WO2023080201A1 - 皮膚組織 - Google Patents

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WO2023080201A1
WO2023080201A1 PCT/JP2022/041189 JP2022041189W WO2023080201A1 WO 2023080201 A1 WO2023080201 A1 WO 2023080201A1 JP 2022041189 W JP2022041189 W JP 2022041189W WO 2023080201 A1 WO2023080201 A1 WO 2023080201A1
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WO
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cells
epidermis
skin
embryo
mature
Prior art date
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PCT/JP2022/041189
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English (en)
French (fr)
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直彬 水野
啓光 中内
寿人 長野
英樹 正木
素生 渡部
秀征 佐藤
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present disclosure relates to skin tissue.
  • the present disclosure provides, by way of non-limiting example, an isolated skin tissue comprising an epidermis, a basement membrane, and a dermis, wherein the epidermis is attached to one side of the basement membrane, and the dermis is attached to the basement membrane. and the epidermis comprises first cells and the dermis comprises second cells, the second cells lacking the ability to differentiate into mature epidermal cells.
  • skin tissue comprising an epidermis, a basement membrane, and a dermis, wherein the epidermis is attached to one side of the basement membrane, and the dermis is attached to the basement membrane. and the epidermis comprises first cells and the dermis comprises second cells, the second cells lacking the ability to differentiate into mature epidermal cells.
  • Non-Patent Documents 1 to 6 the sheets obtained by these methods generally lack the basement membrane and the dermis and are sheets containing only epidermal cells (that is, cultured epidermis sheets). Even if it is transplanted to the body surface, it is not easy to engraft on the body surface due to the lack of dermis. Attempts have also been made to produce artificial skin substitutes in vitro, but they have yet to construct a functionally thick dermis layer.
  • the present disclosure provides skin tissue.
  • the present disclosure provides, by way of non-limiting example, an isolated skin tissue comprising an epidermis, a basement membrane, and a dermis, wherein the epidermis is attached to one side of the basement membrane, and the dermis is attached to the basement membrane. and the epidermis comprises first cells and the dermis comprises second cells, the second cells lacking the ability to differentiate into mature epidermal cells.
  • Skin tissue may be provided.
  • the present disclosure by administering donor cells that have the ability to differentiate into mature epidermis to host embryos that do not have the ability to differentiate into mature epidermal cells, epidermis, basement membrane, and dermis, and epidermis was derived from donor cells, and dermis was derived from donor and host cells.
  • the present disclosure is based on such findings.
  • An isolated skin tissue comprising an epidermis, a basement membrane (or basal lamina), and a dermis, wherein the epidermis is attached to one surface of the basement membrane (or basal lamina), and the dermis is attached to the other side of the basement membrane (or basal lamina), and the epidermis comprises the first cells, or preferably the epidermis comprises the first cells, the dermis comprises the second cells, the dermis may further comprise the first cells;
  • the second cell is skin tissue that has reduced or lost ability to differentiate into mature epidermal cells.
  • a method for producing skin tissue comprising: providing a host embryo (or a host embryo engineered to do so) that is incapable of (autonomously) developing a mature epidermis; injecting mature epidermal-potential donor cells into said host embryo, wherein said injection is performed under conditions suitable for engraftment of said cells into the skin; growing the resulting embryo in or by implanting it in the uterus of a pseudopregnant mammalian mammal to obtain an individual with mature epidermis from the mammal; A method comprising isolating mature epidermis containing cells derived from the donor cells, basement membrane, and skin tissue comprising the dermis containing cells derived from the host from the obtained individual.
  • [6] The method of [5] above, wherein the host embryo incapable of developing mature epidermis is a p63 knockout embryo.
  • the donor cells capable of differentiating into the mature epidermis are cells selected from the group consisting of pluripotent cells and cells committed to the epidermis.
  • [8] The method according to any one of [5] to [7] above, wherein the embryo is at any developmental stage from the 8-cell stage to the blastocyst stage.
  • Skin tissue according to any one of the above [30] 99 or more of the epidermal cells are the first cells, less than 1% are the second cells, and 50% or less of the dermal cells are the second cells, and 50% or more are the second cells 1. Skin tissue according to any one of the above. [31] 95% or more of the epidermal cells are the first cells, less than 5% are the second cells, and 50% or more of the dermal cells are the second cells, and less than 50% are The skin tissue according to any of the above, which is the first cell.
  • a graft material comprising any of the skin tissues described above.
  • both ⁇ 2 microglobulin and CIITA are knocked out in the first cell, thereby improving tolerance to immune rejection in allogeneic transplantation compared to the absence of said suppression;
  • One or more selected from the group consisting of HLA-G, HLA-E, CD47, and PD-L1 are forcibly expressed, whereby the allograft is compared with the case where the expression is not suppressed.
  • HLA-A, HLA-B, and HLA-C are knocked out only at a unilateral locus (HLA pseudohomozygosity), whereby the expression suppression is The skin tissue according to any one of [53] to [57] above, which has improved tolerance to immune rejection in allogeneic transplantation compared to when it was not done.
  • a product comprising the skin tissue according to any one of the above and a preservation solution suitable for preserving the same.
  • the preservation solution is physiological saline.
  • the preservation solution is a serum-free medium.
  • the preservation solution is a scientifically defined medium.
  • Any of the above products comprising either or both of an anti-inflammatory agent and an immunosuppressive agent.
  • a transplant material comprising the skin tissue according to any one of [51] to [54] above, for use in transplanting into a human subject from which the first cells are derived.
  • a graft material comprising the skin tissue of [53] or [54] above, for use in grafting into a human subject allogeneic to the human from which the first cells were derived, graft material.
  • a method of manufacturing any of the skin tissue, graft material, or product described above providing a host embryo incapable of developing a mature epidermis; injecting mature epidermal-potential donor cells into said host embryo, wherein said injection is performed under conditions suitable for engraftment of said cells into the skin; growing the resulting embryo in or by implanting it in the uterus of a pseudopregnant mammalian mammal to obtain an individual with mature epidermis from the mammal; isolating skin tissue comprising mature epidermis containing donor cell-derived cells, basement membrane, and dermis containing host-derived cells from the obtained individual;
  • a method including
  • a method of producing a non-human mammal individual comprising: Committed to cells having the ability to form chimeras and to differentiate into mature epidermis or epidermis or epidermal lineage cells on the body surface of a non-human mammalian individual (host) before epidermal basal cells are formed
  • a method comprising contacting cells (donor cells), thereby obtaining a non-human mammalian individual having skin tissue comprising host cells and donor cells.
  • a method of producing a non-human mammal individual comprising: Committed to cells having the ability to form chimeras and to differentiate into mature epidermis or epidermis or epidermal lineage cells on the body surface of a non-human mammalian individual (host) before epidermal basal cells are formed
  • a method comprising contacting cells (donor cells), thereby obtaining a non-human mammalian individual having an epidermis comprising donor cells.
  • FIG. 1 shows the appearance of p63 knockout mice at E18.5.
  • Figure 2. Generation of p63 knockout embryos, injection of pluripotent cells (GFP-positive embryonic stem cells (ESCs) are used in the figure) into the embryos, and transplantation into pseudopregnant foster mice. and a scheme for obtaining chimeric embryos.
  • FIG. 3 shows an optical microscope image of a wild-type (WT) mouse embryo and an E19.5 chimeric embryo, and a fluorescence microscope image obtained by observing fluorescence derived from GFP in the embryo. In the fluorescence microscopic image, fluorescence mainly derived from GFP from the body surface is detected.
  • WT wild-type
  • FIG. 4 shows left and right appearances of an E19.5 chimeric embryo and fluorescence microscopic images obtained by observing fluorescence derived from GFP from the body surface (left and right) of the embryo.
  • the numbers in the figure correspond to the individual numbers in Table 1.
  • FIG. 5 is a diagram plotting the relationship between the chimerism contribution rate (chimerism) of donor cells in the spleen and the body surface area on which the epidermis is formed (percentage of the total surface area).
  • FIG. 6 shows GFP-derived fluorescence images of the body surface 7 days and 56 days after transplantation of the obtained skin tissue. In this experiment, skin tissue was isolated from chimeric neonates grown from chimeric embryos and transplanted into the excised area of skin tissue from other mice.
  • FIG. 5 is a diagram plotting the relationship between the chimerism contribution rate (chimerism) of donor cells in the spleen and the body surface area on which the epidermis is formed (percentage of the total surface area).
  • FIG. 7A shows fluorescence microscopic images (GFP, CK8/K18, and p63) of the epidermis of chimeric embryos.
  • FIG. 7B is a superimposed image of the images in FIG. 7A.
  • FIG. 7C depicts host-side cells being displaced by the donor cells in FIG. 7B so that the skin surface is occupied by the donor cells.
  • FIG. 8A shows a fluorescence micrograph of a portion of the body surface of an E18.5 chimeric embryo.
  • FIG. 8B is a superimposed image of the images of FIG. 8A. Eliminated host cells are located further out of the outermost layer of skin and are not left in the skin tissue.
  • FIG. 8A shows fluorescence microscopic images (GFP, CK8/K18, and p63) of the epidermis of chimeric embryos.
  • FIG. 7B is a superimposed image of the images in FIG. 7A.
  • FIG. 7C depicts host-side cells being
  • FIG. 9A shows the appearance of E16.5 chimeric individuals obtained by transplanting GFP-positive human HaCaT cells into the amniotic cavity of E13.5 embryos of p63 knockout mice.
  • FIG. 9B is an enlarged image of the square frame in FIG. 9A.
  • FIG. 9C shows a fluorescence microscope image of the chimeric individuals of FIG. 9A.
  • FIG. 10A shows the relationship between embryonic chimerism and surface coverage of the formed skin.
  • FIG. 10B is a fluorescence microscope image of a skin section of a chimeric embryo generated with p63KO embryos and donor embryonic stem cells.
  • FIG. 11A shows fluorescence microscopy images of the epidermis of chimeric embryos generated from wild-type embryos and donor embryonic stem cells.
  • FIG. 11B shows fluorescence microscopy images of the epidermis of chimeric embryos generated from p63KO embryos and donor embryonic stem cells.
  • FIG. 12 shows the engraftment results of the skin after transplantation of the skin tissue of the present disclosure.
  • FIG. 13 shows the results of the construction of human epidermis on individual mice according to the disclosed method.
  • subject refers to mammals, including, but not limited to, rodents such as mice and rats, farm animals such as pigs, goats, llamas, sheep, and cows, dogs and cats. and other pets, birds such as chickens, and primates such as monkeys.
  • rodents such as mice and rats
  • farm animals such as pigs, goats, llamas, sheep, and cows, dogs and cats. and other pets, birds such as chickens, and primates such as monkeys.
  • an animal can be a non-human animal.
  • a "somatic chimeric animal” refers to the cells of one individual and the cells of another individual (e.g., allogeneic cells, or allogeneic or allogeneic cells that have been genetically engineered to one or more cells) and animals with mixed tissues or organs at the cellular level.
  • a somatic cell chimeric animal can be obtained by introducing a plurality of (eg, about 10) pluripotent cells into an embryo (eg, morula or blastocyst). More specifically, as the embryo, various embryos from the 8-cell stage to the blastocyst stage can be used, and methods for introducing pluripotent cells into such animal embryos are also applicable. well known to traders.
  • the cells When introducing cells into blastocyst-stage embryos, the cells can be introduced, for example, into the blastocoel. Early embryos up to the morula stage may be aggregated by contacting the cells. Also, somatic cell chimeric animals can be obtained by administering the cells into fetal amniotic fluid. In this aspect, skin epithelial cells can be administered into the amniotic fluid.
  • Pluripotent cells include pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and pluripotent cells such as inner cell mass (ICM), and can be introduced into embryos in the present invention.
  • the number of pluripotent stem cells to be introduced into the embryo can also be determined as appropriate, and is not particularly limited. For example, when introduced into the embryo, the number can be about 3 to 10. In this specification, "somatic cell chimeric animal" may be simply referred to as "chimera".
  • host animal means an individual such as an embryo (hereinafter also referred to as "host embryo") into which cells such as pluripotent cells are introduced when producing a somatic chimeric animal.
  • embryo-introduced cells means cells (hereinafter also referred to as “donor cells”) that are introduced into an individual such as an embryo when producing a somatic cell chimeric animal.
  • pluripotent cells mean pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and pluripotent cells such as inner cell mass (ICM). Pluripotent cells are known to be able to differentiate into virtually any fetal or adult cell.
  • genetic manipulation means genetic modification.
  • alteration of gene expression means alteration that results in an enhancement or attenuation of gene expression. Attenuation of gene expression can be achieved by disruption of the gene.
  • genetic modification means that the gene differs from the wild type, and includes artificial modifications.
  • Representative examples of genetic modification include transgenics and knockouts. Knockout involves, but is not limited to, introducing mutations such as nonsense mutations and frameshift mutations into the target gene, or disrupting the regulatory region of the target gene to induce functional deficiency in the target gene. Knockouts may also introduce exogenous genes, such as marker genes, within or to replace the target gene.
  • epidermis As used herein, "epithelium” is the tissue that lines the outer surface of an animal individual, such as body cavities or lumens of organs.
  • skin is the tissue that covers the outer surface of an animal individual.
  • the skin consists of an epidermis, which is epidermis, and an underlying connective tissue system, the dermis.
  • the epidermis is mainly formed by keratinocytes (keratinocytes).
  • keratinocytes keratinocytes
  • stratum spinosum, stratum granulosum, and stratum corneum are arranged in layers.
  • the epidermis does not normally have blood vessels or nerves.
  • the skin has a basement membrane just below the epidermis.
  • the basement membrane has a basal lamina and a zona pellucida and is interposed between the epidermis and dermis.
  • the basal cells adhere to the basal lamina via the zona pellucida on the side opposite to the dermis (epidermal side) and actively cause cell division.
  • the epidermis and dermis are strongly connected via the basement membrane.
  • the dermis is the layer of skin that has the papilla layer and the upper reticular dermis between the epidermis and the subcutaneous tissue.
  • the dermis is primarily composed of fibrous connective tissue. Approximately 70% of the dermis is occupied by collagen, and the rest is composed of fibers such as elastic fibers (elastin), extracellular matrix and hyaluronic acid.
  • the dermis has organs such as blood vessels, lymph vessels, sweat glands, and hair follicles.
  • the dermis also contains fibroblasts that produce collagen fibers, macrophages that are involved in immunity and inflammation, mast cells, and plasma cells. Deeper than the dermis is the subcutaneous tissue.
  • the epidermis is of ectodermal origin, whereas the dermis is predominantly populated with fibroblasts, which are of mesodermal origin and are developmentally distinct.
  • the dermis has blood vessels and nerves in addition to fibroblasts, and it is believed that the blood vessels are derived from the endoderm and the nerves are derived from the ectoderm. These are believed to be the structures of common human epithelium and skin.
  • skin tissue can be provided.
  • Skin tissue includes the epidermis, basement membrane and dermis.
  • the epidermis is attached to one side of the basement membrane (the basal cells on that side) and the dermis is attached to the other side of the basement membrane (the basal lamina).
  • a zona pellucida may intervene between the dermis and the basal lamina.
  • the epidermis preferably consists of autologous or allogeneic cells, while the dermis may contain allogeneic or xenogeneic cells.
  • the epidermis consists of autologous cells, more preferably the autologous cells are free of foreign material (eg, foreign genes, products of foreign genes, and other antigenic substances). This is because such a graft material can engraft into an individual after transplantation.
  • the epidermis contains first cells and the dermis contains second cells.
  • the epidermis is of ectodermal origin, whereas the dermis is of mesodermal origin and is developmentally distinct.
  • the epidermis contains cells of the ectodermal lineage and the dermis contains cells of the mesodermal lineage.
  • the first cell may be of the ectodermal lineage and the second cell may be of the mesodermal lineage.
  • the first cells have the ability to differentiate into mature epidermal cells, while the second cells have the ability to differentiate into mature epidermal cells by genetic modification, gene knockdown, or the like. do not have.
  • the second cells are incapable of differentiating into any or all cells selected from the group consisting of basal cells, stratum corneum cells, granule cells, and spinous cells.
  • the second cell may or may not have the ability to differentiate into basal cells.
  • basement cells can include first cells.
  • the first cell has an allogeneic relationship with the second cell.
  • the first cell has a heterologous relationship with the second cell.
  • the first cell can be of human origin and the second cell can be of mammalian origin selected from the group consisting of primate, porcine, goat, sheep, llama, and bovine (e.g., a second The cells can be porcine).
  • the term "cells capable of differentiating into mature epidermal cells” includes not only undifferentiated cells capable of differentiating into mature epidermal cells, but also cells differentiated into mature epidermal cells. Used.
  • the first cells may have the ability to differentiate into one or more or all of the cells selected from the group consisting of basal cells, stratum corneum cells, granule cells, and spinous cells.
  • the second cell has reduced or preferably no ability to differentiate into mature epidermal cells.
  • the first cells have the ability to differentiate into one or more or all of the cells selected from the group consisting of basal cells, stratum corneum cells, granule cells, and spinous cells; have reduced, or preferably no, ability to differentiate into any or all cells selected from the group consisting of stratum corneum cells, granule cells, and spinous cells.
  • the second cell may have the ability to differentiate into basal cells.
  • the epithelium of p63-deficient individuals has a monolayer of cells expressing keratin K8/K18 on the basement membrane, and does not develop further (Shalom-Feuerstein et al., Cell Death Differ., 18:887- 896, 2011, incorporated herein by reference in its entirety).
  • donor cells with the ability to differentiate into the epidermis are introduced into p63-deficient embryos and developed, the host cells on the basement membrane are almost completely eliminated, and almost 100% or 100% of the epidermis is derived from donor cells. become cells (the epidermis consists of cells derived from donor cells);
  • the skin thus obtained can be preferably used as the skin of the present disclosure.
  • p63KO animal embryo or individual having an epidermis composed of human cells is appropriately generated, the first cell being a human cell and the second cell being any mammal such as a primate, domestic animal, or pet animal.
  • the skin of the present disclosure can be obtained.
  • Functional deficiency of p63 can be produced by disrupting or knocking down the p63 gene.
  • Disruption of the p63 gene is, for example, disruption of the control region of the p63 gene, introduction of a nonsense mutation into the p63 gene, introduction of a frameshift mutation, introduction of a missense mutation, introduction of a knockout cassette into the translation region by one or more selected from be able to.
  • Disruption of the p63 gene and introduction of a knockout cassette can be appropriately achieved by those skilled in the art using, for example, genome editing technology.
  • Genome editing techniques include TALE nucleases (TALENs), zinc finger nucleases (ZFNs), and CRISPR/Cas9 systems, which can be used to generate cells with p63 functional defects. More specifically, a target region is set within the gene of p63, and TALENs, ZFNs, or CRISPR/Cas9 designed to cleave the target region are introduced into cells to cleave the target region. The cleaved target regions are religated between the cleaved ends as they are repaired by the cell's self-repair mechanisms. However, during this repair process, base sequences can be randomly dropped, resulting in nonsense mutations and frameshift mutations.
  • TALE nucleases TALENs
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • CRISPR/Cas9 systems which can be used to generate cells with p63 functional defects. More specifically, a target region is set within the gene of p63, and TALENs, ZFNs, or CRISPR
  • the genomic DNA incorporates the donor DNA, thereby allowing disruption of the gene.
  • the donor DNA has an upstream homology arm having a sequence homologous to a region upstream of the cleavage site and a downstream homology arm having a sequence homologous to a region downstream of the cleavage site, and between the upstream homology arm and the downstream homology arm Includes knockout cassette.
  • the knockout cassette can include, for example, a selectable marker gene (eg, a drug selectable marker gene or a gene encoding a visualization marker such as a fluorescent protein) for selecting cells into which the knockout cassette has been inserted.
  • those skilled in the art can obtain cells having a disrupted gene using genome editing technology designed to appropriately cleave the target region.
  • introduction of the knockout cassette may be performed by classical homologous recombination.
  • Whether or not the p63 gene has been disrupted can be confirmed by sequencing the target region.
  • Whether or not the p63 gene has been disrupted can also be confirmed by testing whether the cells have the ability to differentiate into mature epidermis. Whether or not it has the ability to differentiate into mature epidermis is determined by obtaining p63 knockout individuals using ES cells having the disrupted gene (p63 knockout ES cells) or fertilized eggs having the disrupted gene. It can be confirmed by confirming the formation of the epidermis.
  • an isolated skin tissue comprising an epidermis, a basement membrane, and a dermis, wherein the epidermis is attached to one side of the basement membrane, and the dermis is attached to the basement membrane. attached to the other side of the membrane, and the epidermis contains first cells and the dermis contains second cells, the second cells lacking the ability to differentiate into mature epidermal cells , skin tissue is provided.
  • the first cell has a p63 gene with normal function and the second cell may have a functional defect in p63, eg, a disrupted p63 gene.
  • epidermal cells especially keratinocytes, which may include stratum basale (a layer consisting of basal cells), stratum spinosum, stratum granulosum, and stratum corneum), 98% or more, or 99% or more can consist of the first cells.
  • keratinocytes which may include stratum basale (a layer consisting of basal cells), stratum spinosum, stratum granulosum, and stratum corneum
  • 98% or more or 99% or more
  • 60% or more of the dermis preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, particularly preferably can consist of 99% or more of the second cell.
  • the contribution of the first cells in the dermis is thought to depend on the ability of the first cells to form chimeras in the embryo. Even when the chimera-forming ability of the first cells in the embryo is low, the chimera contribution rate of the first cells in keratinocytes can be maintained at a high value, while the chimera contribution rate in tissues other than the epidermis can be kept low. It is possible and preferable.
  • the epidermal cells are the first cells, and 75% or more of the dermal cells are the second cells. In a preferred embodiment, in the skin tissue of the present disclosure, 99% or more of the epidermal cells are the first cells, and 95% or more of the dermal cells are the second cells. In a preferred embodiment, in the skin tissue of the present disclosure, 99% or more of the epidermal cells are the first cells, and 99% or more of the dermal cells are the second cells.
  • the first cells are derived from the donor cells described below, and the second cells are derived from the host embryos described below.
  • technical requirements for donor cells and host embryos can be applied to technical requirements for first and second cells, respectively.
  • a second A composition comprising one cell. Further, according to the present disclosure, 99% or more of the epidermal cells are the first cells, and 99% or more of the dermal cells are the second cells. , a second cell is provided.
  • a kit for use in producing the skin tissue of the present disclosure wherein 99% or more of the epidermal cells are first cells and 99% or more of the dermal cells are second cells. and comprising a first cell and a second cell. In the kit, the first cells and the second cells are preferably contained in separate containers.
  • a graft material can be provided that includes the skin tissue of the present disclosure.
  • the implantable material of the present disclosure can be used to repair wounds.
  • the implantable material of the present disclosure can be used to treat body surfaces that have burns. If necessary, the damaged skin may be excised, and the graft material of the present disclosure may be transplanted to the skin-excised body surface.
  • Implantable materials of the present disclosure can also be used to treat skin diseases such as intractable ulcers and bullous blisters.
  • Implantable materials of the present disclosure can also be used for screening of active pharmaceutical ingredients (eg, compounds) for treatment of burns, cosmetology, skin tumors, and the like.
  • the method for producing the skin tissue of the present disclosure (hereinafter referred to as “the method for producing the skin tissue of the present disclosure") is provided.
  • the method for producing skin tissue of the present disclosure includes preparing a host embryo.
  • a host embryo is an embryo that has reduced or preferably no capacity to differentiate into mature epidermal cells.
  • the host embryo is genetically engineered (eg, gene knockout or knockdown) to have reduced, or preferably no, ability to differentiate into mature epidermal cells.
  • Host embryos are the second source of cells in the skin tissue of the present disclosure.
  • the method for producing skin tissue of the present disclosure may include injecting donor cells having the ability to differentiate into mature epidermal cells into the host embryo to form a chimeric individual. The injection may be performed under conditions suitable for engraftment of donor cells into the skin.
  • Donor cells can be, for example, pluripotent cells.
  • Donor cells can also be, for example, cells with mature epidermal differentiation potential (e.g., stem cells and progenitor cells) or cells committed to epidermal or epidermal lineage cells (e.g., epidermal stem cells, basal cells, spinous cells, granule cells). , and keratinocytes such as corneocytes).
  • Donor cells may preferably be pluripotent cells.
  • Donor cells may also preferably be cells with mature epidermal differentiation potential or cells committed to epidermal or epidermal lineage cells, in particular epidermal stem cells or basal cells.
  • any cell capable of differentiating into mature epidermis can be used as the donor cell, except in cases where engraftment is significantly inhibited and no donor cell-derived epidermis is formed.
  • the fact that cells having various stages of differentiation can be used as donor cells, as long as they are cells that have the potential to differentiate into mature epidermis, can be achieved by using pluripotent stem cells as donor cells to create skin having an epidermis composed of donor cells. and that even if HaCaT cells are used as donor cells, it is possible to obtain skin having an epidermis composed of donor cells.
  • the basal cells and epidermis can then be formed with donor cell-derived cells by contacting the donor cells with the host embryo prior to the formation of the basal cells (eg, CK8/K18 positive cells) of the host embryo.
  • Donor cells can be autologous or allogeneic, preferably autologous, more preferably unmodified autologous. Unmodified means that transformation (for example, modification by genetic recombination) has not been performed.
  • the donor cells are allogeneic cells, the donor cells are preferably resistant to immune rejection (ie, have improved tolerance to immune rejection).
  • the donor cells are preferably deficient in either HLA class I and class II, or preferably both, in their genomic DNA to improve tolerance to immune rejection in allogeneic transplantation. ing.
  • HLA class I deletion can be achieved by ⁇ 2 microglobulin knockout or HLA class I knockout.
  • deletion of HLA class II can be achieved by CIITA knockout or HLA class II knockout.
  • overexpression or forced expression of one or more selected from the group consisting of HLA-G, HLA-E, CD47, and PD-L1 in allogeneic transplantation compared to the case where the expression is not suppressed May improve tolerance to immune rejection.
  • HLA-A, HLA-B, and HLA-C only at one locus HLA pseudohomozygosity
  • HLA heterozygotes can be obtained. It may improve tolerance to immune rejection in allogeneic transplantation in comparison.
  • Donor cells may also be knocked-in with a suicide gene linked under the control of an inducible promoter to allow for active elimination after transplantation for any reason.
  • multiple donor cells may be contacted (or administered) to a single host embryo.
  • the number of donor cells administered per host embryo can be, for example, on the order of 3-10, such as 3-5, 5-7, or 8-10.
  • Donor cells may be cells that have a low chimera-contributing ability (chimera-forming ability). For example, as long as it has chimera-forming ability, the chimera contribution rate is 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2 % or less, or 1% or less.
  • the chimeric contribution ability is defined as the donor in all cells of an individual or a part of an individual (e.g., a specific organ) in a chimeric individual generated by injecting donor cells into a normal embryo (e.g., blastocyst stage of a normal embryo). It can be determined as a percentage of cells from a cell.
  • Donor cells may be limited in their contributions to tissues other than the epidermis if the chimeric contribution of the donor cells is low. This is preferable in that ethical problems can be alleviated.
  • the donor cells can be mixed with the cells of the host embryo or injected into the blastocoel of the host embryo. If the host embryo is at the blastocyst stage or later, the donor cells can be administered into the amniotic cavity, thereby allowing the donor cells to contact the surface of the host embryo.
  • injection methods are examples, and there are various other injection methods, and a person skilled in the art can appropriately select or determine an injection method and use it in the method of the present disclosure.
  • a host embryo injected or administered with donor cells (herein referred to as a "chimeric embryo”) can be transplanted into the uterus of a pseudopregnant foster mother mammal, engrafted, and then allowed to grow.
  • the pseudopregnant foster mother mammal is preferably of the same species as the host embryo. By doing so, engraftment of the host embryo into the uterus may be facilitated.
  • the obtained chimeric embryo can have skin tissue including epidermis, basement membrane and dermis. Further growth of the obtained chimeric embryos causes the epidermis to mature and develop into an epidermis with stratum corneum, stratum granulosum and stratum spinosum. Isolating skin tissue containing epidermis, basement membrane and dermis, preferably skin tissue containing mature epidermis, basement membrane and dermis from the obtained chimeric embryo or chimeric individual obtained by further growing the chimeric embryo. can be done. Isolation can be performed by physical excision.
  • the isolated skin tissue can be stored, for example, in an appropriate solution such as physiological saline or a liquid medium, under an environment suitable for storage (e.g., oxygen concentration, carbon dioxide concentration, and temperature conditions).
  • an environment suitable for storage e.g., oxygen concentration, carbon dioxide concentration, and temperature conditions.
  • the oxygen concentration can be, for example, about 20%
  • the carbon dioxide concentration can be from 0 to about 5%
  • the temperature conditions can be from 0° C. to about 37° C. (particularly body temperature).
  • the host embryo can be a non-human mammalian embryo.
  • donor cells can be human cells or non-human mammalian cells.
  • the host embryo can be a porcine embryo and the donor cells can be human cells.
  • engraftment of cells has been confirmed between mice and humans, which are more evolutionarily distant than between pigs and humans.
  • human cells can be introduced into embryos of many non-human mammals to form chimeric embryos or individuals.
  • the human cells may be the skin of the recipient, but are preferably obtained from organoids having human epidermis, and are not particularly limited, for example, Lee, J. et al.
  • the skin tissue of the present disclosure can be treated with an anti-inflammatory agent or an immunosuppressive agent before inflammation is observed in the skin tissue after birth. After inflammation is observed in the skin tissue of the present disclosure after birth, the skin tissue may be treated with an anti-inflammatory agent or an immunosuppressive agent.
  • immunosuppressants include, but are not limited to, calcineurin inhibitors such as cyclosporine and tacrolimus, mTOR inhibitors such as rapamycin and everolimus, antimetabolites such as azathioprine, mizoribine, methotrexate, mycophenolate mofetil, and leflunomide, and alkylating agents. Cyclophosphamide can be mentioned and can be used in the present invention.
  • Anti-inflammatory agents include, but are not limited to, steroidal anti-inflammatory drugs (SAIDs), non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), and the like, and can be used in the present invention.
  • Steroids include cortisol, prednisolone, triamcinolone, beclomethasone, betamethasone, fluticasone, dexamethasone, hydrocortisone and can be used in the present invention.
  • Other anti-inflammatory agents include inflammatory cytokine inhibitors such as anti-inflammatory cytokine antibodies, such as anti-TNF- ⁇ antibodies, and solubilized cytokine antibodies, such as solubilized TNF receptors, which are used in the present invention. be able to.
  • a steroidal anti-inflammatory agent having functions as an immunosuppressive agent and an anti-inflammatory agent can be preferably used. In the present invention, it can be expected that a sufficient effect can be obtained simply by suppressing either immune reaction or inflammation.
  • the skin tissue of the present disclosure is preserved in saline or in a medium containing an anti-inflammatory and/or ). Due to the presence of the dermis, post-transplant skin tissue can regenerate skin on the body surface of the recipient in the presence of anti-inflammatory and/or immunosuppressive agents. On the body surface of the recipient, it can be expected that the cells derived from the host embryo will be removed over time and replaced by the recipient's cells. Therefore, it can be expected that the recipient's skin will regenerate after a sufficient period of time has passed after transplantation.
  • the donor cells are preferably recipient-derived cells (preferably recipient-derived induced pluripotent cells from the viewpoint of ease of acquisition), and the resulting graft material containing skin tissue is It can be used to transplant into a recipient.
  • recipient-derived cells preferably recipient-derived induced pluripotent cells from the viewpoint of ease of acquisition
  • Pluripotent Stem Cells As mouse embryonic stem cells (ESC), mouse ESCs (strain name: B6ES2 and strain name: SGE2 ) was used. As rat ESCs, rat ESCs (strain name: BN2i-4) established from BN rats were used. ESCs were cultured using mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts as feeders. N2B27 medium supplemented with 1 ⁇ M PD0325901, 3 ⁇ M CHIR99021 and 1000 U/ml mouse leukocyte inhibitory factor (LIF) was used for culture.
  • HaCaT cells HaCaT cells were purchased from Cell Lines Service, cultured in Cnt-07 (CellnTEC) medium and used.
  • Cnt-07 CellnTEC
  • an EGFP expression cassette under the control of the CAG promoter was introduced into BN2i-4 and HaCaT cells using a lentiviral vector. Only the GFP (+) population after transfection was used for the experiment by sorting GFP-positive cells with a flow cytometer (BD, FACS Aria III). Fluorescently labeled cells are hereinafter referred to as "BN2i-4-EGFP" and "HaCaT-EGFP".
  • Nucleotide sequence in exon 5 of p63 CACGGATAACAGCGCCCTGT is recognized.
  • Cas9 protein IDT, Alt-R (trademark) Sp Cas9 Nuclease
  • donor ESCs SGE2 or BN2i-4-CAG-EGFP
  • punching Piero or laser punch
  • Two to five per embryo were microinjected into the perivitelline space.
  • chimeric embryos were cultured in KSOM/AA medium to the embryo number and transferred to the uterus of pseudopregnant mice to obtain chimeric fetuses.
  • CAG-EGFP CAG-EGFP
  • BDF1-EGFP DBA2 spermatozoa
  • Genotyping A portion of the tail of p63 mutation mice was collected, permeated with Proteinase K-containing Lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% SDS), and incubated at 60°C for 5 minutes. After dissolving by heating for 24 hours, proteinase K was inactivated by heating at 98°C for 2 minutes to obtain a genomic DNA extract. Primers (CACGTTTGTACAAGCCAGAACTTA, TCTTTTGGT CTTCCCGAGCCT) were designed to sandwich the mutation region, and the target sequence was amplified by PCR reaction.
  • the base sequence was confirmed by Sanger sequencing, and the genotype was determined by TIDE analysis (doi:10.1093/nar/gku936).
  • host-side splenic lymphocytes (GFP-/CD45+/DAPI- or GFP+/CD45+/DAPI-) were fractionated with a flow cytometer and similarly genotyped.
  • individuals with frameshift mutant alleles or large deletion alleles of 50 base pairs or more accounting for 90% or more of the total alleles were analyzed.
  • Intrauterine Injection A pseudopregnant mouse (E13.5) implanted with a p63 mutation embryo was subjected to laparotomy under isoflurane inhalation anesthesia to expose the uterus. The uterine wall was punctured with a glass needle, HaCaT-EGFP was injected into the amniotic cavity together with 5 ⁇ l of medium, and the abdomen was closed. On day 3 of transplantation, p63 mutation fetuses were excised, cell engraftment was observed under a fluorescence microscope, and skin pieces were collected and pathologically evaluated.
  • C57BL/6N-Tg (CAG-EGFP) skin grafted group negative control 1
  • BDF1-EGFP fetal skin grafted group positive control 2
  • BDF1-EGFP fetal skin grafted to C57BL Allocated to the group transplanted to /6N-Tg CAG-EGFP
  • negative control 2 performed a skin graft experiment.
  • tacrolimus a calcineurin inhibitor
  • C57BL/6N-Tg CAG-EGFP
  • BN rats negative control
  • fetal skin was transplanted to BN rats, and performed a skin transplantation experiment.
  • the keratinocytes thus obtained are believed to contain basal cells, granule cells, spinous cells and stratum corneum cells.
  • cut dermis pieces were cultured in a dish containing DMEM high glucose + 10% FBS for several days, and adhered cells were analyzed. After pipetting, the spleen was hemolyzed with ACK buffer, and CD45 (+) was analyzed as leukocytes.
  • results p63 knockout mouse models show epidermal vascularity with partial or complete absence of squamous epithelium (Mills et al., Nature, 398:708-713, 1999 and Yang et al., Nature, 398:714-1999). 718, 1999, which are incorporated herein by reference in their entireties).
  • p63-deficient epithelium remains with a monolayer of non-proliferating cells expressing K8/K18 and remains developmentally refractory (Shalom-Feuerstein et al., Cell Death Differ., 18:887-896, 2011). incorporated herein by reference in its entirety).
  • a method was used in which exon 5 of p63 was targeted and the p63 gene was deficient by CRISPR/Cas9, thereby obtaining p63 knockout embryos (see FIG. 1).
  • the chimera-forming ability of pluripotent stem cells was determined as the percentage of GFP-positive donor cells to total cells in splenic lymphocytes obtained from each chimeric individual.
  • the chimera-forming ability of pluripotent stem cells was also determined as the percentage of GFP-positive donor cells to total keratinocyte cells obtained from each chimeric individual.
  • the area of regenerated epidermis was determined as the percentage of the area of GFP-positive epidermis relative to the total surface area of the individual. The results were as shown in Table 1.
  • FIG. 5 A graph plotting the results of Table 1 is shown in FIG. As shown in FIG. 5, it is clear that even donor cells with low chimera-forming ability, which hardly form chimeras in organs other than skin (here, spleen), strongly contribute to skin.
  • the formed epidermis was basically derived from donor cells. This suggests that the donor cells form the epidermis by eliminating immature epidermal cells formed in the host.
  • the chimeric individual's skin was analyzed histologically. It was then revealed that the epidermis and hair follicles were derived exclusively from donor cells. In contrast, the dermis was found to be in a chimeric state of donor cells and host cells (derived from p63KO embryos).
  • the GFP-positive skin (including the epidermis and dermis) of the obtained chimeric individuals was excised and transplanted to the skin of wild-type C57BL/6N mice. Observation of the transplanted skin 7 days after transplantation revealed the presence of GFP-positive cells in the transplanted portion, as shown in FIG. These GFP-positive cells could be observed even 56 days after transplantation (see FIG. 6).
  • Epidermal progenitor cells are found on the skin surface of p63 knockout mice. However, no p63 knockout-derived cells were observed in the epidermis of E19.5 chimeric individuals (see, eg, keratinocyte data in Table 1). Therefore, the skin of the E14.5 chimeric individual was observed.
  • CK8/K18-positive host cells derived from p63 knockout embryos
  • GFP-positive cells derived from donor cells
  • expression of p63 was also confirmed by fluorescent staining at the same time. Then, as shown in FIG. 7A, on the same skin, a skin area where the presence of CK8/K18-positive host cells (derived from p63 knockout embryos) and GFP-positive cells (derived from donor cells) could be confirmed was observed.
  • donor GFP-positive/p63-positive cells were found on the basement membrane, while host CK8/K18-positive cells were flipped over by the donor cells, as shown in FIG. 7B. It was observed to be pushed away and detached from the basement membrane.
  • donor cell-derived organs were formed by occupying empty niches due to organ defects (see WO2010/021390A and WO2008/102602A. These are cited by incorporated herein in its entirety).
  • the donor cells were observed to push away and remove host cells instead of occupying empty niches. That is, it was suggested that the host cells were removed by the donor cells due to cell competition.
  • GFP-positive donor cells and CK8/K18-positive host cells in the skin of E18.5 chimeric individuals were observed under a fluorescence microscope. Then, at E18.5, host-derived cells had been removed from the basement membrane, which was mostly populated with GFP-positive donor cells.
  • the epidermis and appendages were mostly populated by pluripotent stem cell-derived EGFP-positive cells, and the dermis was donor- and embryo-derived chimeras (i.e., obtained The skin was semi-autologous skin). It was found that this enabled semi-autologous skin regeneration.
  • a skin graft material includes epidermis and dermis, and implantation of this graft material into a subject is believed to promote skin engraftment in the subject.
  • contamination of the epidermis with host cells can result in rejection of the skin, preventing engraftment of skin grafts, as described below.
  • epidermis and dermis epidermis and dermis of the skin constructed as described above using p63KO embryos (BDF1 line) expressing EGFP and donor cells (B6 line) were transplanted into the B6 line.
  • BDF1 line p63KO embryos
  • B6 line donor cells
  • group C autografts (transplantation of EGFP-expressing BDF1 line skin into BDF1 line) as group A and allografts (transplantation of EGFP-expressing BDF1 line skin into B6 line skin) as groups B and D. transplantation) experiments were conducted.
  • group A skin harvested from BDF1-Tg(CAG-EGFP) mice was transplanted to other BDF1-Tg(CAG-EGFP) mice.
  • BDF1-Tg(CAG-EGFP) mice are F1 of EGFP-expressing B6 and DBA2 mice.
  • Group A both epidermis and dermis of the graft are immunologically matched to the graft recipient.
  • group B skin harvested from BDF1-Tg (CAG-EGFP) mice was transplanted to B6-Tg (CAG-EGFP) mice.
  • Group B neither the epidermis nor the dermis of the graft are immunologically matched to the graft recipient.
  • mice were created by injecting wild-type B6-derived ES cells into fertilized embryos of BDF1-Tg (CAG-EGFP) mice expressing EGFP and having a wild-type p63 gene, and collected from the chimeras. Chimeric skin grafts (epidermis also chimera of donor and host embryos) were transplanted into B6-Tg(CAG-EGFP) mice. In group D, neither the epidermis nor the dermis of the graft contain host embryo-derived components that are immunologically incompatible with the graft recipient.
  • the epidermis, hair follicles, sebaceous glands, and sweat glands were derived from donor cells, and the dermis, nerves, blood vessels, and arrector pili muscles were chimeras of donor cells and germ cells.
  • the epidermis and dermis of the skin constructed as described above using p63KO embryos (BDF1 line) and EGFP-expressing donor cells (B6 line)
  • BDF1 line p63KO embryos
  • B6 line EGFP-expressing donor cells
  • mice contributed by HaCaT cells were grown to E18.5. Then, as shown in FIG. 13, epidermis derived from human epidermal cells was constructed on part of the surface of the resulting chimeric mouse. A section of the obtained skin was prepared, the nucleus was stained with DAPI, and the mature keratinocyte marker Krt14 was stained by immunohistological staining. When observed under a fluorescence microscope, the GFP-labeled human epidermis formed a Krt14-positive epidermis on the mouse dermis, as shown in FIG. Was. Thus, skin tissue with human epidermis could be constructed on xenogenic skin. From this, it is considered possible to construct human epidermis on porcine dermis. In addition, porcine skin is sometimes used as a skin graft material for humans, and it is expected that the engraftment efficiency will be enhanced by using human epidermis (reference: FIG. 12).
  • a skin with an epidermis composed of autologous cells can be constructed on the dermis.
  • the epidermis consisted of autologous or immunologically compatible cells
  • skin grafts containing the epidermis showed good long-term engraftment.
  • the dermis contains immunologically incompatible cells, it hardly affects the engraftment of the grafted skin.
  • the epidermis composed of autologous cells prepared from p63-disrupted non-human animal embryos and human cells and the skin containing the dermis containing the non-human animal cells can be preferably used for autologous skin transplantation to humans. Conceivable.

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Abstract

本開示は、表皮と基底膜と真皮とを含む単離された皮膚組織であって、前記表皮は前記基底膜の一方の面に接着しており、前記真皮は前記基底膜の他方の面に接着しており、かつ、表皮が第１の細胞を含み、真皮が第２の細胞を含み、第２の細胞は、成熟表皮細胞への分化能を欠失している、皮膚組織を提供する。

Description

皮膚組織
　本開示は、皮膚組織に関する。本開示は、非限定例として、表皮と基底膜と真皮とを含む単離された皮膚組織であって、前記表皮は前記基底膜の一方の面に接着しており、前記真皮は前記基底膜の他方の面に接着しており、かつ、表皮が第１の細胞を含み、真皮が第２の細胞を含み、第２の細胞は、成熟表皮細胞への分化能を欠失している、皮膚組織に関する。
　創傷または熱傷により、真皮に至る皮膚の損傷を生じることがある。このような損傷は、自律的には修復ができないために皮膚組織の移植を必要とする。皮膚移植では、自家移植がなされ、皮膚の欠損部に対して体の別の体表から取得した皮膚を移植する。この場合には生着率が極めて高いが、皮膚の損傷が広範囲にわたるために自家移植が困難な症例が存在する。また、自家移植が可能な場合であっても、皮膚を採取した箇所には傷が残るために、自家移植を避けたいとの要望がある。
　同種異系または異種の皮膚を移植する方法では、免疫拒絶等により恒久的な生着を望むことができない場合が多い。患者自身から採取した細胞から培養皮膚細胞シートを作成する試みがなされている（非特許文献１～６）。しかし、これらの方法で得られるシートは、一般的に、基底膜や真皮が欠如しており、表皮細胞のみを含むシート（すなわち培養表皮シート）であり、このようにして得られる培養表皮シートを体表に移植しても真皮が欠如しているために体表上に生着させることが容易ではない。また、インビトロで人工皮膚代替物を作製する試みがなされているが、機能的な厚みのある真皮層を構築するには至っていない。
Rheinwald JG, Green H. Cell. 1975;6:331-343. Matsumura H et al. Burns. 2016;42:769-76. Hefton JM et al. Lancet. 1983;2:428-430. KatzAB, Taichman LB. J Invest Dermatol. 1994;102:55-60. Sakamoto M et al. Ann Plast Surg. 2017;78(6):651-658. Sakamoto M et al. PLoS One. 2020;15(8):e0237985.
　本開示は、皮膚組織を提供する。本開示は、非限定例として、表皮と基底膜と真皮とを含む単離された皮膚組織であって、前記表皮は前記基底膜の一方の面に接着しており、前記真皮は前記基底膜の他方の面に接着しており、かつ、表皮が第１の細胞を含み、真皮が第２の細胞を含み、第２の細胞は、成熟表皮細胞への分化能を欠失している、皮膚組織を提供し得る。
　本開示によれば、成熟した表皮細胞への分化能を有しないホスト胚に対して、成熟した表皮への分化能を有するドナー細胞を投与することにより、表皮と基底膜と真皮を含み、表皮はドナー細胞に由来し、真皮は、ドナー細胞とホスト細胞に由来する皮膚組織が得られた。本開示は、このような知見に基づく。
　本開示によれば、以下の発明が提供される。
［１］表皮と基底膜（または基底板）と真皮とを含む単離された皮膚組織であって、前記表皮は前記基底膜（または基底板）の一方の面に接着しており、前記真皮は前記基底膜（または基底板）の他方の面に接着しており、かつ、
　表皮が第１の細胞を含み、または好ましくは表皮が第１の細胞からなり、真皮が第２の細胞を含み、真皮は第１の細胞をさらに含んでいてもよく、
　第２の細胞は、成熟表皮細胞への分化能を低下させているか、または欠失している、皮膚組織。
［２］第２の個体の細胞が、ｐ６３に機能欠損を有する細胞である、上記［１］に記載の皮膚組織。
［３］表皮が成熟した表皮である、上記［１］または［２］に記載の皮膚組織。
［４］表皮の細胞（好ましくは、基底細胞を含む表皮の細胞である）の９５％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の７５％以上が第２の細胞である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の皮膚組織。
［５］皮膚組織を作製する方法であって、
　成熟した表皮を（自律的には）発生させることができないホスト胚（またはそのように操作されたホスト胚）を用意することと、
　前記ホスト胚に対して、成熟した表皮への分化能を有するドナー細胞を注入すること、ここで、前記注入は、前記細胞の皮膚への生着に適した条件下で行われ、
　得られた胚を偽妊娠仮母哺乳動物の子宮内でまたは子宮に移植して成長させて、当該哺乳動物から成熟した表皮を有する個体を得ることと、
　得られた個体からドナー細胞由来の細胞を含む成熟した表皮と、基底膜と、ホスト由来の細胞を含む真皮を含む皮膚組織を単離することと
を含む、方法。
［６］成熟した表皮を発生させることができないホスト胚が、ｐ６３ノックアウト胚である、上記［５］に記載の方法。
［７］成熟した表皮への分化能を有するドナー細胞が、多能性細胞、および表皮に向けて運命決定された細胞からなる群から選択される細胞である、上記［５］または［６］に記載の方法。
［８］胚が、８細胞期から胚盤胞期のいずれかの発生段階の胚である、上記［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］胚が、胚盤胞期からＫ８／Ｋ１８陽性の細胞を含む表皮を形成するまでのいずれかの発生段階の胚である、上記［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］胚が、Ｋ８／Ｋ１８陽性の細胞の表皮を有する胚である、上記［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［２１］第２の細胞が、有棘細胞、顆粒細胞、および角層細胞からなる群から選択される成熟表皮細胞のいずれかまたはすべてへの分化能を欠失している、上記［１］～［４］のいずれかに記載の皮膚組織または上記［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［２２］第２の細胞が、第２の細胞が、有棘細胞、顆粒細胞、および角層細胞からなる群から選択される成熟表皮細胞のすべてへの分化能を欠失している、上記［１］～［４］のいずれかに記載の皮膚組織または上記［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［２３］第２の細胞が、基底細胞への分化能を有する、上記［２１］に記載の皮膚組織または方法。
［２４］第２の細胞が、基底細胞への分化能を有する、上記［２２］に記載の皮膚組織または方法。
［２５］第１の細胞が、正常機能を有するｐ６３遺伝子を有する、上記［１］～［４］のいずれかに記載の皮膚組織、上記［５］～［７］のいずれかに記載の方法、または、上記［２１］～［２４］のいずれかに記載の皮膚組織もしくは方法。
［２６］表皮細胞の９５％以上が、第１の細胞であり、５％未満が第２の細胞である、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［２７］真皮細胞の７０％以上が、第２の細胞であり、３０％未満が第１の細胞である、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［２８］表皮細胞の９５％以上が、第１の細胞であり、５％未満が第２の細胞であり、かつ、真皮細胞の７０％以上が、第２の細胞であり、３０％未満が第１の細胞である、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［２９］表皮細胞の９９以上が、第１の細胞であり、１％未満が第２の細胞であり、かつ、真皮細胞の９０％以上が、第２の細胞であり、１０％未満が第１の細胞である、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［３０］表皮細胞の９９以上が、第１の細胞であり、１％未満が第２の細胞であり、かつ、真皮細胞の５０％以下が、第２の細胞であり、５０％以上が第１の細胞である、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［３１］表皮細胞の９５％以上が、第１の細胞であり、５％未満が第２の細胞であり、かつ、真皮細胞の５０％以上が、第２の細胞であり、５０％未満が第１の細胞である、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［４１］上記いずれかの皮膚組織を含む、移植材料。
［４２］対象における皮膚移植において移植することに用いるための上記［４１］に記載の移植材料。
［４３］対象が、熱傷または創傷による皮膚の損傷を有する、上記［４２］に記載の移植材料。
［５１］第１の細胞が、ヒト由来であり、第２の細胞が、非ヒト哺乳動物由来である、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［５２］第１の細胞が、ヒト由来であり、第２の細胞が、ブタ由来である、上記［５１］に記載の皮膚組織。
［５３］第１の細胞において、ＨＬＡクラス１およびクラスＩＩのいずれかまたは両方が欠失しており、これにより、前記発現抑制がなされていない場合と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させている、上記いずれかに記載の皮膚組織。
［５４］第１の細胞において、ＨＬＡクラス１およびクラスＩＩの両方が欠失しており、これにより、前記発現抑制がなされていない場合と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させている、上記［５３］に記載の皮膚組織。
［５５］第１の細胞において、β２ミクログロブリンおよびＣＩＩＴＡのいずれかまたは両方がノックアウトされ、これにより、前記発現抑制がなされていない場合と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させている、上記［５３］に記載の皮膚組織。
［５６］第１の細胞において、β２ミクログロブリンおよびＣＩＩＴＡの両方がノックアウトされ、これにより、前記発現抑制がなされていない場合と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させている、上記［５４］に記載の皮膚組織。
［５７］ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される１以上が強制発現され、これにより、前記発現抑制がなされていない場合と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させている、上記［５３］～［５６］のいずれかに記載の皮膚組織。
［５８］ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃからなる群から選択される１以上またはすべてを片側遺伝子座においてのみノックアウト（ＨＬＡ擬似ホモ接合体化）され、これにより、前記発現抑制がなされていない場合と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させている、上記［５３］～［５７］のいずれか一項に記載の皮膚組織。
［６１］上記いずれかに記載の皮膚組織とその保存に適した保存液とを含む、製品。
［６２］保存液が生理食塩水である、上記［６１］に記載の製品。
［６３］保存液が無血清培地である、上記［６１］に記載の製品。
［６４］保存液が科学的に定義された培地である、上記［６３］に記載の製品。
［６５］抗炎症剤および免疫抑制剤のいずれかまたは両方を含む、上記いずれかの製品。［６５］皮膚移植において移植することに用いるための上記いずれかの製品。
［７１］上記［５１］～［５４］のいずれかに記載の皮膚組織を含む移植材料であって、第１の細胞が由来するヒト対象に移植することに用いるための、移植材料。
［７２］上記［５３］または［５４］に記載の皮膚組織を含む移植材料であって、当該第１の細胞の由来するヒトとは同種異系のヒト対象に移植することに用いるための、移植材料。
［８１］上記いずれかの皮膚組織、移植材料、または製品を製造する方法であって、
　成熟した表皮を発生させることができないホスト胚を用意することと、
　前記ホスト胚に対して、成熟した表皮への分化能を有するドナー細胞を注入することと、ここで、前記注入は、前記細胞の皮膚への生着に適した条件下で行われ、
　得られた胚を偽妊娠仮母哺乳動物の子宮内でまたは子宮に移植して成長させて、当該哺乳動物から成熟した表皮を有する個体を得ることと、
　得られた個体からドナー細胞由来の細胞を含む成熟した表皮と、基底膜と、ホスト由来の細胞を含む真皮を含む皮膚組織を単離することと、
を含む、方法。
［９１］非ヒト哺乳動物個体を作製する方法であって、
　表皮の基底細胞が形成される前の非ヒト哺乳動物個体（ホスト）の体表に、キメラ形成能を有し、かつ成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞（ドナー細胞）を接触させることを含み、これにより、ホストの細胞とドナー細胞とを含む皮膚組織を有する非ヒト哺乳動物個体を得る、方法。
［９２］非ヒト哺乳動物個体が、ｐ６３ノックアウト個体である、上記［９１］に記載の方法。
［９３］キメラ形成能を有し、かつ成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞（ドナー細胞）が、ヒト細胞である、上記［９１］または［９２］に記載の方法。
［９４］非ヒト哺乳動物個体が、マウスまたはブタである、上記［９１］～［９３］のいずれか一項に記載の方法。
［９５］キメラ形成能を有し、かつ成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞（ドナー細胞）が、ヒト細胞であり、非ヒト哺乳動物個体が、マウスまたはブタである、上記［９１］～［９４］のいずれかに記載の方法。
［９６］ホストの細胞とドナー細胞が真皮に含まれる、上記［９１］～［９５］のいずれかに記載の方法。
［９７］ホストの細胞とドナー細胞が、表皮および真皮のそれぞれに含まれる、上記［９１］～［９４］のいずれかに記載の方法。
［９８］前記接触が、ホストの羊膜腔内にドナー細胞を注入することにより実施される、上記［９１］～［９７］のいずれかに記載の方法。
［９９］前記接触または注入が、経子宮的投与により行われる、上記［９１］～［９８］のいずれかに記載の方法。
［１０１］非ヒト哺乳動物個体を作製する方法であって、
　表皮の基底細胞が形成される前の非ヒト哺乳動物個体（ホスト）の体表に、キメラ形成能を有し、かつ成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞（ドナー細胞）を接触させることを含み、これにより、ドナー細胞を含む表皮を有する非ヒト哺乳動物個体を得る、方法。
［１０２］非ヒト哺乳動物個体が、ｐ６３ノックアウト個体である、上記［１０１］に記載の方法。
［１０３］キメラ形成能を有し、かつ成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞（ドナー細胞）が、ヒト細胞である、上記［１０１］または［１０２］に記載の方法。
［１０４］非ヒト哺乳動物個体が、マウスまたはブタである、上記［１０１］～［１０３］のいずれか一項に記載の方法。
［１０５］キメラ形成能を有し、かつ成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞（ドナー細胞）が、ヒト細胞であり、非ヒト哺乳動物個体が、マウスまたはブタである、上記［１０１］～［１０４］のいずれかに記載の方法。
［１０６］前記接触が、ホストの羊膜腔内にドナー細胞を注入することにより実施される、上記［１０１］～［１０５］のいずれかに記載の方法。
［１０７］前記接触または注入が、経子宮的投与または羊膜腔内投与により行われる、上記［１０１］～［１０６］のいずれかに記載の方法。
図１は、ｐ６３ノックアウトマウスのＥ１８．５における外観を示す。 図２は、ｐ６３ノックアウト胚の作製と、多能性細胞（図中では、ＧＦＰ陽性の胚性幹細胞（ＥＳＣ）が用いられている）の胚への注入と、偽妊娠仮母マウスへの移植と、キメラ胚の取得までのスキームを示す。 図３は、野生型（ＷＴ）マウス胎児と、Ｅ１９．５のキメラ胚の光学顕微鏡像と、当該胚のＧＦＰに由来する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。蛍光顕微鏡像では、主に体表からのＧＦＰに由来する蛍光が検出されている。 図４は、Ｅ１９．５のキメラ胚の左右の外観と、当該胚の体表（左右）からのＧＦＰに由来する蛍光を観察した蛍光顕微鏡像を示す。図中の数字は、表１中の個体番号に対応している。 図５は、ドナー細胞の脾臓におけるキメラ寄与率（キメリズム）と表皮が形成された体表面積（全体表面積に対する割合）との関係をプロットした図である。 図６は、得られた皮膚組織の移植後の体表の７日後および５６日後のＧＦＰ由来の蛍光像を示す。この実験では、キメラ胚を成長させて得られたキメラの新生仔から皮膚組織を単離して、他のマウスの皮膚組織を切除した領域に移植した。 図７Ａは、キメラ胚の表皮の蛍光顕微鏡像（ＧＦＰ、ＣＫ８／Ｋ１８、およびｐ６３）を示す。 図７Ｂは、図７Ａの各画像を重ね合わせた像である。 図７Ｃは、図７Ｂにおいて、ホスト側の細胞が、ドナー細胞により押しのけられて皮膚表面がドナー細胞により占有されるようすが図示されている。 図８Ａは、Ｅ１８．５のキメラ胚の体表の一部の蛍光顕微鏡写真を示す。 図８Ｂは、図８Ａの画像の重ね合わせた像である。排除されたホスト細胞は、皮膚の最外層のさらに外に位置しており、皮膚組織中には残されていない。 図９Ａは、ｐ６３ノックアウトマウスのＥ１３．５の胚の羊膜腔内にＧＦＰ陽性のヒトＨａＣａＴ細胞を移植して得られたＥ１６．５のキメラ個体の外観を示す。 図９Ｂは、図９Ａの四角い枠の拡大像である。 図９Ｃは、図９Ａのキメラ個体の蛍光顕微鏡像を示す。 図１０Ａは、胚のキメラ率と形成された皮膚の表面カバー率との関係を示す。 図１０Ｂは、ｐ６３ＫＯ胚とドナー胚性幹細胞により作製されたキメラ胚の皮膚の切片の蛍光顕微鏡像である。 図１１Ａは、野生型胚とドナー胚性幹細胞により作製されたキメラ胚の表皮の蛍光顕微鏡像を示す。 図１１Ｂは、ｐ６３ＫＯ胚とドナー胚性幹細胞により作製されたキメラ胚の表皮の蛍光顕微鏡像を示す。 図１２は、本開示の皮膚組織の移植後の当該皮膚の生着結果を示す。 図１３は、本開示の方法によるヒト表皮のマウス個体上での構築の結果を示す。
発明の詳細な説明
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物を指し、特に限定されないが、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類、ブタ、ヤギ、ラマ、ヒツジ、およびウシなどの家畜動物、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ニワトリなどの鳥類、並びにサルなどの霊長類が挙げられる。本明細書では、動物は非ヒト動物であり得る。
　本明細書では、「体細胞キメラ動物」とは、ある個体の細胞と別の個体の細胞（例えば、同種異系の細胞、または１以上の遺伝子操作が加えられた同種同系細胞若しくは同種異系細胞）とが細胞レベルで混在した組織または臓器を有する動物を言う。本発明では、体細胞キメラ動物は、胚（例えば、桑実胚や胚盤胞）に複数個（例えば、１０個程度）の多能性細胞を導入することにより得ることができる。より具体的には、胚としては、８細胞期の胚から胚盤胞期の胚まで様々な胚を用いることができ、また、このような動物胚に多能性細胞を導入する方法は当業者に周知である。胚盤胞期の胚に細胞を導入する場合には、例えば、卵割腔に細胞を導入することができる。桑実胚期までの初期胚であれば、細胞を接触させることにより集合させてもよい。また、胎児の羊水中に細胞を投与することにより体細胞キメラ動物を得られ得る。この態様では、羊水中に皮膚上皮細胞を投与することができる。多能性細胞としては、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞が挙げられ、本発明において胚に導入することができる。胚に導入する多能性幹細胞の数も、適宜決定することができ、特に限定されないが例えば、胚に導入する場合には３個～１０個程度とすることができる。本明細書では、「体細胞キメラ動物」を単に「キメラ」ということがある。
　本明細書では、「宿主動物」とは、体細胞キメラ動物を作製する際に多能性細胞などの細胞が導入される胚（以下「ホスト胚」ともいう）などの個体を意味する。
　本明細書では、「胚導入細胞」とは、体細胞キメラ動物を作製する際に胚などの個体に導入する細胞（以下「ドナー細胞」ともいう）を意味する。
　本明細書では、「多能性細胞」（pluripotent cell）とは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、並びに、内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞を意味する。多能性細胞は、胎児または成体の概ねすべての細胞に分化できることで知られる。
　本明細書では、「遺伝子操作」とは、遺伝子改変を意味する。本明細書では、遺伝子発現の改変は、遺伝子発現の増強または減弱を生じる改変を意味する。遺伝子発現の減弱は、遺伝子の破壊により行われ得る。
　本明細書では、「遺伝子改変」とは、遺伝子が野生型と異なることを意味し、人工の改変が含まれる。遺伝子改変の代表的な例としては、トランスジェニックおよびノックアウトが挙げられる。ノックアウトでは、特に限定されないが例えば、標的遺伝子に対してナンセンス変異、およびフレームシフト変異などの変異を導入して、または、標的遺伝子の制御領域を破壊して、標的遺伝子の機能欠損を誘導する。ノックアウトでは、標的遺伝子の内部に、または標的遺伝子と置き換えるように、マーカー遺伝子等の外来性の遺伝子を導入する場合もある。
　本明細書では、「含む」は、記載された構成要素を含み、記載されていない構成要素は含んでいても含んでいなくてもよいことを意味する。本明細書では、「からなる」は、記載された構成要素を含み、防げない程度の記載されていない構成要素の混入を許容する。
　本明細書では、「上皮」は、動物個体の外表面、および体腔または器官の内腔などを覆う組織である。本明細書では、「皮膚」は、動物個体の外表面を覆う組織である。皮膚は、上皮性の表皮とその下の結合組織系の真皮とから構成されている。
　表皮は、主にケラチノサイト（角化細胞）により形成されている。表皮は、ケラチノサイトの幹細胞を含む一層の基底細胞から生じるケラチノサイトが成熟するにつれて表面側に移行するために、表皮では成熟段階によって異なる形態の角化細胞（例えば、基底層（基底細胞からなる層）、有棘層、顆粒層、および角層）が層状に配列している。表皮の約９５％は、ケラチノサイトであるが、残りの５％は、ランゲルハンス細胞、およびメルケル細胞などであり、免疫および知覚に関与する。表皮には、通常は血管や神経は存在しない。
　皮膚は、表皮の直下に基底膜を有する。基底膜は、基底板と透明帯を有し、表皮と真皮との間に介在する。基底細胞は、真皮と反対の面（表皮側）において透明帯を介して基底板に接着し、盛んに細胞分裂を引き起こす。表皮と真皮とは、基底膜を介して強く結合している。ケラチノサイト同士とはデスモソームなどの細胞間接着を担う構造により強固に連結し、基底膜と基底細胞とは、ヘミデスモソームにより透明帯を介して結合していると考えられている。
　真皮は、表皮と皮下組織の間の毛乳頭層と真皮網上層を有する皮膚の層である。真皮は主に線維性結合組織から構成されている。真皮の約７０％がコラーゲンで占められ、その他は、弾性繊維（エラスチン）、細胞外マトリックス、ヒアルロン酸などの繊維から構成される。真皮は、血管、リンパ管、汗腺、毛包などの器官を有する。真皮はまた、コラーゲン線維を生成する線維芽細胞、免疫や炎症に関与するマクロファージ、肥満細胞、および形質細胞を有する。真皮のさらに奥には皮下組織が存在する。
　表皮は、外胚葉由来であるが、真皮は主に線維芽細胞で占められ、線維芽細胞は中胚葉由来であり、発生学的に異なる。なお、真皮は線維芽細胞の他に血管や神経を有するが、血管は内胚葉由来であり、神経は外胚葉由来であると考えられている。
　以上が一般的なヒトの上皮および皮膚の構造であると考えられている。
　本開示によれば、皮膚組織が提供され得る。皮膚組織は、表皮と基底膜と真皮を含む。表皮は、基底膜の一方の面（当該面上の基底細胞）に接着し、真皮は、基底膜の他方の面（基底板）に接着している。真皮と基底板の間には、透明帯が介在し得る。表皮と基底膜と真皮とが積層して構造体を形成することにより、前記皮膚組織は、表皮のみの構造体よりも高い機械的強度を有し得る。本開示により提供される皮膚組織は、皮膚移植用の移植材料として用いられ得る。移植材料において、表皮は好ましくは自家または同種異系からなるが、真皮は同種異系または異種の細胞を含んでいてもよい。ある好ましい態様では、表皮は、自家からなり、より好ましくは、自家細胞は、外来の物質（例えば、外来の遺伝子、外来の遺伝子の産物、およびその他の抗原性を有する物質）を含まない。このような移植材料は、移植後に個体に生着することができるためである。
　本開示の皮膚組織において、表皮は、第１の細胞を含み、かつ真皮は、第２の細胞を含む。表皮は、外胚葉由来であるが、真皮は中胚葉由来であり、発生学的に異なる。したがって、表皮は外胚葉系の細胞を含み、真皮は中胚葉系の細胞を含む。したがって、第１の細胞は、外胚葉系の細胞であり得、第２の細胞は、中胚葉系の細胞であり得る。また、第１の細胞は、成熟した表皮細胞への分化能を有しているが、第２の細胞は、遺伝子改変または遺伝子のノックダウン等により成熟した表皮細胞への分化能を有していない。ある好ましい態様では、第2の細胞は、基底細胞、角層細胞、顆粒細胞、および有棘細胞からなる群から選択されるいずれかまたはすべての細胞への分化能を有しない。ある態様では、第2の細胞は、基底細胞に分化する能力を有していてもよく、基底細胞に分化する能力を有していなくてもよい。後述する実施例によれば、第２の細胞が成熟表皮細胞への分化能を有しない場合には、基底細胞に分化する能力を有している場合であっても、第１の細胞により細胞が置き換えられ得る。したがって、基底細胞は、第１の細胞を含み得る。ある好ましい態様では、第１の細胞は、第２の細胞と同種異系の関係を有する。ある好ましい態様では、第１の細胞は、第２の細胞と異種の関係を有する。例えば、第１の細胞はヒト由来であり、第２の細胞は、霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、およびウシからなる群から選択される哺乳動物由来であり得る（例えば、第２の細胞はブタであり得る）。本明細書では、「成熟した表皮細胞への分化能を有する細胞」には、成熟した表皮細胞への分化能を有する未分化細胞に加えて、成熟した表皮細胞に分化した細胞も含む意味で用いられる。
　ある好ましい態様では、第１の細胞は、基底細胞、角層細胞、顆粒細胞、および有棘細胞からなる群から選択される１以上またはすべての細胞への分化能を有し得る。また、ある好ましい態様では、第２の細胞が成熟表皮細胞への分化能を低下させているか、または好ましくは有しない。ある好ましい態様では、第１の細胞は、基底細胞、角層細胞、顆粒細胞、および有棘細胞からなる群から選択される１以上またはすべての細胞への分化能を有し、かつ、第２の細胞が角層細胞、顆粒細胞、および有棘細胞からなる群から選択されるいずれかまたはすべての細胞への分化能を低下させているか、または好ましくは有しない。この態様において、第２の細胞は、基底細胞に分化する能力を有していてもよい。
　ある好ましい態様では、第１の細胞は、基底細胞、角層細胞、顆粒細胞、および有棘細胞からなる群から選択される１以上またはすべての細胞への分化能を有し、第２の細胞は、ｐ６３の機能欠損を有する細胞であり得る。ある好ましい態様では、第１の細胞は、正常機能を有するｐ６３遺伝子を有する。このようにすることで、表皮の実質的にすべての細胞を第１の細胞由来とし得る。真皮は、第１の細胞と第２の細胞とのキメラになり得る。
　ｐ６３欠損個体の上皮は、ケラチンＫ８／Ｋ１８を発現する単層の細胞を基底膜上に有し、それ以上の発生が進行しない（Shalom-Feuerstein et al., Cell Death Differ., 18:887-896, 2011参照、引用されることによりその全体が本明細書に組込まれる）。ｐ６３欠損胚に対して、表皮への分化能を有するドナー細胞を導入して発生させると、基底膜上のホスト細胞はほぼ完全に除去され、表皮のほぼ１００％または１００％がドナー細胞由来の細胞となる（表皮がドナー細胞由来の細胞からなる）。このようにして得られる皮膚は、本開示の皮膚として好ましく用いられ得る。近年のゲノム編集技術の発達により、霊長類や家畜、愛玩動物を含む様々な哺乳動物の胚のゲノム編集が可能となり、ｐ６３の破壊も可能である。したがって、ヒト細胞からなる表皮を有するｐ６３ＫＯ動物胚または個体を適宜作製し、第１の細胞がヒト細胞であり、第２の細胞が霊長類や家畜、愛玩動物などの哺乳動物のいずれかである、本開示の皮膚を得ることができる。
　ｐ６３の機能欠損は、ｐ６３遺伝子を破壊すること、またはノックダウンすることによって生成されうる。ｐ６３遺伝子の破壊は、例えば、ｐ６３遺伝子の制御領域の破壊、ｐ６３遺伝子に対するナンセンス変異の導入、フレームシフト変異の導入、およびミスセンス変異の導入、翻訳領域に対するノックアウトカセットの導入から選択される１以上によることができる。ｐ６３遺伝子の破壊やノックアウトカセットの導入は、例えば、ゲノム編集技術を用いて当業者であれば適宜達成することができる。ゲノム編集技術としては、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが挙げられ、これらの技術をｐ６３の機能欠損を有する細胞の生成に用いることができる。より具体的には、ｐ６３の遺伝子内に標的領域を設定し、標的領域を切断するように設計したＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を細胞に導入して、標的領域を切断する。切断された標的領域は、細胞の自己修復機構により修復される際に、切断末端間で再連結がなされる。しかし、この修復過程において、塩基配列の脱落がランダムに生じ得るために、ナンセンス変異やフレームシフト変異が生じ得る。また、この修復過程においてノックアウトカセットを含むドナーＤＮＡが存在する場合には、ゲノムＤＮＡがドナーＤＮＡを取込み、これにより遺伝子の破壊が可能となる。ドナーＤＮＡは、切断部位の上流領域に相同な配列を有する上流ホモロジーアームと切断部位の下流領域に相同な配列を有する下流ホモロジーアームを有し、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームとの間にノックアウトカセットを含む。ノックアウトカセットは、例えば、ノックアウトカセットが挿入された細胞を選択するための選択マーカー遺伝子（例えば、薬剤選択マーカー遺伝子や蛍光タンパク質などの可視化マーカーをコードする遺伝子）を含み得る。このようにして、当業者であれば、標的領域を適宜切断できるように設計されたゲノム編集技術を用いて、破壊された遺伝子を有する細胞を取得することができる。また、ノックアウトカセットの導入は、古典的な相同組換えにより行ってもよい。ｐ６３遺伝子が破壊されたか否かは、当該標的領域のシークエンシングにより確認することができる。ｐ６３遺伝子が破壊されたか否かは、当該細胞が成熟した表皮への分化能を有するかいなかを試験することによっても確認することができる。成熟した表皮への分化能を有するか否かは、当該破壊された遺伝子を有するＥＳ細胞（ｐ６３ノックアウトＥＳ細胞）または当該破壊された遺伝子を有する受精卵を用いてｐ６３ノックアウト個体を得て、その表皮の形成を確認することにより確認することができる。
　ある態様では、本開示によれば、表皮と基底膜と真皮とを含む単離された皮膚組織であって、前記表皮は前記基底膜の一方の面に接着しており、前記真皮は前記基底膜の他方の面に接着しており、かつ、表皮が第１の細胞を含み、真皮が第２の細胞を含み、第２の細胞は、成熟表皮細胞への分化能を欠失している、皮膚組織が提供される。ここで、好ましい態様では、第１の細胞は、正常機能を有するｐ６３遺伝子を有し、第２の細胞は、ｐ６３に機能欠損を有し得、例えば、破壊されたｐ６３遺伝子を有し得る。
　この態様では、表皮の細胞（特にケラチノサイトであり、基底層（基底細胞からなる層）、有棘層、顆粒層、および角層を含み得る）の９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上が、第１の細胞からなり得る。また、真皮の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、とりわけ好ましくは９９％以上が、第２の細胞から成り得る。真皮における第１の細胞の寄与率は、第１の細胞の胚におけるキメラ形成能に依存すると考えられる。胚における第１の細胞のキメラ形成能が低い場合であっても、ケラチノサイトにおける第１の細胞のキメラ寄与率は高い値で維持できる一方で、表皮以外の組織におけるキメラ寄与率を低く留めることができ、好ましい。
　ある好ましい態様では、本開示の皮膚組織において、表皮の細胞の９５％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の７５％以上が第２の細胞である。ある好ましい態様では、本開示の皮膚組織において、表皮の細胞の９９％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の９５％以上が第２の細胞である。ある好ましい態様では、本開示の皮膚組織において、表皮の細胞の９９％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の９９％以上が第２の細胞である。
　本開示の皮膚組織においては、第１の細胞は、下記ドナー細胞に由来し、第２の細胞は、下記ホスト胚に由来する。したがって、ドナー細胞およびホスト胚についての技術的要件は、第１の細胞および第２の細胞の技術的要件にそれぞれ適用され得る。
　本開示によれば、表皮の細胞の９９％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の９９％以上が第２の細胞である本開示の皮膚組織を作製することに用いるための、第１の細胞を含む組成物が提供される。また、本開示によれば、表皮の細胞の９９％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の９９％以上が第２の細胞である本開示の皮膚組織を作製することに用いるための、第２の細胞を含む組成物が提供される。本開示によれば、表皮の細胞の９９％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の９９％以上が第２の細胞である本開示の皮膚組織を作製することに用いるための、キットであって、第１の細胞と第２の細胞を含む、キットが提供される。キットにおいては、第１の細胞と第２の細胞はそれぞれ別の容器に含まれていることが好ましい。
　本開示によれば、本開示の皮膚組織を含む、移植材料が提供され得る。本開示の移植材料は、創傷を修復することに用いられ得る。本開示の移植材料は、熱傷を有する体表を処置することに用いられ得る。必要に応じて傷害を受けた皮膚を切除し、皮膚が切除された体表に対して本開示の移植材料が移植され得る。本開示の移植材料はまた、難治性潰瘍および水疱症などの皮膚疾患の治療に用いることができる。本開示の移植材料はさらに、熱傷、美容、皮膚腫瘍などの治療に用いる医薬有効成分（例えば、化合物）のスクリーニングに用いることができる。
　本開示によれば、本開示の皮膚組織を作製する方法（以下「本開示の皮膚組織の製造方法」という）が提供される。
　本開示の皮膚組織の製造方法は、ホスト胚を用意することを含む。ホスト胚は、成熟表皮細胞への分化能を低下させているか、または好ましくは有しない胚である。ある態様では、ホスト胚は、成熟表皮細胞への分化能を低下させているか、または好ましくは有しないような遺伝子操作（例えば、遺伝子のノックアウトまたはノックダウン）がなされている。ホスト胚は、本開示の皮膚組織における第２の細胞の供給源である。本開示の皮膚組織の製造方法は、成熟した表皮細胞への分化能を有するドナー細胞を前記ホスト胚に注入して、キメラ個体を形成することを含み得る。前記注入は、ドナー細胞の皮膚への生着に適した条件下で行われ得る。
　ドナー細胞は、例えば、多能性細胞であり得る。ドナー細胞はまた、例えば、成熟した表皮への分化能を有する細胞（例えば、幹細胞および前駆細胞）または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞（例えば、表皮幹細胞、基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、および角層細胞などのケラチノサイト）であり得る。ドナー細胞は、好ましくは多能性細胞であり得る。ドナー細胞はまた、好ましくは、成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは表皮系列細胞にコミットした細胞、特に表皮幹細胞または基底細胞であり得る。生着が顕著に阻害されてドナー細胞由来の表皮が形成されないような場合を除き、成熟した表皮への分化能を有する細胞のいずれもドナー細胞として用いることができる。成熟した表皮への分化能を有する細胞である限り、様々な分化段階を有する細胞をドナー細胞として用い得ることは、多能性幹細胞をドナー細胞として用いて、ドナー細胞からなる表皮を有する皮膚を得ることができること、および、ＨａＣａＴ細胞をドナー細胞として用いても、ドナー細胞からなる表皮を有する皮膚を得ることができることから明らかである。そして、ドナー細胞をホスト胚の基底細胞（例えば、ＣＫ８／Ｋ１８陽性の細胞）の形成前にホスト胚と接触させることにより、基底細胞および表皮をドナー細胞由来の細胞で形成させ得る。ドナー細胞は、自家細胞、または同種異系細胞であり得、好ましくは自家細胞であり、より好ましくは未改変の自家細胞である。未改変とは、形質転換（例えば、遺伝子組換えによる改変）がなされていないことを意味する。ドナー細胞が同種異系細胞である場合には、ドナー細胞は、好ましくは、免疫拒絶に対して耐性であり得る（すなわち、免疫拒絶への寛容性を向上させている）。ドナー細胞では、好ましくは、そのゲノムＤＮＡ中のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩのいずれか、または好ましくは両方が欠失しており、これにより同種異系移植のいける免疫拒絶への寛容性を向上させている。ＨＬＡクラスＩの欠失は、β２ミクログロブリンのノックアウトやＨＬＡクラスＩのノックアウトによりなされ得る。また、ＨＬＡクラスＩＩの欠失は、ＣＩＩＴＡのノックアウトやＨＬＡクラスＩＩのノックアウトによりなされ得る。また、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される１以上の過剰発現または強制発現により、前記発現抑制がなされていない場合と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させ得る。さらに、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃからなる群から選択される１以上またはすべてを片側遺伝子座においてのみノックアウト（ＨＬＡ擬似ホモ接合体化）することによっても、ＨＬＡヘテロ接合体と比較して同種異系移植における免疫拒絶への寛容性を向上させ得る。ドナー細胞はまた、何らかの理由により移植後に積極的に除去することを可能とするために、誘導性プロモーターの制御下に連結させた自殺遺伝子をノックインされていてもよい。
　ある好ましい態様では、複数個のドナー細胞は、１つのホスト胚に対して接触（または投与）され得る。１つのホスト胚に対して投与されるドナー細胞の個数は、例えば、３～１０個程度、例えば、３～５個、５～７個、または８～１０個であり得る。
　ドナー細胞は、低いキメラ寄与能（キメラ形成能）を有する細胞であってもよい。例えば、キメラ形成能を有する限り、キメラ寄与率が５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または、１％以下のキメラ寄与能を有していてよい。キメラ寄与能は、正常胚（例えば、正常胚の胚盤胞期）にドナー細胞を注入して、発生させたキメラ個体における、個体または個体の一部（例えば、特定臓器）の全細胞におけるドナー細胞由来の細胞の割合として求められ得る。ドナー細胞のキメラ寄与能が低い場合には、ドナー細胞が表皮以外の組織への寄与が限定され得る。これにより、倫理的な問題を軽減し得る点で好ましい。
　ホスト胚が、８細胞期～胚盤胞期である場合、ドナー細胞はホスト胚の細胞と混合するか、ホスト胚の卵割腔に注入することができる。ホスト胚が胚盤胞期以降の場合には、ドナー細胞は、羊膜腔内に投与することができ、これにより、ホスト胚の表面にドナー細胞を接触させることができる。これらの注入方法は例示であり、他にも様々な注入方法が存在し、当業者であれば適宜注入方法を選択または決定して本開示の方法において用いることができる。
　ドナー細胞が注入または投与されたホスト胚（本明細書では「キメラ胚」という）は、偽妊娠仮母哺乳動物の子宮に移植して生着させ、その後、成長させることができる。偽妊娠仮母哺乳動物は、ホスト胚と同じ動物種とすることが好ましい。そのようにすることによって、ホスト胚の子宮への生着が促進され得る。
　得られたキメラ胚は、表皮と基底膜と真皮を含む皮膚組織を有し得る。得られたキメラ胚をさらに成長させることにより、表皮は成熟し、角層、顆粒層、および有棘層を有する表皮へと発達する。得られたキメラ胚またはキメラ胚をさらに成長させて得られるキメラ個体から、表皮と基底膜と真皮を含む皮膚組織、好ましくは、成熟した表皮と基底膜と真皮を含む皮膚組織を単離することができる。単離は、物理的な切除術により行うことができる。
　単離された皮膚組織は、例えば、生理食塩水、または液体培地などの適切な溶液中等で、保存に適した環境下（例えば、酸素濃度、二酸化炭素濃度、および温度条件下）で保存され得る。酸素濃度は、例えば、約２０％であり得、二酸化炭素濃度は、０～約５％であり得、温度条件は、０℃～約３７℃（特に、体温）であり得る。
　ある態様では、ホスト胚は、非ヒト哺乳動物胚であり得る。ある態様では、ドナー細胞は、ヒト細胞、または非ヒト哺乳動物細胞であり得る。ある態様では、ホスト胚は、ブタ胚であり、ドナー細胞はヒト細胞であり得る。後述する実施例に示されるように、ブタ－ヒト間よりも進化的距離の遠いマウス－ヒト間において細胞の生着が確認されている。したがって、多くの非ヒト哺乳動物の胚に対してヒト細胞を導入してキメラ胚またはキメラ個体を形成させることができる。ヒト細胞は、レシピエントの皮膚であってもよいが、好ましくは、ヒト表皮を有するオルガノイドから得てもよく、特に限定されないが、例えば、Lee, J. et al. Nature 582, 399-404, 2020に記載された方法で得られるオルガノイドから得ることができる。このようにして、レシピエントと同種同系であるヒト細胞（特に、成熟した表皮への分化能を有する細胞）を得ることができる。また、ホスト胚において免疫系が確立する前に導入されると、同種異系細胞または異種の細胞は、免疫拒絶を受けることなく、胚に生着し得る。但し、生後は、皮膚等において炎症を生じることがある（ＷＯ２０１８／１３９５０２Ａ参照）。そのため、本開示の皮膚組織において生後に炎症を認める前に、抗炎症剤や免疫抑制剤により皮膚組織を処置することができる。本開示の皮膚組織において生後に炎症を認めた後に、抗炎症剤や免疫抑制剤により皮膚組織を処置してもよい。
　免疫抑制剤としては、特に限定されないが例えば、カルシニューリン阻害剤としてシクロスポリン、タクロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤としてラパマイシン、エベロリムス、代謝拮抗剤であるアザチオプリン、ミゾリビン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、アルキル化剤としてシクロフォスファミドが挙げられ、本発明に用いることができる。抗炎症剤としては、特に限定されないが例えば、ステロイド系抗炎症薬（ＳＡＩＤｓ）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）等が挙げられ、本発明で用いることができる。ステロイドとしては、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾンが挙げられ、本発明で用いることができる。その他、抗炎症剤としては、抗炎症性サイトカイン抗体、例えば抗ＴＮＦ－α抗体や、可溶化型サイトカイン抗体、例えば可溶化型ＴＮＦ受容体などの炎症性サイトカイン阻害薬が挙げられ、本発明で用いることができる。
　本発明のある態様では、免疫抑制剤としての機能と抗炎症剤としての機能を有するステロイド系抗炎症剤が好ましく用いられ得る。本発明では、免疫反応または炎症のどちらかを抑制するだけでも、十分な効果が得られると期待できる。
　本開示の皮膚組織は、抗炎症剤および／または免疫抑制剤を含む生理食塩水中または培地中で保存され、皮膚組織を必要とする個体（本明細書では「レシピエント」という）（例えば、ヒト）に移植されうる。真皮が存在するために、移植後の皮膚組織は、抗炎症剤および／または免疫抑制剤の存在下で、レシピエントの体表で皮膚を再生し得る。レシピエントの体表では、ホスト胚に由来する細胞が時間経過と共に除去され、レシピエントの細胞により置き換わると期待できる。したがって、移植後に十分な時間が経過すると、レシピエントにおいて皮膚が再生していることが期待できる。
　したがって、ドナー細胞は好ましくは、レシピエント由来の細胞（取得容易性の観点からは、好ましくは、レシピエント由来の人工多能性細胞）であり得、得られた皮膚組織を含む移植材料は、レシピエントに移植することに用いられ得る。
材料と実験方法
１）多能性幹細胞
　マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）としては、C57BL/6NマウスとC57BL/6N-Tg (CAG-EGFP)マウスからそれぞれ樹立したmouse ESCs (株名B6ES2と株名SGE2)を用いた。ラットＥＳＣとしては、BNラットから樹立したrat ESCs (株名BN2i-4)を使用した。ESCsはマイトマイシンCで処理したマウス胚性線維芽細胞をフィーダーとして用いて培養した。培地はN2B27培地に1μM PD0325901, 3μM CHIR99021, 1000 U/ml マウス白血球阻害因子（ＬＩＦ）を添加して培養に使用した。
２）ＨａＣａＴ細胞
　HaCaT cellはCell Lines Service社から購入し, Cnt-07 (CellnTEC社)培地で培養して使用した。蛍光標識のためにBN2i-4とHaCaT cellにCAGプロモーター制御下のEGFP発現カセットをレンチウイルスベクターを用いて導入した。導入後にGFP (＋) populationのみフローサイトメーター(BD, FACS Aria III)で分取したＧＦＰ陽性細胞を実験に使用した。以降では、蛍光標識した細胞は「BN2i-4-EGFP」および「HaCaT-EGFP」と表記する。
３）動物
　日本エスエルシーからSlc:ICRマウス, C57BL/6N-Tg(CAG-EGFP)マウス, DBA/2CrSlcマウス, BN/SsNSlcラットを購入して実験に使用した。すべての動物実験は, 東京大学医科学研究所の倫理委員会の許可を取得し既定のガイドラインを遵守して実施した。
４）ｐ６３変異キメラ動物の作製
　p63ノックアウト胚を得るため、受精卵CRISPR/Cas9ゲノム編集で小欠失・挿入変異を生じた受精卵を作成した。まず自然交配後に膣栓が確認できたICR雌 (0.5 dpc)から1細胞期受精卵を採取した。受精卵はKSOM/AA培地で数時間培養し, Ribonucleoprotein (RNP)含有電極液中でエレクトロポレーションした。RNP含有電極液はOpti-MEM培地(Thermo社)に終濃度2.94 μMのsgRNA (IDT社, Alt-R（商標）CRISPR-Cas9 sgRNA。p63のexon 5中の塩基配列 : CACGGATAACAGCGCCCTGTを認識する。)と終濃度0.61 μMのCas9 protein (IDT社, Alt-R（商標） S.p. Cas9 Nuclease)を混合して作成した。p63 mutation chimeraを得るために、ｐ６３遺伝子の破壊後に8 cell stageまで培養した受精卵の透明帯を穿孔 (Piezoもしくはレーザー穿孔装置)して、ドナーESCs (SGE2もしくはBN2i-4-CAG-EGFP)を胚1個当たり2～5個ずつ囲卵腔へ顕微注入した。注入後のキメラ胚をKSOM/AA培地中で胚番号まで培養し、偽妊娠マウスの子宮へ胚移植してキメラ胎仔を得た。
　皮膚移植の実験ではICRマウス受精卵の代わりにC57BL/6N-Tg (CAG-EGFP)卵子とDBA2精子を体外受精させた受精卵 (BDF1-EGFP)を実験に使用した。この受精卵にC57BL/6N由来のB6ES2を注入してキメラ胎仔を得た。
５）遺伝子型決定
　p63 mutation miceの尾の一部を採取し、Proteinase K 含有Lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% SDS)に浸透し、60℃で5分～24時間加熱溶解後、98℃2分間の加熱でProteinase Kを不活化し、ゲノムDNA抽出液を得た。Mutation領域を挟んでprimer (CACGTTTGTACAAGCCAGAACTTA, TCTTTTGGT CTTCCCGAGCCT)を設計し、PCR反応でターゲット配列を増幅した。サンガーシークエンスで塩基配列を確認し、TIDE解析(doi:10.1093/nar/gku936)でgenotypeを判別した。chimera胎仔の場合は、ホスト側脾臓リンパ球 (GFP－/CD45＋/DAPI－またはGFP＋/CD45＋/DAPI－)をフローサイトメーターで分取して同様にgenotypingを行った。以降の実験ではフレームシフト変異アリルまたは50塩基対以上の大欠失アリルが総アリルの90%以上を占める個体を解析の対象とした。
６）子宮内注入
　p63 mutation embryoを胚移植した偽妊娠マウス(E13.5)をイソフルラン吸入麻酔下で開腹して子宮を露出した。子宮壁をガラスニードルで穿刺し、羊膜腔内へHaCaT-EGFPを5 μlのmediumとともに注入し、閉腹した。移植3日目に p63 mutation 胎仔を摘出し, 蛍光顕微鏡で細胞の生着を観察し、皮膚片を採取して病理学的に評価した。
７）皮膚移植
　まず皮膚グラフトの採取のため、p63 mutation chimeraを胚移植した偽妊娠マウス (E18.5)を帝王切開し胎仔を摘出した。マウスは通常妊娠19.5日で出産するので、これは出生前日に相当する。蛍光顕微鏡でchimera胎仔を確認し、p63 mutation chimera胎仔から皮膚片を採取し、剪刀で用手的に分層化した。レシピエントマウス (8-12週齢のC57BL/6Nマウスまたはレシピエントラット (3-6週齢のBNラット)の側腹部皮膚全層を除去し、移植片をナイロン糸で縫着した。植皮片上にガーゼを置いてナイロン糸でタイオーバー固定した。固定後マウスの体幹部全周をテープで固定した。移植7日目に固定を除去し、その後移植部を経時的に観察して生着を評価した。また同種植皮実験のコントロールグループとして、p63 mutation chimera胎仔の皮膚をBDF1-GFPへ移植した群 (positive control 1)、BDF1-EGFP受精卵へB6ES2を注入して作成したWT-chimera胎仔の皮膚をC57BL/6N-Tg (CAG-EGFP)に移植した群 (negative control 1), BDF1-EGFP胎仔の皮膚をBDF1-EGFPに移植した群(positive control 2), BDF1-EGFP胎仔の皮膚をC57BL/6N-Tg (CAG-EGFP)へ移植した群 (negative control2)に割り当てそれぞれ植皮実験を行った。異種植皮実験では, 植皮日から術後14日目までタクロリムス（カルシニューリン阻害薬。主にT細胞免疫に対する免疫抑制剤。）をラット体重1 gあたり0.5 μgを腹腔内へ投与した。コントロールグループとして、C57BL/6N-Tg (CAG-EGFP)のをBNラットへ移植した群 (negative control)、BN胎仔の皮膚をBNラットへ移植した群 (positive control)に割り当てそれぞれ植皮実験を行った。
８）キメリズム解析
　表皮(keratinocyte, melanocyte)、真皮(fibroblast)、脾臓リンパ球(lymphocyte)のキメリズム解析をFlow cytometryで行った。表皮は終濃25 U/mlのdispase II(Thermo社)を添加したCnT-07培地中で4℃で12時間静置し、基底膜を選択的に処理した皮膚から真皮を除去して採取した。汎血球マーカーCD45陰性、死細胞染色PI陰性の表皮細胞分画中、CD49f (+)をケラチノサイトとし、CD117(+)をメラノサイトとしてGFP陽性率からキメリズムを計測した。このようにして得られるケラチノサイトは、基底細胞、顆粒細胞、有棘細胞、および角層細胞を含むと考えられる。真皮は細切した真皮片をDMEM high glucose+10%FBSを加えたdishで数日間培養し、接着した細胞を解析した。脾臓はピペッティング後、ACK bufferで溶血処理し、CD45 (+)を白血球として解析した。
９）組織学解析
　キメラ胎仔 (E8.5, E14.5, E18.5)及び植皮後の皮膚(術後14日, 28日, 90日)を採取し,4%PFA中で一晩浸漬した。規定通り手順でパラフィンブロックと切片を作成した。免疫染色はキシレンとエタノールで脱パラフィン処理を段階的に行い、クエン酸緩衝液で抗原不活化を行った (121℃, 20分)。0.2% triton溶液中に各1次抗体を加えて一晩反応させ, 洗浄後に蛍光標識2次抗体を室温1時間で反応させて染色した。作成した標本は、蛍光顕微鏡(Keyence BZ-9000)または共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡 (Fuji film FV3000)で撮像した。
結果
　ｐ６３ノックアウトマウスモデルは、扁平上皮の部分的または完全な欠如を含む表皮の血管を示す（Mills et al., Nature, 398：708-713, 1999およびYang et al., Nature, 398：714-718, 1999参照、これらは引用されることによりその全体が本明細書に組込まれる）。ｐ６３欠損上皮は、Ｋ８／Ｋ１８を発現する非増殖細胞の単層を有する状態のままになり、そのまま発生が進行しない（Shalom-Feuerstein et al., Cell Death Differ., 18:887-896, 2011参照、引用されることによりその全体が本明細書に組込まれる）。本実施例においては、ｐ６３のエクソン５を標的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりｐ６３遺伝子に欠損を生じさせ、これによりｐ６３のノックアウト胚を得る方法を用いた（図１参照）。
　この表皮を完全には欠損しないｐ６３ノックアウトマウスの胚に対して正常な多能性幹細胞を導入し、キメラ個体を得る実験を行った。具体的には、図２に示されるように、Ｅ０．５のｐ６３ノックアウト胚に対してｐ６３を標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを導入した。Ｅ２．５において、多能性幹細胞としてＧＦＰ陽性のマウスＥＳＣを卵割腔に注入した。その後、Ｅ３．５の胚盤胞まで成長させ、偽妊娠仮母マウスの子宮に移植した。Ｅ１９．５で、得られた個体（キメラ個体）を光学顕微鏡下および蛍光顕微鏡下で観察した。
　結果は、図３に示される通りであった。野生型と、キメラ個体３匹が並べられている。キメラ個体では、表皮が形成された部分と形成されていない部分を有する個体（左から２番目および３番目の個体）と、表皮がほぼ完全に形成された個体（右から１番目の個体）が確認された。
　多能性幹細胞のキメラ形成能（％）と再生された表皮の面積（％）との関係を調べた。多能性幹細胞のキメラ形成能は、各キメラ個体から得られた脾臓のリンパ球における全細胞に対するＧＦＰ陽性ドナー細胞のパーセントとして求めた。多能性幹細胞のキメラ形成能はまた、各キメラ個体から得られたケラチノサイトの全細胞に対するＧＦＰ陽性ドナー細胞のパーセントとして求めた。再生された表皮の面積は、個体の全体の表面積に対するＧＦＰ陽性の表皮の面積のパーセントとして求めた。結果は、表１に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、脾臓のリンパ球におけるドナー細胞由来の細胞の割合は、とても低い値であるのに対して、表皮におけるＧＦＰ陽性表皮の面積の割合は実質的に大きなものであった。このことから、キメラ形成能の低いドナー細胞を用いた場合においても、表皮におけるドナー細胞の寄与は大きくなることが明らかであった。なお、いずれの個体においてもＧＦＰ陽性の表皮の形成されていない表面には、成熟した表皮は存在しなかった（例えば、図４参照）。
　図５に表１の結果をプロットしたグラフを示す。図５に示されるように、皮膚以外の臓器（ここでは脾臓）でキメラ形成をほとんどしない、キメラ形成能の低いドナー細胞であっても、皮膚には強力に寄与することが明らかである。
　また、皮膚のケラチノサイトにおけるＧＦＰ陽性ドナー細胞の割合がほぼ１００％であったことから、形成された表皮は基本的にはドナー細胞に由来することが明らかであった。このことから、ドナー細胞は、宿主において形成される未熟な表皮細胞を排除して表皮を形成すると考えられた。
　キメラ個体の皮膚を組織学的に分析した。すると、表皮および毛包は、ドナー細胞のみに由来することが明らかとなった。これに対して、真皮は、ドナー細胞と宿主細胞（ｐ６３ＫＯ胚由来）とのキメラ状態であることが明らかとなった。
　得られたキメラ個体のＧＦＰ陽性の皮膚（表皮および真皮を含む）を切除して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮膚に移植した。移植７日後に移植した皮膚部分を観察すると、図６に示されるように、移植部分にＧＦＰ陽性細胞の存在を認めた。このＧＦＰ陽性細胞は、移植５６日後にも観察できた（図６参照）。
　ｐ６３ノックアウトマウスの皮膚表面には、表皮前駆細胞（Ｋ８／Ｋ１８陽性細胞）が見出される。しかし、Ｅ１９．５のキメラ個体の表皮には、ｐ６３ノックアウト由来の細胞は認められなかった（例えば、表１のケラチノサイトのデータ参照）。そこで、Ｅ１４．５のキメラ個体の皮膚を観察した。ＣＫ８／Ｋ１８陽性ホスト細胞（ｐ６３ノックアウト胚由来）と、ＧＦＰ陽性細胞（ドナー細胞由来）とを蛍光染色で染め分けた。また、ｐ６３の発現も同時に蛍光染色により確認した。すると、図７Ａに示されるように、同一皮膚上で、ＣＫ８／Ｋ１８陽性ホスト細胞（ｐ６３ノックアウト胚由来）と、ＧＦＰ陽性細胞（ドナー細胞由来）の存在を確認できる皮膚領域を認めた。
　これらの写真をマージすると、図７Ｂに示されるように、ドナーのＧＦＰ陽性／ｐ６３陽性細胞が、基底膜上に見出されたが、ホストのＣＫ８／Ｋ１８陽性細胞が、ドナー細胞によりめくり上げ、押しのけられて基底膜から剥離する様子が観察された。
　これまでの臓器補完法では、臓器欠損による空いたニッチをドナー細胞が占有することにより、ドナー細胞由来の臓器が形成された（ＷＯ２０１０／０２１３９０Ａ、およびＷＯ２００８／１０２６０２Ａ参照。これらは引用されることによりその全体が本明細書に組込まれる）。これに対して、本実施例の結果によれば、空いたニッチをドナー細胞が占有するのではなく、ホスト細胞が存在するところを、ドナー細胞が押しのけて除去するようすが観察された。すなわち、細胞競合により、ホスト細胞がドナー細胞により除去されていることが示唆された。
　Ｅ１８．５のキメラ個体の皮膚におけるＧＦＰ陽性ドナー細胞と、ＣＫ８／Ｋ１８陽性ホスト細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。すると、Ｅ１８．５では、ホスト由来の細胞は基底膜から除去され、基底膜は、ＧＦＰ陽性のドナー細胞でほぼ占められていた。
　胚におけるキメラ率と表皮の被覆率との関係を調べた。胚におけるキメラ率（Global chimerism）は、胚におけるドナー細胞の割合（％）である。また、皮膚の被覆率（Skin covered area）は、皮膚が形成された面積の割合（％）である。結果、図１０Ａに示されるように、キメラ率が約３０％で表面のほぼ１００％に皮膚が形成された。キメラ率が約２３％でも表面の９０％以上に皮膚が形成された。このことから、キメラ率が低くても、表面においてはより高い割合で皮膚が形成されることが明らかであった。組織切片を染色すると、図１０Ｂに示されるように、表皮および付属器は、多能性幹細胞由来のＥＧＦＰ陽性細胞によりほぼ占められ、真皮は、ドナー由来と胚由来のキメラ（すなわち、得られた皮膚は半自家の皮膚）であった。これにより、半自家（semi-autologous）の皮膚の再生が可能となったことが分かった。
　重要なことは、皮膚の被覆率が低い個体からも皮膚を回収することができ、皮膚の移植材料として用いることができるということである。皮膚の移植材料は、表皮と真皮を含み、この移植材料の対象への移植より、当該対象における皮膚の生着が促進されると考えられる。対して、表皮にホスト細胞が混入すると、後述するように、皮膚は拒絶を受けて、移植皮膚の生着が妨げられ得る。
　実際にｐ６３ＫＯ胚の代わりに野生型胚とドナー細胞とを用いて上記の通りにキメラ胚を構築すると、図１１Ａに示されるように、表皮にドナー細胞と胚由来のホスト細胞が混じった。表皮へのホスト細胞への混入の割合は大きく、得られた皮膚（表皮及び真皮を含む）を別の個体に移植すると、この皮膚は拒絶された。これに対して、ｐ６３ＫＯ胚とドナー細胞を用いて上記の通りにキメラ胚を構築すると、図１１Ｂに示されるように、表皮のほぼ１００％または１００％がドナー細胞に由来した。表皮が形成された領域の皮膚（表皮及び真皮を含む）を別の個体に移植すると、この皮膚は当該別個体に生着した。ｐ６３ＫＯ胚とドナー細胞を用いて構築されたキメラからは、ほぼ１００％または１００％がドナー細胞に由来する表皮を有する皮膚の採取は容易であった。そして、ほぼ１００％または１００％がドナー細胞に由来する表皮は、皮膚移植に好適に用いることができた。
　さらに、ＥＧＦＰを発現するｐ６３ＫＯ胚（ＢＤＦ１系統）とドナー細胞（Ｂ６系統）を用いて上記の通りに構築された皮膚（本開示の皮膚）の表皮および真皮のＢ６系統への移植実験を行った（Ｃ群）。対照として、Ａ群として自家移植（ＥＧＦＰを発現するＢＤＦ１系統の皮膚のＢＤＦ１系統への移植）およびＢ群およびＤ群として他家皮膚移植（ＥＧＦＰを発現するＢＤＦ１系統の皮膚のＢ６系統の皮膚への移植）の実験を行った。Ａ群では、ＢＤＦ１－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスから採取した皮膚を、他のＢＤＦ１－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスに移植した。ＢＤＦ１－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスは、ＥＧＦＰ発現Ｂ６マウスとＤＢＡ２マウスのＦ１である。Ａ群では、移植片の表皮、真皮のいずれも免疫学的に移植レシピエントと合致している。Ｂ群では、ＢＤＦ１－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスから採取した皮膚を、Ｂ６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスに移植。Ｂ群では、移植片の表皮、真皮のいずれも免疫学的に移植レシピエントと合致しない。Ｄ群では、ＥＧＦＰを発現し、野生型ｐ６３遺伝子を有するＢＤＦ１－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスの受精胚に、野生型Ｂ６由来ＥＳ細胞を注入してキメラマウスを作成し、当該キメラから採取したキメラ皮膚移植片（表皮もドナーとホスト胚のキメラ）を、Ｂ６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）マウスに移植した。Ｄ群では、移植片の表皮、真皮のいずれも免疫学的に移植レシピエントと合致しないホスト胚由来成分を含む。
　上記実験において、移植後の皮膚の生着率を観察した。結果は、図１２に示される通りであった。図１２に示されるように、Ａ群では、自家移植した皮膚の１００％が生着した。これに対して、Ｂ群およびＤ群では、他家移植した皮膚の生着は２週間以内に劇的に悪化した。本開示の皮膚（Ｃ群）は、長期にわたって良好な生着を示した。この結果から、表皮が自己の細胞から構成されていれば、真皮は自家と他家により構成されている場合でも高い生着を示すことが分かる。本開示の皮膚では、表皮、毛包、皮脂腺、および汗腺は、ドナー細胞由来となり、真皮、神経、血管、および立毛筋は、ドナー細胞と胚細胞とのキメラになっていた。これらのことから、真皮、神経、血管、および立毛筋において、免疫的に適合しない細胞が含まれていることは移植皮膚の長期の生着にほとんど影響しないと考えられた。なお、Ｃ群の実験に代えて、ｐ６３ＫＯ胚（ＢＤＦ１系統）とＥＧＦＰを発現するドナー細胞（Ｂ６系統）を用いて上記の通りに構築された皮膚（本開示の皮膚）の表皮および真皮のＢ６系統への移植実験を行った場合（Ｃ’群）には、ＥＧＦＰ発現ドナー細胞の生着が一部拒絶された。ＥＧＦＰ発現が拒絶を誘発したことから、ドナー細胞は抗原（特に、外来または異種抗原）を含まないことが好ましいと考えられた。
　これまでの研究で、胚に対する経子宮的な細胞の注入で細胞が胚に生着するとの報告がなされている（Cohen et al., PNAS, 113(6):1570-5, 2016参照。引用されることによりその全体が本明細書に組込まれる）。そこで、本実施例では、不死化したヒトケラチノサイトであるＨａＣａＴ細胞をＥＧＦＰ標識した上で、羊膜腔注入でＥ１３．５のｐ６３ノックアウト胚に移植した。なお、移植に際して免疫抑制剤は使用しなかった。Ｅ１６．５で胚を取り出して実体顕微鏡および蛍光顕微鏡下でドナー細胞由来のＧＦＰシグナルを観察した。すると、図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、ＨａＣａＴ細胞は、皮膚に寄与している上に、図９Ｃに示されるように、胚における細胞の生着が観察された。
　ＨａＣａＴ細胞が寄与したマウスをＥ１８．５まで成長させた。すると、図１３に示されるように、得られたキメラマウスの表面の一部にヒト表皮細胞由来の表皮が構築された。得られた皮膚の切片を作製してＤＡＰＩにより核を染色し、成熟ケラチノサイトマーカーであるＫｒｔ１４を免疫組織学染色により染色した。蛍光顕微鏡下で観察すると、図１３に示されるように、ＧＦＰ標識されたヒト表皮は、マウス真皮上でＫｒｔ１４陽性の表皮を形成していたが、表皮は正常な皮膚において認められる多層構造を有していた。このように、ヒト表皮を有する皮膚組織を異種動物の皮膚上に構築することができた。このことから、ヒト表皮をブタ真皮上に構築することも可能であると考えられる。また、ブタ皮膚は、ヒトへの皮膚移植材料として用いられることがあるが、表皮をヒトとすることにより、生着効率が高まることが期待される（参考：図１２）。
　このようにして、真皮上に自家細胞からなる表皮を備えた皮膚を構築することができる。表皮が自家細胞または免疫的に適合する細胞からなる場合には、当該表皮を含む移植皮膚は、良好な長期生着を示した。このときに、真皮には、免疫的に適合しない細胞が含まれていても、移植した皮膚の生着にはほとんど影響しない。このことから、ｐ６３破壊非ヒト動物胚とヒト細胞とから作成した自家細胞からなる表皮と、前記非ヒト動物細胞を含む真皮を含む皮膚は、ヒトへの自家皮膚移植などに好ましく用いられ得ると考えられる。

 

Claims (11)

  1. 　表皮と基底膜と真皮とを含む単離された皮膚組織であって、前記表皮は前記基底膜の一方の面に接着しており、前記真皮は前記基底膜の他方の面に接着しており、かつ、表皮が第１の細胞を含み、真皮が第２の細胞を含み、第２の細胞は、成熟表皮細胞への分化能を低下させているか、または欠失している、皮膚組織。
  2. 　第２の個体の細胞が、ｐ６３に機能欠損を有する細胞である、請求項１に記載の皮膚組織。
  3. 　表皮が成熟した表皮である、請求項１または２に記載の皮膚組織。
  4. 　表皮の細胞の９５％以上が第１の細胞であり、真皮の細胞の７５％以上が第２の細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の皮膚組織。
  5. 　皮膚組織を作製する方法であって、
    　成熟した表皮を自律的には発生させることができないホスト胚を用意することと、
    　前記ホスト胚に対して、成熟した表皮への分化能を有するドナー細胞を注入すること、ここで、前記注入は、前記細胞の皮膚への生着に適した条件下で行われ、
    　得られた胚を偽妊娠仮母哺乳動物の子宮内でまたは子宮に移植して成長させて、当該哺乳動物から成熟した表皮を有する個体を得ることと、
    　得られた個体からドナー細胞由来の細胞を含む成熟した表皮と、基底膜と、ホスト由来の細胞を含む真皮を含む皮膚組織を単離することと
    を含む、方法。
  6. 　成熟した表皮を発生させることができないホスト胚が、ｐ６３ノックアウト胚である、請求項５に記載の方法。
  7. 　成熟した表皮への分化能を有するドナー細胞が、多能性細胞、および表皮に向けて運命決定された細胞からなる群から選択される細胞である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　胚が、８細胞期から胚盤胞期のいずれかの発生段階の胚である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　胚が、胚盤胞期からＫ８／Ｋ１８陽性の細胞を含む表皮を形成するまでのいずれかの発生段階の胚である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　胚が、Ｋ８／Ｋ１８陽性の細胞の表皮を有する胚である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　非ヒト哺乳動物個体を作製する方法であって、表皮の基底細胞が形成される前の非ヒト哺乳動物個体の体表に、キメラ形成能を有し、かつ成熟した表皮への分化能を有する細胞または表皮もしくは成熟した表皮への分化能を有する細胞（ドナー細胞）を接触させることを含み、これにより、ホストの細胞とドナー細胞とを含む皮膚組織を有する非ヒト哺乳動物個体を得る、方法。


     
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