CN118109633A - 用于鉴定香菇杂交群体温型的InDel标记引物及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于鉴定香菇杂交群体温型的InDel标记引物及鉴定方法，引物组合物，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列；方法包括S1、获取香菇的DNA；S2、PCR扩增香菇的DNA；S3、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；S4、根据电泳条带的数量和长度判断香菇的温型；本发明的InDel标记引物可用于快速鉴定香菇杂交群体温型，检测准确性高，重复性好，检测效率高，操作性强，实现了在菌丝阶段就能进行香菇杂交群体低温型及高温型杂交子早期筛选的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及遗传育种技术领域，具体是用于鉴定香菇杂交群体温型的InDel标记引物及鉴定方法。
背景技术
香菇(Lentinula edodes)味道鲜美，风味独特，富含的蛋白质、氨基酸、香菇多糖及矿物质元素，且在我国栽培广泛，产量多年居食用菌首位，2022年香菇产量达到1295.48万吨，占我国食用菌总产量的30.68％，在我国食用菌产业发展中具有重要地位。目前，随着香菇栽培规模的不断增加及栽培模式的设施化和集约化转型，对香菇不同类型品种的需求越来越高，对耐高温品种的需求尤为迫切。温度是影响香菇生长发育的重要环境因素之一。热胁迫常引起香菇菌丝凋亡和菌棒腐烂，降低香菇菌丝对杂菌的抗性，造成重大的经济损失。高温易引发菇体畸形、继发性不出菇等，成为局部严重减产甚至绝收的主要问题。因此，耐高温性成为食用菌抗逆性评价的首选指标。但是目前生产上仍以中低温品种为主，缺乏耐高温品种。
目前香菇品种选育仍以传统杂交育种为主，对杂交群体温型的判断还是育种者根据杂交群体栽培出菇差异凭经验判断，温型性状还无法做到定向选育。香菇育种工作中，需要对大量杂交后代进行多轮重复筛选，工作量大、成本高。通过分子标记辅助进行定向选择带有目标性状的杂交后代，不仅省时、省力，而且准确性高、效率高。在香菇高质量基因组组装完成的基础上，在香菇中利用InDel分子标记进行定向选育。利用分子标记准确性高、稳定性好、分型快捷简便等优点辅助选择育种，可以快速准确的筛选出带有目的性状的优良杂交后带。
因此，开发一种用于鉴定香菇杂交群体温型的InDel标记引物及其检测方法成为本领域的主要研究问题。
发明内容
针对上述问题，本发明还提供了一种用于鉴定香菇杂交群体温型的InDel标记引物及鉴定方法，可用于香菇杂交群体杂交子低温型、高温型菌株早期筛选鉴定，进一步可用于香菇分子标记辅助育种。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供一种用于鉴定香菇杂交群体温型的InDel标记引物组合物，包括：SEQ ID NO.1：3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’；SEQ ID NO.2：3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’。
进一步地，所述引物扩增的InDel标记位点为：chr2：3687644-3732590，标记位置为3715738-插入24。
进一步地，所述香菇包括931、L135、18、49、67、121、233、292、362、366、388、464、482、505、592、609、702、767、950、1024、1110、1197、150、157、162、222、224、236、251、297、307、392、417、418、450、459、463、486、556、639、713、816、854、925、961或1121中的任意一种或多种。
第二方面，本发明提供一种用于鉴定香菇杂交群体温型的试剂盒，所述试剂盒包括用于鉴定InDel标记位点chr2：3687644-3732590，标记位置为3715738-插入24的碱基、蛋白或化合物。
进一步地，所述碱基包括：SEQ ID NO.1：3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’；SEQ IDNO.2：3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’。
第三方面，本发明提供一种用于鉴定香菇杂交群体温型的方法，包括以下步骤：S1、获取香菇的DNA；S2、PCR扩增香菇的DNA；S3、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；S4、根据电泳条带的数量和长度判断香菇的温型。
进一步地，步骤S4的判断方法为，当扩增出175bp、199bp处2个条带，即为香菇杂交群体高温型菌株；当扩增出175bp处1条带，即为香菇杂交群体低温型菌株。
进一步地，步骤S2中，PCR引物为：
SEQ ID NO.1：3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’；
SEQ ID NO.2：3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’。
进一步地，步骤S2中，PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，57-59℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明以香菇杂交育种群体为研究对象，综合利用混池重测序和生物信息学手段，对低温型、高温型优异标记位点进行开发，形成1对适用于香菇杂交群体温型早期筛选的InDel标记和1个InDel位点的基因型的等位基因特异性引物，以及该标记在判定香菇杂交群体杂交子温型及早期筛选的应用方法，利用该标记和判定方法能够快速鉴定香菇杂交群体低温型、高温型育种材料，检测准确性高，重复性好，检测效率高，操作性强，克服了现有技术高温品种选育效率低下的问题，减少了大量的工作量及试验成本，实现在菌丝阶段就能进行香菇杂交群体低温型及高温型杂交子早期筛选的技术效果。
附图说明
图1为本发明实施例1的GATK(上)、MAPPR(下)loess图；
图2为本发明实施例2的不同引物序列的PCR扩增结果图；
图3为本发明实施例3的香菇杂交群体低温型菌株PCR扩增结果；
图4为本发明实施例4的香菇杂交群体高温型菌株PCR扩增结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步的说明，但是不作为本发明的限定。
在以下详细描述中，阐述了许多特定细节以提供对本发明的更透彻理解。此外，应理解在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
在本实施例中菌株和实验材料的来源如下：
菌株来源：931为高温型栽培菌株，来源于国家食用菌工程技术研究中心；L135为低温型栽培菌株，菌株来源于福建省三明真菌研究所；其低温型杂交子编号分别为：18、49、67、121、233、292、362、366、388、464、482、505、592、609、702、767、950、1024、1110、1197；高温型杂交子编号分别为：150、157、162、222、224、236、251、297、307、392、417、418、450、459、463、486、556、639、713、816、854、925、961、1121。
Marker、Premix TaqTM均购自：Takala Bio宝日生物科技有限公司。
核酸染料购自：北京全式金生物技术有限公司。
其余材料和试剂均为普通市售产品。
实施例1、筛选InDel标记
以香菇L135和931为亲本构建杂交群体，将杂交子菌棒分为4个温度(12℃、17℃、22℃、27℃)进行出菇试验。根据栽培试验不同菌株从接种到原基形成(营养生长)天数、现蕾数量、单菇重和总产量综合计算温型。将15℃以下出菇农艺性状较好的菌株作为低温型菌株，25℃以上也可以出菇较好的菌株作为高温型菌株，其余算作中间温型菌株。
随机选取高温型菌株24株，低温型菌株20株及中间温型菌株27株，进行BSA混池测序，构建基因组DNA文库，基于Illumina NovaSeq测序平台，采用第二代测序技术(NextGeneration Sequencing，NGS)，对这些DNA文库进行双末端(Paired-end，PE)测序。双亲和子代重测序深度为30X，每个池测序6个G的数据。对原始测序数据进行过滤，得到高质量reads。将Clean Data比对到香菇参考基因组L808-1(GenBank accessionno.JABFYJ000000000)，统计变异位点，使用GATK和MMAPP统计的等位基因深度计算ED值，然后使用loess算法进行拟合，选取拟合后的ED值大于99％分位数的区域作为目标区域。
图1为本发明实施例1的GATK(上)、MAPPR(下)loess图，从左到右依次为1号染色体(chr1)、10号染色体(chr10)、2号染色体(chr2)、3号染色体(chr3)、4号染色体(chr4)、5号染色体(chr5)、6号染色体(chr6)、7号染色体(chr7)、8号染色体(chr8)和9号染色体(chr9)，结果如图1所示：存在多个SNP阈值峰区，且1号、2号(chr2)、6号(chr6)、10号(chr10)染色体上峰区最为明显。进一步与参考基因组比对，定位到6个与温型相关的位点，分别位于1号染色体的7825611-8179964bp，2号染色体的3687644-3732590bp，6号染色体的2729520-2805891bp、3220810-3260266bp，10号染色体的2108352-2199237bp、2317609-2353705bp。
实施例2、InDel标记的引物设计及筛选
对上述实施例1中筛选到的6个与温型相关的位点进行引物设计。引物通过Premier Primer 5.0软件于InDel位点两翼各200bp长度内设计7对，引物信息如下表1所示，获得的引物序列由生工生物合成。随机挑选低温型菌株(18、49、67、121、233)、高温型菌株(150、157、162、307、392)及其亲本(香菇L135和931)提取的DNA进行PCR扩增，将进行引物筛选。
图2为本发明实施例2的不同引物序列的PCR扩增结果图，其中，图2(上)的从左到右依次表示为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物组、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物组、SEQID NO.1和SEQ ID NO.2引物组以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物组，图2(下)的从左到右依次表示为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10引物组、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12引物组、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14引物组；并且每个引物组中的各条带从左到右依次为Marker(M)、L135、931、18、49、67、121、233、150、157、162、307、392菌株；结果如图2所示，SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4引物组，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物组以及SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10引物组无法对亲本(L135和931)进行区分；对比低温型杂交子菌株、高温型杂交子菌株与对应温型亲本条带位置，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物组，SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12引物组以及SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14引物组条带位置与其对应温型亲本的相符程度没有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物组的相符程度高。因此，筛选到SEQ ID NO.1：3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’及SEQ ID NO.2：3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’引物组合对亲本(L135和931)及不同温型杂交子的相符程度最高，用于后续实验。
表1
| 编号 | 序列 |
| SEQ ID NO.1 | 3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’ |
| SEQ ID NO.2 | 3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’ |
| SEQ ID NO.3 | 3’-CCGCATCGCTAGAAGTAGGG-5’ |
| SEQ ID NO.4 | 3’-GGCGATCGCTTTTTGAGAGG-5’ |
| SEQ ID NO.5 | 3’-TTTCGCTCTGGCCGCATATT-5’ |
| SEQ ID NO.6 | 3’-GACAGCCTCGACTGCTTCTC-5’ |
| SEQ ID NO.7 | 3’-TGTCCAGTGTCAGGAAGTGC-5’ |
| SEQ ID NO.8 | 3’-TAGGTGATGAGGCCCAGAGT-5’ |
| SEQ ID NO.9 | 3’-AGCAACGGCATGGTAGATGT-5’ |
| SEQ ID NO.10 | 3’-TCCCAGTCAGTATCCCGTGT-5’ |
| SEQ ID NO.11 | 3’-GGAACGCTTGGTACTGTCCT-5’ |
| SEQ ID NO.12 | 3’-AAGCCGACTGTCGATAAGCC-5’ |
| SEQ ID NO.13 | 3’-TTTTGGGTCACTCGGTGGAA-5’ |
| SEQ ID NO.14 | 3’-ATGGCTCGCCATCACCTTC-5’ |
实施例3、采用InDel标记对香菇杂交群体低温型杂交子及其亲本进行检测
对杂交群体低温型菌株及其亲本提取的DNA进行PCR扩增，其中PCR反应条件如下：
PCR扩增体系：2×Es Premix TaqTM 10μL，InDel标记正向引物、反向引物(10μmol/L)各1μL，模板DNA(20～30ng/μL)2μL，补ddH2O至20μL；PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，57-59℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min；10℃保存；
电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为3％，电泳缓冲液为1xTAE，电压90v，电流300mA，功率100w，电泳5h，用凝胶成像系统拍照，分析结果；
选用上述InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照DNA Marker500可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，并统计条带数量。
其中InDel位点为实施例1筛选的：位于2号染色体，InDel标记名称为chr2：3687644-3732590，标记位置为3715738-插入24。
引物为实施例2设计的：正向引物3’-5’为ATTTTGTGGCACTCCCCAGT，反向引物3’-5’为GCAACGGTAGCGGTAAATGC，产物大小为175bp。
检测待检菌株的InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量；于175bp处有1条带，即为低温型菌株。
香菇杂交群体低温型菌株PCR扩增结果如下图3所示：在20个杂交子中有13个菌株(分别为18、49、121、233、292、464、482、505、592、702、767、950、1110菌株)于175bp处有1条带，统计为低温型菌株，即65％的菌株温型鉴定结果与前期栽培法鉴定的温型结果一致；有35％的菌株温型(即8个分别为67、362、366、388、609、1024和1197菌株)鉴定结果与前期栽培法鉴定温型的结果不一致，这可能与前期栽培法鉴定温型的标准有关。目前香菇高温型与低温型菌株没有明确的界定标准，只有少部分温型性状极为明显的品种是业内公认的高温品种或者低温品种。栽培法需要育种工作者根据农艺性状表现综合判定其属于低温型还是高温型，具有一定的主观性，而我们开发的温型分子标记引物可以从基因层面对杂交子进行筛选，可以更客观准确的判断筛选不同温型的杂交子。本检测准确性较高，重复性好，检测效率高，操作性强，可以很大程度上减少香菇育种工作的时间及研发成本，克服了现有技术只能在菌棒阶段凭借栽培经验判断的效率低下的问题，具有很大的实际应用价值。
实施例4采用InDel标记对香菇杂交群体高温型菌株及其亲本进行检测
对杂交群体高温型菌株及其亲本提取的DNA进行PCR扩增，其中PCR反应条件如下：
PCR扩增体系：2×Es Premix TaqTM 10μL，InDel标记正向引物、反向引物(10μmol/L)各1μL，模板DNA(20～30ng/μL)2μL，补ddH2O至20μL；PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，57-59℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min；10℃保存。
电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为3％，电泳缓冲液为1xTAE，电压90v，电流300mA，功率100w，电泳4h，用凝胶成像系统拍照，分析结果；
选用上述InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照DNA Marker500可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，并统计条带数量；
其中InDel位点为实施例1筛选的：位于2号染色体，InDel标记名称为chr2：3687644-3732590，标记位置为3715738-插入24。
引物为实施例2设计的：正向引物3’-5’为ATTTTGTGGCACTCCCCAGT，反向引物3’-5’为GCAACGGTAGCGGTAAATGC，产物大小为175bp。检测待检菌株的InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量；分别于175bp及199bp处各有1条带，即为高温型菌株。
香菇杂交群体高温型菌株PCR扩增结果如图3所示，24个杂交子中有13个菌株(分别为150、157、162、222、307、392、417、418、459、463、486、639和713)分别于175bp及199bp处各有1条带，统计为高温型菌株，即有54.17％的菌株温型鉴定结果与前期栽培法鉴定的温型结果一致。有45.83％(即11个分别为224、236、251、297、450、556、816、854、925、961、1121菌株)的菌株温型鉴定结果与前期栽培法鉴定温型的结果不一致，这可能与前期栽培法鉴定温型的标准有关。目前香菇高温型与低温型菌株没有明确的界定标准，只有少部分温型性状极为明显的品种是业内公认的高温品种或者低温品种。栽培法需要育种工作者根据农艺性状表现综合判定其属于低温型还是高温型，具有一定的主观性，而我们开发的温型分子标记引物可以从基因层面对杂交子进行筛选，可以更客观准确的判断筛选不同温型的杂交子。本分子标记检测具有较高的准确性，重复性好，检测效率高，操作性强，可以很大程度上减少香菇育种工作杂交群体筛选的时间及研发成本，克服了现有技术只能在菌棒阶段凭借栽培经验判断的效率低下的问题，具有很大的实际应用价值。
申请人声明，在上述说明书的描述过程中：
术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
最后应说明的是：
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种用于鉴定香菇杂交群体温型的InDel标记引物组合物，其特征在于，包括：SEQID NO.1：3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’；
SEQ ID NO.2：3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’。
2.如权利要求1所述的InDel标记引物组合物，其特征在于，所述引物扩增的InDel标记位点为：chr2：3687644-3732590，标记位置为3715738-插入24。
3.如权利要求1所述的InDel标记引物组合物，其特征在于，所述香菇包括931、L135、18、49、67、121、233、292、362、366、388、464、482、505、592、609、702、767、950、1024、1110、1197、150、157、162、222、224、236、251、297、307、392、417、418、450、459、463、486、556、639、713、816、854、925、961或1121中的任意一种或多种。
4.一种用于鉴定香菇杂交群体温型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于鉴定InDel标记位点chr2：3687644-3732590，标记位置为3715738-插入24的碱基、蛋白或化合物。
5.如权利要求4所述的一种用于鉴定香菇杂交群体温型的试剂盒，其特征在于，所述碱基包括：
SEQ ID NO.1：3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’；
SEQ ID NO.2：3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’。
6.一种用于鉴定香菇杂交群体温型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、获取香菇的DNA；
S2、PCR扩增香菇的DNA；
S3、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
S4、根据电泳条带的数量和长度判断香菇的温型。
7.如权利要求6所述的一种用于鉴定香菇杂交群体温型的方法，其特征在于，步骤S4的判断方法为，当扩增出175bp、199bp处2个条带，即为香菇杂交群体高温型菌株；当扩增出175bp处1条带，即为香菇杂交群体低温型菌株。
8.如权利要求6所述的一种用于鉴定香菇杂交群体温型的方法，其特征在于，步骤S2中，PCR引物为：
SEQ ID NO.1：3’-ATTTTGTGGCACTCCCCAGT-5’；
SEQ ID NO.2：3’-GCAACGGTAGCGGTAAATGC-5’。
9.如权利要求6所述的一种用于鉴定香菇杂交群体温型的方法，其特征在于，步骤S2中，PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，57-59℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
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