CN104673929A - 一种高分辨率ssr分子标记基因分型的方法 - Google Patents

一种高分辨率ssr分子标记基因分型的方法 Download PDF

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Abstract

一种高分辨率SSR分子标记基因分型的方法。该方法使用3个引物在同一反应体系中同时进行PCR扩增。提供了三个引物的设计的方法，相应的PCR配方，PCR循环的参数和基于测序仪的片段分型的检测方法。该方法提供了一种分辨率在一个核苷酸水平的基因分型用的引物设计方法、统一了PCR试剂的特定配方和PCR循环的参数，实验过程无需优化。此外解决了基于测序仪的SSR分子标记基因分型噪音大的问题。该方法适用各种物种DNA的SSR标记开发和高通量高分辨率的DNA片段分型。以烟草SSR分子标记为例测试了该方法应用。

Description

一种高分辨率SSR分子标记基因分型的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于测序仪的SSR分子标记基因分型的高分辨率的方法。
背景技术
生物基因组序列中存在一种由几个碱基为重复单位并经过串联排列组成的DNA序列，英文简称为SSR(simple sequence repeats)，也称为微卫星(microsatellite)(Ellegren 2004；Sharma2007)。SSR序列的特点是在品种间存在可以遗传的多态性，是本世纪以来发现的可以联系基因组序列和性状品质基因及分子育种最重要的纽带(Sharma 2007；Xu and Crouch 2008)。SSR序列是用来开发分子标记最理想的序列之一，广泛用于研究物体品种的遗传与进化关系、反向遗传中基因的图位克隆、性状的QTL定位和分子育种(Schlotterer 2004)。最早的SSR分子标记主要是从EST或者零散的DNA序列中开发。自从拟南芥和水稻基因组被测定以来，大量SSR分子标记被开发，用来定位基因，品质改良和育种(Arabidopsis Genome Initiative 2000；International Rice GenomeSequencing Project 2005；Xu and Crouch 2008)。至今SSR标记是两大广泛应用的主要分子标记之一(Davey et al.2011)。据文献查证，至今还没有报道系统的成套SSR分子标记开发和检测方法。SSR分子标记的开发报道倒是有一些。这些报道一般只适合小量的SSR标记的PCR引物设计，因为设计PCR引物的技术参数比较宽松，在应用时PCR引物往往反复需要优化每一对PCR引物的反应条件；检测往往是通过凝胶电泳的方法，从而分辨率低，劳动力大，效率低(Tong et al.2012)。Bindler等采用荧光标记和测序仪检测的办法检测SSR片段，大大提高了检测效率(Bindler et al.2011；Bindler et al.2007)；但是每一个SSR标记均需要荧光来单独标记其中的一个引物，从而增大了成本。针对现有方法的不足，我们开发了一套系统的成套SSR分子标记开发和检测方法。对于任何一个SSR分子标记，我们的方法均只要在PCR反应时加入一个通用的共同的荧光标记引物，在PCR引物设计时用软件检测了通用荧光引物与其他两个PCR引物的兼容性，从而保证了通用引物的可靠性；又由于后续PCR反应是基于共同的荧光标记引物，因此不同的分子标记的PCR条件是统一的。荧光引物合成价格比常规的引物合成要高出几倍到几十倍，因此我们的发明方法中采用通用的共同的荧光标记引物的策略，大大降低了实验成本和效率。现有一些报道一次只检测一种荧光标记的产物，我们的本发明方法可以采取多重(1‐3重)荧光产物混合检测，从而进一步提高了检测效率。
本发明的方法在反复摸索的情况下，采用全功能的Taq聚合酶，进一步保证了PCR产物长度的一致性，从而杂信号低，克服现有技术存在的基因分型的峰值不完美，峰型往往有2‐3个裂峰，跨越2‐3bp的距离，从而大大降低了分辨率的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高分辨率SSR分子标记基因分型的方法。该方法能克服现有技术存在的基因分型的峰值不完美，峰型往往有2‐3个裂峰，跨越2‐3bp的距离，从而大大降低了分辨率的不足。利用本发明的方法可以达到清晰的1bp的分辨率，片段的峰型完美，没有裂峰。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，包括设计SSR分子标记的三引物，配制SSR分子标记专用的PCR配方，进行SSR分子标记专用的PCR反应，SSR分子标记的PCR产物的分析，基因分型的数据分析步骤。
如所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其中：
所述的设计SSR分子标记的三引物为通用荧光标记引物，带尾正向引物和反向引物，原始储备液浓度均为5uM，在PCR反应中的用量体积的比为2∶1∶4；所述通用荧光标记引物为公共引物，在引物合成时在5’末端加荧光标记，选择荧光标记物为ABI测序仪能识别的荧光试剂FAM或HEX或TAMRA，其中，荧光的选择不能与ABI测序仪基因分型所用的DNA分子参照的荧光相同；正向引物和反向引物为带有SSR序列位点的靶序列的特异引物，使用引物设计软件Primer3设计，在线使用网址为http://frodo.wi.mit.edu/primer3/，设计时引物序列不能在SSR序列中，PCR产物包含SSR位点，长度为19‐24bp，最适Tm为60℃，GC％值在45‐55％，无引物的二聚体结构；带尾正向引物为正向引物的序列的5’端加上与荧光标记引物相同的序列CGTTGTAAAACGACGGCCAGT，不加荧光标记物，然后使用软件OligoAnalyzer 3.1(http://www.idtdna.com/)检测，若无引物二聚体和发夹结构产生，该带尾正向引物序列合理，设计完成；如果有引物二聚体产生，则要用Primer3重新设计新的正向引物和荧光标记引物相同的序列以后再用软件检测，直至无引物二聚体产生。
如所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其中所述的配制SSR分子标记专用的PCR配方是Taq聚合酶是全功能的DNA聚合酶，是用100ul或者更小的洁净PCR试管，PCR反应总体积为15ul，按表1的配方依次加入设计的3种引物、待测样品的DNA和去离子水，荧光引物最后加入，混合试剂，轻微漩涡混合，并离心5秒钟。这里的全功能的DNA聚合酶配方采用Hot Start Flex 2X Master Mix，但不限制于Hot Start Flex 2X Master Mix，
表1每15ulPCR反应的试剂配方
如所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其中所述的SSR分子标记专用的PCR反应是将步骤3混好液体的试管置于带有Touchdown功能的PCR仪器进行扩增反应，PCR反应由3个touchdown循环和后续的35个标准循环组成，PCR循环的设置为起始变性温度为94℃ 3分钟，3个touchdown循环为94℃变性30秒，68℃退火1分钟，每执行一个循环后将退火温度降低2℃，72℃延伸1分钟，35个标准循环为94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒，完成以上循环以后，在72℃保持10分钟，最后将PCR产物冷却到室温或者4℃，从PCR仪取出以后，立即包裹锡箔纸避光，冷冻保存或者继续实验。
如所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其中所述的SSR分子标记的PCR产物的分析分为琼脂糖凝胶电泳和测序仪基因分型，其中琼脂糖凝胶电泳步骤非必须；所述琼脂糖凝胶电泳是移取10ul的PCR产物用3％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法电泳分离，EB染色，紫外成像仪观察PCR扩增的DNA片段rn；移取1‐5ul的PCR产物，用ABI3730XL按照仪器标准的基因分型法检测，DNA分子大小的内部参照标准采用LIZ500。
如所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其中所述的基因分型的数据分析采用的数据文件为.fsa格式，每一个PCR孔的样品产生一个对应的数据文件.fsa；将数据导入数据文件分析软件如GeneMapper或者GeneMarker，然后按照软件的说明进行基因分型的数据分析；ABI测序仪的基因分型检测时，标准DNA分子参照的范围包涵50‐500bp；1‐5ul PCR产物的用量用于ABI测序仪的基因分型检测，剩余PCR产物用于3％的琼脂糖凝胶电泳检测。
附图说明
图1为基于琼脂糖凝胶电泳的PCR片段图谱
图2为基于测序仪的SSR片段的DNA基因分型图。其中：N.Syl,N.Tom,HD,K326分别为林烟草，绒毛烟草，HD烟草，K326烟草
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的物种烟草为例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本方法。
实施例1
下面从SSR分子标记的设计、PCR配方、PCR反应程序、基于测序仪的基因分型检测和数据分析等步骤来具体描述本发明：
(1).SSR分子标记的三引物设计
本发明需要3个引物：分别为通用荧光标记引物，带尾正向引物和反向引物。通用荧光标记引物为公共引物，适用于本方法中任何一个的PCR反应，与带尾正向引物和反向引物配套使用。该荧光标记引物的序列固定为CGTTGTAAAACGACGGCCAGT，在引物合成时需要在5’末端加荧光标记。可选的荧光标记物为FAM,HEX,TAMRA等ABI测序仪可以识别的任何荧光试剂。其中，荧光的选择不能与ABI测序仪基因分型所用的DNA分子参照的荧光相同。
正向引物和反向引物为带有SSR序列位点的靶序列的特异引物，使用引物设计软件Primer3设计，可以在线使用，网址为http://frodo.wi.mit.edu/primer3/。设计时要求引物序列不能在SSR序列中，PCR产物要包含SSR位点，长度为19‐24bp，最适Tm为60℃，GC％值在45‐55％，无引物的二聚体结构。
带尾正向引物为正向引物的序列的5’端加上与荧光标记引物相同的序列CGTTGTAAAACGACGGCCAGT，但是不要加荧光标记物。然后使用软件OligoAnalyzer 3.1(http://www.idtdna.com/)检测，若无引物二聚体和发夹结构产生，该带尾正向引物序列合理，设计完成；如果有引物二聚体产生，则需要利用Primer3重新设计新的正向引物和荧光标记引物相同的序列以后再用软件检测，直至无引物二聚体产生。
(2).SSR分子标记专用的PCR配方
本发明的方法需要100ul或者更小的洁净PCR试管。PCR反应总体积为15ul，只需要按照下面的配方依次加入设计的3种引物、待测样品的DNA和去离子水即可以。试剂的具体的配方值见表1。常用的Taq聚合酶为重组Taq聚合酶，活性高，但是没有了3’到5’外切酶的功能。本方法中DNA Taq聚合酶一定要具有5’到3’的聚合酶功能和3’到5’外切酶的功能，这里所用的酶为Taq聚合酶Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix(NEB公司)。在混合试剂时，注意荧光引物应该加在最后，建议在暗处和冰上操作。混合试剂，轻微漩涡混合，并离心5秒钟以确保混合液体处于试管底部。
表1每15ulPCR反应的试剂配方
(3).SSR分子标记专用的PCR反应程序
将上述混好液体的试管置于带有Touchdown功能的PCR仪器进行扩增反应。PCR反应由3个touchdown循环和后续的35个标准循环组成。PCR循环的设置为起始变性温度为94℃ 3分钟。3个touchdown循环为94℃变性30秒，68℃退火1分钟，每执行一个循环后将退火温度降低2℃，72℃延伸1分钟。35个标准循环为94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒。完成以上循环以后，在72℃保持10分钟。最后将PCR产物冷却到室温或者4℃。从PCR仪取出以后，立即包裹锡箔纸避光，冷冻保存或者继续下面的实验。
(4).SSR分子标记的PCR产物的分析
产物的分析分为琼脂糖凝胶电泳和测序仪基因分型，其中琼脂糖凝胶电泳步骤可以忽略不做。A).琼脂糖凝胶电泳：移取10ul的PCR产物用3％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法电泳分离。EB染色，紫外成像仪观察PCR扩增的DNA片段。B).移取1‐5ul的PCR产物，用ABI3730XL按照仪器标准的基因分型法检测，DNA分子大小的内部参照标准采用LIZ500。其他大小的内参也可以使用，只要DNA分子大小的内部参照标准覆盖PCR产物的大小范围既可以。
(5).基因分型的数据分析
ABI 3730XL的基因分型的数据文件为.fsa格式，每一个PCR孔的样品产生一个对应的数据文件.fsa。将数据导入数据文件分析软件如GeneMapper或者GeneMarker，然后按照软件的说明进行基因分型的数据分析。一般情况下，基因分型的峰值不是完美的，峰型往往有2‐3个裂峰，跨越2‐3bp的距离，从而大大降低了分辨率。利用本发明的方法可以达到清晰的1bp的分辨率，片段的峰型完美，没有裂峰。
实施例2
a.DNA的提取
用五种烟草包括林烟草、绒毛状烟草、HD烟草和K326烟草来做测试样品。DNeasyPlant Mini Kit试剂盒用来提取每一种烟草的总DNA。提取方法按照试剂盒的提供的步骤，最后溶解DNA到50ul。Nanodrop检测DNA浓度。DNA的浓度用重蒸水稀释到30‐50ng/ul的浓度。
b.三引物的设计
按照实施例1所述的方法，用在线的primer3软件和OligoAnalyzer 3.1设计引物。三个设计好的引物的序列为：1、标记名字xm8的带尾正向引物为：
CGTTGTAAAACGACGGCCAGTCACTCGCAGTTTCTCTGCAC；2、反向引物为：
ACCTCGAAAATCACCACCAG。3、荧光标记引物的序列为：5’FAM‐
CGTTGTAAAACGACGGCCAGT。设计好的引物由上海生工合成。
c.PCR试剂配制
按照表2的配方配好试剂的浓度，然后按照给定的体积混合试剂。在混合试剂时，注意荧光引物应该加在最后，建议在暗处和冰上操作。混合试剂，轻微漩涡混合，并离心5秒钟以确保混合液体处于试管底部。
表2每15ulPCR反应的试剂配方
d.PCR反应
将上述混好液体的试管置于带有Touchdown功能的PCR仪器进行扩增反应。PCR反应由3个touchdown循环和后续的35个标准循环组成。PCR循环的设置为起始变性温度为94℃ 3分钟。3个touchdown循环为94℃变性30秒，68℃退火1分钟，每执行一个循环后将退火温度降低2℃，72℃延伸1分钟。35个标准循环为94℃变性30秒，68℃退火45秒，72℃延伸45秒。完成以上循环以后，在72℃保持10分钟。最后将PCR产物冷却到室温或者4℃。从PCR仪取出以后，立即包裹锡箔纸避光，冷冻保存或者继续下面的实验。
e.SSR标记的PCR产物的检测
产物的分析分为琼脂糖凝胶电泳和测序仪基因分型。A).琼脂糖凝胶电泳：移取10ul的PCR产物用3％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法电泳分离。EB染色，紫外成像仪观察PCR扩增的DNA片段。结果见图1。
B).移取5ul的PCR产物送样基因测序公司，用ABI3730XL按照仪器标准的基因分型法检测，DNA分子大小的内部参照标准采用LIZ500。
f.SSR基因分型的数据分析
ABI 3730XL的基因分型的数据文件为.fsa格式，每一个PCR孔的样品产生一个对应的数据文件.fsa。将数据导入数据文件分析软件如GeneMapper或者GeneMarker，然后按照软件的说明进行基因分型的数据分析。利用本发明的方法可以达到清晰的1bp的分辨率，片段大小的峰型完美，基本没有裂峰，见图2。

Claims (6)

1.一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：该方法包括设计SSR分子标记的三引物，配制SSR分子标记专用的PCR配方，进行SSR分子标记专用的PCR反应，SSR分子标记的PCR产物的分析，基因分型的数据分析步骤。
2.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：
所述的设计SSR分子标记的三引物为通用荧光标记引物，带尾正向引物和反向引物，原始储备液浓度均为5uM，在PCR反应中的用量体积的比为2∶1∶4；所述通用荧光标记引物为公共引物，在引物合成时在5’末端加荧光标记，选择荧光标记物为ABI测序仪能识别的荧光试剂FAM或HEX或TAMRA，其中，荧光的选择不能与ABI测序仪基因分型所用的DNA分子参照的荧光相同；正向引物和反向引物为带有SSR序列位点的靶序列的特异引物，使用引物设计软件Primer3设计，在线使用网址为http://frodo.wi.mit.edu/primer3/，设计时引物序列不能在SSR序列中，PCR产物包含SSR位点，长度为19‐24bp，最适Tm为60℃，GC％值在45‐55％，无引物的二聚体结构；带尾正向引物为正向引物的序列的5’端加上与荧光标记引物相同的序列CGTTGTAAAACGACGGCCAGT，不加荧光标记物，然后使用软件OligoAnalyzer 3.1(http://www.idtdna.com/)检测，若无引物二聚体和发夹结构产生，该带尾正向引物序列合理，设计完成；如果有引物二聚体产生，则要用Primer3重新设计新的正向引物和荧光标记引物相同的序列以后再用软件检测，直至无引物二聚体产生。
3.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的配制SSR分子标记专用的PCR配方中的Taq聚合酶是全功能的DNA聚合酶，是用100ul或者更小的洁净PCR试管，PCR反应总体积为15ul，按表1的配方依次加入设计的3种引物、待测样品的DNA和去离子水，荧光引物最后加入，混合试剂，轻微漩涡混合，并离心5秒钟。这里的全功能的DNA聚合酶配方采用Hot Start Flex 2XMaster Mix，但不限制于Hot Start Flex 2X Master Mix，
表1每15ulPCR反应的试剂配方
4.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的SSR分子标记专用的PCR反应是将步骤3混好液体的试管置于带有Touchdown功能的PCR仪器进行扩增反应，PCR反应由3个touchdown循环和后续的35个标准循环组成，PCR循环的设置为起始变性温度为94℃ 3分钟，3个touchdown循环为94℃变性30秒，68℃退火1分钟，每执行一个循环后将退火温度降低2℃，72℃延伸1分钟，35个标准循环为94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒，完成以上循环以后，在72℃保持10分钟，最后将PCR产物冷却到室温或者4℃，从PCR仪取出以后，立即包裹锡箔纸避光，冷冻保存或者继续实验。
5.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的SSR分子标记的PCR产物的分析分为琼脂糖凝胶电泳和测序仪基因分型，其中琼脂糖凝胶电泳步骤非必须；所述琼脂糖凝胶电泳是移取10ul的PCR产物用3％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法电泳分离，EB染色，紫外成像仪观察PCR扩增的DNA片段；移取1‐5ul的PCR产物，用ABI3730XL按照仪器标准的基因分型法检测，DNA分子大小的内部参照标准采用LIZ500，检测前，不同荧光标记的PCR产物可以多重混合，混合至同一个PCR管进行检测，但是最多混合三种荧光标记的产物。
6.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的基因分型的数据分析采用的数据文件为.fsa格式，每一个PCR孔的样品产生一个对应的数据文件.fsa；将数据导入数据文件分析软件如GeneMapper或者GeneMarker，然后按照软件的说明进行基因分型的数据分析；ABI测序仪的基因分型检测时，标准DNA分子参照的范围包涵50‐500bp；1‐5ul PCR产物的用量用于ABI测序仪的基因分型检测，剩余PCR产物能用于3％的琼脂糖凝胶电泳检测。
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