CN104611325B - 毛竹microRNA前体基因的克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了毛竹microRNA前体基因的克隆方法，分别对毛竹microRNA前体基因的PCR扩增体系和PCR反应条件进行优化，通过减少引物用量、提高模板量，控制退火温度在66‑68℃，循环次数为30‑32次、以及改变琼脂糖凝胶电泳的胶浓度、电压和电泳时间，实现高效克隆毛竹microRNA前体基因。本发明方法特异性强，目的基因的产物量高，在前体基因的关键成熟序列区域无碱基错配现象，获得的前体基因序列与目的基因序列同源性高达100％。有利于进一步构建植物表达载体，用于转基因植物的培育，在农林作物遗传改良和分子育种方面具有良好的应用前景。

Description

毛竹microRNA前体基因的克隆方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及毛竹microRNA前体基因的克隆方法。

背景技术

毛竹(Phyllostachys edulis)属于禾本科竹亚科(Bambusadea)刚竹属，广泛分布于我国20多个省区，是我国种植面积最大、分布最广的笋材两用竹种。毛竹用途极为广泛，可作为建筑、农具、造纸、家具和工艺品的原料或材料，是重要经济作物。毛竹是单稔植物，终生开一次花，且属于全体成片开花的类型。毛竹开花具稀少性、随意性和不确定性等特点，即使在一个地区内，各片竹林或竹丛开花先后不一，持续时间相当长。毛竹开花后地下鞭系统腐烂，地上竹株成片枯死，带来巨大的经济损失和生态问题。长期以来，毛竹开花一直是竹类研究的难点和重点。

miRNA广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位(locus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300-1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即miRNA前体基因，长度大约为70-200个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24nt的成熟miRNA。在毛竹中存在大量的miRNA前体基因，长度分布从70-190碱基，其中miR4414b的长度较短，为81bp；miR319a长度较长，为153bp。miRNA是真核生物基因表达中的一类负调控因子，主要在转录后水平上通过介导靶基因mRNA的裂解或抑制翻译来调节植物基因的表达,参与调控植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌、信号转导以及对外界环境胁迫的应答能力等生物学过程。miRNAs在各种多细胞的生物发育过程中调控有关基因的表达。miRNA能通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。miRNA通常由独立的转录单位编码。然而，miRNA基因编码的一段长miRNA前体必须经过加工才能生成成熟的miRNA。随着科学研究的进一步深入，现在已经证明miRNA在植物生长发育、开花时间调控和花器官发育过程中也起着不可替代的作用。miRNA在植物内源激素信号转导、糖代谢、春化启动途径和光周期调控等开花途径所发挥的调控作用也受到越来越多的关注。之前研究发现miR319a能够控制拟南芥花器官的大小和形状，它的过量表达会使植物叶片偏上生长、叶片边缘锯齿化和开花期延迟等一系列多效表型；miR4414b也和植物花发育密切相关，它的过量表达会引起植物开花延迟。研究miRNA在毛竹花发育和开花调控过程中所发挥的潜在调控作用，揭示毛竹花发育的分子调控机制，这不仅为延缓和减少毛竹林的死亡提供理论依据，还将为农林作物抗逆遗传改良和分子育种奠定基础。

目前为止，未见在毛竹中克隆miRNA前体基因的相关报道。现有技术报道了拟南芥miRNA前体基因的克隆方法，参见文献(张芸等.拟南芥miR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化[J].南京农业大学学报,2010,33(2):25-29)，按照现有技术公开的克隆拟南芥miRNA前体基因的方法去克隆毛竹miRNA前体基因，克隆效果很不稳定，无法稳定地克隆出目的基因，并有引物二聚体现象。且克隆到目的基因时,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载体pMD18-T Vector连接,转化DH5α感受态细胞,在含有IPTG、X-gal和Amp的LB平板上挑选单克隆，摇菌后送菌液到生工生物公司测序后，发现有碱基错配的现象。

发明内容

本发明的目的在于提供毛竹miRNA前体基因的克隆方法，以克服现有技术中没有成功先例的缺陷。

本发明提供的毛竹microRNA前体基因的克隆方法，分别对毛竹microRNA前体基因的PCR扩增体系和PCR反应条件进行优化，通过减少引物用量、提高模板量，控制退火温度在66-68℃，循环次数为30-32次、以及改变琼脂糖凝胶电泳的胶浓度、电压和电泳时间，实现高效克隆毛竹microRNA前体基因。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供的毛竹microRNA前体基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取毛竹基因组DNA；以基因组DNA为模板，使用引物进行PCR；PCR扩增体系中，减少引物的用量，增加模板的用量；

(2)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，电泳时降低电压、延长电泳时间。

其中，步骤(1)中，当上、下游引物浓度为10μmol/L时，在20μL的PCR扩增体系中，上、下游引物的体积分别为0.7-0.8μL。

本发明经过反复实验研究发现，当扩增的毛竹microRNA前体基因＞100bp、上、下游引物的浓度为10μmol/L时，20μL的PCR扩增体系中，上、下游引物的体积均为0.8μL时，扩增效果最好，特异性条带最清晰、明亮，扩增产物含量最高。

当扩增的毛竹microRNA前体基因＜100bp、上、下游引物的浓度为10μmol/L时，20μL的PCR扩增体系中，上、下游引物的体积均为0.7μL时，扩增效果最好，特异性条带最清晰、明亮，扩增产物含量最高。

本发明方法中，当模板浓度为50ng/μL时，在20μL的PCR扩增体系中，模板用量为4μL。现有技术中，模板用量往往选择为50ng/μL时1-2μL，发明人通过对模板用量翻倍，发现扩增效果最佳，扩增产物含量最高，特异性条带清晰、明亮。

在本发明的一个实施例中，用于克隆＞100bp毛竹microRNA前体基因的PCR20μL体系为：

在本发明的一个实施例中，用于克隆＜100bp毛竹microRNA前体基因的PCR20μL体系为：

步骤(1)中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62-70℃退火30s，72℃延伸30s，28-36个循环；72℃延伸10min。

优选地，步骤(1)中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，66-68℃退火30s，72℃延伸30s，30-32个循环；72℃延伸10min。

当扩增的毛竹microRNA前体基因＞100bp时，PCR使用的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。

当扩增的毛竹microRNA前体基因＜100bp时，PCR使用的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示。

本发明方法中，步骤(2)的琼脂糖凝胶电泳的胶浓度为0.01-0.015g/mL。

优选地，琼脂糖凝胶的胶浓度为0.0125g/mL。

本发明方法中，步骤(2)的琼脂糖凝胶电泳时的电压为90-100V，琼脂糖凝胶电泳时间为26-29min。优选地，电压为100V，电泳时间为26min。

本领域技术人员可以理解，当获得毛竹microRNA前体基因后，可将该基因与载体连接，构建植物表达载体，用于转基因植物的培育，进而用于在农林作物抗逆遗传改良和分子育种。因此本发明克隆方法在毛竹遗传改良中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果至少体现在以下几方面：

1、引物是PCR特异性反应的关键。浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且可导致引物二聚体的形成。降低引物的量，能够有效地减少错配和引物二聚体的形成。

2、模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。提高模板量，能够增加目的基因的产物量，胶回收后可以获得较多的回收产物，模板的浓度为50ng/μL。

3、退火温度是影响PCR特异性的较重要因素，提高PCR反应的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。本发明在退火温度从60℃-70℃之间进行了梯度PCR实验，发现退火温度在66℃和68℃时效果最好，其它温度效果不好。循环次数决定PCR扩增程度，适当增加循环数，有利于扩增产物量的增加。循环次数从26个循环到36个循环均进行了实验，发现28-36个循环的效果较好，尤其以30到32个循环时效果最好。

4、琼脂糖凝胶电泳：目的基因的迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。目的基因电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于目的基因的大小。分离小片段的目的基因所需胶浓度是1.0-1.5％(即0.01-0.015g/mL)，本发明把凝胶浓度确定为到1.25％(即0.0125g/mL)时，扩增效果最好。在低电压下琼脂糖凝胶分离目的基因，分离效果较好。在低电压条件下，目的基因的电泳迁移率与所用的电压呈正比。降低电压，延长电泳时间，有利于充分跑胶，使目的基因与引物二聚体分开。

本发明通过优化miRNA前体基因克隆体系成功克隆到毛竹的miRNA前体基因，电泳结果显示只出现特异性扩增带，条带清晰、整齐，亮度较高，目的基因的产物量高，miR4414bPCR产物经胶回收和纯化后浓度能够达到55ng/uL，高于测序公司的测序要求。无引物二聚体现象，获得的前体基因序列与目的基因序列同源性高达100％。本发明方法获得的毛竹miRNA前体基因经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载体pMD18-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞,在含有IPTG、X-gal和Amp的LB平板上挑选单克隆，摇菌后送菌液到生工生物公司测序后，发现在前体基因的关键成熟序列区域无碱基错配现象。有利于进一步构建植物表达载体，转基因和进行功能验证。

附图说明

图1为本发明方法克隆的毛竹miR319a前体基因琼脂糖凝胶电泳图，M是Marker 1，在设计引物时分别在正向和反向引物中加入了酶切位点和保护碱基，酶切位点和保护碱基合计16bp，所以获得的目的基因全长为169bp。

图2为当琼脂糖凝胶浓度为0.01g/mL时、电泳电压120V和电泳时间25min条件下的毛竹miR4414b琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker 1。

图3为为本发明方法克隆的毛竹miR4414b前体基因琼脂糖凝胶电泳图，M是Marker1，在设计引物时分别在正向和反向引物中加入了酶切位点和保护碱基，酶切位点和保护碱基合计16bp，所以获得的目的基因全长为97bp。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 miR319a前体基因(153bp)的克隆

1、模板：提植物基因组DNA，以植物基因组DNA为模板。

上下游引物序列分别为：

miR319a Prime F：TAGGATCCCTTCAGTCCACTCTCAGATGGC(SEQ ID NO.1)

miR319a Prime R：CCAAGCTTCTTCAGTCCAACCACAAACAAC(SEQ ID NO.2)

2、20μL PCR体系为：

3、PCR反应条件：

94℃预变性5min；94℃30s，66℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

4、琼脂糖凝胶电泳：

(1)配制0.0125g/mL的琼脂糖凝胶。

(2)电泳电压100V，电泳时间26min。

结果见图1，扩增结果只出现1条特异性扩增带，条带清晰、整齐，亮度较高，大小同预期大小相符。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载体pMD18-T Vector连接,转化DH5α感受态细胞,在含有IPTG、X-gal和Amp的LB平板上挑选单克隆，摇菌后送菌液到生工生物公司测序，与毛竹miRNA目的基因的同源性是100％，在前体基因的关键成熟序列区域无碱基错配现象。PCR产物经胶回收和纯化后浓度高于测序公司的要求。

本实施例同时设立了对比试验1，退火温度在60-70℃之间选择11个梯度，即60℃、61℃、62℃……70℃，其他条件不改变，结果发现，只有在退火温度为66℃和68℃时，PCR反应的效果最好，条带最特异、明亮，回收测序后，与目的基因的同源性是100％，在前体基因的关键成熟序列区域无碱基错配现象。

本实施例同时设立了对比试验2，循环次数选择26-36次，即26、27……36共11个不同的循环次数，其他条件不改变，结果发现，只有在循环次数为30、31、32时，PCR反应的效果最好，条带最特异、明亮，目的基因的含量最高。

本实施例设立了对比试验3，PCR反应体系中，改变引物体积，上下游引物体积均为1.0μL，模板体积为2μL(相应地改变去核酸水的用量为11.0μL，其他试剂用量不改变)，结果发现，上述设置的PCR反应体系，其反应结果不如选择上下游引物体积为0.8μL，模板体积为4μL时的效果好，即前者的条带不明显，目的基因含量少。

本实施例设立了对比试验4，琼脂糖凝胶电泳配制0.01g/mL、0.012g/mL、0.0125g/mL、0.013g/mL、0.0135g/mL 0.015g/mL的琼脂糖凝胶，电泳电压分别选择100V、120V和150V，其他条件不改变。结果发现，只有当琼脂糖凝胶电泳的胶浓度为0.0125g/mL，电泳电压为100V时，PCR扩增效果最好。

实施例2mi4414b前体基因(81bp)的克隆方法

1、模板：提植物基因组DNA，以植物基因组DNA为模板。

上下游引物序列分别为：

mi4414b Prime F：TAGGATCCCTGCCGACTCATTCACCCAC(SEQ ID NO.3)

mi4414b Prime R：CGAAGCTTAACTTTACCTCCCGCTTCATTC(SEQ ID NO.4)

2、PCR体系：

20μL PCR体系为：

3、反应条件：

94℃预变性5min；94℃30s，68℃30s，72℃30s，32个循环；72℃延伸10min。

4、琼脂糖凝胶电泳：

(1)配制0.0125g/mL的琼脂糖凝胶。

(2)电泳电压90V,电泳时间29min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载体pMD18-T Vector连接,转化DH5α感受态细胞,在含有IPTG、X-gal和Amp的LB平板上挑选单克隆，摇菌后送菌液到生工生物公司测序，与毛竹miRNA目的基因的同源性是100％，在前体基因的关键成熟序列区域无碱基错配现象。PCR产物经胶回收和纯化后浓度能够达到55ng/uL，高于测序公司的测序要求。

本实施例设立1个对比试验，即琼脂糖凝胶的胶浓度为0.01g/mL、电泳电压120V和电泳时间25min，其他PCR反应的参数不改变。结果发现，对比试验的电泳扩增条带的亮度和清晰度均不如琼脂糖凝胶的胶浓度为0.0125g/mL、电泳电压90V和电泳时间29min的效果，且Marker也没能完全跑开。

miR319a和miR4414b与毛竹花发育密切相关，可能参与毛竹开花代谢调控网络，在毛竹开花调控和花发育中发挥重要的潜在调控作用，它们在毛竹中的过量表达可能会引起毛竹开花延迟，减少毛竹开花后成片死亡带来的经济和生态影响，具有重要的理论和实际意义。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.毛竹microRNA前体基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取毛竹基因组DNA；以基因组DNA为模板，使用如SEQ ID NO.1-2所示的引物或使用SEQ ID NO.3-4所示的引物进行PCR；

PCR扩增体系中，减少引物的用量，增加模板的用量；

其中，当上、下游引物浓度为10μmol/L时，在20μL的PCR扩增体系中，上、下游引物的体积分别为0.7-0.8μL；当模板浓度为50ng/μL时，在20μL的PCR扩增体系中，模板用量为4μL；

(2)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，电泳时降低电压、延长电泳时间；

其中，所述琼脂糖凝胶电泳的胶浓度为0.01-0.015g/mL；琼脂糖凝胶电泳时的电压为90-100V，琼脂糖凝胶电泳时间为26-29min。

2.如权利要求1所述的克隆方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62-70℃退火30s，72℃延伸30s，28-36个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的克隆方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，66-68℃退火30s，72℃延伸30s，30-32个循环；72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述的克隆方法，其特征在于，当扩增的毛竹microRNA前体基因＞100bp时，PCR使用的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。

5.如权利要求1所述的克隆方法，其特征在于，当扩增的毛竹microRNA前体基因＜100bp时，PCR使用的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示。

6.权利要求1-5任一所述的克隆方法在毛竹遗传改良中的应用。