CN108424954A - 一个增加水稻产量的邻氨基苯甲酸合酶等位基因片段及其应用 - Google Patents

一个增加水稻产量的邻氨基苯甲酸合酶等位基因片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一个增加水稻产量的邻氨基苯甲酸合酶等位基因片段及其应用。本发明所提供的筛选具有不同产量性状的水稻的方法，可包括如下步骤：(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA1，存在OsASA1_a和OsASA1_b两种等位形式，所述OsASA1_a如序列表的序列1所示，所述OsASA1_b如序列表的序列2所示；(2)进行如下判定：在同等生长条件下，基因型为OsASA1_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OsASA1_a纯合型的水稻群体的平均产量。实验证明，本发明提供的方法可筛选具有不同单株产量性状的水稻，且操作简单，准确率高，在水稻育种中具有重要的应用价值。

Description

一个增加水稻产量的邻氨基苯甲酸合酶等位基因片段及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种培育普适性高产水稻的等位基因片段和特异引物对,尤其涉及一个增加水稻产量的邻氨基苯甲酸合酶等位基因片段及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)提供了世界一半以上人口的主食。随着全球人口的增加，培育高产水稻品种的需求也在增加。获得控制水稻高产性状的基因组成分，对育种过程中有针对性地选取亲本材料，最终培育出具高产性状的水稻品种有重要的意义。
在实践中，水稻育种的基本目标是将优良性状结合在同一个品种中，使之在较广泛的地理条件下生长出产量高且品质好的稻谷。目前育种方法大多依赖可见性状或/和分子标记，由于影响水稻性状的因子多而复杂，人们改良它们的手段大多依赖对单个或多个基因的评价。
对水稻基因功能的研究需要结合它们在大田的表现才能对农业育种起指导作用。对水稻群体中的自然变异的研究目前以单核苷酸多态为主，基于相关数据的全基因组关联分析可以找到一些表型和单核苷酸多态之间的关联性估计。这类方法获得的结果对农业育种的影响仍有待评估。
近数十年来分子生物学的发展带来了分子育种的兴起，以特定基因或分子标记为选择条件的育种为传统育种增加了成功的概率。对产量而言，分子育种的一个制约因素是确定哪些基因或分子片段最适合作为选择条件。
发明内容
本发明提供了一个培育高产水稻的等位基因和特异引物对及其筛选方法。
本发明所提供的筛选方法适于选择在不同地理条件下均可高产的水稻(方法甲)，包括如下步骤：
(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA1，存在OsASA1_a和OsASA1_b两种等位形式，所述OsASA1_a如序列表的序列1所示，所述OsASA1_b如序列表的序列2所示；
(2)进行如下判定：在不同地理区域的同等生长条件下，基因型为OsASA1_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OsASA1_a纯合型的水稻群体的平均产量；
适于不同地理条件的高产水稻为在不同地理位置的大田条件下，基因型为OsASA1_b纯合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为OsASA1_a纯合型的水稻群体的平均产量。
所述不同地理区域的同等生长条件为不同地理区域但是同等生长条件。
本发明还提供的筛选方法适于选择在不同地理条件下均可高产的水稻(方法乙)，包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用下述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_b纯合型；
(2)进行如下判定：在同等生长条件下，基因型为OsASA1_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OsASA1_a纯合型的水稻群体的平均产量。
本发明还可以提供一种高产水稻的筛选方法，为方法A或方法B；
所述方法A包括如下步骤：
(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA11，存在OsASA11_a和OsASA11_b两种等位形式，所述OsASA11_a如序列表的序列1所示，所述OsASA11_b如序列表的序列2所示；
(2)进行如下判定：同等生长条件下，基因型为OsASA11_b纯合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为OsASA11_a纯合型的水稻群体的平均产量；
所述方法B包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsASA11_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA11_b纯合型；
(2)进行如下判定：同等生长条件下，基因型为OsASA11_b纯合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为OsASA11_a纯合型的水稻群体的平均产量。
上述同等生长条件可以为相同地理区域的同等生长条件。
生长条件指自然环境(土壤、温度、湿度和养分等)和人工管理(施肥、农药使用和驱鸟等)。
本发明还提供了一种选育水稻方法(方法丙)，可包括如下步骤：
(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA1，存在OsASA1_a和OsASA1_b两种等位形式，所述OsASA1_a如序列表的序列1所示，所述OsASA1_b如序列表的序列2所示；
(2)基因型为OsASA1_b纯合型的水稻为选育的目的水稻；
本发明还提供了一种选育水稻方法(方法丁)，可包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用下述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_b纯合型；
(2)基因型为OsASA1_b纯合型的水稻为选育的目的水稻。
所述目的水稻为产量高的水稻。
以上任一所述特异引物对可由引物1和引物2组成；
所述引物1可为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物2可为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列4所示的单链DNA；
(b2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
本发明还保护一种特异等位基因片段，所述特异等位基因片段可为OsASA1_a或OsASA1_b；
所述OsASA1_a为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列1所示的DNA分子；
(c2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述OsASA1_b为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列2所示的:DNA分子；
(d2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
(c2)或(d2)中，“取代和/或缺失和/或添加”发生的位置位于序列表的序列1与序列表的序列2之间的三个差异以外的区域。
所述特异引物对也属于本发明的保护范围。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种试剂盒，包括所述特异引物对。所述试剂盒中还可包括用于提取水稻基因组DNA的常规试剂和/或用于进行PCR扩增的常规试剂和/或用于进行测序的常规试剂。
所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)或(e4)：
(e1)筛选适于不同地理条件的高产水稻；
(e2)筛选具有不同产量性状的水稻；
(e3)鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；
(e4)鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将所述试剂盒中各条引物分别单独包装的步骤。
本发明还保护所述特异等位基因片段或所述特异引物对的应用，为如下(e1)或(e2)或(e3)或(e4)：
(e1)筛选适于不同地理条件的高产水稻；
(e2)筛选具有不同产量性状的水稻；
(e3)鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；
(e4)鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。。
所述特异等位基因片段、所述特异引物对、所述试剂盒或以上任一所述方法在水稻育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述水稻育种的育种目标为获得产量高的水稻。
上述任一所述产量可为单株产量。上述任一所述产量可为籽粒产量。
本发明还提供一种鉴定优势等位基因的方法，包括如下步骤：通过比较不同群体的生物性状差异，确定具有优势性状的等位基因；所述不同群体中，每个群体均由所述等位基因纯合的个体组成。
所述生物可为有性繁殖生物，具体可为植物，更具体可为水稻。
所述性状可为可测量性状，具体可为产量性状，更具体可为籽粒产量性状。
实验证明，利用本发明提供的方法可筛选具有不同单株产量性状的水稻，操作简单，准确率高，在水稻育种中具有重要的应用价值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1、引物的设计与合成
邻氨基苯甲酸是水稻体内合成色氨酸和吲哚的重要前体。在水稻基因组中，已经有至少一个基因被注释为编码邻氨基苯甲酸合酶(EC 4.1.3.27)，称为邻氨基苯甲酸合酶1(anthranilate synthase alpha 1，AB022602.1；OsASA1)的基因(以下简称为OsASA1基因)。OsASA1基因位于水稻第3号染色体上。通过大量预实验和序列比对，本发明的发明人发现OsASA1基因中存在至少两种等位基因片段(一种等位基因片段如序列表的序列1所示，命名为等位基因片段OsASA1_a；另一种等位基因片段如序列表的序列2所示，命名为等位基因片段OsASA1_b)，它们和水稻单株产量具有相关性。
根据上述两种等位基因片段设计特异引物对，由引物1和引物2组成。
引物1(序列表中序列3)：5’-GTTACTGGAGAGTTGCGTGATG-3’；
引物2(序列表中序列4)：5’-CTCATCTACGAATGTAGACTCGGC-3’。
实施例2、水稻中基于所述等位基因片段的分型方法的建立
建立的方法如下：
1、以待测水稻的基因组DNA(约10～100ng)为模板，采用引物1和引物2组成的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增的反应程序：95℃5分钟；95℃30秒、61℃1分钟、72℃1分钟，35个循环；72℃8分钟。
2、完成步骤1后，对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行如下判定：如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_b纯合型；如果PCR扩增产物为两种，一种如序列表中序列1所示，另一种如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_a/OsASA1_b杂合型。
由于水稻品种均为栽培种或农家种，因此基因型为纯合型的个体比例高。
实施例3、水稻中基于所述等位基因片段的基因型与水稻单株产量的关联分析
一、统计不同水稻品种的单株产量
于2014年在海南省三亚市和北京市分别种植多个水稻品种(具体见表1和表2，水稻品种名称见第2列，水稻品种的产地见第3列，部分水稻品种的2009编号见第6列)。在田间采用完全随机试验设计方案。待水稻成熟后，水稻植株按单株收种，称量，取平均值，得到该品种的单株产量(结果见表1和表2，第5列)。
二、按照实施例2建立的分型方法，检测各水稻品种的基因型(结果见表1和表2，第4列)。
表1三亚试验
表1的结果显示：53个随机水稻品种中32个品种的基因型为OsASA1_a纯合型，这32个品种的平均单株产量为33.11±2.21克；53个水稻品种中21个品种的基因型为OsASA1_b纯合型，这34个品种的平均单株产量为45.11±4.17克；双尾t-测试检验为显著不同(P＝0.016)。
表2北京试验
表2的结果显示：66个随机水稻品种中44个品种的基因型为OsASA1_a纯合型，这44个品种的平均单株产量为25.78±2.09克；66个水稻品种中22个品种的基因型为OsASA1_b纯合型，这22个品种的平均单株产量为33.25±3.57克；双尾t-测试检验为显著不同(P＝0.015)。
三、建立筛选具有不同单株产量性状的水稻的方法
筛选具有不同单株产量性状的水稻的方法为：
(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA1，存在至少OsASA1_a和OsASA1_b两种等位形式，所述OsASA1_a如序列表的序列1所示，所述OsASA1_b如序列表的序列2所示；
(2)进行如下判定：在不同地理区域但同等生长条件下，基因型为OsASA1_b纯合型的水稻群体的平均单株产量均高于基因型为OsASA1_a纯合型的水稻群体的平均单株产量。
序列表
<110>中国科学院植物研究所
<120>一个增加水稻产量的邻氨基苯甲酸合酶等位基因片段及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gttactggag agttgcgtga tgatctgact tgttgggatg ctcttcgagc agcattgccc 60
gttggaacag ttagtggtgc accaaaggta aggaaataca tgttggcacc gtatggttgc 120
atcacctgaa tgctgtttca gaaagaaaac gagaaacact ctgccaactc aatatatcta 180
tatgcgccat catattcatc agatattgac atgactgttg accatagttt gttaaccact 240
gcctttcctt cgtttcatct acttcctccg tttcaggtta taagacttta tagtattgca 300
cacattcata taaatattaa tgaatctaaa cacatatata tgtctagatt cactaacata 360
tatatggatg tagacaatgc tagaaagtct tataaactga aacggaggga gtaacatcta 420
ccatgcatta ttcatgttcc accgagctca atctctcatc ctcgtcttca accaggtgag 480
agcgatggag ctgattgacc agatggaagg gaagatgcgt gggccgtaca gtggtggctt 540
tggaggggtt tctttccgtg gagacatgga catcgcactt gctctccgta ccatcgtctt 600
ccccacggga tctcgcttcg acaccatgta ctcctacact gacaagaatg ctcgtcagga 660
gtgggtggct caccttcagg ctggagctgg gatcgtcgct gacagcaagc ctgacgatga 720
gcatcaggag tgcttgaaca aggctgctgg ccttgctcgt gccatcgatc ttgccgagtc 780
tacattcgta gatgag 796
<210> 2
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gttactggag agttgcgtga tgatctgact tgttgggatg ctcttcgagc agcattgccc 60
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tatgcgccat catattcatc agatattgac atgactgttg accatagttt gttaaccact 240
gcctttcctt cgtttcatct acttcctccg tttcaggtta taagacttta tagtattgca 300
cacattcata taaatattaa tgaatctaaa cacatatata tgcctagatt cactaacata 360
tatatggatg tagacaatgc tagaaagtct tataaactga aacggaggga gtaacatcta 420
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<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
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<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ctcatctacg aatgtagact cggc 24

Claims (10)

1.一种筛选适于不同地理条件的高产水稻的方法，为方法甲或方法乙；
所述方法甲包括如下步骤：
(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA1，存在OsASA1_a和OsASA1_b两种等位形式，所述OsASA1_a如序列表的序列1所示，所述OsASA1_b如序列表的序列2所示；
(2)进行如下判定：在不同地理区域的同等生长条件下，基因型为OsASA1_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OsASA1_a纯合型的水稻群体的平均产量；
所述方法乙包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求5所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_b纯合型；
(2)进行如下判定：在不同地理区域的同等生长条件下，基因型为OsASA1_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OsASA1_a纯合型的水稻群体的平均产量。
2.一种高产水稻的筛选方法，为方法A或方法B；
所述方法A包括如下步骤：
(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA11，存在OsASA11_a和OsASA11_b两种等位形式，所述OsASA11_a如序列表的序列1所示，所述OsASA11_b如序列表的序列2所示；
(2)进行如下判定：同等生长条件下，基因型为OsASA11_b纯合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为OsASA11_a纯合型的水稻群体的平均产量；
所述方法B包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求4所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsASA11_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA11_b纯合型；
(2)进行如下判定：同等生长条件下，基因型为OsASA11_b纯合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为OsASA11_a纯合型的水稻群体的平均产量。
3.一种水稻选育方法，为方法丙或方法丁；
所述方法丙包括如下步骤：
(1)检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsASA1，存在OsASA1_a和OsASA1_b两种等位形式，所述OsASA1_a如序列表的序列1所示，所述OsASA1_b如序列表的序列2所示；
(2)基因型为OsASA1_b纯合型的水稻为选育的目的水稻；
所述方法丁包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求5所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsASA1_b纯合型；
(2)基因型为OsASA1_b纯合型的水稻为选育的目的水稻。
4.特异等位基因片段，为OsASA1_a或OsASA1_b；
所述OsASA1_a为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列1所示的DNA分子；
(c2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述OsASA1_b为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列2所示的:DNA分子；
(d2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
5.特异引物对，由引物1和引物2组成；
所述引物1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物2为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列4所示的单链DNA；
(b2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
6.一种试剂盒，包括权利要求5所述特异引物对；
所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)或(e4)：
(e1)筛选适于不同地理条件的高产水稻；
(e2)筛选具有不同产量性状的水稻；
(e3)鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；
(e4)鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。
7.权利要求6所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求6所述试剂盒中各条引物分别单独包装的步骤。
8.权利要求4所述特异等位基因片段或权利要求5所述特异引物对的应用，为如下(e1)或(e2)或(e3)或(e4)：
(e1)筛选适于不同地理条件的高产水稻；
(e2)筛选具有不同产量性状的水稻；
(e3)鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；
(e4)鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。
9.权利要求1-3中任一所述方法，或，权利要求4所述特异等位基因片段，或，权利要求5所述特异引物对，或，权利要求6所述试剂盒，在水稻育种中的应用。
10.一种鉴定优势等位基因的方法，包括如下步骤：通过比较不同群体的生物性状差异，确定具有优势性状的等位基因；所述不同群体中，每个群体均由所述等位基因纯合的个体组成。
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