JP2014511692A - 非特異的活性が低下したｐｃｒ反応混合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、核酸分子を、ポリメラーゼ-Sso7 DNA結合ドメインコンジュゲートおよびアルギニン、スペルミジン、またはスペルミンとともにインキュベートする段階を含む、核酸増幅の特異性を改善するための方法を提供する。本発明はまた、核酸増幅の特異性を改善するための反応混合物およびキットも提供する。

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は、2011年4月8日付で出願された米国仮特許出願第61/473,710号の優先権の恩典を主張し、この出願は参照により組み入れられる。
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような核酸増幅反応は一般に、標的核酸の別々の相補鎖を過剰の二種類のオリゴヌクレオチドプライマーで処理することによって所望の核酸配列が増幅される鋳型依存的な反応である。プライマーは伸長して相補的なプライマー伸長産物を形成し、これが所望の核酸配列を合成するための鋳型として働く。そのような過程で、各DNA鎖上のプライマー間の核酸配列が選択的に増幅される。しかしながら、核酸増幅反応の特異性は、いくつかの要因によって負の影響を受けうる。
本発明は、核酸分子を増幅する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、
(a)(i) 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー;
(ii) ポリメラーゼ; および
(iii) 遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
を含む、核酸増幅に十分な組成物中に、核酸を提供する段階、ならびに
(b) 該核酸を増幅するのに十分な条件の下で混合物をインキュベートし、それによって該核酸を、もし存在するなら、増幅させる段階
を含む。
いくつかの態様において、ポリメラーゼはDNA結合ドメインとコンジュゲートしている。いくつかの態様において、ポリメラーゼはSso7ドメインとコンジュゲートしている。
いくつかの態様において、作用物質は、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する。いくつかの態様において、作用物質は、遊離アルギニンまたはその塩である。いくつかの態様において、遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度は、約1 mM〜約500 mMである。
いくつかの態様において、ポリメラーゼは、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、Sso7ドメインは、SEQ ID NO:3に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの態様において、組成物は、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む。いくつかの態様において、緩衝液は、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される。
いくつかの態様において、本方法は、
(a)(i) 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー; および
(ii) 少なくとも20単位/反応の濃度で存在する、ポリメラーゼ
を含む、核酸増幅に十分な組成物を、核酸に提供する段階、ならびに
(b) 該核酸を増幅するのに十分な条件の下で該組成物中の該核酸をインキュベートし、それによって該核酸を増幅させる段階
を含む。
いくつかの態様において、組成物は、遊離アルギニンまたはその塩をさらに含む。いくつかの態様において、遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度は、約1 mM〜約500 mMである。
いくつかの態様において、ポリメラーゼはDNA結合ドメインとコンジュゲートしている。いくつかの態様において、ポリメラーゼはSso7ドメインとコンジュゲートしている。
いくつかの態様において、ポリメラーゼは、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、Sso7ドメインは、SEQ ID NO:3に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの態様において、組成物は、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む。いくつかの態様において、緩衝液は、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される。
別の局面において、本発明は、核酸分子を増幅するための反応混合物を提供する。いくつかの態様において、反応混合物は、
ポリメラーゼ; および
遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
を含む。
別の局面において、本発明は、核酸分子を増幅させるためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、
ポリメラーゼ; および
遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
を含む。
いくつかの態様において、ポリメラーゼはDNA結合ドメインとコンジュゲートしている。いくつかの態様において、ポリメラーゼはSso7ドメインとコンジュゲートしている。
いくつかの態様において、作用物質は、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する。いくつかの態様において、作用物質は、遊離アルギニンまたはその塩である。いくつかの態様において、遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度は、約1 mM〜約500 mMである。
いくつかの態様において、ポリメラーゼは、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、Sso7ドメインは、SEQ ID NO:3に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの態様において、反応混合物および/またはキットは、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む。いくつかの態様において、反応混合物および/またはキットは、緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、塩、安定剤、二本鎖DNA結合色素、およびヌクレアーゼ不含水からなる群より選択される少なくとも一つのメンバーをさらに含む。
いくつかの態様において、反応混合物は、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む。いくつかの態様において、緩衝液は、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される。
別の局面において、本発明は、標的核酸のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅におけるシグナル標準化のための反応混合物を提供し、該混合物は、(a) 標準化のために高濃度のパッシブリファレンス色素を利用するリアルタイムPCR増幅システムおよび(b) 標準化のために低濃度のパッシブリファレンス色素を利用するリアルタイムPCR増幅システムの両方での使用に適合しており、以下を含む：増幅反応とは無関係の蛍光シグナルを生成する複数のパッシブリファレンス色素; および20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液。
いくつかの態様において、緩衝液は、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される。
いくつかの態様において、反応混合物は、遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質をさらに含む。
いくつかの態様において、混合物は、
ストークスシフトを有し、低濃度のパッシブリファレンス色素による標準化で用いるのに十分な濃度であり、第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大および第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大を有する、第一のパッシブリファレンス色素; ならびに
第一のパッシブリファレンス色素のストークスシフトよりも大きいストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大とほぼ同じ発光波長極大、および第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大とは顕著に異なる励起波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素
を含む。
いくつかの態様において、第二のパッシブリファレンス色素は少なくとも約60 nmのストークスシフトを有する。いくつかの態様において、第一のパッシブリファレンス色素は、5-カルボキシ-X-ローダミンおよび/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミンまたはそれらの類似体を含む。いくつかの態様において、第二のパッシブリファレンス色素は、550 nmまたはそれ以下の励起波長極大を有する。いくつかの態様において、5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/または6-カルボキシ-X-ローダミン色素の濃度は、100 nM未満である。
いくつかの態様において、反応混合物は、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 緩衝液、インターカレーティング色素、逆転写酵素、およびポリメラーゼをさらに含む。いくつかの態様において、反応混合物は、DNAポリメラーゼを含む。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、抗体と複合体化されている。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、化学的に不活性化されているが、しかし加熱によって活性化される。
いくつかの態様において、第二のパッシブ色素は蛍光ドットである。
いくつかの態様において、第二のパッシブリファレンス色素は一つの成分(moiety)とコンジュゲートしている。
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法も提供される。いくつかの態様において、本方法は、標的核酸を含む疑いのある生物学的サンプルをさらに含む上記の反応混合物を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う段階を含む。
上記の反応混合物を作製する方法も提供し、該方法は、複数のパッシブリファレンス色素を混合し、それによって該反応混合物を作出する段階を含む。
別の局面において、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行うためのキットが提供される。いくつかの態様において、キットは以下を含む：ストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大および第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大を有する、第一のパッシブリファレンス色素; 第一のパッシブリファレンス色素のストークスシフトよりも大きいストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大とほぼ同じ発光波長極大、および第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大とは顕著に異なる励起波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素; ならびに20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液。
いくつかの態様において、緩衝液は、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される。
いくつかの態様において、キットは、遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質をさらに含む。
いくつかの態様において、第二のパッシブリファレンス色素は少なくとも約60 nmのストークスシフトを有する。いくつかの態様において、第一のパッシブリファレンス色素は、5-カルボキシ-X-ローダミンおよび/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミンまたはそれらの類似体を含む。
いくつかの態様において、第一のパッシブリファレンス色素は5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素またはそれらの類似体を含み、かつ第二のパッシブリファレンス色素は、少なくとも60 nmのストークスシフトを有する蛍光色素であり、ここで、第二のパッシブリファレンス色素は約620 nmの発光波長極大を有する。
いくつかの態様において、混合物は、5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/または6-カルボキシ-X-ローダミン色素と;少なくとも約60 nmのストークスシフトを有し、約590 nmの発光波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素とを含む。
いくつかの態様において、キットは以下のうちの一つまたは複数をさらに含む: 一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 緩衝液、インターカレーティング色素、逆転写酵素、およびDNAポリメラーゼ。
いくつかの態様において、第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素は、キット内の異なる容器中に含有されている。いくつかの態様において、第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素は、キット内の同じ容器中に含有されている。
定義
「ポリメラーゼ」という用語は、ポリヌクレオチドの鋳型指向性合成を行う酵素をいう。この用語には、完全長ポリペプチド、およびポリメラーゼ活性を有するドメインの両方が包含される。パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)およびサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritime)から単離されたもしくはそれらに由来するDNAポリメラーゼ、またはその修飾型を含むが、これらに限定されない、DNAポリメラーゼが当業者に周知である。それらはDNA依存性ポリメラーゼ、および逆転写酵素などのRNA依存性ポリメラーゼの両方を含む。DNA依存性DNAポリメラーゼは少なくとも5つのファミリーが知られているが、ほとんどはファミリーA、BおよびCに分類される。異なるファミリー間には配列類似性はほとんどまたは全くない。ほとんどのファミリーAポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性および5'から3'方向のエキソヌクレアーゼ活性を含む複数の酵素機能を含みうる一本鎖タンパク質である。ファミリーBポリメラーゼは典型的には、ポリメラーゼ活性および3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を持つ単一の触媒ドメイン、ならびにアクセサリー因子を有する。ファミリーCポリメラーゼは典型的には、重合活性および3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を持つ多サブユニットタンパク質である。大腸菌(E. coli)では、3種類のDNAポリメラーゼ、つまりDNAポリメラーゼI (ファミリーA)、II (ファミリーB)およびIII (ファミリーC)が見つかっている。真核生物細胞では、3種類の異なるファミリーBポリメラーゼであるDNAポリメラーゼα、δおよびεが核複製に関与しており、ファミリーAポリメラーゼの1つであるポリメラーゼγがミトコンドリアDNAの複製に用いられる。他の種類のDNAポリメラーゼはファージポリメラーゼを含む。同様に、RNAポリメラーゼは典型的には、真核生物RNAポリメラーゼI、IIおよびIII、ならびに細菌RNAポリメラーゼのほかに、ファージおよびウイルスのポリメラーゼも含む。RNAポリメラーゼはDNA依存性でもRNA依存性でもありうる。いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列と同一または実質的に同一である(例えば、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有する)。
本明細書において用いられる「熱安定性ポリメラーゼ」は、DNAまたはRNAを鋳型として用いたヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単位の付加によるポリヌクレオチド合成を触媒し、かつ45℃超の温度で最適な活性を有する任意の酵素をいう。
本明細書において用いられる「Sso7様タンパク質」または「Sso7」という用語は、以下である核酸およびポリペプチド多型変種、対立遺伝子、変異体、ならびに種間相同体をいう：(1) SEQ ID NO:3のSso7配列に対し、好ましくは少なくとも約15、25、35、50個またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約60%超のアミノ酸配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する; (2) SEQ ID NO:3のアミノ酸配列およびその保存的に改変された変種を含む免疫原に対して作製された抗体、例えばポリクローナル抗体に結合する; (3) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、SEQ ID NO:3のアミノ酸をコードするSso7d核酸配列およびその保存的に改変された変種と特異的にハイブリダイズする; あるいは(4) SEQ ID NO:3をコードする核酸配列に対し、好ましくは少なくとも約50、100、150またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%超のまたはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。この用語には、全長Sso7ポリペプチド、および配列非特異的な二本鎖結合活性を有するポリペプチドの断片の両方が含まれる。Sso7様タンパク質は、Sac7d、Sac7e、Ssh7bおよびSto7eを含む。
「野生型Sso7」は、天然Sso7タンパク質をいう。いくつかの態様において、野生型Sso7は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する。「野生型Sso7様」は、天然Sso7様タンパク質、例えば、Sac7d、Sac7e、Ssh7bおよびSto7eをいう。
「ドメイン」は、その単位が定義された機能を持つような、ポリペプチド部分配列、完全ポリペプチド配列または複数のポリペプチド配列を含む、タンパク質またはタンパク質複合体の単位をいう。この機能は広く定義されるものと理解されており、これはリガンド結合、触媒活性であってもよく、またはタンパク質の構造に対して安定化効果をもたらしてもよい。
「DNA結合ドメイン」という用語は、配列非特異的にDNAに結合するタンパク質ドメインをいう。いくつかの態様において、DNA結合ドメインは、かなり高い親和性でDNAに結合するタンパク質ドメインであり、これに関して、同じヌクレオチド組成を持つが異なるヌクレオチド配列を持つ別の核酸よりも100倍を上回る親和性でこのタンパク質ドメインに結合する既知の核酸は存在しない。
本明細書において用いられる「ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート」という用語は、ポリメラーゼドメインまたはポリメラーゼドメインの触媒サブユニットと連結された少なくとも一つのSso7 DNA結合ドメインを含む修飾ポリメラーゼをいう。ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートは、複数のSso7 DNA結合ドメインを含んでもよい。
「連結する」とは、介在ドメインを伴うまたは伴わない組換え融合、インテインを介した融合、非共有性結合、およびジスルフィド結合を含む共有結合; 水素結合; 静電結合; ならびにコンフォメーション結合、例えば、抗体-抗原会合およびビオチン-アビジン会合を含むが、これらに限定されない、タンパク質ドメインを機能的に接続するための当技術分野において公知の任意の方法をいう。
「核酸増幅」または「増幅反応」という用語は、核酸の標的配列のコピーを増やすための任意のインビトロ手段をいう。そのような方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、DNAリガーゼ連鎖反応(米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)を参照のこと)、(LCR)、QβRNAレプリカーゼ、およびRNA転写に基づく(TASおよび3SRなどの)増幅反応、ならびに当業者に公知の他の方法を含むが、これらに限定されることはない。
「増幅すること」とは、反応構成要素の全てが完全である場合に、溶液を、ポリヌクレオチドの増幅を可能とするのに十分な条件に供することをいう。増幅反応の構成要素には、例えば、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチドなどが含まれる。増幅することという用語は、典型的には、標的核酸の「指数関数的」増加をいう。しかしながら、本明細書において用いられる増幅することとは、サイクル配列決定で得られるような、核酸の選択標的配列の数の直線的増加をいうこともできる。
「増幅反応混合物」または「増幅反応組成物」という用語は、標的核酸を増幅するために用いられるさまざまな試薬を含む水溶液をいう。これらには、酵素、水性緩衝液、塩、増幅プライマー、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸が含まれる。本明細書においてさらに論じられるように、増幅反応混合物は、効率および特異性を最適化するために安定剤および他の添加物をさらに含んでもよい。状況に応じて、混合物は完全または不完全な増幅反応混合物のいずれかであってよい。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、標的二本鎖DNAの特定のセグメントまたは部分配列が等比級数的に増幅される方法をいう。PCRは当業者に周知であり; 例えば、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号; ならびにPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990を参照されたい。例示的なPCR反応条件は、典型的には、2段階サイクルまたは3段階サイクルのいずれかを含む。2段階サイクルでは変性段階、その後にハイブリダイゼーション/伸長段階がある。3段階サイクルでは変性段階、その後にハイブリダイゼーション段階、その後に別個の伸長段階を含む。
「オリゴヌクレオチドプライマー」または「プライマー」は、標的核酸の配列にハイブリダイズし、核酸合成の開始点となるオリゴヌクレオチド配列をいう。プライマーは種々の長さのものであってよく、多くの場合、長さが50ヌクレオチド未満、例えば、長さが12〜30ヌクレオチドである。PCRで用いるプライマーの長さおよび配列は、当業者に公知の原理に基づいてデザインすることができる; 例えば、Innis et al., 前記を参照されたい。
「鋳型」は、プライマーハイブリダイゼーション部位によって挟まれた、増幅されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列をいう。したがって、「標的鋳型」は、5'プライマーおよび3'プライマーのハイブリダイゼーション部位によって挟まれた標的ポリヌクレオチド配列を含む。
核酸増幅に関して用いられる「特異性」という用語は、非特異的増幅産物と比べて特異的増幅産物を産生する核酸増幅反応の可能性をいう。「特異的増幅産物」は、正しく一致したプライマーと鋳型による増幅で産生されたポリヌクレオチド(すなわち、真の標的配列)をいう。「非特異的増幅産物」は、特異的増幅産物以外の、増幅反応の間に産生されたポリヌクレオチドをいう。
核酸増幅に関して用いられる「特異性の改善」または「特異性を改善する」という語句は、産生された非特異的増幅産物の量と比べて、核酸増幅で産生された特異的増幅産物の量の検出可能な増加をいう。増幅反応の特異性は、融解曲線分析またはゲル分析を含むがこれらに限定されない、任意の方法によって測定することができる。いくつかの態様において、増幅反応の特異性は、増幅特異性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)を含む反応混合物での増幅反応の非特異的産物と比べた特異的産物の相対収率(すなわち、非特異的産物の融解ピークの高さに対する特異的産物の融解ピークの高さにより測定される、収量の比率)が、作用物質を欠く反応混合物での非特異的産物と比べた特異的産物の相対収率よりも高い場合に、増加している。いくつかの態様において、増幅特異性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)は、増幅特異性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)が含まれていない反応と比べて、前記比率について少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、100%、2倍(200%)、2.5倍(250%)、3倍(300%)またはそれ以上の増加を示す。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖型または二本鎖型のいずれかのそれらの重合体をいうように本明細書において互換的に用いられる。この用語には、合成性、天然性および非天然性であって、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同じように代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは連結を含有する核酸が包含される。そのような類似体の例としては、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸(PNA)が挙げられる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体をいうように本明細書において互換的に用いられる。この用語は天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体ばかりでなく、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸重合体に当てはまる。
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をいう。天然アミノ酸とは遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびにヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンといった後に修飾されるアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムといった、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合しているα炭素を有する化合物をいう。そのような類似体は修飾されたR基(例えばノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体はアミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有する化合物をいうが、天然アミノ酸と類似の様式で機能する。
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB生化学命名法委員会の推奨する一般に知られている3文字記号または1文字記号によって言及することができる。同様に、ヌクレオチドは、一般に是認されている1文字表記によって言及することができる。
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸配列にも核酸配列にも当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変種とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列をいう。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは全て、アミノ酸のアラニンをコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的に改変された変種の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変化も表す。当業者は、核酸内の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を改変して、機能的に同一の分子を産生できることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化が、記述されている各配列において暗に意味されている。
アミノ酸配列に関して、コードされる配列内の単一アミノ酸またはほんの小数のアミノ酸を変化、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加が、その変化によって化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的に改変された変種」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換の表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを排除するものではない。
「プロモーター」という用語は、転写の開始場所から上流および/または下流に位置する領域または配列をいい、これは転写を開始するためのRNAポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関わる。
「ベクター」は、ポリヌクレオチド配列を細胞へ導入するためのDNA構築物である。ベクターは、例えば、転写および翻訳終結因子、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含むことができる。いくつかの態様において、ベクターは、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーター配列を有し、かつポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの、適当な宿主での発現をもたらすことが可能な、発現ベクターである。
「組換え」とは、ヒトにより操作されたポリヌクレオチドまたはヒトにより操作されたポリヌクレオチドのコピーもしくは相補体をいう。例えば、第二のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、発現カセットを含む単離核酸のヒトによる操作(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)またはCurrent Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記述されている方法による)の結果として第二のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含むことができる。別の例として、組換え発現カセットは、ポリヌクレオチドが、自然界に見られる可能性が極端に低くなるように組み合わされたポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、ヒトにより操作された制限部位またはプラスミドベクター配列は、第二のポリヌクレオチド由来のプロモーターに隣接していてもよく、またはそれとは離れていてもよい。当業者は、ポリヌクレオチドは多くの方法で操作されうること、および上記の例に限定されないことを認識するであろう。
二つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列についての文脈で「同一の」または「同一性」割合という用語は、同じものである二つまたはそれ以上の配列または部分配列をいう。配列は、指定のある場合には特定領域にわたって、または他に指定のない場合には参照配列の全体にわたって、比較ウィンドウ、すなわち以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いてもしくは手作業による整列および目視検査によって測定される指定領域にわたり、最大の対応関係が得られるように比較および整列を行ったときに、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定の割合(例えば、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性)を有するなら、それらの配列は互いに「実質的に同一」である。これらの定義はまた、被験配列の相補体にも当てはまる。
配列比較の場合、典型的には、ある配列が参照配列となり、これと被験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータが一般的に用いられ、または別のパラメータが指定されてもよい。次に、プログラムのパラメータに基づき、参照配列に対する被験配列の配列同一性または類似性の割合を配列比較アルゴリズムで計算する。
本明細書において用いられる「比較ウィンドウ」は、二つの配列を最適に整列させた後に、ある配列が同数の連続位置の参照配列と比較されうるような、連続位置、例えば20〜600個の連続位置、約50〜約200個の連続位置、または約100〜約150個の連続位置のセグメントに対する言及を含む。比較のための配列の整列の方法は当技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)により、NeedlemanおよびWunschの相同性整列アルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)により、PearsonおよびLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(例えば、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)により、または手作業による整列ならびに目視検査(例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照のこと)により行うことができる。
配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムは、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)およびAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)に記述されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは国立生物工学情報センター(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列を行った場合に何らかの正値の閾値スコアTと一致するまたはそれを満たす、長さWの短いワードを問い合わせ配列中で特定することにより、高スコア配列ペア(HSP)をまず初めに特定することを伴う。Tは隣接ワードスコア閾値といわれる(Altschul et al, 前記)。これらの初期の隣接ワードでのヒットは、それらを含む長いHSPを見いだすための検索を開始する源となる。ワードヒットは、累積整列スコアが増加されうる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向でのワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される: 累積整列スコアが、その最大達成値から量X低下した場合; 一つもしくは複数の負のスコアリング残基整列の蓄積に起因して、累積スコアがゼロ以下になる場合; またはいずれかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、TおよびXは、整列の感度および速度を決定する。BLASTプログラムはデフォルトとしてワード長(W) 11、BLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと)の整列(B) 50、期待値(E) 10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。
BLASTアルゴリズムは、二つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の指標の一つは最小合計確率(P(N))であり、これは二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間での一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合に、参照配列と類似していると見なされる。
「パッシブリファレンス色素」は、ポリメラーゼ連鎖反応の他の構成要素と相互作用しない蛍光色素またはドットをいう。例えば、パッシブリファレンス色素は、核酸の有無に基づいてそのシグナルを大幅に変えることはなく、かつPCR反応混合物においてまたはリアルタイム機器による別の色素の検出において別の色素とFRET相互作用の点で大幅に相互作用することがない。パッシブリファレンス色素は、核酸に連結されうるが、しかし多くの態様では、核酸に連結されない。パッシブリファレンス色素は、ストークスシフトを有し得、すなわち、その結果、励起波長極大と発光極大は異なる。
本明細書において用いられる「低」濃度のパッシブリファレンス色素(例えば、ROX(商標)などの5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)は、それ単独で低ROX濃度での増幅(例えば、qPCR)システムで用いるのに適した濃度のパッシブリファレンス色素(例えば、5-もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素または5-もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素類似体)である。低濃度の5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素用の機器(「標準化のために低濃度の5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素を利用するqPCR機器」)には、Applied Biosystems ABI 7500もしくはApplied Biosystems ViiA7またはStratagene MXシリーズリアルタイムPCRシステムが含まれるが、これらに限定されることはない。したがって、低濃度のパッシブリファレンス色素(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)は一般に、100 nM未満であり、例えば、1〜10 nM、10〜100 nMなどである。
本明細書において用いられる「高」濃度のパッシブリファレンス色素(例えば、ROX(商標)などの5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)は、高濃度の5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素での増幅(例えば、qPCR)システムで用いるのに適した濃度のパッシブリファレンス色素(例えば、ROX(商標)などの5-もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素または5-もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素類似体)である。高濃度の5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素用の機器(「標準化のために高濃度の5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素の使用を採用するqPCR機器」)には、Applied Biosystems ABI PRISM 7000、7700もしくは7900またはABI 7300 Real-Time PCR SystemsまたはABI GeneAmp 5700 Real-Time PCR Systemが含まれるが、これらに限定されることはない。したがって、高濃度のパッシブリファレンス色素(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)は一般に、100 nM超であり、例えば、100〜300 nM、300〜700 nMなどである。
「パッシブリファレンス色素発光波長極大とほぼ同じ発光波長極大」は、パッシブリファレンス色素の発光波長極大の、30 nm、および任意で、20、10、5、3または1 nm以内である発光波長極大をいう。
色素の励起波長についての文脈で「顕著に異なる」とは、ある色素が、顕著に異なる励起波長極大を持つ別の色素を励起せずに励起されうるほど十分に異なる波長をいう。いくつかの態様において、「顕著に異なる」とは、二つの色素が少なくとも10、20、30、40、50、60、70 nmまたはそれ以上離れた励起極大を有することを意味する。
発明の詳細な説明
I. 導入
本発明は、核酸増幅における核酸増幅の特異性の改善のための、および阻害物質に対する増幅反応混合物の耐性の増大のための方法および組成物を提供する。本発明者らは、驚いたことに、ポリメラーゼによる増幅反応にアルギニン一塩酸塩またはスペルミジン三塩酸塩もしくはスペルミン四塩酸塩などのポリアミン塩を加えることで、非特異的PCR産物の形成が低減されること、およびPCR阻害物質に対する増幅試薬の耐性が増強されることを見いだした。
したがって、一つの局面において、本発明は、核酸分子を増幅する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、(a) ポリメラーゼ(例えば、Sso7またはSso7様タンパク質を含むがこれらに限定されないDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、ポリメラーゼ)と、アルギニン(すなわち、ポリペプチドの一部ではない「遊離した」アルギニン)、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質とを含む、核酸増幅に十分な組成物を、核酸分子と混合する段階; ならびに(b) 核酸分子を増幅するのに十分な条件の下で該混合物をインキュベートする段階を含む。いくつかの態様において、作用物質は、非特異的産物と比べた特異的産物の相対収率における少なくとも10%の増加をもたらすのに十分な量で存在する。いくつかの態様において、ポリメラーゼ(例えば、ポリメラーゼ-DNA結合ドメインコンジュゲート、例えば、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート)は、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼドメイン、および/または非特異的増幅活性を低下させる一つもしくは複数の点突然変異を有するSso7ドメインを含む。
いくつかの態様において、本方法は、(a) ポリメラーゼ(例えば、Sso7またはSso7様タンパク質を含むがこれらに限定されないDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、ポリメラーゼ)を少なくとも20単位/mlの濃度で含む、核酸増幅に十分な組成物を、核酸分子と混合する段階; および(b) 核酸分子を増幅するのに十分な条件の下で該混合物をインキュベートする段階を含む。いくつかの態様において、本組成物は、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質をさらに含む。
別の局面において、本発明は、ポリメラーゼ(例えば、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート)を用いる核酸増幅反応を行うための反応混合物およびキットを提供する。いくつかの態様において、反応混合物またはキットは、ポリメラーゼ(例えば、Sso7またはSso7様タンパク質を含むがこれらに限定されないDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、ポリメラーゼ)と、アルギニン、スペルミジン、またはスペルミンを含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質とを含む。
さらに、特定の緩衝液がパッシブ(すなわち、非核酸相互作用性の)蛍光色素の貯蔵のための安定性を改善することを可能にすること、および増幅反応の特異性も改善することを発見した。HEPESおよびPOPSOがこれらの効果をもたらすという発見に基づくと、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する任意の緩衝液がパッシブ蛍光色素の安定性を改善するものと考えられる。この発見は、上記の特異性を改善する作用物質の発見とは別個のものであるが、特異性を改善する作用物質を、この特定のタイプの緩衝液を含む反応混合物中で、例えば反応混合物中で組み合わせることができる。
II. 核酸増幅の特異性を改善する作用物質
本発明は、標的核酸分子の増幅の前に増幅反応混合物に添加された場合に、核酸増幅の特異性を改善する作用物質を提供する。いくつかの態様において、作用物質は、遊離アルギニン(例えば、別のアミノ酸に連結されていない、L-アルギニンまたはD-アルギニン)、スペルミジン、およびスペルミンから選択される。いくつかの態様において、作用物質は、遊離アルギニンである。
いくつかの態様において、核酸増幅の特異性を改善する作用物質は、約1 mM〜約500 mMの濃度で増幅反応混合物中に存在する。いくつかの態様において、作用物質は、約1 mM〜約100 mM、約1 mM〜約75 mM、約1 mM〜約50 mM、約1 mM〜約25 mMまたは約5 mM〜約15 mMの濃度で存在する。
本発明のアルギニン、スペルミジン、および/またはスペルミン作用物質は、塩として提供されてもよい。適用可能な塩形態の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩(例えば、(+)-酒石酸塩、(-)-酒石酸塩またはラセミ混合物を含むその混合物)、コハク酸塩、および安息香酸塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に公知の方法によって調製されうる。ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩のような塩基付加塩、または類似の塩も含まれる。本発明の作用物質が比較的塩基性の官能基を含む場合、中性形態のそのような化合物を、そのままで、または適当な不活性溶媒中で、十分な量の所望の酸と接触させることにより、酸付加塩を得ることができる。許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸(monohydrogencarbonic)、リン酸、一水素リン酸(monohydrogenphosphoric)、二水素リン酸(dihydrogenphosphoric)、硫酸、一水素硫酸（monohydrogensulfuric）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来する塩、および酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような有機酸に由来する塩が挙げられる。いくつかの態様において、アルギニン、スペルミジン、および/またはスペルミンの塩は、一塩酸塩、二塩酸塩、三塩酸塩、または四塩酸塩である。
増幅反応の特異性は、例えば、融解曲線分析またはゲル分析を用いて測定することができる。いくつかの態様において、核酸増幅反応の特異性は、一方が、予想されるTmを持つ特異的産物であり、他方が、特異的産物のTmよりも低いまたは高いTmを持つ非特異的産物である、二つの産物の相対収率を比較することによって判定される。増幅特異性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)を含む反応混合物での増幅反応の非特異的産物と比べた特異的産物の相対収率(すなわち、非特異的産物の融解ピークの高さに対する特異的産物の融解ピークの高さにより測定される、収量の比率)は、作用物質を欠く反応混合物での非特異的産物と比べた特異的産物の相対収率よりも高い。いくつかの態様において、増幅特異性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)は、増幅特異性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)が含まれていない反応と比べて、前記比率について少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、100%、2倍(200%)、2.5倍(250%)、3倍(300%)またはそれ以上の増加を示す。
いくつかの態様において、増幅特異性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)はまた、増幅阻害物質に対する増幅反応混合物の耐性を改善する。阻害物質耐性は、異なる濃度の公知の阻害物質(例えば、チョコレート、血液、土壌、ミルク、または血清)の存在下または非存在下で増幅反応(例えば、qPCR)を行うことによって評価することができる。増幅阻害物質に対する反応混合物の耐性を改善する作用物質(例えば、アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩)を含む反応混合物は、作用物質を欠く反応混合物と比べて、高濃度の阻害物質の存在下で反応性能(例えば、増幅のCt値によって測定されるような)を維持する。
III. ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート
いくつかの態様において、本発明の核酸増幅方法では、DNA結合ドメインまたはタンパク質、例えば、Sso7またはSso7様ドメインとコンジュゲートしているポリメラーゼポリペプチドまたはドメインを利用する。そのようなポリメラーゼコンジュゲートは、処理能力の増大を示すことが知られている。例えば、米国特許出願第12/683,950号を参照されたく、この内容は、全ての目的のために、具体的には、ポリメラーゼ、ポリメラーゼコンジュゲート、ならびにそのようなポリメラーゼを作製および使用するための全ての方法に関連する全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼドメインまたはポリペプチドを含む。本明細書において用いられる「エキソヌクレアーゼ欠損」とは、ポリメラーゼが実質的に低減した(すなわち、野生型ポリメラーゼと比べて3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性の10%、5%もしくは1%未満の)エキソヌクレアーゼ活性を有するか、またはエキソヌクレアーゼ活性を有しないことを意味する。いくつかの態様において、ポリメラーゼコンジュゲートには、このエキソヌクレアーゼ欠損をもたらす、ポリメラーゼドメイン中の一つまたは複数の点突然変異が含まれる。
いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、Sso7 DNA結合ドメインまたはタンパク質を含む。Sso7またはSso7様DNA結合ドメインを含むポリメラーゼコンジュゲートは、Sso7様ドメインを欠くポリメラーゼと比べて核酸増幅での処理能力の増大および反応時間の低減を示す。本発明者らは、驚いたことに、Sso7 DNA結合ドメインにおける一つまたは複数の残基での点突然変異が、該点突然変異を欠くSso7 DNA結合ドメインを含むポリメラーゼと比べて非特異的PCR産物の形成を減らしうることを見いだした。したがって、いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、Sso7 DNA結合ドメインにおける一つまたは複数の点突然変異を含む。
いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、SEQ ID NO:31〜56のアミノ酸配列と実質的に同一である(例えば、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有する)。いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、SEQ ID NO:31〜56のアミノ酸配列を有する。
A. ポリメラーゼ
種々のポリメラーゼを、本発明のポリメラーゼとして、または本発明のポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートのポリメラーゼドメインの少なくとも一部分として用いることができる。DNA依存性DNAポリメラーゼは少なくとも5つのファミリーが知られているが、ほとんどはファミリーA、BおよびCに分類される。異なるファミリー間には配列類似性はほとんどまたは全くない。ほとんどのファミリーAポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性および5'から3'方向のエキソヌクレアーゼ活性を含む複数の酵素機能を含みうる一本鎖タンパク質である。ファミリーBポリメラーゼは典型的には、ポリメラーゼ活性および3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を持つ単一の触媒ドメイン、ならびにアクセサリー因子を有する。ファミリーCポリメラーゼは典型的には、重合活性および3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を持つ多サブユニットタンパク質である。大腸菌では、3種類のDNAポリメラーゼ、つまりDNAポリメラーゼI (ファミリーA)、II (ファミリーB)およびIII (ファミリーC)が見つかっている。真核生物細胞では、3種類の異なるファミリーBポリメラーゼであるDNAポリメラーゼα、δおよびεが核複製に関与しており、ファミリーAポリメラーゼの1つであるポリメラーゼγがミトコンドリアDNAの複製に用いられる。他の種類のDNAポリメラーゼはファージポリメラーゼを含む。これらのポリメラーゼのいずれか、これらのポリメラーゼの全部または一部の組み合わせ、およびこのようなポリメラーゼまたはその等価物の二つまたはそれ以上の間でのキメラまたはハイブリッドを用いて、本発明のポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼドメインの一部または全部を形成させることができる。
さらに、いくつかの態様において、非耐熱性ポリメラーゼが本発明によって用いられてもよい。例えば、変異(D355A、E357A)を持つ大腸菌DNAポリメラーゼIの大断片(Klenow) (Klenow断片)は3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を消失している。この酵素または等価な酵素を、増幅反応が高温で行われないような態様において用いることができる。
一つの例示的な態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートはPfuおよびDeep Ventのような、二つの親ポリメラーゼに由来するポリメラーゼドメインを有する。そのようなポリメラーゼは、例えば、米国特許出願公開第20040219558号; 同第20040214194号; 同第20040191825号; 同第20030162173号に記述されており、これらはそれぞれ、全ての目的のために、具体的には、ハイブリッドポリメラーゼに関連する全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、SEQ ID NO:1 (任意でSEQ ID NO:4のようなリンカーを含んでもよい)またはSEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:61と実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一である。
いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、変異を含んだポリメラーゼドメインを含み、この変異は、このようなポリメラーゼドメインを含む任意のハイブリッドポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を、そのような変異を有しないポリメラーゼドメインを含むハイブリッドポリメラーゼと比べて低減するか、または消失させる。種々の変異を天然のポリメラーゼドメインに導入して、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を除去または排除することができる。例えば、米国特許第6,015,668号; 同第5,939,301号および同第5,948,614号には、TmaおよびTne DNAポリメラーゼの3'から5'方向のエキソヌクレアーゼドメインにおける金属結合アスパラギン酸残基のアラニン残基への変異が記述されている。これらの変異は、これらの酵素の3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を検出可能なレベル未満にまで低減する。同様に、米国特許第5,882,904号には、サーモコッカス・バロッシ(Thermococcus barossi)における類似のアスパラギン酸からアラニンへの変異が記述されており、米国特許第5,489,523号には、パイロコッカス・ウォセイ(Pyrococcus wosei) DNAポリメラーゼの二重変異体D141A E143Aが教示されている。これらの変異ポリメラーゼのどちらも、検出可能な3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない。3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性をアッセイする方法は、当技術分野において周知である。例えば、Freemont et al., Proteins 1:66 (1986); Derbyshire et al., EMBO J. 16:17 (1991)およびDerbyshire et al., Methods in Enzymology 262:363 85 (1995)を参照されたい。上記の変異はあるポリメラーゼにおいてもともと特定されたものであるが、一般的にそのような変異を他のポリメラーゼに導入して、エキソヌクレアーゼ活性を低減または排除できることが理解されよう。
いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、SEQ ID NO:2におけるD141/E143位置に対応するポリメラーゼドメイン中の二重点突然変異(D141A/E143A)を含む。ポリメラーゼアミノ酸に関連して「に対応する」という語句は、参照ポリメラーゼアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO:2)における関心対象のアミノ酸(例えば、D141またはE143)と整列するアミノ酸をいう。それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389 3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 410 (1990)に記述されている、デフォルトパラメータでBLAST 2.2アルゴリズムを含む任意のBLASTを用いて配列比較を行うことができる。いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、SEQ ID NO:2 (任意でSEQ ID NO:4のようなリンカーを含んでもよい)またはSEQ ID NO:61のアミノ酸配列と実質的に同一である(例えば、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有する)ポリメラーゼポリペプチドまたはドメインを含む。
B. Sso7様タンパク質
Sso7dおよびSac7dは、それぞれ、超好熱古細菌スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)およびS.アシドカルダリウス(S. acidocaldarius)由来の小型の(約7 kDaのMW)塩基性染色体タンパク質である(例えば、Choli et al., Biochimica et Biophysica Acta 950:193-203, 1988; Baumann et al., Structural Biol. 1:808-819, 1994; およびGao et al, Nature Struc. Biol. 5:782-786, 1998を参照のこと)。これらのタンパク質は、配列非依存的にDNAに結合し、結合時に、ある条件の下でDNAのTmを40℃まで増大する(McAfee et al., Biochemistry 34:10063-10077, 1995)。Sso7タンパク質およびそれらの相同体は、典型的には、高温でゲノムDNAを安定化させることに関与すると考えられている。Sso7d、Sac7d、Sac7eおよび関連する配列(本明細書において「Sso7タンパク質」または「Sso7ドメイン」といわれる)は、当技術分野において公知である(例えば、UniProtデータベースアクセッション番号: P39476 (Sso7d); O59632 (Ssh7b); P13123 (Sac7d); P13125 (Sac7e); およびQ96X56 (Sto7e)を参照のこと)。
いくつかの態様において、Sso7ドメインまたはタンパク質は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する野生型(すなわち、天然) Sso7ドメインまたはタンパク質である。いくつかの態様において、Sso7またはSso7様ドメインまたはタンパク質は、Sso7 DNA結合ドメインにおける一つまたは複数の変異を作製することにより、野生型Sso7から改変される。
いくつかの態様において、Sso7またはSso7様ドメインは、SEQ ID NO:3のK28および/またはR43に対応する位置に天然アミノ酸からのアミノ酸変化を有する。そのような位置指定は、特許請求する分子それ自体におけるアミノ酸の番号を示すのではなく、特許請求する分子配列をSEQ ID NO:3と最大限に整列させたときの、特許請求する分子におけるその残基の存在位置を示すと理解すべきである。変種Sso7ドメインについての文脈で、Sso7様タンパク質配列との「対応」は、特定の配列(すなわち、SEQ ID NO:3)のアミノ酸位置番号に従って番号付けするという慣例と、さらには、SEQ ID NO:3との配列同一性の割合を最大化するようにSso7様タンパク質配列を整列させることとに基づく。整列は、手作業でまたは配列比較アルゴリズムを用いて(例えば、NCBI BLASTプログラムを初期設定パラメータで用いて)行うことができる(例えば、Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997を参照のこと)。対応する配列は、以下のようにまとめることができる。
Figure 2014511692
SEQ ID NO:3に対応するK28および/またはR43の位置で、いずれかのSso7 DNA結合タンパク質ドメインを置換することができる。したがって、例えば、いくつかの態様において、変種Sso7ポリペプチド配列は、例えば、SEQ ID NO:3、57、58、59、または60のいずれかと実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一であり、K28に対応するアミノ酸の位置にK以外のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、K28に対応するアミノ酸の位置には、セリン(S)、トレオニン(T)、シトシン(cytosine)(C)、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アルギニン(R)、バリン(V)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)が存在する。
いくつかの態様において、変種Sso7ポリペプチド配列は、例えば、SEQ ID NO:3、57、58、59、または60のいずれかと実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一であり、R43に対応するアミノ酸の位置にR以外のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、R43に対応するアミノ酸の位置には、アラニン(A)、シトシン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、またはプロリン(P)が存在する。
いくつかの態様において、変種Sso7ポリペプチド配列は、例えば、SEQ ID NO:3、57、58、59、または60のいずれかと実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一であり、K28に対応するアミノ酸の位置にK以外のアミノ酸を含み、かつR43に対応するアミノ酸の位置にR以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの態様において、位置K28のアミノ酸は、セリン(S)、トレオニン(T)、シトシン(C)、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)より選択され、かつ位置R43のアミノ酸は、アラニン(A)、シトシン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、またはプロリン(P)より選択される。
いくつかの態様において、Sso7ドメインまたはタンパク質は、SEQ ID NO:5〜30のいずれかのアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に同一である(例えば、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有する)。いくつかの態様において、Sso7ドメインまたはタンパク質は、SEQ ID NO:5〜30のいずれかのアミノ酸配列を有する。
C. ポリメラーゼへのSso7様タンパク質のコンジュゲート
本発明のポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートは概して、化学的方法および/または組換え方法を用いて、ポリメラーゼドメインをSso7またはSso7様DNA結合ドメインと連結することによって産生される。
DNA結合タンパク質をポリメラーゼドメインに連結する化学的方法は、例えば、Bioconjugate Techniques, Hermanson, Ed., Academic Press (1996)に記述されている。それらには、例えば、タンパク質化学の技術分野において周知の方法により、直接的にまたは連結化合物を通して、その二つのタンパク質を互いに連結させるための誘導体化が含まれる。例えば、一つの化学的コンジュゲーションの態様において、触媒ドメインとDNA結合ドメインとを連結する手段には、二つの成分間の分子間ジスルフィド結合の形成に最終的に寄与するヘテロ二官能性カップリング試薬が含まれる。本発明のためのこの能力において有用な他の種類のカップリング試薬は、例えば、米国特許第4,545,985号に記述されている。あるいは、分子間ジスルフィドは、天然に存在するか、または遺伝子操作によって挿入される、各成分におけるシステインの間で好都合に形成されてもよい。成分を連結する手段では、ヘテロ二官能性架橋試薬もしくは特定の低pH切断性架橋剤もしくは特定のプロテアーゼ切断性リンカー間のチオエーテル結合、または他の切断性もしくは非切断性化学結合を用いることもできる。
DNA結合ドメイン、例えばSso7とポリメラーゼドメインとを連結する方法は、標準的なペプチド合成化学または組換え手段によって別々に合成される成分の間で形成されるペプチジル結合を含むこともできる。コンジュゲートタンパク質それ自体が、全部または一部としてアミノ酸配列を合成するための化学的方法を用いて産生されてもよい。例えば、ペプチドは、例えば、アミノ酸が成長中のアミノ酸鎖に連続的に付加されるMerrifield固相合成法などの、固相技術によって合成することができる(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2146を参照のこと)。ポリペプチドの自動合成のための装置は、PE Corp. (Foster City, Calif)などの供給業者から市販されており、一般的に、製造業者の使用説明書に従って操作することができる。次いで、合成されたペプチドを樹脂から切断し、例えば、分取高性能液体クロマトグラフィーによって精製することができる(Creighton, Proteins Structures and Molecular Principles, 50-60 (1983)を参照のこと)。合成ポリペプチドの組成またはポリペプチドの部分断片の組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認することができる(例えば、エドマン分解手順; Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, pp. 34-49 (1983)を参照のこと)。
いくつかの態様において、DNA結合ドメインとポリメラーゼドメインは連結基を介して連結することができる。連結基は、例えば、スクシンイミジル-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)を含む、化学架橋剤であってよい。連結基は、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、または同様の連結基を含む、さらなるアミノ酸配列であってもよい。
いくつかの態様において、得られる融合タンパク質における各ポリペプチドのコード配列を、ペプチド結合を介して任意の順序で、そのアミノ末端またはカルボキシ末端に直接連結する。あるいは、アミノ酸リンカー配列を利用して、各ポリペプチドがその二次および三次構造に折り畳まれることを確実とするのに十分な距離だけ、第一ポリペプチド構成要素と第二ポリペプチド構成要素を分離してもよい。そのようなアミノ酸リンカー配列は、当技術分野において周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に組み込まれる。適当なペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づき選択することができる: (1) 可動性の拡張構造をとる能力; (2) 第一および第二ポリペプチド上で機能的エピトープと相互作用し得る二次構造をとることができないこと; および(3) ポリペプチドの機能的エピトープと反応する可能性のある疎水性残基または荷電残基を欠いていること。典型的なペプチドリンカー配列は、Gly、Ser、ValおよびThr残基を含む。Alaなどの、他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列に用いることができる。リンカーとして有用に利用されうるアミノ酸配列には、Maratea et al. (1985) Gene 40:39-46; Murphy et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262; 米国特許第4,935,233号および同第4,751,180号に開示されているものが含まれ、これらはそれぞれ、全ての目的のために、具体的には、リンカーに関連する全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。リンカー配列は一般に、長さが1〜約50アミノ酸、例えば、長さが3、4、6または10アミノ酸でありうるが、長さが100または200アミノ酸であってもよい。第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離しかつ立体障害を妨げるために使用されうる非必須N末端アミノ酸領域を有する場合には、リンカー配列が必要とされないこともある。いくつかの態様において、リンカー配列は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む。
他の化学的リンカーには、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えば、PEGなどが含まれる。例えば、ポリ(エチレングリコール)リンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alaから入手できる。これらのリンカーは、アミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ二官能性結合を任意で有していてもよい。
DNA結合ドメインとポリメラーゼドメインとを連結する他の方法には、陰性および陽性の尾部を発現することによるイオン結合、ならびに抗体およびストレプトアビジン-ビオチン相互作用を通じた間接的結合が含まれる。(例えば、Bioconjugate Techniques, 前記を参照のこと)。ドメインは、中間体相互作用配列を通じて連結することもできる。例えば、DNA結合ドメイン相互作用配列、すなわち、特定のDNA結合ドメイン(Sso7など)に結合する配列を、ポリメラーゼに連結することができる。次に、得られた融合タンパク質をDNA結合ドメインと非共有結合的に結合させて、DNA結合ドメイン-ポリメラーゼコンジュゲートを作出することができる。
D. ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートの産生
本発明のポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートは、当技術分野において公知の技法を用いて産生することができる。ポリメラーゼドメインおよび核酸結合ドメインを含むポリメラーゼを産生するための方法は、例えば、米国特許出願公開第2006/005174号; 同第2004/0219558号; 同第2004/0214194号; 同第2004/0191825号; 同第2004/0081963号; 同第2004/0002076号; 同第2003/0162173号; 同第2003/0148330号; 同第2003/0138830号; ならびに米国特許第6,627,424号および同第7,445,898号に記述されており、これらはそれぞれ、全ての目的のために、具体的には、ポリメラーゼ、ハイブリッド/キメラポリメラーゼ、ならびにこのようなポリメラーゼを作製および使用するための全ての方法に関連する全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ポリメラーゼまたはDNA結合ドメインをコードする核酸は、組換え遺伝学の分野における通常の技術を用いて得ることができる。本発明で役に立つ一般的方法を開示している基本テキストは、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)を含む。そのような核酸は、本明細書において、ならびにBerger、SambrookおよびAusubelのほか、Mullis et al., (1987) 米国特許第4,683,202号; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; および Barringer et al. (1990) Gene 89: 117において記述されているものなどのインビトロ増幅方法を通じて得ることもでき、これらはそれぞれ、全ての目的のために、具体的には、増幅方法に関連する全ての教示のために、その全体が参照により組み入れられる。
本発明のポリメラーゼに対して、その生物学的活性を減弱することなく修飾をさらに行えることを当業者は認識するであろう。クローニング、発現または融合タンパク質へのドメインの組み込みを容易にするためにいくらかの修飾を行うことができる。そのような修飾は当業者に周知であり、結合ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端において、例えば、開始部位を提供するようにアミノ末端に付加されるメチオニンを提供するために、または好都合に位置付けられた制限部位もしくは終止コドンもしくは精製配列を作り出すようにいずれかの末端に位置するさらなるアミノ酸(例えば、ポリHis)を提供するために、コドンを付加することが含まれる。
本発明のポリメラーゼは、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、糸状菌、ならびにCOS、CHO、およびHeLa細胞株および骨髄腫細胞株などのさまざまな高等真核細胞を含む、種々の宿主細胞において発現させることができる。微生物における遺伝子発現の技術は、例えば、Smith, Gene Expression in Recombinant Microorganisms (Bioprocess Technology, Vol. 22), Marcel Dekker, 1994に記述されている。発現のために有用である細菌の例としては、エシェリキア属(Escherichia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、アゾトバクター属(Azotobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、バシラス属(Bacillus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、シゲラ属(Shigella)、リゾビウム属(Rhizobia)、ビトレオシラ属(Vitreoscilla)、およびパラコッカス属(Paracoccus)が挙げられるが、これらに限定されることはない。発現宿主として有用である糸状菌には、例えば、以下の属が含まれる: アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ペニシリウム属(Penicillium)、セファロスポリウム属(Cephalosporium)、アクリャ属(Achlya)、ポドスポラ属(Podospora)、ムコール属(Mucor)、コクリオボルス属(Cochliobolus)、およびピリクラリア属(Pyricularia)。例えば、米国特許第5,679,543号およびStahl and Tudzynski, Eds., Molecular Biology in Filamentous Fungi, John Wiley & Sons, 1992を参照されたい。酵母における異種タンパク質の合成は、周知であり、文献に記述されている。Methods in Yeast Genetics, Sherman, F., et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)は、酵母において酵素を産生するために利用可能な種々の方法について記述している、よく認識された研究である。
当業者に周知である本発明のポリメラーゼポリペプチドを産生するための多くの発現システムが存在している。(例えば、Gene Expression Systems, Fernandex and Hoeffler, Eds. Academic Press, 1999; Sambrook and Russell, 前記; およびAusubel et al, 前記を参照のこと)。典型的には、変種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所望の宿主細胞において機能するプロモーターの制御下に配置する。多くの異なるプロモーターが利用可能であり、当業者に公知であり、特定の用途に依って、本発明の発現ベクターにて使用することができる。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性となる細胞に依る。リボソーム結合部位、転写終結部位などの他の発現制御配列が、任意で含まれてもよい。一つまたは複数のこれらの制御配列を含む構築物を「発現カセット」という。したがって、連結されたポリペプチドをコードする核酸を、所望の宿主細胞における高レベルの発現を目的に組み入れる。
多くの場合、特定の宿主細胞で用いるのに適した発現制御配列は、その細胞において発現される遺伝子をクローニングすることによって得られる。一般に使用される原核生物制御配列(リボソーム結合部位配列に加えて、任意でオペレーターを持ってもよい、転写開始のためのプロモーターを含むと本明細書において定義される)には、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プロモーターシステム(Change et al., Nature (1977) 198: 1056)、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057)、tacプロモーター(DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25)などの、一般に使用されるプロモーター、ならびにλ由来PLプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位(Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128)が含まれる。本発明にとって特定のプロモーターシステムが重要なわけではなく、原核生物において機能する任意の利用可能なプロモーターを用いることができる。標準的な細菌発現ベクターにはpBR322に基づくプラスミド、例えば、pBLUESCRIPT(商標)、pSKF、pET23Dなどのプラスミド、λファージ由来のベクター、ならびにGSTおよびLacZなどの融合発現システムが含まれる。エピトープタグ、例えばc-myc、HAタグ、6-Hisタグ(SEQ ID NO:62)、マルトース結合タンパク質、VSV-Gタグ、抗DYKDDDDK (SEQ ID NO:63)タグ、または多くが当業者に周知である任意のそのようなタグを組換えタンパク質に付加して、簡便な単離法を提供することもできる。
大腸菌以外の原核細胞での発現の場合、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要とされる。そのようなプロモーターは、その種からクローニングされた遺伝子から得ることができ、または異種プロモーターを使用することもできる。例えば、ハイブリッドtrp-lacプロモーターは、大腸菌に加えてバシルス属種においても機能する。これらのおよび他の適当な細菌プロモーターは当技術分野において周知であり、例えば、SambrookらおよびAusubelらに記述されている。本発明のタンパク質を発現させるための細菌発現システムは、例えば、大腸菌、バシルス属種およびサルモネラ属において利用可能である(Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983))。そのような発現システムのためのキットが市販されている。
哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現システムは当技術分野において周知であり、市販もされている。酵母では、ベクターには、酵母組み込みプラスミド(例えば、YIp5)および酵母複製プラスミド(YRpシリーズのプラスミド)ならびにpGPD-2が含まれる。真核生物ウイルス由来の調節要素を含む発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルスに由来するベクターで用いられる。他の例示的な真核生物ベクターには、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、およびCMVプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内での発現に効果的なことが示されている他のプロモーターの指令下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
本発明においては構成性プロモーターまたは調節性プロモーターのいずれを用いることもできる。調節性プロモーターは、その宿主細胞を、融合ポリペプチドの発現を誘導する前に高い密度に増殖させることができるため、好都合でありうる。場合によっては、異種タンパク質の高レベル発現により細胞増殖が遅くなる。誘導性プロモーターとは、遺伝子の発現を指令するプロモーターの一つであり、その発現レベルを、例えば、温度、pH、嫌気性または好気性条件、光、転写因子および化学物質などの環境的または発生的因子によって変化させることができる。
大腸菌および他の細菌宿主細胞の場合、誘導性プロモーターは当業者に公知である。これらには、例えば、lacプロモーター、バクテリオファージλPLプロモーター、ハイブリッドtrp-lacプロモーター(Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80: 21)およびバクテリオファージT7プロモーター(Studier et al. (1986) J. Mol. Biol.; Tabor et al. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1074-8)が含まれる。これらのプロモーターおよびその使用はまた、Sambrookら、前記に論じられている。
発現を増強するために翻訳カップリングを用いることができる。この戦略では、翻訳システムに固有の高発現遺伝子に由来する短い上流オープンリーディングフレームと、リボソーム結合部位とを用い、オープンリーディングフレームはプロモーターの下流に配置し、リボソーム結合部位の後に少数のアミノ酸コドンを介して終結コドンが続く。終結コドンの直前には別のリボソーム結合部位があり、終結コドンに続いて翻訳開始のための開始コドンが存在する。このシステムはRNA中の二次構造を解消し、効率的な翻訳開始を可能にする。Squires, et. al. (1988), J. Biol. Chem. 263: 16297-16302を参照されたい。
ポリヌクレオチド構築物の構築では一般に、細菌内で複製できるベクターの使用を必要とする。このようなベクターは当技術分野において一般的に用いられている。細菌からのプラスミドの精製に向けて多数のキットが市販されている(例えば、Pharmacia BiotechのEasyPrep(商標)、FlexiPrep(商標); StratageneのStrataClean(商標); およびQIAexpress(登録商標) Expression System, Qiagen)。次いで、単離かつ精製されたプラスミドをさらに操作して他のプラスミドを生成し、これを用いて細胞を形質転換することができる。
本発明のポリペプチドは細胞内で発現させることができ、または細胞から分泌させることができる。細胞内発現は高い収量をもたらすことが多い。必要に応じて、再折り畳み手順を行うことで、可溶性の活性融合ポリペプチドの量を増加させてもよい(例えば、Sambrook et al., 前記; Marston et al., Bio/Technology (1984) 2: 800; Schoner et al., Bio/Technology (1985) 3: 151を参照のこと)。本発明のポリペプチドは、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、ならびにCOS、CHOおよびHeLa細胞株および骨髄腫細胞株などのさまざまな高等真核細胞を含む、種々の宿主細胞において発現させることができる。宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または例えば酵母細胞、細菌細胞もしくは真菌細胞などの微生物であってよい。
発現されたら、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的手順に従ってポリペプチドを精製することができる(一般的にはR. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)を参照のこと)。少なくとも約90〜95%の均一性である実質的に純粋な組成物が好ましく、98〜99%またはそれ以上の均一性が最も好ましい。要望どおり、部分的にまたは均一に精製されたら、(例えば、抗体産生用の免疫原として)ポリペプチドを用いることができる。
本発明のポリペプチドの精製を容易にするために、ポリペプチドをコードする核酸に、親和性結合試薬が利用可能なエピトープまたは「タグ」のコード配列を含めることもできる。適当なエピトープの例としてはmycおよびV-5レポーター遺伝子が挙げられ; これらのエピトープを有する融合ポリペプチドの組換え産生に有用な発現ベクターが市販されている(例えば、Invitrogen (Carlsbad, CA)のベクターpcDNA3.1/Myc-HisおよびpcDNA3.1/V5-Hisは、哺乳動物細胞での発現に適している)。本発明の融合タンパク質にタグを付け加えるのに適したさらなる発現ベクター、および対応する検出システムは当業者に公知であり、いくつか市販されている(例えば「FLAG」(Kodak, Rochester N.Y.))。適当なタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合できるポリヒスチジン配列である。典型的には、6個の隣接するヒスチジンが用いられるが、6個よりも多いまたは少ないものも使用できる。ポリヒスチジンタグの結合成分となりうる適当な金属キレート親和性リガンドには、ニトリロ三酢酸(NTA)が含まれる(Hochuli, E. (1990) 「Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents」 In Genetic Engineering: Principles and Methods, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, N. Y.; Qiagen (Santa Clarita, CA)から市販されている)。
生物学的発現または精製の後に、ポリメラーゼコンジュゲートは、構成ポリペプチドの天然立体構造とは実質的に異なる立体構造を保有しうることを当業者は認識するであろう。この場合は、ポリペプチドを変性および還元し、それから、ポリペプチドを好ましい立体構造へ再び折り畳ませることが必要または望ましいことがある。タンパク質を還元および変性する方法、ならびに再折り畳みを誘導する方法は、当業者に周知である(Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem. 4: 581-585; およびBuchner et al. (1992) Anal. Biochem. 205: 263-270を参照のこと)。例えば、Debinskiらは、グアニジン-DTEにおける封入体タンパク質の変性および還元について記述している。その後、酸化型グルタチオンおよびL-アルギニンを含有する酸化還元緩衝液中でタンパク質は再び折り畳まれる。
IV. 増幅対照用の万能パッシブ色素
試薬をさらに添加せず（試験されるサンプル、いくつかの態様においては使用されるプライマーを除いて）とも、任意のタイプのリアルタイム機器またはリアルタイム増幅方法に使用することができる万能プレミックスが提供される。これまでは、定量的PCR (qPCR)に用いられるさまざまなタイプの増幅機器および方法には、標準化のためのパッシブリファレンス色素として高濃度か低濃度かのいずれかの5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素が採用されており、したがって、qPCRに用いられるプレミックスは、高濃度または低濃度の5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素を含んでいたことから、「万能」ではなかった。高濃度の5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素用の機器を、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素が低濃度であるプレミックスで用いたいなら、さらなる5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素をプレミックスに加えなければならず、それによってさらなる段階および潜在的な誤差導入を加えるものであった。しかし、いずれの試薬も添加せず（試験サンプルそれ自体および任意でプライマーを除いて）とも、どちらの機器にも単一のミックスを使用できることが最近になって発見された(PCT/US2011/065617参照)。具体的には、増幅混合物は、低濃度の第一のパッシブリファレンス色素(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)のほかに長いストークスシフトを持つ蛍光色素(「第二のパッシブリファレンス色素」)を含む。長いストークスシフトを持つ蛍光色素は、その色素が第一のパッシブリファレンス色素の波長とは顕著に異なる波長で励起される(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素は、およそ575 nmで励起極大を有する)が、第一のパッシブリファレンス色素と実質的に同じ発光波長極大を有する(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素は、およそ620 nmの発光波長極大を有する)ように選択される。混合物中、長いストークスシフトを持つ蛍光色素と第一のパッシブリファレンス色素(これは5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素でありうるが、これらに限定されることはない)との組み合わせシグナルが、高濃度パッシブリファレンス色素用リアルタイム増幅機器で用いるのに十分であり、例えば、その後にデータを標準化するのに十分でありうるように、長いストークスシフトを持つ蛍光色素の濃度が決定される。低濃度パッシブリファレンス色素用リアルタイム増幅機器にて用いられる場合、長いストークスシフトを持つ蛍光色素は、パッシブリファレンス色素(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン)のチャネルでは励起されず、したがって、そのチャネルではさらにシグナルを生じることがないため、パッシブリファレンス色素による標準化のために検出/使用することができる。プレミックス中に存在する低濃度のパッシブリファレンス色素によって生成されるシグナルが、代わりに標準化に用いられる。結果として、このプレミックスは「高濃度パッシブリファレンス色素」用機器および「低濃度パッシブリファレンス色素」用機器のどちらでも使用することができる。
今回、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液POPSOは、パッシブ蛍光色素を安定化するのに有用な緩衝液であることが発見された。例えば、POPSOは、長いストークスシフトを持つ蛍光色素である色素DY-510XL (Dyomics, Jena, Germany)に対して低い温度および高い温度の両方で最良の安定性をもたらすことが認められ、かつその他の緩衝液Hepes、TAPS、Bicine、およびTrisは、その順で安定性を低下させていくことが認められた。したがって、低濃度の第一のパッシブリファレンス色素(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)のほかに長いストークスシフトを持つ蛍光色素、および(0.1 Mの濃度で測定した場合に)20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有する緩衝液を含む反応混合物が提供される。20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有する緩衝液は、公知である。異なる温度での緩衝液のpH変化は、例えば、20℃および37℃で緩衝液のpKaを測定し、かつpKa値の差を℃差数(17℃)で割って判定することにより、決定することができる。(0.1 Mの濃度で測定した場合に)1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有する例示的な緩衝液には、HEPES ((4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸))、ACES (N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸)、PIPES (ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)、MOPSO (3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、BES (N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸)、MOPS (3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、TES (N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸)、TAPSO (3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、POPSO (ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸))、BICINE (N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)、TAPS (N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸)、およびAMPSO (N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)が含まれるが、これらに限定されることはない。
20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有する緩衝液が、長いストークスシフトを持つ蛍光色素に特に適した環境を促進するという発見は、アルギニンおよび他の作用物質がPCR特異性を改善するという発見とは別である。しかしながら、万能対照としての複数の色素の使用には、増幅反応混合物での用途があるので、いくつかの態様において、反応混合物は、遊離アルギニン、スペルミジン、またはスペルミンを含むがこれらに限定されない核酸増幅の特異性を改善する作用物質を、増幅特異性を改善するための量で、さらに含む。
V. 増幅方法
本明細書において記述されるように、本発明は、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートと、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミンより選択される作用物質とを含む、核酸増幅反応で用いるための組成物を提供する。そのような増幅反応には非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、DNAリガーゼ連鎖反応(LCR)、QベータRNAレプリカーゼ、およびRNA転写に基づく(TASおよび3SRなどの)増幅反応、ならびに当業者に公知の他の方法が含まれる。本明細書において記述される組成物を用いて行うことができるポリメラーゼ連鎖反応には非限定的に、逆転写PCR (rt-PCR)および定量的PCR (qPCR)が含まれる。
ポリメラーゼ(例えば、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート)と、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミンより選択される作用物質とを用いる本発明の増幅方法は、核酸分子を増幅するのに十分である反応混合物を用いて行われる。いくつかの態様において、増幅反応混合物は、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートおよびアルギニン、スペルミジンまたはスペルミンに加えて、以下の構成要素のうちの一つまたは複数を含む: ヌクレオチド三リン酸、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、塩、緩衝液、水、安定剤およびDNA結合色素。
いくつかの態様において、本発明の増幅反応混合物は約1 U/ml〜約75 U/ml (例えば、約1 U/ml、5 U/ml、10 U/ml、15 U/ml、20 U/ml、25 U/ml、30 U/ml、35 U/ml、40 U/ml、45 U/ml、50 U/ml、55 U/ml、60 U/ml、65 U/ml、70 U/mlまたは75 U/ml)の濃度の本明細書において記述されるポリメラーゼ(例えば、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート); 約1 mM〜約100 mM (例えば、約 1 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30mM、35 mM、40 mM、45 mM、50 mM、55 mM、60 mM、65 mM、70 mM、75 mM、80 mM、85 mM、90 mM、95 mMまたは100 mM)の濃度のアルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩; 約0.1 mM〜約10 mM (例えば、約0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mMまたは10 mM)の濃度のdNTP; 約1 mM〜約20 mM (例えば、約1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mMまたは20 mM)の濃度のマグネシウム、例えば、MgCl2; 約10 mM〜約100 mM (例えば、約10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mMまたは100 mM)の濃度の(NH4)2SO4; 約50 mM〜約200 mM (例えば、約50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mMまたは200 mM)の濃度のカリウム、例えば、KCl; 約50 mM〜約200 mM (例えば、約50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mMまたは200 mM)の濃度の緩衝液、例えば、Tris pH 8.5〜9.5または約5 mM〜約200 mM (例えば、約5 mM、10 mM、25 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mMまたは200 mM)の濃度の、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液; 約100 mM〜約500 mM (例えば、約100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mMまたは500 mM)の濃度の二糖類、例えば、トレハロース; 約50 mM〜約200 mM (例えば、約50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mMまたは200 mM)の濃度の、一種または複数種の浸透圧調節物質、例えば、サルコシン、トリメチルアミンN-オキシド(TMAO)、ジメチルスルホニオプロピオネートおよびトリメチルグリシン; 約0.1%〜約0.5% (例えば、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%または0.5%)の濃度のTween-20; 約1%〜約10% (例えば、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%)の濃度のグリセロール; 約1%〜約10% (例えば、約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%または10%)の濃度のDMSO; 約0.001%〜約0.01% (例えば、約0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%または0.01%)の濃度のフルオレセイン; ならびに約0.5×〜約5×(例えば、約0.5×、0.6×、0.7×、0.8×、0.9×、1×、1.5×、2×、2.5×、3×、3.5×、4×、4.5×または5×)の濃度のDNA結合色素(例えば、シアニン色素)を含む。
増幅反応にPOPSOを含めることで、増幅特異性を改善できることが発見されたが、この発見に基づけば、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有するいずれの緩衝液(例えば、POPSO)も同じ効果を有するものと考えられる。したがって、上記の反応混合物は、例えば、HEPES ((4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸))、ACES (N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸)、PIPES (ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)、MOPSO (3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、BES (N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸)、MOPS (3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、TES (N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸)、TAPSO (3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、POPSO (ピペラジン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸))、BICINE (N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)、TAPS (N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸)、またはAMPSO (N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)を含むことができる。
さらに、不利な作用を伴うポリメラーゼ量の増大を用いる方法が発見された。これまで、当業者は、高濃度のポリメラーゼから生じうる非特異的結合の有害作用のせいで、ポリメラーゼを約20 U/ml超の濃度で増幅反応混合物に加えることはなかった。驚いたことに、本発明者らは、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩より選択される作用物質の添加が、高濃度のポリメラーゼにおいてもポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートの特異性を増大することを見いだした。したがって、いくつかの態様において、本発明の反応混合物は、約1 mM〜約100 mMの濃度の、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩より選択される作用物質、ならびに50 U/ml超、55 U/ml超、60 U/ml超、65 U/ml超、70 U/ml超、または75 U/ml超の濃度のポリメラーゼ-Sso7コンジュゲートを含む。
本発明の特定の局面による効率および特異性の改善は、当技術分野において知られているアッセイ法および以下でさらに詳細に記述されるアッセイ法を用いて特定および定量することができる。
いくつかの態様において、色素に基づくqPCR検出法を用いて、本発明の構成要素を利用した増幅反応をモニタリングする。そのような検出法は一般に、増幅されたDNAとDNA結合色素との結合による蛍光シグナルの増加をモニタリングすることに依る。例えば、よく使われる蛍光DNA結合色素SYBR Green Iは、全ての二本鎖DNAに結合するので、全増幅サイクルを通じて蛍光の増加を測定することにより検出をモニタリングする。SYBR Green Iは、それぞれ、494 nmおよび521 nmの励起極大および発光極大を有する。
他の態様において、プローブに基づくqPCR検出法を用いて、本発明の構成要素を利用した増幅反応をモニタリングする。そのような検出法は一般に、所望のPCR産物の配列特異的な検出に依る。全ての二本鎖DNAを検出する色素に基づくqPCR法とは異なり、プローブに基づくqPCRでは蛍光標識された標的特異的プローブを利用し、これによって、増幅されたDNAにおける特異的配列が検出される。
効率を改善するための添加物
特定の局面において、qPCRを含むがこれに限定されない増幅反応における効率を改善するための添加物としてさらなる化合物を含めることが望ましいこともある。いくつかの態様において、添加物を含めることは、添加物を欠く対照混合物と比べて少なくとも5、10、15、20、25、35、40もしくは50%またはそれ以上ポリメラーゼコンジュゲートの効率を高めるのに十分である。
いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、特定の結合色素(例えば、EvaGreen DNA結合色素など)を含む調合物において用いられる場合、特定の標的に対して低い効率を示す。このような低い効率はいくつかの態様において、低濃度の投入DNAと関連するCt値の遅延をもたらすこともある。特定の反応の効率を測定するための方法は、当技術分野において公知であり、以下でさらに詳細に記述される。
いくつかの態様において、添加物は、効率を改善するために本発明の増幅反応に含まれる浸透圧調節物質である。浸透圧調節物質群のメンバーは、タンパク質の熱安定性を改善すること(Santoro, Biochemistry, 1992)、およびDNA二重らせん安定性を低下させること(Chadalavada, FEBS Letters, 1997)が示されている。いくつかの態様において、浸透圧調節物質は、極端な温度、脱水または塩分濃度のような環境ストレスに応答して生物により産生される、および、その細胞構成要素を保護し、最適な細胞質の状態を維持するために役立つ、小分子または化合物である。本発明で役に立つ浸透圧調節物質は非限定的に、サルコシン、トリメチルアミンN-オキシド(TMAO)、ジメチルスルホニオプロピオン酸、およびトリメチルグリシンを含むことができる。サルコシンは、従来のPCRを改善することが示されている化学物質ベタインと化学的に類似している(Henke, Nucleic Acids Research, 1997)。
浸透圧調節物質の従来の用途において、このような化合物の安定化効果は一般的に、比較的高い濃度(> 1 M)で認められている。しかしながら、本発明の方法において、ミリモル濃度の浸透圧調節物質は、qPCRのような増幅反応の反応効率を改善するのに有効であることが分かっている。作用機序によって束縛されるわけではないが、効率の改善は、低濃度の投入DNAサンプルを含有する反応物の鋳型DNAの標的領域へのDNAポリメラーゼの接近可能性を改善することの結果である可能性がある。いくつかの態様において、約100〜約1000 mM濃度の浸透圧調節物質が本発明の方法およびキットにおいて用いられる。さらなる態様において、約50〜約700 mM、約100〜約600 mM、約150〜約500 mM、約200〜約400 mMおよび約300〜約350 mM濃度の浸透圧調節物質が本発明の方法およびキットにおいて用いられる。いくつかの態様において、本発明の方法、反応混合物およびキットにおいて用いられる浸透圧調節物質は、サルコシン(任意で上記の濃度の)である。
VI. 反応混合物
別の局面において、本発明は、ポリメラーゼ(例えば、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート)と、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質とを含む反応混合物を提供し、作用物質は、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩より選択される。反応混合物は、標的核酸を含む生物学的サンプル、一種もしくは複数種のオリゴヌクレオチド、緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、塩、安定剤、効率を改善するための一種もしくは複数種の添加物、ヌクレアーゼ不含水、および/または二本鎖DNA結合色素を任意で含んでもよい。いくつかの態様において、反応混合物は、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有する緩衝液(例えば、POPSO)を含む。いくつかの態様において、反応混合物は、低濃度の第一のパッシブリファレンス色素(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)のほかに長いストークスシフトを持つ蛍光色素を含む。
いくつかの態様において、本発明の反応混合物は、約1 U/ml〜約40 U/mlの濃度のポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート、ならびに約1 mM〜約100 mMの濃度の、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩より選択される作用物質を含む。いくつかの態様において、本発明の反応混合物は、約5 U/ml〜約40 U/mlの濃度のポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート、ならびに約1 mM〜約50 mMの濃度の、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩より選択される作用物質を含む。いくつかの態様において、本発明の反応混合物は、約10 U/ml〜約50 U/mlの濃度のポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート、ならびに約3 mM〜約30 mMの濃度の、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩より選択される作用物質を含む。
VII. キット
別の局面において、本発明は、核酸増幅反応を行うためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、ポリメラーゼ(例えば、ポリメラーゼ-Sso7コンジュゲート)と、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質とを含み、作用物質は、アルギニン、スペルミジン、およびスペルミン、またはそれらの塩より選択される。いくつかの態様において、本発明のキットは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2と同一または実質的に同一であるポリメラーゼドメインを有するポリメラーゼコンジュゲートを含む。いくつかの態様において、本発明のキットは、SEQ ID NO:3または5〜30のいずれかと同一または実質的に同一であるSso7ドメインを含むポリメラーゼコンジュゲートを含む。いくつかの態様において、本発明のキットは、SEQ ID NO:31〜56のいずれかと同一または実質的に同一であるポリメラーゼコンジュゲートを含む。
任意で、キットは、一種もしくは複数種のdNTP、少なくとも一種類の緩衝液(例えば、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有する緩衝液(例えば、POPSO))、および/または二本鎖DNA結合色素を含んでもよい。いくつかの態様において、キットは、低濃度の第一のパッシブリファレンス色素(例えば、5-または6-カルボキシ-X-ローダミン色素)のほかに長いストークスシフトを持つ蛍光色素を含む。そのようなキットは、安定剤および増幅反応の効率を高めるための他の添加物(例えば、サルコシン)を含んでもよい。そのようなキットは、一つまたは複数のプライマーと、キットの構成要素を用いて核酸増幅反応を行うための使用説明書とを含んでもよい。
以下の実施例は、特許請求する発明を例証することを意図するが、これに限定されることはない。
実施例1
ポリメラーゼドメインについてはSEQ ID NO:2に基づき、かつSso7dドメインとしてはSEQ ID NO:3に基づき、一連のSso7d-ポリメラーゼコンジュゲートを作出した。Sso7dドメインは位置番号28 (野生型K)または43 (野生型R)で変異させた。得られたコンジュゲートは、鋳型DNA分子を増幅させることにより、および得られた産物を融解温度分析を用いてSYBR GREENで検出することにより試験した。HeLa細胞由来のcDNA 1 ngを鋳型として用い、二段階PCRを行って18sアンプリコン(18s68)を増幅させた。各増幅サイクルにおいて95℃で5秒の変性段階、その後に61℃で30秒のアニール・伸長段階を伴う常用の2段階PCRプロトコルを用い、Bio-Rad CFX96 qPCR機器にてqPCRを行った。40サイクルのPCR増幅を行い、その後、各段階ごとに5秒の保持を伴う0.5℃の温度増分により融解曲線分析を行った。融解曲線分析は、温度(Tm)の増加とともに二本鎖DNA(dsDNA)から一本鎖DNA (ssDNA)に移行する際の、その解離(融解)挙動に基づいてdsDNAを特徴付ける技法であり、その融解曲線分析を用いてPCR特異性を評価した。概して、融解曲線分析の前にPCRによって標的配列を増幅させた。PCR産物の融解は、ヌクレオチド配列、長さ、GC含量および鎖相補性に従って、特定の融解温度の単一のピークを与える。それゆえ、単一の融解ピークは、一つの特異的PCR産物を示す。複数のピークは、特異的産物に加えて非特異的産物の存在を示す。
野生型コンジュゲートはかなりの非特異的産物を生じた(すなわち融解曲線分析において二本のピーク)が、K28に対応する位置でのいくつかの置換は、活性の改善、すなわち、非特異的ポリメラーゼ活性の低減をもたらした。R28がS、T、C、P、D、E、N、またはQのいずれかに変えられた変異体は、R28野生型と比べて改善した活性(特異性)を有していた。R28MおよびR28Rは、野生型よりも有意に良好というわけではなかった。試験したK28変種Sso7d-ポリメラーゼコンジュゲートには、SEQ ID NO:31〜38に記載の配列を有するものが含まれた。
次に、R43変種Sso7d-ポリメラーゼコンジュゲートに対するPCR特異性を評価するために、HeLa細胞由来のcDNA 1 ngを鋳型として用いて上記と同じ条件の下で二段階PCRを行って、β-アクチンアンプリコン(ActB86)を増幅させた。いくつかの置換は、非特異的ポリメラーゼ活性の低下をもたらした。例えば、R43がG、A、S、T、C、V、L、I、M、F、Y、D、E、N、Q、H、K、またはWのいずれかに変えられた変異体は、R43野生型と比べて改善した活性(特異性)を有していた。R43Mには、ほんのわずかに非特異的なショルダーがあったが、それでもなお、R43Mは野生型と比べて有意に改善されていた。試験したR43変種Sso7-ポリメラーゼコンジュゲートには、SEQ ID NO:39〜56に記載の配列を有するものが含まれた。
さらに、非特異的なポリメラーゼ活性は、PCR反応混合物に試薬を加えることによっても低減されうることが発見された。HeLa細胞由来のcDNA 10 ng、1 ng、100 pgおよび10 pgを鋳型として用いてPCRを行い、18sアンプリコン(18s68)を増幅させた。各増幅サイクルにおいて98℃で5秒の変性段階、その後に60℃で30秒のアニール・伸長段階を伴う常用の2段階PCRプロトコルを用いてqPCRを行った。40サイクルのPCR増幅を実行し、その後、上記のように融解曲線分析を行った。L-アルギニン一塩酸塩(10 mM)、スペルミジン三塩酸塩(5 mM)、またはスペルミン四塩酸塩(5もしくは10 mM)を加えることで、試験したSso7d-ポリメラーゼコンジュゲート変種の非特異的活性がさらに低減された。これは、さまざまな鋳型濃度(10 ng〜10 pg)で10 mMのL-アルギニン一塩酸塩を含有する反応混合物を用いたqPCRの結果においてさらに実証された。遊離アルギニンを欠く対照と比べて、遊離アルギニンを含む対応する反応では、各鋳型濃度において、特異的な産物がより多く、非特異的な産物がかなり少なかった。
次に、qPCR試薬混合物の阻害物質耐性を増強するうえでのアルギニンの効果について試験した。増幅反応混合物には、約24 U/mlの終濃度の、変異Sso7dドメイン(SEQ ID NO:34)とコンジュゲートしているエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ(SEQ ID NO:2)およびポリメラーゼ阻害物質(一般的なPCR阻害物質である異なる二種類のチョコレート(EnlveonetまたはTanzanie)のうちの一種類)が含まれた。アルギニンは、一つのサンプルセットからは除かれ、もう一つのサンプルセットには10 mMの濃度で加えられた。qPCR反応におけるチョコレートの最終百分率濃度は、0〜2%に及んだ。HeLa細胞由来のcDNA 1 ngを鋳型として用いてPCRを行い、ADARアンプリコン(ADAR_162)を増幅させた。各増幅サイクルにおいて95℃で5秒の変性段階、その後に60℃で30秒のアニール・伸長段階を伴う常用の2段階PCRプロトコルを用いてqPCRを行った。40サイクルのPCR増幅を実行し、その後、上記のように融解曲線分析を行った。さまざまな濃度の阻害物質の存在下でのPCR増幅の成功(増幅によって反映され、Ct値によっても評価される)は、反応混合物がPCR阻害物質にどれくらい耐性であるかを示す。どちらのチョコレートの場合にも、より高い濃度の阻害物質の存在下で、アルギニンを欠く試薬混合物については、増幅または十分な増幅は認められなかった。対照的に、アルギニンを補充した試薬混合物は、2%阻害物質の存在下でさえも良好なPCR増幅を依然として示し、より高い阻害物質耐性を示唆するものであった。
実施例2
miRNAの検出での汎用qPCRスーパーミックスの特異性を改善する際のPOPSO緩衝液の効果について判定した。microRNA (miR223)および対照snoRNA (RNU48)の検出および定量化は、最初にmi/snoRNAをcDNAに変換し、これを次に、変異体Sso7dドメインを有しかつエキソヌクレアーゼ活性を有しないハイブリッド融合ポリメラーゼを用いてリアルタイムqPCRによって定量することにより、判定された。この実験では、プールされたヒト総RNA (Ambionから購入した)を、汎用のポリアデニル化および逆転写プロセスによって最初にcDNAに変換した。合成されたcDNAを次に鋳型とし、予めデザインされた標的特異的プライマー対と、Tris緩衝液またはPOPSO緩衝液のどちらかで構成されたqPCRスーパーミックス(qPCRスーパーミックスのその他の構成要素は同じものであった)とを用いて、mi/snoRNA検出および定量化を行った。miR233アッセイにおいて実証されたように、Trisに基づく調合物は、融解曲線分析の間に非特異的な増幅および複数のピークを生じた。対照的に、POPSOに基づく調合物は、きれいな単一の融解ピークを持つPCR産物を生じ、これは、特異的な増幅が行われたことを示す。特異性の改善以外に、POPSOに基づく調合物とTrisに基づく調合物との間には有意な性能差がなかった。どちらの調合物も、対照のアッセイRNU48 snoRNAにおいて同等のCq値およびきれいな融解ピークを示した。
本明細書において記述される実施例および態様は、例示的な目的のものでしかなく、かつそれらに照らしてさまざまな修正または変更が当業者に示唆されるはずであり、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲のなかに含まれるものと理解されよう。本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
非公式の配列表
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いくつかの態様において、第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素は、キット内の異なる容器中に含有されている。いくつかの態様において、第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素は、キット内の同じ容器中に含有されている。
[本発明1001]
(a)(i) 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー;
(ii) ポリメラーゼ; および
(iii) 遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
を含む、核酸増幅に十分な組成物中に、核酸を提供する段階、ならびに
(b) 該核酸を増幅するのに十分な条件の下で混合物をインキュベートし、それによって該核酸を増幅させる段階
を含む、核酸分子を増幅する方法。
[本発明1002]
ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
DNA結合ドメインがSso7ドメインである、本発明1002の方法。
[本発明1004]
作用物質が、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
作用物質が、遊離アルギニンまたはその塩である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度が、約1 mM〜約500 mMである、本発明1005の方法。
[本発明1007]
ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、本発明1001の方法。
[本発明1008]
ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、本発明1001の方法。
[本発明1009]
Sso7ドメインが、SEQ ID NO:3に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1003の方法。
[本発明1010]
組成物が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
(a)(i) 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー; および
(ii) 少なくとも20単位/反応の濃度で存在する、ポリメラーゼ
を含む、核酸増幅に十分な組成物を、核酸に提供する段階、ならびに
(b) 該核酸を増幅するのに十分な条件の下で該組成物中の該核酸をインキュベートし、それによって該核酸を増幅させる段階
を含む、核酸を増幅する方法。
[本発明1013]
ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、本発明1012の方法。
[本発明1014]
DNA結合ドメインがSso7ドメインである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
組成物が、遊離アルギニンまたはその塩をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1016]
遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度が、約1 mM〜約500 mMである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、本発明1012の方法。
[本発明1018]
ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、本発明1012の方法。
[本発明1019]
Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1014の方法。
[本発明1020]
組成物が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む、本発明1012の方法。
[本発明1021]
緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
ポリメラーゼ; および
遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
を含む、反応混合物。
[本発明1023]
ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、本発明1022の反応混合物。
[本発明1024]
DNA結合ドメインがSso7ドメインである、本発明1023の反応混合物。
[本発明1025]
作用物質が、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する、本発明1022の反応混合物。
[本発明1026]
作用物質が、遊離アルギニンまたはその塩である、本発明1022の反応混合物。
[本発明1027]
遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度が、約1 mM〜約500 mMである、本発明1026の反応混合物。
[本発明1028]
ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、本発明1022の反応混合物。
[本発明1029]
ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、本発明1022の反応混合物。
[本発明1030]
Sso7ドメインがSEQ ID NO:2に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1024の反応混合物。
[本発明1031]
一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、本発明1022の反応混合物。
[本発明1032]
緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、塩、安定剤、二本鎖DNA結合色素、およびヌクレアーゼ不含水からなる群より選択される少なくとも一つのメンバーをさらに含む、本発明1022の反応混合物。
[本発明1033]
反応混合物が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む、本発明1022の方法。
[本発明1034]
緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
ポリメラーゼ; および
遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
を含む、キット。
[本発明1036]
ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、本発明1035のキット。
[本発明1037]
DNA結合ドメインがSso7ドメインである、本発明1036のキット。
[本発明1038]
作用物質が、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する、本発明1035のキット。
[本発明1039]
作用物質がアルギニンである、本発明1035のキット。
[本発明1040]
遊離アルギニンの濃度が、約1 mM〜約500 mMである、本発明1039のキット。
[本発明1041]
ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、本発明1035のキット。
[本発明1042]
ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、本発明1035のキット。
[本発明1043]
Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1037のキット。
[本発明1044]
一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、本発明1035のキット。
[本発明1045]
緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、塩、安定剤、二本鎖DNA結合色素、およびヌクレアーゼ不含水からなる群より選択される少なくとも一つのメンバーをさらに含む、本発明1035のキット。
[本発明1046]
ポリメラーゼおよび作用物質が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む溶液中にある、本発明1035のキット。
[本発明1047]
緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、本発明1046の方法。
[本発明1048]
(a) 標準化のために高濃度のパッシブリファレンス色素を利用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅システムおよび(b) 標準化のために低濃度のパッシブリファレンス色素を利用するリアルタイムPCR増幅システムの両方での使用に適合しており、以下を含む、標的核酸のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅におけるシグナル標準化のための反応混合物：
増幅反応とは無関係の蛍光シグナルを生成する複数のパッシブリファレンス色素; および
20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液。
[本発明1049]
緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、本発明1048の混合物。
[本発明1050]
遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
をさらに含む、本発明1048の混合物。
[本発明1051]
ストークスシフトを有し、低濃度のパッシブリファレンス色素による標準化で用いるのに十分な濃度であり、第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大および第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大を有する、第一のパッシブリファレンス色素; ならびに
第一のパッシブリファレンス色素のストークスシフトよりも大きいストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大とほぼ同じ発光波長極大、および第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大とは顕著に異なる励起波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素
を含む、本発明1048の混合物。
[本発明1052]
第二のパッシブリファレンス色素が少なくとも約60 nmのストークスシフトを有する、本発明1051の混合物。
[本発明1053]
第一のパッシブリファレンス色素が、5-カルボキシ-X-ローダミンおよび/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミンまたはそれらの類似体を含む、本発明1051の混合物。
[本発明1054]
第二のパッシブリファレンス色素が、550 nmまたはそれ以下の励起波長極大を有する、本発明1051の混合物。
[本発明1055]
5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/または6-カルボキシ-X-ローダミン色素の濃度が、100 nM未満である、本発明1051の混合物。
[本発明1056]
一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 緩衝液、インターカレーティング色素、逆転写酵素、およびポリメラーゼをさらに含む、本発明1051の混合物。
[本発明1057]
DNAポリメラーゼを含む、本発明1056の混合物。
[本発明1058]
ポリメラーゼが、抗体と複合体化されている、本発明1057の混合物。
[本発明1059]
ポリメラーゼが、化学的に不活性化されているが、しかし加熱によって活性化される、本発明1057の混合物。
[本発明1060]
第二のパッシブ色素が蛍光ドットである、本発明1051の混合物。
[本発明1061]
第二のパッシブリファレンス色素が一つの成分(moiety)とコンジュゲートしている、本発明1051の混合物。
[本発明1062]
標的核酸を含む疑いのある生物学的サンプルをさらに含む本発明1051の混合物を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う段階
を含む、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法。
[本発明1063]
複数のパッシブリファレンス色素を混合し、それによって反応混合物を作出する段階
を含む、本発明1051の反応混合物を作製する方法。
[本発明1064]
ストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大および第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大を有する、第一のパッシブリファレンス色素;
第一のパッシブリファレンス色素のストークスシフトよりも大きいストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大とほぼ同じ発光波長極大、および第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大とは顕著に異なる励起波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素; ならびに
20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液
を含む、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行うためのキット。
[本発明1065]
緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、本発明1064のキット。
[本発明1066]
遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
をさらに含む、本発明1064のキット。
[本発明1067]
第二のパッシブリファレンス色素が少なくとも約60 nmのストークスシフトを有する、本発明1064のキット。
[本発明1068]
第一のパッシブリファレンス色素が、5-カルボキシ-X-ローダミンおよび/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミンまたはそれらの類似体を含む、本発明1064のキット。
[本発明1069]
第一のパッシブリファレンス色素が、5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素またはそれらの類似体を含み、かつ
第二のパッシブリファレンス色素が、少なくとも60 nmのストークスシフトを有する蛍光色素であり、約620 nmの発光波長極大を有する、
本発明1064のキット。
[本発明1070]
混合物が、
5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素; ならびに
少なくとも約60 nmのストークスシフトを有し、約590 nmの発光波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素
を含む、
本発明1064のキット。
[本発明1071]
以下のうちの一つまたは複数をさらに含む、本発明1064のキット:
一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 緩衝液、インターカレーティング色素、逆転写酵素、およびDNAポリメラーゼ。
[本発明1072]
第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素が、キット内の異なる容器中に含有されている、本発明1064のキット。
[本発明1073]
第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素が、キット内の同じ容器中に含有されている、本発明1064のキット。
SEQ ID NO:3に対応するK28および/またはR43の位置で、いずれかのSso7 DNA結合タンパク質ドメインを置換することができる。したがって、例えば、いくつかの態様において、変種Sso7ポリペプチド配列は、例えば、SEQ ID NO:3、57、58、59、または60のいずれかと実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一であり、K28に対応するアミノ酸の位置にK以外のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、K28に対応するアミノ酸の位置には、セリン(S)、トレオニン(T)、システイン(C)、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アルギニン(R)、バリン(V)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)が存在する。
いくつかの態様において、変種Sso7ポリペプチド配列は、例えば、SEQ ID NO:3、57、58、59、または60のいずれかと実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一であり、R43に対応するアミノ酸の位置にR以外のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、R43に対応するアミノ酸の位置には、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、またはプロリン(P)が存在する。
いくつかの態様において、変種Sso7ポリペプチド配列は、例えば、SEQ ID NO:3、57、58、59、または60のいずれかと実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一であり、K28に対応するアミノ酸の位置にK以外のアミノ酸を含み、かつR43に対応するアミノ酸の位置にR以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの態様において、位置K28のアミノ酸は、セリン(S)、トレオニン(T)、システイン(C)、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)より選択され、かつ位置R43のアミノ酸は、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、またはプロリン(P)より選択される。

Claims (73)

  1. (a)(i) 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー;
    (ii) ポリメラーゼ; および
    (iii) 遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
    を含む、核酸増幅に十分な組成物中に、核酸を提供する段階、ならびに
    (b) 該核酸を増幅するのに十分な条件の下で混合物をインキュベートし、それによって該核酸を増幅させる段階
    を含む、核酸分子を増幅する方法。
  2. ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、請求項1記載の方法。
  3. DNA結合ドメインがSso7ドメインである、請求項2記載の方法。
  4. 作用物質が、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する、請求項1記載の方法。
  5. 作用物質が、遊離アルギニンまたはその塩である、請求項1記載の方法。
  6. 遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度が、約1 mM〜約500 mMである、請求項5記載の方法。
  7. ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項1記載の方法。
  8. ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の方法。
  9. Sso7ドメインが、SEQ ID NO:3に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項3記載の方法。
  10. 組成物が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む、請求項1記載の方法。
  11. 緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
  12. (a)(i) 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー; および
    (ii) 少なくとも20単位/反応の濃度で存在する、ポリメラーゼ
    を含む、核酸増幅に十分な組成物を、核酸に提供する段階、ならびに
    (b) 該核酸を増幅するのに十分な条件の下で該組成物中の該核酸をインキュベートし、それによって該核酸を増幅させる段階
    を含む、核酸を増幅する方法。
  13. ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、請求項12記載の方法。
  14. DNA結合ドメインがSso7ドメインである、請求項13記載の方法。
  15. 組成物が、遊離アルギニンまたはその塩をさらに含む、請求項12記載の方法。
  16. 遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度が、約1 mM〜約500 mMである、請求項15記載の方法。
  17. ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項12記載の方法。
  18. ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、請求項12記載の方法。
  19. Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項14記載の方法。
  20. 組成物が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む、請求項12記載の方法。
  21. 緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
  22. ポリメラーゼ; および
    遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
    を含む、反応混合物。
  23. ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、請求項22記載の反応混合物。
  24. DNA結合ドメインがSso7ドメインである、請求項23記載の反応混合物。
  25. 作用物質が、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する、請求項22記載の反応混合物。
  26. 作用物質が、遊離アルギニンまたはその塩である、請求項22記載の反応混合物。
  27. 遊離アルギニンまたは遊離アルギニン塩の濃度が、約1 mM〜約500 mMである、請求項26記載の反応混合物。
  28. ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項22記載の反応混合物。
  29. ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、請求項22記載の反応混合物。
  30. Sso7ドメインがSEQ ID NO:2に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項24記載の反応混合物。
  31. 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項22記載の反応混合物。
  32. 緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、塩、安定剤、二本鎖DNA結合色素、およびヌクレアーゼ不含水からなる群より選択される少なくとも一つのメンバーをさらに含む、請求項22記載の反応混合物。
  33. 反応混合物が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む、請求項22記載の方法。
  34. 緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、請求項33記載の方法。
  35. ポリメラーゼ; および
    遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
    を含む、キット。
  36. ポリメラーゼがDNA結合ドメインとコンジュゲートしている、請求項35記載のキット。
  37. DNA結合ドメインがSso7ドメインである、請求項36記載のキット。
  38. 作用物質が、非特異的な増幅産物と比べた特異的な増幅産物の相対収率を少なくとも10%増加させるのに十分な量で存在する、請求項35記載のキット。
  39. 作用物質がアルギニンである、請求項35記載のキット。
  40. 遊離アルギニンの濃度が、約1 mM〜約500 mMである、請求項39記載のキット。
  41. ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項35記載のキット。
  42. ポリメラーゼが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、請求項35記載のキット。
  43. Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2に対する少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項37記載のキット。
  44. 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項35記載のキット。
  45. 緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、塩、安定剤、二本鎖DNA結合色素、およびヌクレアーゼ不含水からなる群より選択される少なくとも一つのメンバーをさらに含む、請求項35記載のキット。
  46. ポリメラーゼおよび作用物質が、20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液を含む溶液中にある、請求項35記載のキット。
  47. 緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、請求項46記載の方法。
  48. (a) 標準化のために高濃度のパッシブリファレンス色素を利用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅システムおよび(b) 標準化のために低濃度のパッシブリファレンス色素を利用するリアルタイムPCR増幅システムの両方での使用に適合しており、以下を含む、標的核酸のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅におけるシグナル標準化のための反応混合物：
    増幅反応とは無関係の蛍光シグナルを生成する複数のパッシブリファレンス色素; および
    20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液。
  49. 緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、請求項48記載の混合物。
  50. 遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
    をさらに含む、請求項48記載の混合物。
  51. ストークスシフトを有し、低濃度のパッシブリファレンス色素による標準化で用いるのに十分な濃度であり、第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大および第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大を有する、第一のパッシブリファレンス色素; ならびに
    第一のパッシブリファレンス色素のストークスシフトよりも大きいストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大とほぼ同じ発光波長極大、および第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大とは顕著に異なる励起波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素
    を含む、請求項48記載の混合物。
  52. 第二のパッシブリファレンス色素が少なくとも約60 nmのストークスシフトを有する、請求項51記載の混合物。
  53. 第一のパッシブリファレンス色素が、5-カルボキシ-X-ローダミンおよび/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミンまたはそれらの類似体を含む、請求項51記載の混合物。
  54. 第二のパッシブリファレンス色素が、550 nmまたはそれ以下の励起波長極大を有する、請求項51記載の混合物。
  55. 5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/または6-カルボキシ-X-ローダミン色素の濃度が、100 nM未満である、請求項51記載の混合物。
  56. 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 緩衝液、インターカレーティング色素、逆転写酵素、およびポリメラーゼをさらに含む、請求項51記載の混合物。
  57. DNAポリメラーゼを含む、請求項56記載の混合物。
  58. ポリメラーゼが、抗体と複合体化されている、請求項57記載の混合物。
  59. ポリメラーゼが、化学的に不活性化されているが、しかし加熱によって活性化される、請求項57記載の混合物。
  60. 第二のパッシブ色素が蛍光ドットである、請求項51記載の混合物。
  61. 第二のパッシブリファレンス色素が一つの成分(moiety)とコンジュゲートしている、請求項51記載の混合物。
  62. 標的核酸を含む疑いのある生物学的サンプルをさらに含む請求項51記載の混合物を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う段階
    を含む、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法。
  63. 複数のパッシブリファレンス色素を混合し、それによって反応混合物を作出する段階
    を含む、請求項51記載の反応混合物を作製する方法。
  64. ストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大および第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大を有する、第一のパッシブリファレンス色素;
    第一のパッシブリファレンス色素のストークスシフトよりも大きいストークスシフトを有し、第一のパッシブリファレンス色素発光波長極大とほぼ同じ発光波長極大、および第一のパッシブリファレンス色素励起波長極大とは顕著に異なる励起波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素; ならびに
    20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を(0.1 Mの濃度で測定した場合に)有する緩衝液
    を含む、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行うためのキット。
  65. 緩衝液が、HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS、およびAMPSOからなる群より選択される、請求項64記載のキット。
  66. 遊離アルギニン、スペルミジン、もしくはスペルミン、またはそれらの塩を含む、核酸増幅の特異性を改善するのに十分な量の作用物質
    をさらに含む、請求項64記載のキット。
  67. 第二のパッシブリファレンス色素が少なくとも約60 nmのストークスシフトを有する、請求項64記載のキット。
  68. 第一のパッシブリファレンス色素が、5-カルボキシ-X-ローダミンおよび/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミンまたはそれらの類似体を含む、請求項64記載のキット。
  69. 第一のパッシブリファレンス色素が、5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素またはそれらの類似体を含み、かつ
    第二のパッシブリファレンス色素が、少なくとも60 nmのストークスシフトを有する蛍光色素であり、約620 nmの発光波長極大を有する、
    請求項64記載のキット。
  70. 混合物が、
    5-カルボキシ-X-ローダミン色素および/もしくは6-カルボキシ-X-ローダミン色素; ならびに
    少なくとも約60 nmのストークスシフトを有し、約590 nmの発光波長極大を有する、第二のパッシブリファレンス色素
    を含む、
    請求項64記載のキット。
  71. 以下のうちの一つまたは複数をさらに含む、請求項64記載のキット:
    一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一種または複数種のデオキシヌクレオシド三リン酸; 緩衝液、インターカレーティング色素、逆転写酵素、およびDNAポリメラーゼ。
  72. 第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素が、キット内の異なる容器中に含有されている、請求項64記載のキット。
  73. 第一のパッシブリファレンス色素および第二のパッシブリファレンス色素が、キット内の同じ容器中に含有されている、請求項64記載のキット。
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