CN111218525A - 棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉花纤维品质育种技术领域，具体而言，涉及棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记及其应用。棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记，所述SNP标记为碱基A或G，所述SNP标记位于棉花Dt06染色体上GhCYSb基因的第310bp位置处，所述GhCYSb基因的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明利用10660个高质量的SNP位点，对276份棉花品种的品质性状关联分析，挖掘出GhCYSb基因上一个SNP位点与纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)显著相关。

Description

棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及棉花纤维品质育种技术领域，具体而言，涉及棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记及其应用。

背景技术

棉花是重要的纤维作物，是纺织工业中重要的天然纤维来源。随着育种目标的改变，在保证棉花产量的同时，培育纤维品质优良的棉花已成为育种家新的目标。棉花纤维品质性状主要包括纤维长度(FL)、纤维比强度(FS)、纤维伸长率(FE)、马克隆值(FM)和纤维整齐度(FU)。在这些性状中，纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)对棉花纤维品质影响相对较大。棉花品种具有优异的纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)，对于满足人们和棉纺织工业所追求的高档棉纺织用品、实现棉花的机械化采摘具有十分重要的意义。

优质纤维是棉花育种的重要目标，但由于棉花纤维品质一般由多基因控制，容易受到环境因素的影响，控制纤维品质的遗传基础复杂，因此科研工作者应用多种方法筛选与纤维长度和纤维比强度相关的基因。随着测序技术的发展和成本的降低，高质量的棉花全基因组数据已经被人们广泛利用，这为通过全基因组关联分析的方法解析棉花纤维品质性状提供了机会。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明利用10660个高质量的SNP位点，对276份棉花品种的品质性状关联分析，挖掘出GhCYSb基因上一个SNP位点与纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)显著相关。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了以下技术方案：

棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记，所述SNP标记为碱基A或G，所述SNP标记位于棉花Dt06染色体上GhCYSb基因的第310bp位置处，所述GhCYSb基因的序列如SEQ IDNO:1所示。

纤维长度和纤维比强度是改善纤维品质的两个主要目标性状。本发明运用10660个SNP标记对纤维长度和纤维比强度性状进行全基因组关联分析，得到GhCYSb基因上一个SNP位点与这两个纤维品质性状显著关联。该SNP位点是非同义突变，由AA基因型突变成GG基因型，造成氨基酸由精氨酸变成甘氨酸。

与AA基因型材料相比，含有GG基因型的材料具有较高的纤维长度和纤维比强度，因此，借助GG基因型的标记位点可以选择纤维长度和纤维比强度优良的材料，能有效提高选择效率和准确性。

进一步地，所述SNP标记的GG基因型棉花的纤维长度和纤维比强度高于AA基因型棉花。

因此，通过检测SNP标记的GG基因型可以判断纤维长度和纤维比强度性状的优良度。

本发明还提供了针对上述的SNP标记设计的引物对或探针或芯片。

本发明提供的检测纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记的引物对或探针或芯片，能有效的将AA基因型与CC基因型分开，通过确定待检测物的基因型，以有效预测棉花的纤维长度和纤维比强度性状的表现。

本发明提供的检测SNP标记的引物对、探针或芯片，依据GhCYSb基因SNP标记的序列按常规方法进行设计。

用于检测上述的SNP标记的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。

本发明提供的检测GhCYSb基因SNP标记的引物对，可鉴别出影响棉花纤维长度和纤维比强度的GG基因型和AA基因型。

本发明还提供了含有上述的SNP标记的引物对或探针或芯片的试剂盒，为上述GG基因型与AA基因型的检测提供良好的技术支持。

本发明还提供了上述的SNP标记在检测优质纤维长度和纤维比强度棉花中的应用。

具体地，本发明还提供了一种高纤维品质棉花的检测方法，采用上述的SNP标记检测样品的基因组，若所述样品检测结果为GG基因型，则所述样品为优质纤维长度和纤维比强度棉花。

其中，样品可取自任何成长阶段的棉花的部分，如可以为花粉、花药、子房、种子、胚珠、胚囊、枝、根、茎、叶、子叶、花、原生质体、胚、下胚轴、分生组织细胞等。

采用SNP标记检测样品的基因组可用的检测手段可以为测序、PCR、杂交等方式。

本发明还提供了上述的SNP标记在优质纤维长度和纤维比强度棉花育种中的应用。

具体地，本发明还提供了一种高纤维品质棉花育种方法，选择上述的所述SNP标记为GG基因型的棉花进行杂交繁殖。

由于本发明提供的纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记，能够区分不同样品的基因型，而GG基因型棉花的纤维长度和纤维比强度高于AA基因型棉花，据此，该SNP标记辅助育种，能够更快的得到高纤维品质棉花，节省时间、成本低廉。

本发明还提供了所述的SNP标记在棉花种群遗传多样性研究中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括如下方面：

(1)本发明运用10660个SNP标记对纤维长度和纤维比强度性状进行全基因组关联分析，得到GhCYSb基因上一个SNP位点与这两个纤维品质性状显著关联。

(2)本发明提供的棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记是非同义突变，由AA基因型突变成GG基因型，造成氨基酸由精氨酸变成甘氨酸。与AA基因型材料相比，含有GG基因型的材料具有较高的纤维长度和纤维比强度。

(3)本发明借助GG基因型的标记位点可以选择纤维长度和纤维比强度优良的材料，能有效提高选择效率和准确性。

(3)本发明提供的GhCYSb基因SNP标记可用于优质纤维长度和纤维比强度棉花的辅助育种中，通过选择该标记位点的GG基因型的有利等位变异，有效缩短高纤维品质材料的育种年限。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中纤维长度和纤维比强度性状在276份陆地棉群体中的频率分布图；

图2为本发明实施例1中Dt06染色体上SNP标记与纤维长度和纤维比强度性状的关联分析图；

图3为本发明实施例2中Dt06染色体59.8-60.2Mb区间的连锁不平衡区块分析图；

图4为本发明实施例2中GhCYSb基因结构及其突变位点图；

图5为本发明实施例2中GhCYSb基因两种基因型的纤维长度和纤维比强度表现情况图；

图6为本发明实施例2中GhCYSb基因在不同组织的表达水平柱形图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一、试验材料和方法

1、棉花材料和田间种植

本发明所用的276份材料来自中国农业科学院棉花研究所国家棉花种质中期库中在不同历史阶段发挥过重要作用的棉花品种和本研究团队长期积累的育种基础材料。这些材料种植在河南省安阳市(2016年和2017年)、湖北省荆州市(2016年和2017年)、新疆阿拉尔市(2016年和2017年)、江西省九江市(2016年)、湖北省黄冈市(2017年)。采用随机区组种植，共两个重复，行长6米，行宽0.8米，每行20-25株。

2、田间表型调查和统计分析

在吐絮盛期，以每行中间长势一致的10个植株为研究对象，随机摘取它们中部共25个正常吐絮的棉铃。轧花后，每个样本的10-15克纤维送至中国农业科学院棉花研究所农业部棉花品质监督检验测试中心(河南省安阳市开发区黄河大道38号)，检测纤维长度和纤维比强度。

为了降低环境影响，利用R语言的lme4软件包计算每份材料每个性状的最佳线性无偏估计值(BLUP)，然后分析差异显著性、皮尔逊相关系数、广义遗传力和方差。

3、纤维品质性状的关联分析

借助棉花芯片CottonSNP63K被过滤的高质量SNP共10660个，利用我们先前报道的群体结构和亲缘关系矩阵，选用GAPIT软件的混合线性模型(MLM)进行276份材料的纤维品质性状关联分析。其中阈值的设定是根据公式P＝1/10660来计算，最终校正后阈值为P＝1.0×10^-3。

二、试验结果

1、纤维品质性状的表型特征

利用纤维长度和纤维比强度的BLUP值统计表型变异，结果如表1所示。从表1中可以看出，纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)的变异范围分别是25.17-31.02mm和25.08-31.69cN/tex；对应的平均值为28.85mm和28.49cN/tex；相应的变异系数为2.60％和3.61％。

表1纤维长度和纤维比强度的表型统计

对纤维长度和纤维比强度性状的数据进行表型统计分析，得到的柱形图如图1所示。从图1可以看出，纤维长度和纤维比强度性状均符合标准正态分布，表明这两个性状是多基因控制的数量性状。

纤维品质性状的相关性分析显示纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)之间存在强烈的正相关，相关系数为0.84(P<0.01)。

另外，棉花纤维长度和纤维比强度性状的方差分析如表2所示。

表2棉花纤维长度和纤维比强度性状的方差分析

G：基因型；E：环境；G×E：基因型与环境互作；***：在0.001水平下差异显著

方差分析显示基因型、环境型和基因与环境互作间存在显著差异，表明纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)受基因型和环境的影响。

而纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)的广义遗传力为84.54％和84.78％，表明纤维品质主要被遗传影响(表1)。

2、纤维品质的关联分析

对芯片CottonSNP63K过滤和筛选，鉴定出10660个用于后续分析的SNP，基于这些高质量的SNP运用混合线性模型对276份自然群体的纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)表型性状进行全基因组关联分析，结果如图2所示。

从图2中可以看出，位于Dt06染色体的59.8-60.2Mb基因组区间内存在一个多效性SNP位点，与纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)性状相关联。

实施例2

1、关键基因的鉴定

连锁不平衡区块分析显示关联的SNP位点位于区块内，表明该基因位点与其相邻的染色体区段形成较强的遗传连锁，在传递过程中不易被交换重组(图3)。

进一步分析发现，该SNP位点位于基因GhCYSb(基因编号为Gh_D06G1908)上。GhCYSb基因的序列如SEQ ID NO:1所示，对该基因进行基因结构分析，结果如图4所示。根据基因结构分析，得出该基因存在3个外显子和2个内含子，其中，该SNP位点在第1个外显子内也就是该基因的310bp位置的一个非同义突变，由A碱基突变成G碱基，引起了该基因位点的氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸(图4)。

这个SNP位点形成的两种基因型(AA型与GG型)与纤维长度(FL)和纤维比强度(FS)性状的表型显著关联。其中GG基因型具有较高的纤维长度和纤维比强度，而AA基因型与其相反(图5)。

2、实时荧光定量PCR验证

在棉花正常生长期，取陆地棉TM-1样品苗期的根、茎、叶，以及取开花后5天、10天、15天、20天和30天的棉铃，分别剥开取胚珠上的纤维，使用北京天根生物公司的Trizolreagent试剂盒分别抽提不同组织和不同时期的RNA。提取RNA后使用1.5％的琼脂糖凝胶检测其质量，使用Nanodrop2000检测其浓度。使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNAEraser(Takara，中国)将RNA反转录合成cDNA。设计基因的特异性引物，引物序列见表3。

表3GhCYSb基因和内参基因GhHis3的特异性引物序列

基因名称	正向引物(5'-3')	反向引物(5'-3')
			GhCYSb	GTGAAAGCAACGGAGCAAGTGG	TGGCTTGACCCACACTTTAGCC
GhHis3	TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA	GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC

使用LightCycler480 II system(Roche，德国)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试验，以FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche，德国)为试剂，以GhHis3为内参基因。每个样品进行3次生物学重复。用2^-ΔCT法分析qRT-PCR数据。

根、茎、叶取自苗期，该生长期的根茎叶代表营养生长的组织，开花后不同时期纤维代表纤维发育的不同阶段。

对GhCYSb基因的表达模式进行实时荧光定量分析，结果如图6所示。图6中，Root即根；Stem即茎；Leaf即叶；Fiber即纤维；DPA为Days post anthesis，即开花后天数。

从图6中可以看出，该基因在纤维发育阶段表达量逐渐上升，在开花后30天表达达到最高。说明相对于根茎叶，该基因在纤维发育阶段优势表达而发挥作用，该基因与纤维品质特定指标密切有关。

该基因在拟南芥的同源基因为AtCYSb(At3g12490)，其编码一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂，超表达可以显著促进拟南芥生长。而棉花纤维由单细胞发育而成。因此，进一步证明棉花中该基因可能是一个多效性基因，控制纤维的纤维长度和纤维比强度。

总的来说，上述GhCYSb基因SNP标记的发现增强了对棉花纤维性状遗传基础的认识，为纤维性状的分子机制的探索提供了有力的支持。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

atgcgaaatc ccagtttcgc aatctctttt ttattctaca taccaatctc aattctcttc 60

ttcaacaatt tctttgcgga atcaactctc agctctgaac caatggccac caccgccgcc 120

aatttgggtg gatttcgccc gtccggcaga tcccaaaaca gcgcggagct cgaaaacgtc 180

tctcgcttcg ccgtcgatgg gcacaacaag aaagagaaga gtatggttga gtttgtgagg 240

gtggtgaaag caacggagca agtggtggcg gggacgcttc aacatttgac tgtggaagcc 300

attgatggta gaaaaaagaa gctttatgag gctaaagtgt gggtcaagcc atggatgaac 360

gtgaaggaat tgcaggagtt taaacatgcc gatgatttcc cttcttgtac aacttcggat 420

cttggtatca agaaaggttt gttcataact caaatcctct ttgattgttg atattaaact 480

tagataaatt attgggtgaa aatagatggg catggccatg gattgcaagg tgtgccaata 540

catgaccctg tagttgaagg tgctgcaaat catgctctca aagccattca gcagagatca 600

aattcccttg tgccttatga actcaaagaa atccttcatg ccaatgctga ggtatggtgt 660

gtcatccggt ttaataatat tattgaagtg aattggtttt gacatgaaag tggaaataca 720

caggtggtgg aagatttgac caaacttgaa atggttctga aggttaagag aggagacaag 780

gaatag 786

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtgaaagcaa cggagcaagt gg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tggcttgacc cacactttag cc 22

Claims (10)

1.棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为碱基A或G，所述SNP标记位于棉花Dt06染色体上GhCYSb基因的第310bp位置处，所述GhCYSb基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的GG基因型棉花的纤维长度和纤维比强度高于AA基因型棉花。

3.针对权利要求1所述的SNP标记设计的引物对或探针或芯片。

4.用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

5.含有权利要求3所述的SNP标记的引物对或探针或芯片的试剂盒。

6.权利要求1所述的SNP标记在检测优质纤维长度和纤维比强度棉花中的应用。

7.一种高纤维品质棉花的检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的SNP标记检测样品的基因组，若所述样品检测结果为GG基因型，则所述样品为优质纤维长度和纤维比强度棉花。

8.权利要求1所述的SNP标记在优质纤维长度和纤维比强度棉花育种中的应用。

9.一种高纤维品质棉花育种方法，其特征在于，选择权利要求1所述的所述SNP标记为GG基因型的棉花进行杂交繁殖。

10.权利要求1所述的SNP标记在棉花种群遗传多样性研究中的应用。

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