。ある態様では、多能性細胞は、アポトーシス抑制遺伝子を過剰発現した細胞であり得る。ある態様では、多能性細胞は、単一細胞に分散した状態でコロニー形成する能力を有し得る。
本実施例では、膵臓欠損ラットの胚盤胞にマウス多能性幹細胞を導入することにより、胚盤胞を成長させて得られるラットの体内にマウスの細胞からなる膵臓を作製した。
膵臓欠損ラットは、マウスで行われたのと同様にPdx1コード領域内における変異導入により作製した(Takahashi, R., et al., Transgenic Res. 8, 397-400 (1999))。ラットとしてはWisterラット(SLC Japanから購入)を用いた。具体的には、図1Aに示されるように、雄のラット接合体の核に対して、Pdx1開始コドンの3bpから下流および35bpから下流をそれぞれ標的としたPdx1 TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)とラットExo1のインビトロで転写したmRNA(各mRNAを3 ng/μlまたは10 ng/μl)をインジェクションすることにより、Pdx1遺伝子を破壊して、Pdx1+/mu膵臓欠損ラットを得た(3 ng/μlインジェクション群から4匹と10 ng/μlインジェクション群から3匹)。
得られたPdx1変異体には、図1Bに示されるように4種類のPdx1遺伝子の変異体A〜Dが見られた。変異体AおよびB(以下、それぞれ「Pdx1+/muA」および「Pdx1+/muB」と呼ぶ)は、フレームシフト変異体であり、それぞれ30番目および28番目のアミノ酸において終止コドンを生じていた。変異体Aを有するラットと変異体Bを有するラットとを交配させて、変異体AとBとをそれぞれのアリルに有するラット(Pdx1muA/muB)を得た。得られたラットはすべて、膵臓欠損の表現型を示し(図1C参照)、生後3日以内に死亡した。
EGFP標識野生型マウスiPS細胞(GT3.2)またはESC(mRHT, SGE2)をPdx1+/muAの雄ラットとPdx1+/muBの雌ラット、またはPdx1+/muBの雄ラットとPdx1+/muAの雌ラットを交配させて得た複数の胚盤胞にインジェクションした。得られた10週齢ラットの末梢血単核球(PBMC)からEGFP陰性のPBMCの有無を検出した。Pdx1muA/muBの遺伝子型を有するラットは、iPS細胞注入群では10%の頻度で、ES細胞注入群では20%の頻度で確認された。膵臓が欠損するとラットは生後3日で死滅することから、Pdx1muA/muBの遺伝子型を有するラットは、iPS細胞またはES細胞で膵臓が補完されたラットであると理解された。
同種異系での膵臓移植においては、移植直後から免疫拒絶により50〜70%の膵島が破壊される。そこで、実施例1で作製したマウスR膵臓を有するPdx1muA/muBのラットにおいて免疫拒絶の有無を観察した。
胚盤胞補完により作製した異種間キメラ動物個体は、母体内ではこのような炎症反応を引き起こすことがなかった。また、上記の炎症反応は、異種間キメラ動物個体すべてで認められる現象ではなく、一部の異種間キメラ動物個体で生じた。
このことから、少なくとも抗炎症剤によって炎症を抑制することで、このような一部の個体においても、正常な異種膵臓を得ることが可能になると考えられた。
本実施例では、まず、免疫不全動物の胚盤胞を得るため、IL2Rgの破壊による免疫不全動物を作製した。IL2Rg−/−動物の表現型を確認し、その後、IL2Rg−/−動物の胚盤胞を用いて異種間キメラを作製した。
IL2Rgは、インターロイキン2受容体γサブユニットをコードする遺伝子である。本実施例では、図6Aに示されるようにターゲッティングベクターを用いてIL2Rg遺伝子のエキソンの一部を薬剤耐性遺伝子であるネオマイシンに置き換えることによりIL2Rgを破壊したラットを作製した。ターゲッティングベクターにより相同組換えを受けたラットES細胞を着床前のラット胚に移植し、得られたキメララットを野生型ラットと交配させてIL2Rg+/−ラットを作製した。その後、IL2Rg+/−ラット同士を交配させ、IL2Rg遺伝子が破壊されたIL2Rg−/−ラットを得た。
得られたIL2Rg−/−ラットから末梢血を採取し、フローサイトメトリーにより血球分画を観察した。結果は、図6Bに示される通りであった。図6Bに示されるように、IL2Rg−/−ラットでは、CD45R陽性かつCD3陰性であるB細胞が、野生型ラットと比較して顕著に減少していた。また、図6Bに示されるように、IL2Rg−/−ラットでは、CD45R陰性かつCD3陽性であるT細胞が33.5%(野生型)から3.4%へと顕著に減少していた上に、減少したT細胞をさらにソーティングすると、残存していたT細胞のほとんどがCD4シングルポジティブ細胞であり、CD8シングルポジティブ細胞はほとんど消失していた。さらに、図6Bに示されるように、末梢血のCD3陰性の分画に対して、CD45RおよびCD161でソーティングしたところ、CD45R陰性かつCD161陽性であるNK細胞が野生型ラットと比較して顕著に減少していた。このように、IL2Rg−/−ラットでは、B細胞、CD8シングルポジティブ細胞およびNK細胞などの免疫細胞が野生型と比較して顕著に減少していた。
上記実施例と同様にして、IL2Rg−/−ラットの着床前胚に野生型マウスES細胞を移植して異種間キメラ動物(IL2Rg−/−ラット−マウスキメラという)を作製した。対照として、野生型ラットの着床前胚に野生型マウスES細胞を移植して得た異種間キメラ動物(野生型ラット−マウスキメラという)を用いた。次に、IL2Rg−/−ラット−マウスキメラの末梢血を回収し、フローサイトメトリーにより血球分画を得た。結果は図7Aに示される通りであった。図7Aに示されるように、野生型ラット−マウスキメラでは、ラット由来とマウス由来の両方のT細胞、B細胞およびNK細胞が観察されたのに対して、IL2Rg−/−ラット−マウスキメラでは、マウス由来のT細胞、B細胞およびNK細胞が観察された一方でラット由来のT細胞、B細胞およびNK細胞は顕著に減少していた。このように、IL2Rg−/−ラット−マウスキメラでは、IL2Rg遺伝子を破壊した胚盤胞由来の免疫細胞が顕著に減少していた。
マウスES細胞のIL2Rg遺伝子をCRISPR/Cas9法によって破壊して、IL2Rg−/−マウスES細胞を得た。得られたIL2Rg−/−マウスES細胞を野生型ラットの着床前胚に移植し、異種間キメラを作製した。得られた異種間キメラの表皮を生後1日目および7日目において観察した。結果は図8Aのパネルa〜dに示される通りであった。図8Aのパネルb〜dに示されるように、この異種間キメラでは、表皮に角化異常(角化の亢進)や皮膚の肥厚が認められた。
そこで、IL2Rg−/−ラットの着床前胚にIL2Rg−/−マウスES細胞を導入して、T細胞、B細胞およびNK細胞が顕著に減少または消失した異種間キメラを作製した。得られた異種間キメラの表皮を生後1日目および7日目において観察した。結果は図8Aのパネルeおよびfに示される通りであった。図8Aのパネルeおよびfに示される通り、ES細胞および胚の両方においてIL2Rg遺伝子を破壊した異種間キメラ動物では、皮膚の上記角化異常や肥厚は観察されなかった。また、生後6週前後において、ES細胞および胚の両方においてIL2Rg遺伝子を破壊した異種間キメラ動物では、表皮の炎症反応も観察されなかった。
このように、免疫や炎症を抑制することにより、異種間キメラ個体における炎症や免疫異常が低減されることが確認された。
配列番号1:ラットPdx1遺伝子のエキソン1中のTALENの標的配列(左側)
配列番号2:ラットPdx1遺伝子のエキソン1中のTALENの標的配列(右側)
配列番号3:ラットPdx1遺伝子の標的部分の野生型の配列
配列番号4:ラットPdx1遺伝子の標的部分の改変された配列(変異体A)
配列番号5:ラットPdx1遺伝子の標的部分の改変された配列(変異体B)
配列番号6:ラットPdx1遺伝子の標的部分の改変された配列(変異体C)
配列番号7:ラットPdx1遺伝子の標的部分の改変された配列(変異体D)
Claims (10)
- 出生した異種間または同種異系間のキメラ動物において生じる免疫反応または炎症を抑制することに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含み、当該キメラ動物は、免疫系が構築される前に同種異系若しくは異種の細胞を混合して得られる生後の個体であり、免疫反応または炎症が、皮膚において生じる免疫反応または炎症または補完された臓器若しくは組織において生じる免疫反応または炎症である、組成物。
- 抑制が、予防的に行われる、請求項1に記載の組成物。
- キメラ動物が、胚盤胞補完キメラ動物である、請求項1に記載の組成物。
- 出生した異種間または同種異系間の非ヒトキメラ動物から成体を得る方法であって、出生した非ヒトキメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、当該非ヒトキメラ動物は、免疫系が構築される前に同種異系若しくは異種の細胞を混合して得られる生後の個体である、方法。
- 抗炎症剤または免疫抑制剤が、非ヒトキメラ動物に免疫反応または炎症が生じる前に投与される、請求項4に記載の方法。
- 出生した非ヒトキメラ動物の表皮に免疫反応または炎症が生じたことを確認することと、
免疫反応または炎症が確認されたら非ヒトキメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、請求項4に記載の方法。 - 出生した異種間または同種異系間の非ヒトキメラ動物を飼育するまたは成長させる方法であって、当該非ヒトキメラ動物は、免疫系が構築される前に同種異系若しくは異種の細胞を混合して得られる生後の個体であり、当該非ヒトキメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、免疫反応または炎症が、皮膚において生じる免疫反応または炎症または補完された臓器若しくは組織において生じる免疫反応または炎症であり、これにより、当該キメラ動物の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
- 出生した異種間または同種異系間の非ヒトキメラ動物から成体を得る方法であって、当該非ヒトキメラ動物は、免疫系が構築される前に同種異系若しくは異種の細胞を混合して得られる生後の個体であり、当該非ヒトキメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、免疫反応または炎症が、皮膚において生じる免疫反応または炎症または補完された臓器若しくは組織において生じる免疫反応または炎症であり、これにより、当該キメラ動物の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
- 非ヒトキメラ動物が、胚盤胞補完キメラ動物である、請求項7に記載の方法。
- 非ヒトキメラ動物が、胚盤胞補完キメラ動物である、請求項8に記載の方法。
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