JP2022546040A - Ｐｃｓｋ９を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本願で提供されるのは、特に、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡ組成物、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する方法、およびＰＣＳＫ９遺伝子発現と関連する１種またはそれ以上の疾患を処置する方法である。

Description

本開示は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）を標的とするｄｓＲＮＡ組成物、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する方法、およびＰＣＳＫ９遺伝子発現と関連する１種またはそれ以上の疾患を処置する方法に関する。
配列表の提出
本明細書では、参照としての役割を果たす核酸配列が開示されている。同一の配列はまた、特許事項の目的のための標準要件に従ってフォーマットされた配列表にも示されている。任意の配列が標準配列表と異なる場合には、本明細書で説明されている配列を参照すべきである。
ＰＣＳＫ９は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリのメンバーである。他の８種の哺乳動物サブチリシンプロテアーゼＰＣＳＫ１～８は、分泌経路で多種多様なタンパク質を処理するプロタンパク質変換酵素であり、多様な生物学的プロセスで役割を果たす。ＰＣＳＫ９は、コレステロール代謝で役割を果たすことが提案されている。ＰＣＳＫ９メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現は、マウスでは食事性コレステロールの摂取により下方制御されており（非特許文献１）、ＨｅｐＧ２細胞ではスタチンにより上方制御されており（非特許文献２）、ステロール制御因子結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）トランスジェニックマウスでは上方制御されており（非特許文献３）、コレステロール生合成酵素および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と類似している。さらに、ＰＣＳＫ９ミスセンス変異は、常染色体優生高コレステロール血症の一種と関連していることが判明している（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。ＰＣＳＫ９は、一般集団では低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルの決定でも役割を果たし得、なぜならば、日本人集団では、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）がコレステロールレベルと関連しているからである（非特許文献７）。
常染色体優生高コレステロール血症（ＡＤＨ）は、患者が総コレステロールレベルおよびＬＤＬコレステロールレベルの上昇、腱黄色腫、ならびに早期粥状動脈硬化を示す単一遺伝子疾患である（非特許文献８）。ＡＤＨおよび劣勢型の常染色体劣勢高コレステロール血症（ＡＲＨ）（非特許文献９）の発病は、肝臓によるＬＤＬ取り込みの欠損に起因する。ＡＤＨは、ＬＤＬ取り込みを防ぐＬＤＬＲ変異により引き起こされるか、またはＬＤＬＲに結合する、ＬＤＬ上のタンパク質であるアポリポタンパク質Ｂの変異により引き起こされる。ＡＲＨは、クラスリンとの相互作用を介したＬＤＬＲ－ＬＤＬ複合体のエンドサイトーシスに必要な低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）タンパク質の変異により引き起こされる。
過剰発現の研究から、ＬＤＬＲレベル（従って肝臓によるＬＤＬ取り込み）の制御におけるＰＣＳＫ９の役割が示されている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。マウスにおけるマウスＰＣＳＫ９またはヒトＰＣＳＫ９のアデノウイルス媒介過剰発現により、総コレステロールレベルおよびＬＤＬコレステロールレベルが上昇し、この効果は、ＬＤＬＲノックアウト動物では見られない（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。加えて、ＰＣＳＫ９過剰発現により、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡレベル、ＳＲＥＢＰタンパク質レベル、またはＳＲＥＢＰタンパク質の核対細胞質比が影響を受けることなく、肝臓ＬＤＬＲタンパク質が著しく減少する。
ＰＣＳＫ９での機能喪失変異は、マウスモデルで設計されており（非特許文献１３）、ヒト個体で同定されている（非特許文献１４）。両方の場合でも、ＰＣＳＫ９機能の喪失により、総ＬＤＬコレステロールが低下する（ＬＤＬ－Ｃ）。ＰＣＳＫ９遺伝子の配列バリエーションと関連する血漿ＬＤＬ－Ｃの生涯にわたる減少の効果が研究されており、データは、ＬＤＬ－Ｃの血漿レベルの適度な生涯にわたる減少が、冠動脈イベントの発生の相当な減少と関連しており、冠動脈心疾患に対する予防をもたらすことを示した（非特許文献１５）。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知の高度に保存された制御機序における遺伝子発現をブロックすることが知られている。特許文献１では、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における遺伝子の発現を阻害するための少なくとも２５個のヌクレオチドの長さのｄｓＲＮＡの使用が開示されていた。ｄｓＲＮＡはまた、植物（例えば、特許文献２、特許文献３を参照されたい）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（例えば、非特許文献１６を参照されたい）、および哺乳動物（例えば、特許文献４を参照されたい）等の他の生物においても標的ＲＮＡを分解することが示されている。この天然の機序は、現在、遺伝子の異常なまたは望まれていない制御により引き起こされる障害を処置するための新規のクラスの医薬品の開発の焦点となっている。
国際公開第９９／３２６１９号パンフレット 国際公開第９９／５３０５０号パンフレット 国際公開第９９／６１６３１号パンフレット 国際公開第００／４４８９５号パンフレット
Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００３）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４，２１０９～２１１９頁 Ｄｕｂｏｃ，Ｇ．（２００４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４，１４５４～１４５９頁 Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．（２００３）ＰＮＡＳ １００ １２０２７～１２０３２頁 Ａｂｉｆａｄｅｌ，Ｍ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，１５４～１５６頁 Ｔｉｍｍｓ，Ｋ．Ｍ．（２００４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４，３４９～３５３頁 Ｌｅｒｅｎ，Ｔ．Ｐ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５，４１９～４２２頁 Ｓｈｉｏｊｉ，Ｋ．（２００４）Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９，１０９～１１４頁 Ｒａｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１７９５～１８０３頁 Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１４，１２１～１２７頁 Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１，７１００～７１０５頁 Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．他（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７９，４８８６５～４８８７５頁 Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５０６３０～５０６３８頁 Ｒａｓｈｉｄ他（２００５）ＰＮＡＳ，１０２，５３７４～５３７９頁 Ｃｏｈｅｎ他（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１６１～１６５頁 Ｃｏｈｅｎ他（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４～１２７２頁 Ｙａｎｇ，Ｄ．他（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：１１９１～１２００頁
ＬＤＬコレステロールの制御におけるＰＣＳＫ９の重要性と、高コレステロール血症等の循環器疾患の流行とに起因して、ｄｓＲＮＡ等のＰＣＳＫ９発現の阻害剤を同定し、そのような阻害剤を有効性および望まれていない副作用（例えば細胞傷害性）に関して試験することが継続的に求められている。
特許出願、特許公報、非特許文献、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号等の、本明細書で引用されている全ての参考文献は、各個々の参考文献を参照によって組み入れることが明確にかつ個々に示されていたかのように、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
これらの要求および他の要求を満たすために、本明細書で提供されるのは、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＫＳ９）遺伝子の発現の阻害に有用な二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）である。
従って、一態様では、本明細書で提供されるのは、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列は相補的であり、第１の配列は、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含む、ｄｓＮＲＡである。
別の態様によれば、本開示は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列は相補的であり、第１の配列は、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含み、ｄｓＲＮＡは、場合により、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡは、場合により、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する、ｄｓＲＮＡを提供する。
別の実施形態では、本開示は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列は相補的であり、第１の配列は、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含み、前記選択される配列は、３０％未満のＧＣを含み、ｄｓＲＮＡは、場合により、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡは、場合により、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する、ｄｓＲＮＡを提供する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（１）センス鎖中にＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵ（配列番号６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡ（配列番号３７３）を含むか；（２）センス鎖中にＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵ（配列番号７）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡ（配列番号３７４）を含むか；（３）センス鎖中にＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵ（配列番号８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵ（配列番号３７５）を含むか；（４）センス鎖中にＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡ（配列番号９）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡ（配列番号３７６）を含むか；（５）センス鎖中にＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号１０）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡ（配列番号３７７）を含むか；（６）センス鎖中にＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵ（配列番号１１）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡ（配列番号３７８）を含むか；（７）センス鎖中にＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵ（配列番号３１０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡ（配列番号３８０）を含むか；（８）センス鎖中にＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡ（配列番号３１１）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵ（配列番号３８１）を含むか；（９）センス鎖中にＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵ（配列番号３１２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵ（配列番号３８２）を含むか；（１０）センス鎖中にＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵ（配列番号３１３）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡ（配列番号３８３）を含むか；（１１）センス鎖中にＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵ（配列番号３１４）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡ（配列番号３８４）を含むか；（１２）センス鎖中にＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡ（配列番号３１５）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡ（配列番号３８５）を含むか；（１３）センス鎖中にＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵ（配列番号３１６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵ（配列番号３８６）を含むか；（１４）センス鎖中にＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵ（配列番号３１７）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣ（配列番号３８７）を含むか；（１５）センス鎖中にＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵ（配列番号３１８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵ（配列番号３８８）を含むか；（１６）センス鎖中にＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵ（配列番号３１９）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡ（配列番号３８９）を含むか；（１７）センス鎖中にＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡ（配列番号３２０）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡ（配列番号３９０）を含むか；または（１８）センス鎖中にＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号３２１）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡ（配列番号３９１）を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（１）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号１７６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号１７７）を含むか；（２）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８１）を含むか；（３）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号１８３）を含むか；（４）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号１８４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号１８５）を含むか；（５）センス鎖中にＣＣＡＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号１８６）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８７）を含むか；（６）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８９）を含むか；（７）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号３２３）を含むか；（８）センス鎖中にＣＣＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号３２４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵｄｔｄｔ（配列番号３２５）を含むか；（９）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号３２７）を含むか；（１０）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３２９）を含むか；（１１）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３３１）を含むか；（１２）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号３３２）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号３３３）を含むか；（１３）センス鎖中にＣＣＡＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３４）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵｄＴｄＴ（配列番号３３５）を含むか；（１４）センス鎖中にＣＣＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣｄＴｄＴ（配列番号３３７）を含むか；（１５）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号３３９）を含むか；（１６）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３４０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４１）を含むか；（１７）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号３４２）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４３）を含むか；または（１８）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号３４４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４５）を含む。一部の実施形態では、第１の配列は、ＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡ（配列番号２）の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと同一であり、ＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵ（配列番号５）、ＵＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵ（配列番号５７６）、またはＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡ（配列番号５７７）の内の１つではない。
別の態様では、本開示は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列のみが相補的であり、第１の配列は、配列番号３、４、および１３の内の１つである、ｄｓＲＮＡに関する。別の態様では、本開示は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列のみが相補的であり、第１の配列は、配列番号３、４、および１３の内の１つであり、ｄｓＲＮＡは、場合により、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡは、場合により、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する、ｄｓＲＮＡに関する。一部の実施形態では、本開示は、ｄＳＮＡが、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを提供し、第１の配列および第２の配列のみが相補的であり、第１の配列は、配列番号３、４、および１３の内の１つであり、第１の配列は、３０％未満のＧＣを含み、ｄｓＲＮＡは、場合により、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡは、場合により、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（１９）センス鎖中にＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵ（配列番号３）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣＡＡ（配列番号３７０）を含むか；（２０）センス鎖中にＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵ（配列番号４）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣ（配列番号３７１）を含むか；または（２１）センス鎖中にＧＡＧＵＧＵＧＡＡＡＧＧＵＧＣＵＧＡＵ（配列番号１３）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＣＡＧＣＡＣＣＵＵＵＣＡＣＡＣＵＣ（配列番号３７９）を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（１９）センス鎖中にＣＣＡＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１６２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣＡＡｄＴｄＴ（配列番号１６３）を含むか；（２０）センス鎖中にＣＣＡＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１６６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣｄＴｄＴ（配列番号１６７）を含むか；または（２１）センス鎖中にＣＣＡＧＡＧＵＧＵＧＡＡＡＧＧＵＧＣＵＧＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号２９０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＣＡＧＣＡＣＣＵＵＵＣＡＣＡＣＵＣｄＴｄＴ（配列番号２９１）を含む。
先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、第１の配列および第２の配列は、それぞれ長さが３０個以下のヌクレオチドである。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、第１の配列および第２の配列は、それぞれ長さが少なくとも１９個および／または２３個以下のヌクレオチドである。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドの内の少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、５’－ホスホロチオエートヌクレオチド、またはコレステロール誘導体もしくは親油性部分に連結された末端ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドの内の少なくとも１つは、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メトキシエチル、拘束エチル（ｃＥｔ）、デオキシ、逆位デオキシ、逆位ジデオキシ、ロックド核酸、脱塩基、２’－アミノ、２’－アルキル、モルホリノ、ホスホルアミデート、または非天然の塩基含有ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと、１つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドとを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２つ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと、２つ以上の２’－フルオロヌクレオチドとを、パターンＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ－ＦまたはＦ－ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ（式中、ＯＭｅは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを表し、Ｆは、２’－フルオロヌクレオチドを表す）で含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、それぞれ２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである最大１０個の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれぞれ２’－フルオロヌクレオチドである最大１０個の連続したヌクレオチドを含む。
先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート基を含む。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ホスホロチオエート基を含まない。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホトリエステル基を含む。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ホスホトリエステル基を含まない。
先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リンカーを介して１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に付着している。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、三価分枝リンカーを介して３つのＧａｌＮＡｃ誘導体に付着している。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体の内の少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、またはセンス鎖の５’に付着している。
先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングをさらに含む。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングをさらに含む。一部の実施形態では、３’オーバーハングは、２つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、１つまたはそれ以上のチミンを含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの鎖の一方または両方は、式（Ｉ）：
Figure 2022546040000001
 （式中、
－ Ｂは、複素環式核酸塩基であり；
－ Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分、または式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、
－ Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、またはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、ここで、Ｒ１は、
（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であって、場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されており、ここで、
Ｊは、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基、
（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３であって、ここで、
ｍは、０または１を意味する整数であり、
ｐは、０～１０の範囲の整数であり、
Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、または－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、ここで、
Ｋは、ＯまたはＳであり、
Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、またはＲ３は、細胞ターゲティング部分である、基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３
であり、
－ Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
－ Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）
の構造を有する１つまたはそれ以上の化合物を含むか、またはその薬学的に許容できる塩である。
一部の実施形態では、ｄＳＲＮＡは、式（Ｉ）（式中、Ｙは、
ａ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
ｂ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であって、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であり；
ｃ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であり；
ｄ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、シクロヘキシル基であり；
ｅ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
ｆ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、フェニル基で置換されているメチル基であり；
ｇ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、場合により置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であるか、
または
ｈ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、メチルもしくはペンタデシルである）
の１つまたはそれ以上の化合物を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、式（Ｉ）（式中、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリン、および置換プリンからなる群から選択される）の１つもしくはそれ以上の化合物またはその薬学的に許容できる塩を含む。
一部の実施形態では、Ｒ３は、式（ＩＩ）
Figure 2022546040000002
 （式中、
Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、ＯＨであり、
Ａ４は、ＯＨもしくはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、ここで、Ｒ５は、（Ｃ１～Ｃ６アルキル基であって、場合により、ハロゲン原子で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキルである）
またはその薬学的に許容できる塩である。
一部の実施形態では、Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンまたはその薬学的に許容できる塩である。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表Ａからの１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、式（Ｉ）の２～１０個の化合物またはこれらの薬学的に許容できる塩を含む。一部の実施形態では、式（Ｉ）の２～１０個の化合物は、センス鎖上に存在する。
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端に式（Ｉ）の２～５個の化合物を含み、および／または３’末端に式（Ｉ）の１～３個の化合物を含む。
一部の実施形態では、
ａ）センス鎖の５’末端における式（Ｉ）の２～５個の化合物は、ｌｇＴ３を含み、場合により、３個の連続したｌｇＴ３ヌクレオチドを含み；
および／または
ｂ）センス鎖の３’末端における式（Ｉ）の１～３個の化合物は、ｌＴ４を含み；場合により、２個の連続したｌＴ４を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基であって、独立して、ホスホジエステル骨格連結基、ホスホトリエステル骨格連結基、ホスホロチオエート骨格連結基、ホスホロジチオエート骨格連結基、アルキル－ホスホネート骨格連結基、およびホスホルアミデート骨格連結基からなる群から選択されるヌクレオシド間連結基、またはその薬学的に許容できる塩を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２～４中のｄｓＲＮＡから選択される。
一部の実施形態では、
ａ）センス鎖は、配列番号５７８、５８５、５８７、６２０、６２１、６２２、および６２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；
ならびに／または
ｂ）アンチセンス鎖は、配列番号５８９、５９１、６３１、６３２、６３４、６３５、および６３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、
ａ）配列番号５７８および５８９；［Ｃ０２７．００１］
ｂ）配列番号６２０および６３１；［Ｃ０２７．００３］
ｃ）配列番号５８５および５９１；［Ｃ０２７．００１＃４０］
ｄ）配列番号５８７および５９１；［Ｃ０２７．００１＃５８］
ｅ）配列番号６２１および６３４；［Ｃ０２７．００３＃０３］
ｆ）配列番号６２２および６３２；［Ｃ０２７．００３＃０６］
ｇ）配列番号６２２および６３５；［Ｃ０２７．００３＃０８］
ｈ）配列番号６２７および６３９；［Ｃ０２７．００３＃４７］
のヌクレオチド配列を含む。
先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（例えば、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む）である。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、非ヒトＰＣＳＫ９遺伝子である。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、非ヒト霊長類ＰＣＳＫ９遺伝子（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｇ７ＮＶＺ１により表されるもの等のカニクイザルＰＣＳＫ９）である。
別の態様では、本開示は、本明細書で説明されている１種またはそれ以上のｄｓＲＮＡをコードするベクターに関する。
別の態様では、本開示は、本明細書で説明されている１種またはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／またはベクターを含む単離宿主細胞に関する。
別の態様では、本開示は、本明細書で説明されている１種またはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／またはベクターを含む製品またはキットに関する。
別の態様では、本開示は、本明細書で説明されている１種またはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／またはベクターを含む組成物に関する。一部の実施形態では、この組成物は医薬組成物である。一部の実施形態では、この組成物は、薬学的に許容できる担体を含む。一部の実施形態では、この組成物は送達ビヒクルを含む。一部の実施形態では、この送達ビヒクルは、リポソーム、リポプレックス、複合体、およびナノ粒子から選択される。
別の態様では、本開示は、対象中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法であって、この対象に、本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／または本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上の組成物の有効量を投与することを含む方法に関する。別の態様では、本開示は、対象中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法での本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／または本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上の組成物の使用に関する。別の態様では、本開示は、対象中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための医薬品の製造での使用のための本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／または本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上の組成物に関する。別の態様では、本開示は、必要な対象のＰＣＳＫ９媒介疾患を処置するかまたは予防する方法であって、この対象に、本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／または本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上の組成物の有効量を投与することを含む方法に関する。別の態様では、本開示は、必要な対象のＰＣＳＫ９媒介疾患を処置するかまたは予防する方法での本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／または本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上の組成物の使用に関する。別の態様では、本開示は、必要な対象のＰＣＳＫ９媒介疾患を処置するかまたは予防するための医薬品の製造での使用のための本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡおよび／または本明細書で説明されている１種もしくはそれ以上の組成物に関する。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、対象の肝臓中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡにより阻害される。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９媒介障害は、高コレステロール血症である。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、投与は、皮下投与、静脈内投与、または肺投与である。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、対象はヒトである。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、投与により、対象の血清コレステロールが低下する。先の実施形態の内のいずれかと組み合わされる一部の実施形態では、この方法は、対象に、ＰＣＳＫ９媒介疾患を処置するかまたは予防するための１種またはそれ以上の追加の治療薬の有効量を投与することをさらに含む。
本明細書で説明されている様々な実施形態の特性の内の１つ、一部、または全てを組み合わせて本開示の他の実施形態を形成し得ることを理解しなければならない。本開示のこれらのおよび他の態様は、当業者に明らかになるだろう。
図１は、トランスフェクトしていないヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における、またはＰＣＳＫ９をターゲティングする増大する濃度の１４種の異なる試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における、陽性および陰性対照処理と比較したＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析を示す。＊は、このアッセイにおいてＰＣＳＫ９発現の最も強力な低減を示したｓｉＲＮＡを示す。 図２は、トランスフェクトしていないヒトＣ３Ａ細胞における、またはＰＣＳＫ９をターゲティングする増大する濃度の１４種の異なる試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞における、陽性および陰性対照処理と比較したＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析を示す。＊は、このアッセイにおいてＰＣＳＫ９発現の最も強力な低減を示したｓｉＲＮＡを示す。 図３Ａおよび３Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図３Ａは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅｐ３Ｂ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図３Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図３Ａは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅｐ３Ｂ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図３Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。 図４は、トランスフェクトしていないヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における、またはＰＣＳＫ９をターゲティングする増大する濃度の６０種の異なる試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における、陽性および陰性対照処理と比較したＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析を示す。＊は、このアッセイにおいてＰＣＳＫ９発現の最も強力な低減を示したｓｉＲＮＡを示す。 図５は、ＰＣＳＫ９をターゲティングする増大する濃度の５種の異なる試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞における、陽性および陰性対照処理と比較したＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析を示す。＊は、このアッセイにおいてＰＣＳＫ９発現の最も強力な低減を示したｓｉＲＮＡを示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図６Ａは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅｐ３Ｂ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図６Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図６Ａは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅｐ３Ｂ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。図６Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞についての細胞毒性アッセイの結果を示す。 図７は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される、ＰＣＳＫ９をターゲティングする増大する濃度の１０種の試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞についてのヒトＣ３Ａ細胞培養物の上清に分泌されたＰＣＳＫ９タンパク質の量を示す。 図８は、ＥＬＩＳＡにより決定される、ＰＣＳＫ９をターゲティングする３つの異なる濃度のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞培養物の上清に分泌されたＰＣＳＫ９タンパク質の量を示す。 図９は、ヒト初代肝細胞における、ＰＣＳＫ９をターゲティングする３つの異なる濃度のｓｉＲＮＡの自由取り込み中の細胞毒性アッセイの結果を示す。 図１０は、ＥＬＩＳＡにより決定される、３人のドナーから単離し、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）の上清に放出されたインターフェロンα（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α：ＩＦＮα）タンパク質の量を示す。 図１１は、５０％マウス血清中での、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ血清安定性および相対的半減期を示す。 図１２は、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析の結果の要約を示す。 図１３Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定される、０日目に、ＰＣＳＫ９をターゲティングする、示されるｓｉＲＮＡの単回の１０ｍｇ／ｋｇ皮下用量で処置したヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスにおける経時的な血清ＰＣＳＫ９レベルを示す。図１３Ｂは、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ器具により決定される、これらの同じマウスにおける血清総コレステロールレベルを示す。図１３Ｃは、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ器具により決定される、３日目の血清サンプルにおける急性毒性測定値の結果を示す。図１３Ｄは、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ器具により決定される、１０日目の血清サンプルにおける急性毒性測定値の結果を示す。ＡＳＴ＝アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＢＵＮ＝血中尿素窒素。 図１３－１の続き。 図１４Ａは、トランスフェクトしていないヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における、またはＰＣＳＫ９をターゲティングする２つの異なる濃度の追加の試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅｐ３Ｂ細胞における、陽性および陰性対照処理と比較したＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析を示す。 図１４Ｂは、トランスフェクトしていないヒトＣ３Ａ細胞における、またはＰＣＳＫ９をターゲティングする２つの異なる濃度の追加の試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞における、陽性および陰性対照処理と比較したＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析を示す。矢印は、Ｈｅｐ３ＢおよびＣ３Ａ細胞株の両方において、０．１ｎＭの濃度でＰＣＳＫ９の５０％超のノックダウンを示したｓｉＲＮＡ、または１ｎＭの濃度でＰＣＳＫ９の８５％超のノックダウンを示したｓｉＲＮＡを示す。 図１５は、ＰＣＳＫ９をターゲティングする２つの異なる濃度の追加の試験ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３ＢおよびＣ３Ａ細胞における、細胞毒性アッセイの結果を示す。Ｘは、ＬＶ２陰性対照と比較して、５０ｎＭの濃度で５０％超の毒性を有するｓｉＲＮＡを示す。 図１５－１の続き。 図１５－２の続き。 図１５－３の続き。 図１６Ａは、試験したｓｉＲＮＡについての、ヒトＨｅｐ３ＢおよびＣ３Ａ細胞における、計算したＩＣ５０値間の相関を示す。図１６Ｂは、ＰＣＳＫ９をターゲティングする追加の試験ｓｉＲＮＡについての、ヒトＨｅｐ３ＢおよびＣ３Ａ細胞における、計算したＩｍａｘ値間の相関を示す。 図１７は、親配列Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３に基づく最適化ライブラリーからの１００ｎＭおよび１０００ｎＭ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡで処理したヒト初代肝細胞における、ＬＶ２非サイレンシング対照について正規化した、残留ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフを示す。 図１８は、ＥＬＩＳＡにより決定される、３人のドナーから単離し、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の上清に放出されたインターフェロンα２ａ（ＩＦＮα２ａ）タンパク質の量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 図１９Ａ～Ｃは、０日目に、単回用量の４２種類の最適化ＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡおよび６ｍｇ／ｋｇの各々の親分子で皮下処置したヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスにおける、血清ＰＣＳＫ９レベルの相対量を示すグラフである。図１９Ａ～Ｃは、それぞれ、親配列Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３に基づく最適化ＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡについてのデータを表す。タンパク質発現は、ＰＢＳ媒体対照で処置した動物と比較して表される。ヒトＰＣＳＫ９レベルを、ＥＬＩＳＡにより定量し、エラーバーは、ＳＥＭを示す。 図１９Ａ～Ｃは、０日目に、単回用量の４２種類の最適化ＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡおよび６ｍｇ／ｋｇの各々の親分子で皮下処置したヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスにおける、血清ＰＣＳＫ９レベルの相対量を示すグラフである。図１９Ａ～Ｃは、それぞれ、親配列Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３に基づく最適化ＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡについてのデータを表す。タンパク質発現は、ＰＢＳ媒体対照で処置した動物と比較して表される。ヒトＰＣＳＫ９レベルを、ＥＬＩＳＡにより定量し、エラーバーは、ＳＥＭを示す。 図１９Ａ～Ｃは、０日目に、単回用量の４２種類の最適化ＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡおよび６ｍｇ／ｋｇの各々の親分子で皮下処置したヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスにおける、血清ＰＣＳＫ９レベルの相対量を示すグラフである。図１９Ａ～Ｃは、それぞれ、親配列Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３に基づく最適化ＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡについてのデータを表す。タンパク質発現は、ＰＢＳ媒体対照で処置した動物と比較して表される。ヒトＰＣＳＫ９レベルを、ＥＬＩＳＡにより定量し、エラーバーは、ＳＥＭを示す。 図１９ＤおよびＥは、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ器具により決定される、ｓｉＲＮＡ投薬後１４日目（１９Ｄ）および２８日目（１９Ｅ）のこれらの同じマウスにおける血清ＬＤＬコレステロールレベルを示す。 図１９ＤおよびＥは、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ器具により決定される、ｓｉＲＮＡ投薬後１４日目（１９Ｄ）および２８日目（１９Ｅ）のこれらの同じマウスにおける血清ＬＤＬコレステロールレベルを示す。
以下の説明は、例示的な方法、パラメーターなどを示す。しかしながら、そのような説明は本開示の範囲についての限定とは意図されず、そうではなく、例示的な実施形態の説明として提供されることを認識するべきである。
１．定義
本明細書および附属の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別のように規定しない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」についての言及は、場合により、２つまたはそれ以上のそのような分子の組合せなどを含む。
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、本技術分野の当業者に容易に分かる各々の値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」の値またはパラメーターについての言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
本明細書で説明される本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、および「本質的に～からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことが理解される。また、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語または同等物を使用する実施形態の開示は、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」が「～に存する（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｉｎ）」により置換される実施形態を包含することを理解するべきである。
本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳述される天然もしくは修飾ヌクレオチド、または代替置換部分を含む。当業者は、ヌクレオチドのグアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、またはチミンは、置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、他の部分により置換することができることを理解し得る。例えば、非限定的に、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成することができる。それゆえ、本開示のヌクレオチド配列のウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドにより置換してもよい。そのような置換部分を含む配列は、本開示の実施形態として含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＰＣＳＫ９」という用語は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９遺伝子またはタンパク質（ＦＨ３、ＨＣＨＯＬＡ３、ＮＡＲＣ－１、およびＮＡＲＣ１としても公知）を指す。本明細書で使用される場合、「ＰＣＳＫ９」という用語は、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、例えば、ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿１７４９３６．３で見出すことができるヒトＰＣＳＫ９；アミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、例えば、ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿１５３５６５．２で見出すことができるマウスＰＣＳＫ９；アミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、例えば、ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿１９９２５３．２で見出すことができるラットＰＣＳＫ９を含む。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ配列の追加の例は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを使用して容易に入手可能である。
本明細書で使用される場合、「標的配列」とは、標的遺伝子、例えばＰＣＳＫ９遺伝子、またはその部分の転写中に形成される、１次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。
本明細書で使用される場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準のヌクレオチド用語法を使用して言及される配列により示されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、別に示されない限り、「相補的な」という用語は、第２のヌクレオチド配列に関して第１のヌクレオチド配列を説明するために使用されるとき、当業者により理解される通り、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、ある特定の条件下で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。これは、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの、第１または第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成を含む。そのような配列は、本明細書で互いについて「完全に相補的な」と言及することができる。第１の配列が、本明細書で第２の配列について「実質的に相補的な」と言及される場合、２種の配列は完全に相補的であってもよく、またはそれらは、それらの最終的な適用に最も関係する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイゼーションに際して１つもしくはそれ以上の、しかし４、３、もしくは２つ以下のミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしながら、２種のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに際して、１つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとしてみなすべきではない。例えば、長さが２１ヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチドと長さが２３ヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチドとを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）であって、第２のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む、二本鎖ＲＮＡは、それでも、本開示の目的について「完全に相補的な」と言及することができる。また、「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力についての上記必要条件が満たされている限り、非ワトソン・クリック塩基対ならびに／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含んでもよく、または全てそれらから形成してもよい。「相補的な」、「完全に相補的な」、および「実質的に相補的な」という用語は、それらの使用に関して理解される通り、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基適合について使用することができる。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡの「少なくとも部分に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡ）の連続部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの非中断部分に実質的に相補的である場合、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの少なくとも部分に実質的に相補的である。
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２つの逆平行かつ上記に定義される通り実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有する、リボ核酸分子（複数可）の複合体を指す。二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは、別々のＲＮＡ分子であってもよい。別々のＲＮＡ分子である場合、そのようなｄｓＲＮＡは、多くの場合、文献において短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。２つの鎖が１つのより大きな分子の部分であり、それゆえ、二本鎖構造を形成する第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非中断鎖により接続される場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「短ヘアピンＲＮＡ」、または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非中断鎖以外の手段により共有結合される場合、接続構造は、「リンカー」と呼ばれる。「ＲＮＡ」鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの短い方の鎖のオリゴヌクレオチド数から、二本鎖に存在する任意のオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。加えて、本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、多数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み、本明細書で開示されるか、または当該技術分野で公知のすべての種類の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾を含み得る。任意のそのような修飾は、ｓｉＲＮＡタイプの分子において使用される場合、本開示の目的についての「ｄｓＲＮＡ」に包含される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えばデオキシリボヌクレオシドオーバーハング（複数可）を含むデオキシリボヌクレオシド、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分内の１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドなどを含む、修飾リボヌクレオシドを含む。しかしながら、二本鎖ＤＮＡ分子は、どのような場合にも「ｄｓＲＮＡ」という用語に包含されないことが自明である。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の３’末端が第２の鎖の５’末端を超えて伸びているかまたはその逆である場合の対形成していないヌクレオチド、またはｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突き出しているヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に対形成していないヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたり二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。明確にすると、ｄｓＲＮＡの３’末端および／または５’末端にコンジュゲートした化学キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、ｄｓＲＮＡがオーバーハングを有するか、または平滑末端であるかを決定することにおいて考慮されない。
本明細書で使用される場合、「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な配列を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される場合、「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な配列を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞に導入すること」という用語は、当業者により理解される通り、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、自力の拡散もしくは能動的細胞プロセスを通して、または補助剤もしくはデバイスにより起こり得る。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞に限定されるべきではない；ｄｓＲＮＡは、細胞が生物の部分である場合の「細胞に導入される」こともある。そのような場合、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、ｄｓＲＮＡは、組織部位へ注射するか、または全身投与してもよい。また、ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、ベータ－グルカン送達系により媒介することができる（例えば、Ｔｅｓｚ， Ｇ． Ｊ．ら （２０１１） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ４３６（２）：３５１～６２を参照されたい）。細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような当該技術分野で公知の方法を含む。さらなる手法は、本明細書で以下に説明されるか、または当該技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」という用語は、本開示のｄｓＲＮＡにより発現の阻害についてターゲティングされる目的の遺伝子、例えば、ＰＣＳＫ９を指す。
本明細書で使用される場合、「ＰＣＳＫ９関連疾患」という用語は、ＰＣＳＫ９遺伝子またはタンパク質と関連付けられる任意の疾患を含むと意図される。そのような疾患は、例えば、ＰＣＳＫ９タンパク質の過剰産生により、ＰＣＳＫ９遺伝子変異により、ＰＣＳＫ９タンパク質の異常な切断により、ＰＣＳＫ９と他のタンパク質または他の内因性もしくは外因性物質との間の異常な相互作用により、引き起こされる。例示的なＰＣＳＫ９関連疾患は、脂血症、例えば高脂血症、および高コレステロール血症、高トリグリセリド血症のような他の型の脂質不均衡、ならびに心疾患および循環器疾患のようなこれらの障害と関連付けられる病理学的状態を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「～の発現を阻害する」または「～の発現を阻害すること」という用語は、それらがＰＣＳＫ９遺伝子について言及する限り、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるがＰＣＳＫ９遺伝子の発現が阻害されるように処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較した、ＰＣＳＫ９遺伝子が転写され、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞または細胞群から単離される、ＰＣＳＫ９遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量の低減により表される、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。本明細書で使用される場合、「阻害すること」という用語は、「低減すること」、「サイレンシング」、「ダウンレギュレートすること」、「抑制すること」、および他の同様の用語と互換的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。阻害の程度は、通常、（（（対照細胞内のｍＲＮＡ）－（処理した細胞内のｍＲＮＡ））／（対照細胞内のｍＲＮＡ））・１００％について表される。
あるいは、阻害の程度は、ＰＣＳＫ９遺伝子転写に機能的に連結されるパラメーター、例えば、細胞により分泌される、ＰＣＳＫ９遺伝子によりコードされるタンパク質の量、またはある特定の表現型、例えばアポトーシスを呈する細胞の数の低減について示してもよい。原理的には、ＰＣＳＫ９遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム操作により標的を発現する任意の細胞において、および任意の適切なアッセイにより決定することができる。しかしながら、所与のｄｓＲＮＡがある特定の程度ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害し、それゆえ、本開示に包含されるかどうかを決定するために基準が必要とされる場合、以下の実施例において提供されるアッセイは、そのような基準として使用することができる。
本明細書で使用される場合、ＰＣＳＫ９発現に関して、「治療する」、「治療」という用語などは、標的遺伝子発現により媒介される病理学的プロセスからの緩和またはその軽減を指す。本開示に関して、それが本明細書中以下に列挙される他の状態（標的発現により媒介される病理学的プロセス以外の）のいずれかに関する限り、「治療する」、「治療」という用語などは、そのような状態と関連付けられる１つまたはそれ以上の症状を緩和または軽減することを指す。例えば、高脂血症に関して、治療は、血清脂質レベルの減少を含む。
本明細書で使用される場合、疾患または障害についての「予防する」または「～の進行を遅延させる」という用語（およびそれらの文法的変形）は、疾患の予防的処置、例えば、疾患を有することが疑われるかまたは疾患を発症するリスクに晒されている個体における疾患の予防的処置に関する。予防は、疾患の開始もしくは進行を予防もしくは遅延させること、および／または疾患の１つもしくはそれ以上の症状を所望のレベルもしくは病理学的レベル以下に維持することを含み得るが、これらに限定されない。例えば、高脂血症に関して、予防は、高脂血症を有することが疑われるかまたはそれを発症するリスクに晒されている個体において血清脂質レベルを所望のレベルに維持することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という用語は、標的遺伝子発現、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子発現により媒介される病理学的プロセス、または標的遺伝子発現、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子発現により媒介される病理学的プロセスの明白な症状の治療、予防、または管理において治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な特定の量は、通常の医療実施者により容易に決定することができ、例えば、標的遺伝子発現、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子発現により媒介される病理学的プロセスの種類、患者の病歴および年齢、標的遺伝子発現、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子発現により媒介される病理学的プロセスの段階、ならびに標的遺伝子発現、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子発現により媒介されるプロセスを阻害する他の剤の投与のような当該技術分野で公知の因子により変動し得る。
本明細書で使用される場合、「個体」または「対象」という用語は、哺乳動物である。哺乳動物は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルのような非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
２．二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）
本開示のある特定の態様は、ＰＣＳＫ９を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子に関する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖および第２の鎖を含むアンチセンス鎖という２本の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分に相補的である。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖中の第２の配列に実質的に相補的であるかまたは完全に相補的である第１の配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖中の第２の配列は、標的配列に実質的に相補的であるかまたは完全に相補的である。一部の実施形態では、標的配列は、標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡ（例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡ）の配列に由来する。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子はヒトＰＣＳＫ９遺伝子であり、例えば本明細書で説明されているヒトＰＣＳＫ９遺伝子である。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は非ヒトＰＣＳＫ９遺伝子である。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、非ヒト霊長類ＰＣＳＫ９遺伝子（例えば、カニクイザルＰＣＳＫ９（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｇ７ＮＶＺ１））である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの別個の分子で存在する。一部の実施形態では、二本鎖領域は、２つの別個の分子のセンス鎖中の第１の配列とアンチセンス鎖中の第２の配列との間に形成されている。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、２つの別個の分子は、互いに共有結合的に連結されていない。一部の実施形態では、２つの別個の分子は、互いに共有結合的に連結されている。一部の実施形態では、２つの別個の分子は、ヘアピンループ以外の手段により互いに共有結合的に連結されている。一部の実施形態では、２つの別個の分子は、接続構造（本明細書では「共有結合性リンカー（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｌｉｎｋｅｒ）」と称される）により互いに共有結合的に連結されている。
一部の実施形態では、（センス鎖中の）第１の配列および（アンチセンス鎖中の）第２の配列のそれぞれは、長さが９～３０個のヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、各配列は、長さが１２～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１４～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２５～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２７～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～１９個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～１８個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～１７個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～１９個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２４個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２４個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２４個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２３個のヌクレオチドであり得るか、または長さが２１～２２個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、各配列は、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、各配列は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個以下のヌクレオチドである。即ち、各配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個という上限と、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個という独立して選択される下限とを有するヌクレオチド長さの範囲であって、この下限は、この上限と比べて小さい、範囲の内のいずれかであり得る。一部の実施形態では、各配列は、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１の配列および第２の配列は、それぞれ長さが３０個以下のヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１の配列および第２の配列は、それぞれ長さが少なくとも１９個および２３個以下のヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１の配列および第２の配列は、異なる数のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、第１の配列は、第２の配列と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドだけ長い。一部の実施形態では、第２の配列は、第１の配列と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドだけ長い。一部の実施形態では、第１の配列および第２の配列は、同じ数のヌクレオチドの長さである。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、長さが９～３６個のヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、各鎖は、長さが１２～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１４～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２５～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２７～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～２０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～１９個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～１８個のヌクレオチドであり得るか、長さが１５～１７個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１７～１９個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１８～２０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２４個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが１９～２０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２４個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２３個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２２個のヌクレオチドであり得るか、長さが２０～２１個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～３０個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２６個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２５個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２４個のヌクレオチドであり得るか、長さが２１～２３個のヌクレオチドであり得るか、または長さが２１～２２個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、各鎖は、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、各鎖は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個以下のヌクレオチドである。即ち、各鎖は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個という上限と、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個という独立して選択される下限とを有するヌクレオチド長さの範囲であって、この下限は、この上限と比べて小さい、範囲の内のいずれかであり得る。一部の実施形態では、各鎖は、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドの長さである。
一部の実施形態では、（センス鎖中の）第１の配列および（アンチセンス鎖中の）第２の配列は、３０％未満のＧＣを含む。「３０％未満のＧＣ」は、第１の配列および／または第２の配列の総ヌクレオチド含有量と比較して、前記配列のヌクレオチドの３０％未満がＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）であることを意味する。Ｇ（グアニン）ヌクレオチド含有量およびＣ（シトシン）ヌクレオチド含有量にはまた、修飾されたＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドも含まれる。そのような修飾は下記で説明されており、例えば下記が挙げられる：２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍＧ）、２’－メチルシチジン（ｍＣ）、２’－フルオロ－グアノシン（ｆＧ）、２’－フルオロ－シチジン（ｆＣ）、またはロックドグアニンおよびロックドシトシン（ｌＧおよびｌＣ）。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＧＣ含有量が３０％未満である本開示のｄｓＲＮＡがヒトＰＣＳＫ９の発現のノックダウンにおいて比較的高い有効性を示すことに留意している。
オーバーハング
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方の３’末端、５’末端、または両方の末端に１つまたはそれ以上のオーバーハングを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のオーバーハングは、ｄｓＲＮＡの安定性および／または阻害活性を改善する。
一部の実施形態では、オーバーハングは、１個またはそれ以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、または６個以上のヌクレオチドを含む。例えば、オーバーハングは、１～６個のヌクレオチド、２～６個のヌクレオチド、３～６個のヌクレオチド、４～６個のヌクレオチド、５～６個のヌクレオチド、１～５個のヌクレオチド、２～５個のヌクレオチド、３～５個のヌクレオチド、４～５個のヌクレオチド、１～４個のヌクレオチド、２～４個のヌクレオチド、３～４個のヌクレオチド、１～３個のヌクレオチド、２～３個のヌクレオチド、または１～２個のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、オーバーハングは、長さが１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドである。
一部の実施形態では、本開示のオーバーハングは、１つまたはそれ以上のリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示のオーバーハングは、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、１つまたはそれ以上のチミンを含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に位置するオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端とを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に位置するオーバーハングと、センス鎖の５’末端に平滑末端とを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、このｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置するオーバーハングを含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に位置するオーバーハングを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に位置するオーバーハングと、アンチセンス鎖の３’末端に平滑末端とを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に位置するオーバーハングを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端に平滑末端を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に位置するオーバーハングと、センス鎖の３’末端に平滑末端とを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、このｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の５’末端に位置するオーバーハングを含む。
一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖と比べて長いセンス鎖の結果である。一部の実施形態では、オーバーハングは、センス鎖と比べて長いアンチセンス鎖の結果である。一部の実施形態では、オーバーハングは、同一の長さのセンス鎖およびアンチセンス鎖のずれの結果である。一部の実施形態では、オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成する。一部の実施形態では、オーバーハングは、標的ｍＲＮＡに相補的である。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列は、実質的に相補的であるか、または相補的である。一部の実施形態では、第１の配列および第２の配列は実質的に相補的であるかまたは相補的であり、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域を形成する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、長さが９～３６個のヌクレオチド対である。例えば、二本鎖領域は、長さが１２～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１４～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～２６個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～２３個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～２２個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～２１個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～２０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～１９個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～１８個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１５～１７個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１７～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２７～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１７～２３個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１７～２１個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１７～１９個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～２６個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～２５個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～２４個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～２３個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～２２個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～２１個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１８～２０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１９～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１９～２５個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１９～２４個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１９～２３個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１９～２２個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１９～２１個のヌクレオチド対であり得るか、長さが１９～２０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２０～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２０～２６個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２０～２５個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２０～２４個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２０～２３個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２０～２２個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２０～２１個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２１～３０個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２１～２６個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２１～２５個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２１～２４個のヌクレオチド対であり得るか、長さが２１～２３個のヌクレオチド対であり得るか、または長さが２１～２２個のヌクレオチド対であり得る。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個以上のヌクレオチド対である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個以下のヌクレオチド対である。即ち、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個という上限と、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個という独立して選択される下限とを有するヌクレオチド対の長さの範囲であって、この下限は、この上限と比べて小さい、範囲の内のいずれかであり得る。一部の実施形態では、二本鎖領域は、長さが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個のヌクレオチド対である。複数種のｄｓＲＮＡが使用される場合には、各ｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、１種またはそれ以上の追加のｄｓＲＮＡと同一の長さであってもよいし異なる長さであってもよい。
標的配列、ならびにｄｓＲＮＡ中の第１の配列および第２の配列
一部の実施形態では、標的配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子（例えばヒトＰＣＳＫ９遺伝子）に由来する。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子および関連するｍＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＮＭ＿１７４９３６．３に記載されている配列を有する。一部の実施形態では、ヒトＰＣＳＫ９ ｃＤＮＡは、配列
ＧＴＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＣＴＡＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＧＴＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＧＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＡＴＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＧＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＴＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＡＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＡＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＡＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＣＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＣＣＧＣＧＴＣＣＴＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＧＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＣＴＡＣＡＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＣＣＧＴＡＧＡＣＡＡＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡＡＴＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＣＡＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＴＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧＣＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＣＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＴＡＣＣＣＧＧＣＡＧＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＣＧＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＡＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＧＣＡＴＧＧＴＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＧＴＣＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１）
を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡアンチセンス鎖は、標的配列の１２～３０個のヌクレオチドに実質的に相補的であるかまたは相補的である配列を含む。例えば、アンチセンス鎖中の配列は、標的配列の１２～３０個のヌクレオチド、１４～３０個のヌクレオチド、１５～３０個のヌクレオチド、１５～２６個のヌクレオチド、１５～２３個のヌクレオチド、１５～２２個のヌクレオチド、１５～２１個のヌクレオチド、１５～２０個のヌクレオチド、１５～１９個のヌクレオチド、１５～１８個のヌクレオチド、１５～１７個のヌクレオチド、１７～３０個のヌクレオチド、２７～３０個のヌクレオチド、１７～２３個のヌクレオチド、１７～２１個のヌクレオチド、１７～１９個のヌクレオチド、１８～３０個のヌクレオチド、１８～２６個のヌクレオチド、１８～２５個のヌクレオチド、１８～２３個のヌクレオチド、１８～２２個のヌクレオチド、１８～２１個のヌクレオチド、１８～２０個のヌクレオチド、１９～３０個のヌクレオチド、１９～２５個のヌクレオチド、１９～２４個のヌクレオチド、１９～２３個のヌクレオチド、１９～２２個のヌクレオチド、１９～２１個のヌクレオチド、１９～２０個のヌクレオチド、２０～３０個のヌクレオチド、２０～２６個のヌクレオチド、２０～２５個のヌクレオチド、２０～２４個のヌクレオチド、２０～２３個のヌクレオチド、２０～２２個のヌクレオチド、２０～２１個のヌクレオチド、２１～３０個のヌクレオチド、２１～２６個のヌクレオチド、２１～２５個のヌクレオチド、２１～２４個のヌクレオチド、２１～２３個のヌクレオチド、または２１～２２個のヌクレオチドに実質的に相補的であり得るか、または相補的であり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖中の配列は、標的配列の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個以上のヌクレオチドに実質的に相補的であり得るか、または相補的であり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖中の配列は、標的配列の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個以下のヌクレオチドに実質的に相補的であり得るか、または相補的であり得る。即ち、アンチセンス鎖中の配列は、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個という上限と、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個という独立して選択される下限とを有する標的配列のヌクレオチドの範囲であって、この下限は、この上限と比べて小さい、範囲の内のいずれかに実質的に相補的であり得るか、または相補的であり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖中の配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドに実質的に相補的であり得るか、または相補的であり得る。複数種のｄｓＲＮＡが使用される場合には、各ｄｓＲＮＡの相補性の領域は、１種またはそれ以上の追加のｄｓＲＮＡと同一の長さであってもよいし異なる長さであってもよい。
一部の実施形態では、標的配列は、ＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡ（配列番号２）を含む。一部の実施形態では、標的配列は、ＧＡＧＵＧＵＧＡＡＡＧＧＵＧＣＵＧＡＵＧＧＣＣＣＵＣＡＵＣＵ（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、標的配列（例えば、本開示のｄｓＲＮＡのセンス鎖の第１の配列）は、表１Ａで説明されている配列である。
Figure 2022546040000003
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖を含む。一部の実施形態では、第１の配列は、表１Ａで示されている標的配列を含む。一部の実施形態では、第１の配列は、表１Ａで示されている標的配列である。一部の実施形態では、第１の配列は、配列番号３～１１、１３、および３１０～３２１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、第１の配列は、配列番号６～１１および３１０～３２１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、第１の配列は、配列番号３～１１、１３、および３１０～３２１から選択される配列である。一部の実施形態では、第１の配列は、配列番号３、４、および１３から選択される配列である。一部の実施形態では、第１の配列は、ＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵ（配列番号５）、ＵＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵ（配列番号５７６）、またはＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡ（配列番号５７７）のいずれでもない。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含む第１の配列を含み、この配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列は、３０％未満のＧＣを含む。一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含む第１の配列を含み、第１の配列は、３０％未満のＧＣを含む。一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、配列番号３、４、および１３の内の１つである第１の配列を含み、第１の配列は、３０％未満のＧＣを含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、第２の配列は、（即ちセンス鎖中の）第１の配列に実質的に相補的であるか、または完全に相補的である。一部の実施形態では、第２の配列は、（即ちセンス鎖中の）第１の配列に実質的に相補的であり、第２の鎖は、第１の鎖に対して少なくとも１つのミスマッチ（例えば、１つのミスマッチ、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、または４つのミスマッチ）を含む。一部の実施形態では、第２の配列は、（即ちセンス鎖中の）第１の配列に実質的に相補的であり、第２の鎖は、第１の鎖に対して１つまたは２つのミスマッチを含む。一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号３～１１、１３、および３１０～３２１から選択される配列に実質的に相補的であり、第２の鎖は、配列番号３～１１、１３、および３１０～３２１から選択される配列に対して少なくとも１つのミスマッチ（例えば、１つのミスマッチ、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、または４つのミスマッチ）を含む。一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号３～１１、１３、および３１０～３２１から選択される配列に実質的に相補的であり、第２の鎖は、配列番号３～１１、１３、および３１０～３２１から選択される配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含む。一部の実施形態では、第２の配列は、（即ちセンス鎖中の）第１の配列に完全に相補的である。一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号３～１１、１３、および３１０～３２１から選択される配列に完全に相補的である。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、配列番号３～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列に実質的に相補的である第２の配列であって、３０％未満のＧＣを含む第２の配列を含む。一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、配列番号３～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列に完全に相補的である第２の配列であって、３０％未満のＧＣを含む第２の配列を含む。
一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号２内の配列または配列番号１２内の配列に実質的に相補的であるか、または完全に相補的である。一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号２または配列番号１２の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに実質的に相補的であるか、または完全に相補的である。一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号２または配列番号１２の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドに実質的に相補的であるか、または完全に相補的である。一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号２または配列番号１２の３０個以下の連続したヌクレオチドに実質的に相補的であるか、または完全に相補的である。一部の実施形態では、第２の配列は、配列番号２または配列番号１２の少なくとも１９個および２３個以下の連続したヌクレオチドに実質的に相補的であるか、または完全に相補的である。一部の実施形態では、第２の配列は、表１Ｂに示す配列を含む。一部の実施形態では、第２の配列は、表１Ｂに示す配列である。
Figure 2022546040000004
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡまたはこのｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖中の第２の配列は、標的配列に対して１つまたはそれ以上のミスマッチを含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号２または配列番号１２である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖中の第２の配列は、標的配列に対して４、３、または２つ以下のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖中の第２の配列は、標的配列に対して１つ以下のミスマッチを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性の領域の中心に位置していない。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のミスマッチは、相補性領域の５’末端および／または３’末端の５つのヌクレオチド以内に位置するか、４つのヌクレオチド以内に位置するか、３つのヌクレオチド以内に位置するか、２つのヌクレオチド以内に位置するか、または１つのヌクレオチド以内に位置する。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子のある領域に対して相補的である２３個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合には、このｄｓＲＮＡは、一般的に、このｄｓＲＮＡ鎖とＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡとの間の相補性の領域の中心の１３個のヌクレオチド内にはミスマッチを全く含まない。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、表２または表３で説明されているセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含む。表２に示す例示的なｓｉＲＮＡは修飾を含むが、同一の配列を有するが修飾の数／パターン／タイプが異なるｓｉＲＮＡも企図される。同一の配列を有するが２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および２’－フルオロ修飾を有しないｓｉＲＮＡを表３に示す。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表３に示すセンス鎖を含むが５’ＣＣＡおよび／または３’ｉｎｖｄＴを欠いている。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表３に示すアンチセンス鎖を含むが３’ｄＴｄＴを欠いている。
Figure 2022546040000005
Figure 2022546040000006
Figure 2022546040000007
Figure 2022546040000008
Figure 2022546040000009
Figure 2022546040000010
Figure 2022546040000011
Figure 2022546040000012
Figure 2022546040000013
Figure 2022546040000014
Figure 2022546040000015
Figure 2022546040000016
Figure 2022546040000017
Figure 2022546040000018
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＰＣＴ公報国際公開第２０１９／１７０７３１号パンフレットで説明されている１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み、このパンフレットの開示は、その全体を本明細書に組み入れる。そのような修飾ヌクレオチドでは、リボース環は６員の複素環に置き換えられている。そのような修飾ヌクレオチドは、式（Ｉ）：
Figure 2022546040000019
 （式中、
－ Ｂは、複素環式核酸塩基であり；
－ Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分、または式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、
－ Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、またはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、ここで、Ｒ１は、
（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であって、場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されており、ここで、
Ｊは、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基、
（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３であって、ここで、
ｍは、０または１を意味する整数であり、
ｐは、０～１０の範囲の整数であり、
Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、または－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、ここで、
Ｋは、ＯまたはＳであり、
Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、またはＲ３は、細胞ターゲティング部分である、基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３
であり、
－ Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
－ Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）
の構造を有するか、またはその薬学的に許容できる塩である。
一部の実施形態では、ＹはＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ＹはＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であり、この非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基は、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、ヘキサデシルを含む基から選択されるアルキル基を含み、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ＹはＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ＹはＮＲ１であり、Ｒ１はシクロヘキシル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ＹはＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ＹはＮＲ１であり、Ｒ１は、フェニル基で置換されているメチル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ＹはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、場合により置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ＹはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、メチルおよびペンタデシルを含む群から選択され、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３、およびＢは、一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩に関して定義されたのと同じ意味を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、式（Ｉ）（式中、Ｙは、
ａ）ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
ｂ）ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であって、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であり；
ｃ）ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であり；
ｄ）ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、シクロヘキシル基であり；
ｅ）ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
ｆ）ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、フェニル基で置換されているメチル基であり；
ｇ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、ここで、Ｒ１は、場合により置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であるか、
または
ｈ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、ここで、Ｒ１は、メチルもしくはペンタデシルである）
の１つまたはそれ以上の化合物を含む。
一部の実施形態では、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリン、および置換プリン、またはこれらの薬学的に許容できる塩を含む群から選択される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ中のヌクレオシド間連結基は、独立して、ホスホジエステル骨格連結基、ホスホトリエステル骨格連結基、ホスホロチオエート骨格連結基、ホスホロジチオエート骨格連結基、アルキル－ホスホネート骨格連結基、およびホスホルアミデート骨格連結基、またはこれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基であって、独立して、ホスホジエステル骨格連結基、ホスホトリエステル骨格連結基、ホスホロチオエート骨格連結基、ホスホロジチオエート骨格連結基、アルキル－ホスホネート骨格連結基、およびホスホルアミデート骨格連結基からなる群から選択されるヌクレオシド間連結基、またはその薬学的に許容できる塩を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、式（Ｉ）の２～１０個の化合物またはこれらの薬学的に許容できる塩を含む。ある実施形態では、式（Ｉ）の２～１０個の化合物は、センス鎖上に存在する。
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の標的ヌクレオチドまたはその薬学的に許容できる塩を含む。
一部の実施形態では、Ｒ３は、式（ＩＩ）：
Figure 2022546040000020
 （式中、
Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、ＯＨであり、
Ａ４は、ＯＨまたはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、ここで、Ｒ５は、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であって、場合によりハロゲン原子で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、またはその薬学的に許容できる塩である）
である。
一部の実施形態では、Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンまたはその薬学的に許容できる塩である。
式（Ｉ）のヌクレオチドを有する修飾ｓｉＲＮＡを製造するために使用される前駆体を、下記の表Ａで例示する。表Ａは、オリゴヌクレオチド合成用のホスホラミダイトヌクレオチド類似体の例を示す。（２Ｓ，６Ｒ）ジアステレオマー系列において、ヌクレオチド前駆体としてのホスホラミダイトを「ｐｒｅ－ｌ」で略記し、ヌクレオチド類似体を「ｌ」で略記し、続いて核酸塩基および番号で略記し、この番号により式（Ｉ）中の基Ｙを規定する。両方の立体化学を区別するために、類似体（２Ｒ，６Ｒ）－ジアステレオ異性体を追加の「ｂ」により示す。標的ヌクレオチド前駆体、標的ヌクレオチド類似体、および固体支持体を、上記で説明したように略記するが、「ｌ」の代わりに「ｌｇ」で略記する。
Figure 2022546040000021
Figure 2022546040000022
Figure 2022546040000023
Figure 2022546040000024
Figure 2022546040000025
Figure 2022546040000026
式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端、３’末端、または両方の末端に組み入れられ得る。例として、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３、４、または５個、またはより多く）の修飾ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端に組み入れられ得る。一部の実施形態では、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３個、またはより多く）の修飾ヌクレオチドが、センス鎖の５’末端に位置しており、この修飾ヌクレオチドは、アンチセンスに相補的ではないが、場合により、アンチセンス鎖の対応する３’末端の相補ヌクレオチドの内の同数以下と対を形成する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、長さが１７、１８、または１９個のヌクレオチドであるセンス配列を有するセンス鎖であって、式（Ｉ）の３～５個のヌクレオチド（例えば、式（Ｉ）の追加のヌクレオチドを含むかまたは含まない３個の連続したｌｇＴ３またはｌｇＴ７）がセンス配列の５’末端に配置されており、このセンス鎖は長さが２０、２１、または２２個のヌクレオチドとなる、センス鎖を含み得る。そのような実施形態では、センス鎖は、センス配列の３’末端に式（Ｉ）の２つの連続したヌクレオチド（例えば、ｌＴ４またはｌＴ３）をさらに含み得、センス鎖は長さが２２、２３、または２４個のヌクレオチドとなる。ｄｓＲＮＡは、長さが１９個のヌクレオチドのアンチセンス配列であって、この３’末端に２つの修飾ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド（例えばｄＴ）にさらに連結され、アンチセンス鎖は長さが２１個のヌクレオチドとなる、アンチセンス配列を含み得る。さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、天然に存在するヌクレオチド間結合（ホスホジエステル結合）のみを含み、アンチセンス鎖は、場合により、天然に存在しないヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、アンチセンス鎖は、その骨格付近に、またはその５’末端および／もしくは３’末端に、ホスホロチオエート結合を含み得る。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドの使用により、天然に存在しないヌクレオチド間結合の使用等の他のＲＮＡ修飾の必要性が回避され、それにより、ｄｓＲＮＡの化学合成が簡略化される。さらに、式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ誘導体（ＧａｌＮＡｃ自体を含む）等の細胞標的部分を容易に含み得、そのようなヌクレオチドが組み込まれたｄｓＲＮＡの送達効率が向上される。さらに、例えばセンス鎖で式（Ｉ）の修飾ヌクレオチドが組み込まれているｄｓＲＮＡは、このｄｓＲＮＡの安定性および治療力価を顕著に改善することが分かっている。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）で説明されているセンス鎖および／またはアンチセンス鎖であって、このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列は相補的であり、第１の配列は、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含む、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を含む。表４中のｓｉＲＮＡは、下記の修飾の内の任意の１つまたはそれ以上を含み得る：ｍＸ＝２’－Ｏ－メチル－ヌクレオチド、ｆＸ＝２’－フルオロ－ヌクレオチド、ｌＸ＝ロックドヌクレオチド、ｄＴ＝デオキシチミジン、ｌｇＴ３＝ｌｇＴ３ヌクレオチド類似体、ｌＴ４＝ｌＴ４ヌクレオチド類似体、ＰＯ＝ホスホジエステル結合；およびＰＳ＝ホスホロチオエート結合。
Figure 2022546040000027
Figure 2022546040000028
Figure 2022546040000029
Figure 2022546040000030
Figure 2022546040000031
Figure 2022546040000032
Figure 2022546040000033
Figure 2022546040000034
Figure 2022546040000035
Figure 2022546040000036
Figure 2022546040000037
Figure 2022546040000038
Figure 2022546040000039
Figure 2022546040000040
Figure 2022546040000041
Figure 2022546040000042
Figure 2022546040000043
Figure 2022546040000044
Figure 2022546040000045
Figure 2022546040000046
Figure 2022546040000047
Figure 2022546040000048
Figure 2022546040000049
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、
ａ）配列番号５７８、５８５、５８７、６２０、６２１、６２２、および６２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖；
ならびに／または
ｂ）配列番号５８９、５９１、６３１、６３２、６３４、６３５、および６３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖
を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、
ａ）配列番号５７８および５８９；［Ｃ０２７．００１］
ｂ）配列番号６２０および６３１；［Ｃ０２７．００３］
ｃ）配列番号５８５および５９１；［Ｃ０２７．００１＃４０］
ｄ）配列番号５８７および５９１；［Ｃ０２７．００１＃５８］
ｅ）配列番号６２１および６３４；［Ｃ０２７．００３＃０３］
ｆ）配列番号６２２および６３２；［Ｃ０２７．００３＃０６］
ｇ）配列番号６２２および６３５；［Ｃ０２７．００３＃０８］
ならびに
ｈ）配列番号６２７および６３９；［Ｃ０２７．００３＃４７］
のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ（例えば第１のｄｓＲＮＡ）は、１つまたはそれ以上の追加のｄｓＲＮＡ（例えば少なくとも第２のｄｓＲＮＡ）と共に、方法または組成物（例えば医薬組成物）で使用される。一部の実施形態では、第２のｄｓＲＮＡはまた、ＰＣＳＫ９も標的とする。一部の実施形態では、第２のｄｓＲＮＡは、第１のｄｓＲＮＡにより標的とされる領域とは異なるＰＣＳＫ９の領域を標的とする。一部の実施形態では、第２のｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子以外の標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する配列を標的とする。一部の実施形態では、第２のｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９と相互作用する遺伝子および／または脂質代謝もしくはコレステロール代謝に関与する遺伝子を標的とする。
ｄｓＲＮＡ修飾
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾を含む。修飾は、例えば、末端修飾、塩基修飾、糖修飾／置換、および骨格修飾を含む、当該技術分野で公知の任意の修飾を含み得る。末端修飾は、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆連結（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）などのような）および３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結などのような）を含み得る。塩基修飾は、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、パートナーの拡張レパートリーと塩基対形成する塩基による置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲートした塩基を含み得る。糖修飾／置換は、例えば、２’もしくは４’位における修飾、または糖の置換を含み得る。骨格修飾は、例えば、ホスホジエステル結合の修飾または置換を含み得る。
本開示のｄｓＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、チオホスフェートおよびホスホロチオエート（例えば、５’－ホスホロチオエート）のような代替のヌクレオチド間結合を含む修飾ヌクレオチド、ホスホトリエステル修飾ヌクレオチド、コレステロール誘導体または親油性部分に末端で結合した修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＰＮＡ；Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７～１５００を参照されたい）、拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ：ｃＥｔ）修飾ヌクレオチド、逆デオキシ修飾ヌクレオチド、逆ジデオキシ修飾ヌクレオチド、ロックド核酸修飾ヌクレオチド、脱塩基修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノ修飾ヌクレオチド、ホスホルアミデート修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位における修飾を含む修飾ヌクレオチド、ならびに非天然塩基含有修飾ヌクレオチドを含む、当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドのうちの１つまたはそれ以上を含み得る。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、５’－ホスホロチオエートヌクレオチド、またはコレステロール誘導体もしくは親油性部分に結合した末端ヌクレオチドである。２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－Ｏ－プロピル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－アミノアルキル、または２’－デオキシ－２’－フルオロ基の、オリゴヌクレオチドのヌクレオシドへの組込みは、オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション特性の向上および／またはヌクレアーゼ安定性の向上を与え得る。さらに、ホスホロチオエート骨格を含有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ安定性の向上を有し得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、および２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、交互パターンの２つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（ＯＭｅ）および２つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチド（Ｆ）、例えば、パターンＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ－ＦまたはパターンＦ－ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、最高１０個の、各々２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、最高１０個の、各々２’－フルオロヌクレオチドである連続ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート基を含む。一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上のホスホロチオエート基を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ホスホロチオエート基を含まない。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホトリエステル基を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上のホスホトリエステル基を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ホスホトリエステル基を含まない。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上の本明細書で説明される様々な修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、最高で２つの連続修飾ヌクレオチド、最高で３つの連続修飾ヌクレオチド、最高で４つの連続修飾ヌクレオチド、最高で５つの連続修飾ヌクレオチド、最高で６つの連続修飾ヌクレオチド、最高で７つの連続修飾ヌクレオチド、最高で８つの連続修飾ヌクレオチド、最高で９つの連続修飾ヌクレオチド、または最高で１０個の連続修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、連続修飾ヌクレオチドは、同じ修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、連続修飾ヌクレオチドは、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、７つもしくはそれ以上、８つもしくはそれ以上、９つもしくはそれ以上、または１０個もしくはそれ以上の様々な修飾ヌクレオチドである。
ｄｓＲＮＡコンジュゲート
本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のリガンド、部分、またはコンジュゲートに化学的／物理的に連結してもよい。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リンカーを介して１つまたはそれ以上のリガンドにコンジュゲート／結合される。例えば、三価分枝リンカーを含む、当該技術分野で公知の任意のリンカーを使用してもよい。リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートすることは、ｄｓＲＮＡの分布を変更すること、ｄｓＲＮＡの細胞吸収および／もしくは特定の組織へのターゲティングおよび／もしくは１つもしくはそれ以上の特定の細胞種（例えば、肝細胞）による取り込みを向上させること、ならびに／またはｄｓＲＮＡ剤の存続期間を向上させることを可能にする。一部の実施形態では、疎水性リガンドは、細胞膜の直接的浸透および／または細胞（例えば、肝細胞）を通る取り込みを促進するために、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リンカーを介して１つまたはそれ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体に結合される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リンカーを介して３つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。一部の実施形態では、リンカーは、三価分枝リンカーである。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、三価分枝リンカーを介して３つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端に結合される。
例示的かつ非限定的なコンジュゲートおよびリンカーは、例えば、Ｂｉｅｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １３（２）：２９５～３０２（２００２）；Ｃｅｄｉｌｌｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２（８）：Ｅ１３５６（２０１７）；Ｇｒｉｊａｌｖｏら、Ｇｅｎｅｓ ９（２）：Ｅ７４（２０１８）；Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ６：１１６～１３２（２０１７）；Ｎａｉｒら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３６：１６９５８～１６９６１（２０１４）；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２６：１４５１～１４５５（２０１５）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２８（３）：１０９～１１８（２０１８）；ならびに米国特許第８，１０６，０２２号、同第９，１２７，２７６号、および同第８，９２７，７０５号において説明される。ＧａｌＮＡｃコンジュゲーションは、当該技術分野で周知の方法により容易に行うことができる（例えば、上記文献において説明される）。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、以下の化合物に結合される。
Figure 2022546040000050
一部の実施形態では、リガンドは、１つまたはそれ以上のターゲティング基（例えば、細胞または組織ターゲティング剤）、例えば、１つまたはそれ以上のタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、またはコリガンドについての特異的親和性を有する分子である。そのようなリガンドは、肝細胞のような特定の細胞種に結合する、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば抗体を含み得るが、これらに限定されない。ターゲティング基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、またはビオチンであり得る。
リガンドは、例えば、タンパク質、炭水化物（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）、リポ多糖、脂質のような天然物質；合成ポリマーのような組換えまたは合成分子；ポリアミン；アルファヘリックスペプチド；レクチン；ビタミン；および補助因子を含み得る。一部の実施形態では、リガンドは、１つまたはそれ以上の染料、架橋結合剤、多環芳香族炭化水素、ペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）、酵素、ハプテン、輸送／吸収促進剤、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、またはイミダゾールクラスター）、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＨＳＡ）、またはＬＤＬである。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコレステロール誘導体または親油性部分にコンジュゲートされる。非限定的に、コレステロールもしくはコレステロール誘導体；コール酸；ビタミン（葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ（トコフェロール）、ビオチン、ピリドキサールのような）；飽和および不飽和の両方を含む胆汁酸もしくは脂肪酸コンジュゲート（ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）およびパルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）およびドコサニル（Ｃ２２）、リトコール酸および／またはリトコール酸オレイルアミンコンジュゲート（リトコール酸オレイル、Ｃ４３）のような）；ポリマー骨格もしくはスキャフォールド（ＰＥＧ、トリエチレングリコール（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＨＥＧ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）：ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）：ＰＬＧ）、流体力学ポリマーのような）；ステロイド（ジヒドロテストステロンのような）；テルペン（トリテルペンのような）；カチオン性脂質もしくはペプチド；ならびに／または脂質もしくは脂質ベースの分子を含む、当該技術分野で公知の任意の親油性化合物を、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートしてもよい。そのような脂質または脂質ベースの分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合し得る。脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの標的組織への結合をモジュレート（例えば、制御）するために使用してもよい。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓にターゲティングされる可能性がより低く、それゆえ、身体から除去される可能性がより低い。標的組織は、肝臓の実質細胞を含む、肝臓であってもよい。
Ｉ．組成物
本開示のある特定の態様は、本明細書で説明されるｄｓＲＮＡを含む組成物（例えば、医薬組成物）に関する。一部の実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物）は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。一部の実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物）は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現または活性と関連付けられる疾患または障害を治療するために有用である。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現と関連付けられる疾患または障害は、脂血症（例えば、高脂血症）、および／または高コレステロール血症、高トリグリセリド血症のような他の型の脂質不均衡、ならびに心疾患および循環器疾患のようなこれらの障害と関連付けられる病理学的状態である。本開示の組成物（例えば、医薬組成物）は、送達様式に基づいて製剤化され、例えば、非経口送達を介する肝臓への送達のために製剤化された組成物を含む。
本開示の組成物（例えば、医薬組成物）は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与することができる。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの好適な用量は、０．０１ｍｇ／レシピエントの体重１ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
当業者は、非限定的に、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の健康全般および／または年齢、ならびに存在する１つまたはそれ以上の他の疾患を含む、ある特定の因子が、対象を有効に治療するために必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解する。さらに、対象の、治療有効量の医薬組成物による治療は、単回の治療または一連の治療を含み得る。本明細書で開示されるｄｓＲＮＡについての有効投与量およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期の見積もりは、従来法を使用して、または適切な動物モデルを使用するｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて行うことができる。
本開示のｄｓＲＮＡ分子は、薬学的に許容できる担体または希釈剤中で製剤化してもよい。薬学的に許容できる担体は、液体であっても、固形であってもよく、所望の原体、一貫性、ならびに他の適切な輸送および化学特性を提供することを念頭に計画された投与様式により選択してもよい。例えば、水、生理食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填材（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、潤滑剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）、カルシウム塩（例えば、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウムなど）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を含む、任意の公知の薬学的に許容できる担体または希釈剤を使用してもよい。
本開示のｄｓＲＮＡ分子は、他の分子、分子構造、または核酸混合物と混合した、これに被包した、これとコンジュゲートした、または別の方法でこれと関連付けられるｄｓＲＮＡを含有する組成物（例えば、医薬組成物）に製剤化してもよい。例えば、本明細書で説明される１つまたはそれ以上のｄｓＲＮＡを含む組成物は、他の脂質低下剤（例えば、スタチン）のような他の治療剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物）は、送達媒体（本明細書で説明される）をさらに含む。
ＩＩ．ｄｓＲＮＡを製造する方法
本開示のｄｓＲＮＡは、当該技術分野で公知の任意の方法により合成することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、自動合成機の使用により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および精製により（例えば、市販されているｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ合成キットを使用して）、細胞（例えば、ｄｓＲＮＡをコードする発現カセット／ベクターを含む細胞）からの転写および精製などにより、合成することができる。
修飾ｄｓＲＮＡの製造
リガンドをコンジュゲートしたｄｓＲＮＡ、およびリガンド分子を有する本開示の配列特異的結合ヌクレオシドを、当該技術分野で公知の任意の方法によりアセンブルしてもよく、例えば、標準のヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体；または結合部分を既に有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体；リガンド分子を既に有するリガンド－ヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体；またはヌクレオシドリガンド非保有基本単位を利用する好適なＤＮＡ合成機でのアセンブリによる方法を含む。
本開示のリガンドをコンジュゲートしたｄｓＲＮＡは、当該技術分野で公知の任意の方法により合成してもよく、例えば、結合分子の、ｄｓＲＮＡへの結合に由来するような、ペンダント反応性官能基を有するｄｓＲＮＡの使用による方法を含む。一部の実施形態では、この反応性オリゴヌクレオチドは、市販されているリガンド、様々な保護基のいずれかを有するように合成されたリガンド、またはリガンドに結合した結合部分を有するリガンドと直接的に反応させることができる。一部の実施形態では、方法は、リガンドと適切にコンジュゲートし、固体支持材料にさらに結合してもよいヌクレオシドモノマーの使用により、リガンドをコンジュゲートしたｄｓＲＮＡの合成を促進する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合したアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、最初にモノマー基本単位を、長鎖アミノアルキル基を介して制御細孔ガラス支持体に共有結合させ；その後、ヌクレオチドを、標準の固相合成技法により、固体支持体に結合したモノマー基本単位に結合させることにより製造される。モノマー基本単位は、固相合成と適合性のヌクレオシドまたは他の有機化合物であってもよい。
一部の実施形態では、５’末端にアミノ基を所有する本開示の官能化ヌクレオシド配列は、ＤＮＡ合成機を使用して製造され、その後、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応される。活性エステル誘導体は、当業者に周知である。アミノ基と活性エステルとの反応は、選択されたリガンドが連結基を通して５’位に結合された、オリゴヌクレオチドを産生する。５’末端のアミノ基は、５’－アミノモディファイアＣ６試薬を利用して製造することができる。一部の実施形態では、リガンド分子は、リガンド－ヌクレオシドホスホルアミダイトの使用により５’位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ、ここで、リガンドは、５’ヒドロキシ基に、直接的にまたはリンカーを介して間接的に連結される。そのようなリガンド－ヌクレオシドホスホルアミダイトは、典型的に、自動合成手技の最後に使用されて、５’末端にリガンドを有する、リガンドをコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを提供する。
ＩＩＩ．ベクターおよびｄｓＲＮＡ送達
本開示のｄｓＲＮＡは、直接的または間接的に送達することができる。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含む組成物（例えば、医薬組成物）を対象に投与することにより直接的に送達される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、本明細書で説明される１つまたはそれ以上のベクターを投与することにより間接的に送達される。
送達
本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡによる使用について核酸分子を送達する方法を適合させることによる方法（例えば、Ａｋｈｔａｒ， Ｓ．ら （１９９２） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２（５）：１３９～１４４；ＷＯ ９４／０２５９５を参照されたい）、または当該技術分野で公知のさらなる方法による方法（例えば、Ｋａｎａｓｔｙ， Ｒ．ら （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：９６７～９７７；Ｗｉｔｔｒｕｐ， Ａ．およびＬｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｊ． （２０１５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：５４３～５５２；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ， Ｋ．ら （２００９） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ８：１２９～１３８；Ｇａｒｙ， Ｄ．ら （２００７） １２１（１－２）：６４～７３；Ｗａｎｇ． Ｊ．ら （２０１０） ＡＡＰＳ Ｊ． １２（４）：４９２～５０３；Ｄｒａｚ， Ｍ．ら （２０１４） Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ４（９）：８７２～８９２；Ｗａｎ， Ｃ．ら （２０１３） Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌ． Ｒｅｓ． ４（１）：７４～８３；Ｅｒｄｍａｎｎ， Ｖ． Ａ．およびＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．（編） （２０１０） 「ＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＤＯＩ １０．１００７／９７８－３－６４２－１２１６８－５；Ｘｕ， Ｃ．およびＷａｎｇ， Ｊ． （２０１５） Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０（１）：１～１２を参照されたい）を含む、当該技術分野で公知の任意の方法により送達することができる。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含む送達媒体により送達される。一部の実施形態では、送達媒体は、リポソーム、リポプレックス、複合体、またはナノ粒子である。
リポソーム製剤
リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性の内部とを有する単層または多層小胞である。一部の実施形態では、リポソームは、球状の二層（複数可）内に配置された両親媒性脂質からなる小胞である。水性部分は、送達されるべき組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有する。リポソームの利点は、例えば、天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であること；リポソームは、広範な水溶性および脂溶性薬物を組み込むことができること；リポソームは、それらの内部区画内に被包した薬物を代謝および分解から保護することができることを含む（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ、およびＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１巻、２４５頁）。リポソーム製剤の調製において重要な考慮すべきことは、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性体積である。例えば、操作されたカチオン性リポソームおよび立体的に安定化されたリポソームは、ｄｓＲＮＡを送達するために使用することができる。例えば、Ｐｏｄｅｓｔａら （２００９） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４６４、３４３～５４；米国特許第５，６６５，７１０号を参照されたい。
核酸－脂質粒子
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全に被包されて、例えば、核酸－脂質粒子、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、またはＳＮＡＬＰを形成する。本明細書で使用される場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む、安定な核酸－脂質粒子を指す。本明細書で使用される場合、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内に被包されたプラスミドＤＮＡを含む核酸－脂質粒子を指す。核酸－脂質粒子、例えばＳＮＡＬＰは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の循環存続期間の延長を呈し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離した部位）において蓄積するので、それらは全身適用に有用である。ＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開公報第００／０３６８３号で示される被包された濃縮剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、核酸－脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸－脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第６，５３４，４８４号；同第６，８１５，４３２号；およびＰＣＴ公開公報第９６／４０９６４号で開示されている。
一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、カチオン性脂質を含む。当該技術分野で公知の任意のカチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、非カチオン性脂質を含む。当該技術分野で公知の任意の非カチオン性脂質またはその混合物を使用することができる。一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、コンジュゲートした脂質（例えば、凝集を防ぐための）を含む。当該技術分野で公知の任意のコンジュゲートした脂質を使用することができる。
さらなる製剤
ｄｓＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｖｏでうまく送達するために考慮することが重要な因子は：（１）送達される分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果を防ぐこと、および（３）標的組織における送達された分子の蓄積を含む。ｄｓＲＮＡの非特異的効果は、局所投与により、例えば、組織への直接注射もしくはインプランテーション、または調製物を局部投与することにより最小限にすることができる。疾患の治療のためにｄｓＲＮＡを全身投与するために、ｄｓＲＮＡを、修飾するか、またはあるいは薬物送達系を使用して送達してもよく；両方の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防ぐように作用する。また、ＲＮＡまたは医薬担体の修飾は、ｄｓＲＮＡ組成物の、標的組織へのターゲティングを可能にし、望ましくないオフターゲット効果を避けることができる。上記に説明される通り、ｄｓＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上し、分解を防ぐために、コレステロールのような親油性基への化学コンジュゲーションにより修飾してもよい。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系のような薬物送達系を使用して送達される。正に荷電したカチオン性送達系は、ｄｓＲＮＡ分子（負に荷電している）の結合を促進し、また、負に荷電した細胞膜における相互作用を向上して、細胞によるｄｓＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｄｓＲＮＡに結合させるか、またはｄｓＲＮＡを包む小胞もしくはミセルを形成するように誘導してもよい（例えば、Ｋｉｍ Ｓ．Ｈ．ら （２００８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７～１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与されたときのｄｓＲＮＡの分解をさらに防ぐ。カチオン性ｄｓＲＮＡ複合体を製造および投与する方法は、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。
ベクターにコードされたｄｓＲＮＡ
本開示のｄｓＲＮＡは、組換えベクターがコードしてもよい。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、原核細胞における発現と適合性である。一部の実施形態では、ベクターは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ．）における発現と適合性である。一部の実施形態では、ベクターは、真核細胞における発現と適合性である。一部の実施形態では、ベクターは、酵母細胞における発現と適合性である。一部の実施形態では、ベクターは、脊椎動物細胞における発現と適合性である。例えば、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ：ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど）、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス（例えば、オルソポックスまたはアビポックス）などに由来するベクターを含む、当該技術分野で公知の、ｄｓＲＮＡをコードすることができる任意の発現ベクターを使用することができる。ウイルスベクターまたはウイルス由来ベクターの指向性は、適宜、ベクターを、１つもしくはそれ以上の他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原で偽型化することにより、または様々なウイルスカプシドタンパク質を置換することにより、改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質による偽型であり得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを、様々なカプシドタンパク質血清型を発現するように操作することにより、様々な細胞をターゲティングするようにさせることができる。例えば、血清型２ゲノムの血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクターのこの血清型２カプシド遺伝子を、血清型５カプシド遺伝子により置換して、ＡＡＶ２／５ベクターを産生してもよい。様々なカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、以前に、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら （２００２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７９１～８０１で、説明されている。
組換えベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現させるために核酸配列をベクターに挿入するための方法、およびベクターを目的の１つまたはそれ以上の細胞に送達する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｄｏｍｂｕｒｇ （１９９５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． ２：３０１～３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８～６１４；Ｍｉｌｌｅｒ （１９９０） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． １：５～１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５～３０；Ｘｉａら （２００２） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０：１００６～１０１０；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら （２００３） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３３：４０１～４０６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：３０９６～３１０１；Ｆｉｓｈｅｒら （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：５２０～５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉら （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３－３８２２～３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；同第５，１３９，９４１号；ＷＯ ９４／１３７８８；およびＷＯ ９３／２４６４１を参照されたい。
本明細書で説明されるｄｓＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織におけるｄｓＲＮＡの発現に十分な調節エレメント（例えば、異種のプロモーター、エンハンサーなど）を含み得る。一部の実施形態では、ベクターは、１つまたはそれ以上の異種のプロモーターに連結されたｄｓＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上の配列を含む。例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む、ｄｓＲＮＡを発現することができる、当該技術分野で公知の任意の異種のプロモーターを使用することができる。１つまたはそれ以上の異種のプロモーターは、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、調節可能プロモーター、および／または組織特異的プロモーターであり得る。さらなるプロモーターの選択は、当業者の能力の範囲内である。一部の実施形態では、調節エレメントは、構成的発現を提供するために選択される。一部の実施形態では、調節エレメントは、調節発現／誘導性発現／抑制性発現を提供するために選択される。一部の実施形態では、調節エレメントは、組織特異的発現を提供するために選択される。一部の実施形態では、調節エレメントとｄｓＲＮＡをコードする配列とは、転写ユニットを形成する。
本開示のｄｓＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ａら （１９９６） ＴＩＧ １２：５～１０；ＷＯ ００／２２１１３；ＷＯ ００／２２１１４；および米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞種によって、一過性（数時間～数週間の単位で）であっても、維持型（数週間～数ヶ月間またはそれ以上）であってもよい。これらの導入遺伝子は、直鎖状構築物、環状プラスミド、または組込み型もしくは非組込み型ベクターであり得るウイルスベクターとして導入してもよい。また、導入遺伝子は、導入遺伝子が、染色体外プラスミドとして受け継がれることを可能にするように構築してもよい（Ｇａｓｓｍａｎｎら （１９９５） ＰＮＡＳ ９２：１２９２）。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、別々の発現ベクターにコードされる。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ標的細胞に共導入される（例えば、トランスフェクションまたは感染により）２つの別々の発現ベクターで発現される。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターにコードされる。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターに位置する別々のプロモーターから転写される。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ発現ベクターの同じプロモーターから転写される。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、ｄｓＲＮＡがステムおよびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列により接合される逆反復として同じプロモーターから転写される。
ＩＶ．細胞
本開示のある特定の態様は、本明細書で説明されるｄｓＲＮＡを含む１つもしくはそれ以上の単離された細胞、または本明細書で説明されるｄｓＲＮＡをコードするベクターを含む１つもしくはそれ以上の細胞に関する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の細胞は、原核細胞である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の細胞は、大腸菌細胞である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の細胞は、真核細胞である。例えば、酵母細胞、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養における増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、 Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３～２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；Ｈｅｐ３Ｂ細胞；Ｃ３Ａ細胞；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞のような、例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４～６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；骨髄腫細胞株（ＮＳ０およびＳｐ２／０のような）；および対象からの初代細胞（ヒトまたは非ヒト霊長類から単離された初代細胞のような）を含む、当該技術分野で公知の任意の真核細胞は、本明細書で説明されるｄｓＲＮＡまたはベクターを含むことができる。
Ｖ．ｄｓＲＮＡを使用する方法
本開示のある特定の態様は、哺乳動物においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法であって、有効量の、１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡ、１つもしくはそれ以上の本開示のベクター、または１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡを含む本開示の組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む方法に関する。本開示のある特定の態様は、１つまたはそれ以上のＰＣＳＫ９媒介疾患または障害を治療および／または予防する方法であって、１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡ、および／または１つもしくはそれ以上の本開示のベクター、および／または１つもしくはそれ以上の本開示のｄｓＲＮＡを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、対象においてＰＣＳＫ９発現をダウンレギュレートすることは、対象においてＰＣＳＫ９媒介疾患または障害の１つまたはそれ以上の症状を軽減する。ｄｓＲＮＡの例は、節ＩＩにおいて説明される。
一部の実施形態では、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、治療前レベルと比較して、治療後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％阻害される。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、治療前レベルと比較して、治療後に少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、または少なくとも約１００倍阻害される。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、対象の肝臓において阻害される。
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、ＰＣＳＫ９媒介障害または疾患を有するか、またはこれを有すると診断されている。一部の実施形態では、対象は、ＰＣＳＫ９媒介障害または疾患を有することが疑われる。一部の実施形態では、対象は、ＰＣＳＫ９媒介障害または疾患を発症するリスクに晒されている。
本明細書で説明されるｄｓＲＮＡおよび組成物（例えば、医薬組成物）は、脂血症（例えば、高脂血症）、および／または高コレステロール血症、高トリグリセリド血症のような他の型の脂質不均衡、ならびに心疾患および循環器疾患のようなこれらの障害と関連付けられる病理学的状態を治療するために使用することができる。一部の実施形態では、方法は、有効量のｄｓＲＮＡを、ヘテロ接合ＬＤＬＲ遺伝子型を有する対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、本明細書で説明される方法のいずれかによりＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する効果は、対象においてコレステロールレベルの減少をもたらす。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する効果は、対象の血中のコレステロールの減少をもたらす。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する効果は、対象の血清中のコレステロールの減少をもたらす。一部の実施形態では、コレステロールレベルは、治療前レベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％またはそれ以上減少する。一部の実施形態では、コレステロールレベルは、治療前レベルと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍またはそれ以上減少する。
本明細書で説明されるｄｓＲＮＡまたは組成物（例えば、医薬組成物）は、非限定的に、経口経路、または静脈内、筋内、皮下、肺、経皮、および気道（エアロゾル）投与を含む非経口経路を含む、当該技術分野で公知の任意の手段により投与することができる。典型的に、高脂血症を有する哺乳動物を治療する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、非経口手段により全身投与される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、皮下投与により投与される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、静脈内投与により投与される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡおよび／または組成物は、肺投与により投与される。
ｄｓＲＮＡの治療効果または予防効果は、疾患状態の１つもしくはそれ以上のパラメーターの統計的に有意な改善がある場合、またはｄｓＲＮＡでなければ症状が予測されるようなところで症状を悪化もしくは発症しないことにより、明らかである。例えば、疾患の測定可能なパラメーターにおける少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上の都合のよい変化は、有効な治療を示し得る。また、所与のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む組成物についての効能は、当該技術分野で公知の所与の疾患または障害についての実験動物モデルを使用して判断してもよい。実験動物モデルを使用する場合、治療の効能は、マーカーまたは症状の統計的に有意な低減が観察された場合、証明される。
追加の剤
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡと追加の治療剤とは、同じ組成物中で組合せにて投与される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡと追加の治療剤とは、別々の組成物の部分として投与される。一部の実施形態では、別々の組成物は、同時に投与される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡを含む組成物が最初に対象に投与され、その後、追加の治療剤が対象に投与される。一部の実施形態では、追加の治療剤を含む組成物が最初に対象に投与され、その後、ｄｓＲＮＡを含む組成物が対象に投与される。
追加の治療剤の例は、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、または脂質異常症のような脂質障害を治療するための当該技術分野で公知のいずれかを含む。例えば、追加の剤は、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）、フィブレート、胆汁酸封鎖剤、ナイアシン、抗血小板薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、ロサルタンカリウム）、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｙｌＣｏＡ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル転送タンパク質（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロールモジュレーター、胆汁酸モジュレーター、またはペルオキシソーム増殖活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）アゴニストのうちの１つまたはそれ以上であってもよい。特定の例は、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、エゼチミブ、ベザフィブレート、クロフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、シプロフィブレート、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム、およびナイアシンを含むが、これらに限定されない。ＰＣＳＫ９をターゲティングするｄｓＲＮＡとの投与に好適な例示的な組合せ治療は、例えば、ナイアシン／ロバスタチン、アムロジピン／アトルバスタチン、およびエゼチミブ／シンバスタチンを含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で説明されるｄｓＲＮＡをどのように投与するかを、エンドユーザー（例えば、介護者または対象）に教示する方法を提供する。方法は、場合により、エンドユーザーに１つまたはそれ以上の用量のｄｓＲＮＡを提供することと、エンドユーザーに本明細書で説明されるレジメンでｄｓＲＮＡを投与するように教示し、これにより、エンドユーザーを教示することとを含む。
患者の特定
一部の実施形態では、本開示は、対象が、ＬＤＬ低下、ＨＤＬ低下を伴わないＬＤＬ低下、ＡｐｏＢ低下、または総コレステロール低下を必要としていることに基づいて、対象を選択することにより対象を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、対象に、対象のＬＤＬレベルまたはＡｐｏＢレベルを低下させる（ＨＤＬレベルを実質的に低下させることなく）のに十分な量でｄｓＲＮＡを投与することを含む。
遺伝的素因は、標的遺伝子関連疾患、例えば、高脂血症の発症において役割を果たす。それゆえ、ｄｓＲＮＡを必要とする対象は、家族歴を聴取すること、または例えば、１つもしくはそれ以上の遺伝子マーカーもしくはバリアントについてスクリーニングすることにより特定することができる。高脂血症に関与する遺伝子の例は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡｌ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥなど）、コレステリルエステル転送タンパク質（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ：ＬＰＬ）、肝性リパーゼ（ｈｅｐａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ：ＬＩＰＣ）、内皮性リパーゼ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｐａｓｅ：ＥＬ）、レシチン：コレステリルアシルトランスフェラーゼ（ｌｅｃｉｔｈｉｎ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＬＣＡＴ））を含み得るが、これらに限定されない。
医師、看護師、または家族のメンバーのような医療提供者は、ｄｓＲＮＡを処方または投与する前に家族歴を聴取してもよい。加えて、遺伝子型または表現型を決定するために試験を行ってもよい。例えば、ＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡを対象に投与する前に、対象からのサンプル、例えば血液サンプルについてＤＮＡ試験を行って、ＰＣＳＫ９遺伝子型および／または表現型を特定してもよい。一部の実施形態では、試験は、関連する遺伝子型および／または表現型、例えば、ＬＤＬＲ遺伝子型を特定するために行われる。ＬＤＬＲ遺伝子を有する遺伝子バリアントの例は、当該技術分野で公知である（Ｃｏｓｔａｎｚａら （２００５） Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． １５；１６１（８）：７１４～２４；Ｙａｍａｄａら （２００８） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． Ｊａｎ；４５（１）：２２～８；およびＢｏｅｓら （２００９） Ｅｘｐ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌ． ４４：１３６～１６０）。
ＶＩ．キットおよび製造物品
本開示のある特定の態様は、本明細書で説明されるＰＣＳＫ９媒介障害または疾患の治療および／または予防に有用な、本明細書で説明されるｄｓＲＮＡ、ベクター（複数可）、または組成物（複数可）（例えば、医薬組成物（複数可））のうちの１つまたはそれ以上を含む、製造物品またはキットに関する。製造物品またはキットは、容器と、容器上または容器に伴うラベルまたは添付文書とをさらに含み得る。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成することができる。容器は、それ自体でまたは別の組成物と組み合わせて、疾患を治療または予防するために有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針による穿刺可能なストッパーを有する、静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書で説明されるｄｓＲＮＡである。ラベルまたは添付文書は、組成物がＰＣＳＫ９媒介障害または疾患を治療するために使用されることを示す。一部の実施形態では、疾患は、脂血症（例えば、高脂血症）、および／または高コレステロール血症、高トリグリセリド血症のような他の型の脂質不均衡、ならびに心疾患および循環器疾患のようなこれらの障害と関連付けられる病理学的状態である。さらに、製造物品またはキットは、（ａ）組成物を含有する第１の容器であって、組成物が本明細書で説明されるｄｓＲＮＡを含む、第１の容器と；（ｂ）組成物を含有する第２の容器であって、組成物が第２の治療剤を含む、第２の容器とを含み得る。本開示のこの実施形態における製造物品またはキットは、組成物が特定の疾患を治療するために使用することができることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいはまたは加えて、製造物品またはキットは、注射用静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝液、リンガー液、およびデキストロース溶液のような、薬学的に許容できる緩衝液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
本開示を限定するものではないが、本開示のいくつかの実施形態は、例示の目的のために以下に説明される。
項目１：二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列は相補的であり、第１の配列は、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含む、ｄｓＲＮＡ。
項目２：ｄｓＲＮＡは、
（１）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号１７６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号１７７）を含むか、
（２）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８１）を含むか、
（３）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号１８３）を含むか、
（４）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号１８４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号１８５）を含むか、
（５）センス鎖中にＣＣＡＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号１８６）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８７）を含むか、
（６）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８９）を含むか、
（７）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号３２３）を含むか、
（８）センス鎖中にＣＣＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号３２４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵｄｔｄｔ（配列番号３２５）を含むか、
（９）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号３２７）を含むか、
（１０）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３２９）を含むか、
（１１）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３３１）を含むか、
（１２）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号３３２）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号３３３）を含むか、
（１３）センス鎖中にＣＣＡＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３４）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵｄＴｄＴ（配列番号３３５）を含むか、
（１４）センス鎖中にＣＣＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣｄＴｄＴ（配列番号３３７）を含むか、
（１５）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号３３９）を含むか、
（１６）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３４０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４１）を含むか、
（１７）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号３４２）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４３）を含むか、
または
（１８）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号３４４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４５）を含む、
項目１に記載のｄｓＲＮＡ。
項目３：二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列のみが相補的であり、第１の配列は、配列番号３、４、および１３の内の１つである、ｄｓＲＮＡ。
項目４：ｄｓＲＮＡは、
（１９）センス鎖中にＣＣＡＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１６２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣＡＡｄＴｄＴ（配列番号１６３）を含むか、
（２０）センス鎖中にＣＣＡＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１６６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣｄＴｄＴ（配列番号１６７）を含むか、
または
（２１）センス鎖中にＣＣＡＧＡＧＵＧＵＧＡＡＡＧＧＵＧＣＵＧＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号２９０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＣＡＧＣＡＣＣＵＵＵＣＡＣＡＣＵＣｄＴｄＴ（配列番号２９１）を含む、
項目３に記載のｄｓＲＮＡ。
項目５：第１の配列および第２の配列は、それぞれ、長さが３０個以下のヌクレオチドである、項目１～４のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目６：第１の配列および第２の配列は、それぞれ、長さが少なくとも１９個および２３個以下のヌクレオチドである、項目１～５のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目７：ｄｓＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目１～６のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目８：ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む、項目１～７のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目９：１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドの内の少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、５’－ホスホロチオエートヌクレオチド、またはコレステロール誘導体もしくは親油性部分に連結されている末端ヌクレオチドである、項目８に記載のｄｓＲＮＡ。
項目１０：１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドの内の少なくとも１つは、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メトキシエチル、拘束エチル（ｃＥｔ）、逆位デオキシ、逆位ジデオキシ、ロックド核酸、脱塩基、２’－アミノ、２’－アルキル、モルホリノ、ホスホルアミデート、または非天然の塩基含有ヌクレオチドである、項目８に記載のｄｓＲＮＡ。
項目１１：ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと、１つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドとを含む、項目１０に記載のｄｓＲＮＡ。
項目１２：ｄｓＲＮＡは、２つ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと、２つ以上の２’－フルオロヌクレオチドとを、下記のパターン
ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ－ＦまたはＦ－ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ
（式中、ＯＭｅは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを表し、Ｆは、２’－フルオロヌクレオチドを表す）で含む、
項目１１に記載のｄｓＲＮＡ。
項目１３：ｄｓＲＮＡは、それぞれ２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである最大１０個の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれぞれ２’－フルオロヌクレオチドである最大１０個の連続したヌクレオチドを含む、項目１１に記載のｄｓＲＮＡ。
項目１４：ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート基を含む、項目１～１３のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目１５：ｄｓＲＮＡはホスホロチオエート基を含まない、項目１～１３のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目１６：ｄｓＲＮＡは１つまたはそれ以上のホスホトリエステル基を含む、項目１～１５のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目１７：ｄｓＲＮＡはホスホトリエステル基を含まない、項目１～１５のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目１８：ｄｓＲＮＡは、リンカーを介して１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に付着している、項目１～１７のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目１９：ｄｓＲＮＡは、三価分枝リンカーを介して３つのＧａｌＮＡｃ誘導体に付着している、項目１８に記載のｄｓＲＮＡ。
項目２０：１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体の内の少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、またはセンス鎖の５’末端に付着している、項目１８または１９に記載のｄｓＲＮＡ。
項目２１：センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングをさらに含む、項目１、３、および５～２０のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目２２：センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングをさらに含む、項目１、３、および５～２１のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目２３：３’オーバーハングは２つのヌクレオチドを含む、項目２２に記載のｄｓＲＮＡ。
項目２４：オーバーハングは１つまたはそれ以上のチミンを含む、項目２１～２３のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目２５：ｄｓＲＮＡは、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する、項目１～２４のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目２６：ｄｓＲＮＡの鎖の一方または両方は、式（Ｉ）：
Figure 2022546040000051
 （式中、
－ Ｂは、複素環式核酸塩基であり；
－ Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分、または式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、
－ Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、またはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、ここで、Ｒ１は、
（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であって、場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されており、ここで、
Ｊは、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基、
（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３であって、ここで、
ｍは、０または１を意味する整数であり、
ｐは、０～１０の範囲の整数であり、
Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、または－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、ここで、
Ｋは、ＯまたはＳであり、
Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、またはＲ３は、細胞ターゲティング部分である、基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３
であり、
－ Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
－ Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）
の構造を有する１つまたはそれ以上の化合物を含むか、またはその薬学的に許容できる塩である、
項目１に記載のｄｓＲＮＡ。
項目２７：式（Ｉ）（式中、Ｙは、
ａ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
ｂ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であって、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であり；
ｃ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であり；
ｄ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、シクロヘキシル基であり；
ｅ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
ｆ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、フェニル基で置換されているメチル基であり；
ｇ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、場合により置換された（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であるか、
または
ｈ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、メチルもしくはペンタデシルである）
の１つまたはそれ以上の化合物を含む項目２６に記載のｄｓＲＮＡ。
項目２８：式（Ｉ）（式中、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリン、および置換プリンからなる群から選択される）の１つもしくはそれ以上の化合物またはその薬学的に許容できる塩を含む項目２６または２７に記載のｄｓＲＮＡ。
項目２９：Ｒ３は、式（ＩＩ）
Figure 2022546040000052
 （式中、
Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、ＯＨであり、
Ａ４は、ＯＨもしくはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、ここで、Ｒ５は、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であって、場合により、ハロゲン原子で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキルである）
またはその薬学的に許容できる塩である、項目２６～２８のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３０：Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンまたはその薬学的に許容できる塩である、項目２６～２９のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３１：表Ａからの１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む項目２６～３０のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３２：式（Ｉ）の２～１０個の化合物またはこれらの薬学的に許容できる塩を含む項目２６～３１のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３３：式（Ｉ）の２～１０個の化合物は、センス鎖上に存在する、項目３２に記載のｄｓＲＮＡ。
項目３４：センス鎖は、５’末端に式（Ｉ）の２～５個の化合物を含み、および／または３’末端に式（Ｉ）の１～３個の化合物を含む、項目２６～３３のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３５：
ａ）センス鎖の５’末端における式（Ｉ）の２～５個の化合物は、ｌｇＴ３を含み、場合により、３個の連続したｌｇＴ３ヌクレオチドを含み；
および／または
ｂ）センス鎖の３’末端における式（Ｉ）の１～３個の化合物は、ｌＴ４を含み；場合により、２個の連続したｌＴ４を含む、
項目２６～３４のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３６：１つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基であって、独立して、ホスホジエステル骨格連結基、ホスホトリエステル骨格連結基、ホスホロチオエート骨格連結基、ホスホロジチオエート骨格連結基、アルキル－ホスホネート骨格連結基、およびホスホルアミデート骨格連結基からなる群から選択されるヌクレオシド間連結基、またはその薬学的に許容できる塩を含む項目２６～３５のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３７：表２～４中のｄｓＲＮＡから選択される項目２６～３６のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３８：
ａ）センス鎖は、配列番号５７８、５８５、５８７、６２０、６２１、６２２、および６２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；
ならびに／または
ｂ）アンチセンス鎖は、配列番号５８９、５９１、６３１、６３２、６３４、６３５、および６３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
項目２６～３７のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ。
項目３９：ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、
ａ）配列番号５７８および５８９；［Ｃ０２７．００１］
ｂ）配列番号６２０および６３１；［Ｃ０２７．００３］
ｃ）配列番号５８５および５９１；［Ｃ０２７．００１＃４０］
ｄ）配列番号５８７および５９１；［Ｃ０２７．００１＃５８］
ｅ）配列番号６２１および６３４；［Ｃ０２７．００３＃０３］
ｆ）配列番号６２２および６３２；［Ｃ０２７．００３＃０６］
ｇ）配列番号６２２および６３５；［Ｃ０２７．００３＃０８］
ならびに
ｈ）配列番号６２７および６３９；［Ｃ０２７．００３＃４７］
のヌクレオチド配列を含む、項目３８に記載のｄｓＲＮＡ。
項目４０：項目１～３９のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡをコードするベクター。
項目４１：項目１～３９のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡまたは項目４０に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
項目４２：項目１～３９のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡを含むキット。
項目４３：項目１～３９のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡを含む組成物。
項目４４：薬学的に許容できる担体をさらに含む項目４３に記載の組成物。
項目４５：送達ビヒクルをさらに含む項目４３または４４に記載の組成物。
項目４６：送達ビヒクルは、リポソーム、リポプレックス、複合体、およびナノ粒子からなる群から選択される、項目３１に記載の組成物。
項目４７：対象中でＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法であって、対象に、項目１～３９のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡまたは項目４４に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
項目４８：必要な対象のＰＣＳＫ９媒介疾患を処置するかまたは予防する方法であって、対象に、項目１～３９のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡまたは項目４４に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
項目４９：ＰＣＳＫ媒介障害は高コレステロール血症である、項目４８に記載の方法。
項目５０：対象の肝臓中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡにより阻害される、項目４８または４９に記載の方法。
項目５１：投与は、皮下投与、静脈内投与、または肺投与である、項目４８～５０のいずれか１つに記載の方法。
項目５２：対象はヒトである、項目４８～５１のいずれか１つに記載の方法。
項目５３：投与により、対象の血清コレステロールが低下する、項目４８～５２のいずれか１つに記載の方法。
項目５４：ＰＣＳＫ媒介疾患を処置するかまたは予防するための１種またはそれ以上の追加の治療薬の有効量を対象に投与することをさらに含む項目４８～５３のいずれか１つに記載の方法。
上記の開示は、理解を明確にするために説明および例としてある程度詳細に説明されているが、この説明および例は、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
実施例
本開示は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定すると解釈するべきではない。本明細書で説明される実施例および実施形態は、単に例示の目的のためであり、それらに照らした様々な改変または変化は、当業者に示唆され、本出願および附属の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれるべきであることが理解される。
ヒトＰＣＳＫ９発現の阻害についてのｓｉＲＮＡの特定
方法
ｓｉＲＮＡ産生
陰性対照ｓｉＲＮＡ（「ＬＶ２陰性対照」および「ＬＶ２陰性対照２」）を含むｓｉＲＮＡを、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して産生した。陽性対照ｓｉＲＮＡ ｓ４８６９４を、Ａｍｂｉｏｎから購入した。ヌクレオチド修飾を含む各ｓｉＲＮＡの配列を、上記表２に示す。
細胞および組織培養
ヒトＨｅｐ３ＢおよびヒトＣ３Ａ細胞を、以下の通り培養した。ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞を、３７℃、ＣＯ２ ５％、およびＲＨ９５％で増殖させ、１０％ＦＢＳを補充したＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－２００３）で培養した。ヒトＣ３Ａ細胞を、３７℃、ＣＯ２ ５％、およびＲＨ９５％で増殖させ、１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１０９０）で培養した。
トランスフェクション
ノックダウン実験のために、細胞２０，０００個／ウェルのＨｅｐ３ＢまたはＣ３Ａ細胞を、９６ウェルプレートにおいて使用した。細胞に、示される濃度のｓｉＲＮＡを、０．２μｌ／ウェルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造業者のプロトコールに従って逆トランスフェクション設定においてトランスフェクトし、培地交換なしで４８時間インキュベートした。通常、１つの試験サンプルにつき、Ｎ＝４回の技術的反復を行った。ｓｉＲＮＡ関連毒性を試験するために、１５，０００個のＨｅｐ３ＢまたはＣ３Ａ細胞に、上記に説明される通りにトランスフェクトし、７２時間インキュベートした。
ｍＲＮＡ発現分析
ｓｉＲＮＡトランスフェクション４８時間後、細胞ＲＮＡを、ＰｒｏｍｅｇａのＳＶ９６トータルＲＮＡ単離システム（カタログ番号Ｚ３５００）の利用により、手技中のＤＮアーゼステップを含み製造業者のプロトコールに従って回収した。
ｃＤＮＡ合成のために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（カタログ番号Ｎ８０８０２３４）を使用した。ＲＮＡ３０ｎｇからのｃＤＮＡ合成を、１０ｘＲＴ緩衝液１．２μｌ、ＭｇＣｌ２ ２．６４μｌ（２５ｍＭ）、ｄＮＴＰ ２．４μｌ（１０ｍＭ）、ランダムヘキサマー０．６μｌ（５０μＭ）、オリゴ（ｄＴ）１６ ０．６μｌ（５０μＭ）、ＲＮアーゼ阻害剤０．２４μｌ（２０Ｕ／μｌ）、およびＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ０．３μｌ（５０Ｕ／μｌ）を使用して行った（全量１２μｌ）。サンプルを、２５℃で１０分間、および４２℃で６０分間インキュベートした。反応を９５℃で５分間加熱することにより停止させた。
ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３０５７１９）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイＨｓ００５４５３９９＿ｍ１を使用してｑＰＣＲにより定量した。ＰＣＲを、技術上二連で、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００により以下のＰＣＲ条件下：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルにて行った。ＰＣＲを、１反応で標的遺伝子（ＰＣＳＫ９）、および第２の反応で正規化のためのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ３７Ａ）を検出するシンプレックスＰＣＲとして設定した。ＰＣＲ反応の最終体積は、１ｘＰＣＲマスターミックス中の１２．５μｌであり、ＲＰＬ３７Ａプライマーを５０ｎＭの最終濃度および２００ｎＭのプローブで使用した。ΔΔＣｔ法を適用して、標的転写物の相対的発現レベルを計算した。ＰＣＳＫ９発現の割合を、ＬＶ２非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照配列のレベルに基づいた正規化により計算した。
ＩＣ５０測定
Ｈｅｐ３ＢまたはＣ３Ａ細胞に、１０倍希釈ステップを使用する１０ｎＭ～０．０１ｐＭの範囲の濃度の、示されるｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。各ｓｉＲＮＡについての最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）を、Ｂｉｏｓｔａｔ－Ｓｐｅｅｄ統計計算ツールを適用することにより計算した。結果は、ＲａｔｋｏｖｓｋｙおよびＲｅｅｄｙ（１９８６）に従う４パラメーターロジスティックモデルを使用して得た。ＳＡＳ ｖ９．１．３ソフトウェアにおけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用する非線形回帰により、調節を行った。
ＥＬＩＳＡアッセイ
示される濃度のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの４８時間後に、Ｃ３Ａ細胞２５，０００個の培養物の上清中のＰＣＳＫ９タンパク質濃度を、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＰＣＳＫ９ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＰＣ９００）により定量した。希釈していない細胞培養上清５０μｌを使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを、製造業者のプロトコールに従って行った。非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照配列の平均レベルに基づく正規化により、ＰＣＳＫ９発現の割合を計算した。
細胞毒性
Ｈｅｐ３ＢまたはＣ３Ａ細胞１５，０００個の培養物のトランスフェクションの７２時間後に、各サンプル中の細胞生存率／毒性の比を決定することにより、各ｓｉＲＮＡの細胞毒性を測定した。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用する製造業者のプロトコールに従う、細胞内ＡＴＰ含有量の決定により測定した。細胞毒性は、上清においてＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）アッセイ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＬＴ０７－２１７）を使用して製造業者のプロトコールに従って測定した。
結果
ヒトＰＣＳＫ９をターゲティングすることにおいて有用なｓｉＲＮＡを特定するために、以下の基準を適用した。第１に、ＮＭ＿１７４９３６．３（配列番号１）において示されるヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ配列からの１９マーを、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで１８ヌクレオチドの重複を伴って特定した。第１回目のフィルタリング後、潜在的な目的のｓｉＲＮＡ ７１５種を特定した。次に、公知のＳＮＰ（コーカサス集団における１０％超の出現率により特定した）と重複するすべての１９マーを除外し、１９マー配列６９２種のプールを残した。その後、すべての６９２種の１９マーを、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ配列に対して整列させ、カニクイザルＰＣＳＫ９に対するミスマッチを２つ以上有するすべての配列を除外し、ミスマッチを０個有するｓｉＲＮＡ配列１３０種、およびミスマッチを１つ有するさらなる２６７種のｓｉＲＮＡ配列を残した。
その後、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの分析を行って、ヒトトランスクリプトーム（ＲｅｆＳｅｑ ＲＮＡバージョン２０１５－１０－２０）における任意の潜在的オフターゲット転写物を特定した。肝組織における０．５未満のＲＮＡｓｅｑ発現（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｂｏｄｙ Ａｔｌａｓ）ＦＰＫＭを有するヒトオフターゲット配列は考慮しなかった。すべての目的のｓｉＲＮＡ配列は、ＰＣＳＫ９以外の任意のヒト転写物に対して３つ以上のミスマッチを有するか、または４つもしくはそれ以下のヒト遺伝子との２つのミスマッチを有した；これらの２つの基準のうちの１つに適合しない配列は除外した。フィルタリング後、潜在的ｓｉＲＮＡ ２２９種が残った。最終フィルタリングステップを行って、３０％未満のＧＣ含有量を有するｓｉＲＮＡ配列を特定し、ｓｉＲＮＡ １４種を機能的特徴付けのために特定した。すべての１４種のこれらのｓｉＲＮＡは、ヒトＰＣＳＫ９の３’非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）の標的配列を認識した。
上記に説明される通り、ｓｉＲＮＡ １４種を、２’Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ基を有するヌクレオチドを伴って、しかしＧａｌＮＡｃリガンドまたはホスホロチオエートのような追加の修飾は伴わずに産生した。これらの１４種のｓｉＲＮＡの、ＰＣＳＫ９の発現を低減する能力を試験するために、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞に、０．１ｎＭまたは１．０ｎＭの各ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプル中のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現を測定し、陽性および陰性対照と比較した（図１）。１４種のｓｉＲＮＡのうちの９種は、最も強力なｈＰＣＳＫ９阻害を示し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現を、１．０ｎＭの濃度で少なくとも８０％、および０．１ｎＭの濃度で少なくとも５０％低減した。
目的のｓｉＲＮＡ １４種の活性を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞よりも高レベルのＰＣＳＫ９発現により特徴付けられるヒトＣ３Ａ細胞においてさらに試験した（図２）。ｓｉＲＮＡを以下の濃度：０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ、および０．００５ｎＭで試験した。このより厳密なアッセイにおいて、１４種のｓｉＲＮＡのうちの５種は、ｈＰＣＳＫ９発現の最も強力な阻害を示した（Ｂ００１、Ｂ００３、Ｂ００６、Ｂ０１３、およびＢ０１４）。これらのｓｉＲＮＡは、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現を、０．５ｎＭの濃度で少なくとも８０％、および０．０５ｎＭの濃度で少なくとも５０％低減した。
次に、細胞の細胞毒性を、Ｈｅｐ３ＢおよびＣ３Ａ細胞において、目的のｓｉＲＮＡ １４種によるトランスフェクションの７２時間後に測定した。驚くべきことに、Ｈｅｐ３ＢまたはＣ３Ａ細胞における明らかな細胞毒性は、試験したｓｉＲＮＡのいずれについても示されず、最高５０ｎＭの濃度で使用した場合でさえも示されなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。
これらの結果は、合わせると、複数のヒト細胞株において顕著な細胞毒性を伴わずにＰＣＳＫ９発現の強力な阻害を行うことができるｓｉＲＮＡの特定を実証する。
ヒトＰＣＳＫ９発現の阻害についてのさらなるｓｉＲＮＡの特徴付け
さらなるｓｉＲＮＡ配列を、上記に説明される通りに、ただし、３０～６５％のＧ＋Ｃ含有量を有する配列について配列を除外して、選択した。ｓｉＲＮＡ ６０種を、実施例１で説明される通りに産生した。これらのｓｉＲＮＡは、ヒトＰＣＳＫ９の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）全体を通して分布する標的を認識する。
これらの６０種のｓｉＲＮＡの、ＰＣＳＫ９の発現を低減する能力を試験するために、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞に、各ｓｉＲＮＡ ０．１ｎＭまたは１．０ｎＭをトランスフェクトし、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプル中のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現を測定し、陽性および陰性対照と比較した（図４）。６０種のｓｉＲＮＡのうちの５種は、ｈＰＣＳＫ９発現の強力な阻害を示し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現を１．０ｎＭの濃度で少なくとも８６％低減した。
６０種のｓｉＲＮＡのうちの最も極力な５種の活性を、ヒトＣ３Ａ細胞においてさらに試験した（図５）。ｓｉＲＮＡを、以下の濃度：０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ、および０．００５ｎＭで試験した。試験したｓｉＲＮＡのうちの３種は、ｈＰＣＳＫ９発現の強力な阻害を示し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現を、０．５ｎＭの濃度で少なくとも７５％低減した。
次に、細胞の細胞毒性を、Ｈｅｐ３ＢおよびＣ３Ａ細胞において、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後に測定した（図６Ａおよび６Ｂ）。１種のｓｉＲＮＡ、Ｃ０６０は、両方の細胞株において有意な細胞毒性を引き起こし、別のｓｉＲＮＡ、Ｃ０５２は、Ｃ３Ａ細胞において有意な細胞毒性を引き起こした。上記に説明されるＣ３ＡおよびＨｅｐ３Ｂ細胞における活性および細胞毒性データの結果に基づいて、１０種のｓｉＲＮＡ（Ｂ００１、Ｂ００３、Ｂ００６、Ｂ００８、Ｂ０１０、Ｂ０１３、Ｂ０１４、およびＣ０５１）を、ＩＣ５０測定について選択した。１０種のｓｉＲＮＡは、全て同様の強度であった。１０種のｓｉＲＮＡは、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定すると、Ｃ３Ａ細胞において、特に、試験したより高い濃度で、ｈＰＣＳＫ９タンパク質を低減させることがさらに見出された（図７）。
これらの実験の結果を、表Ａに要約する。ｈＰＣＳＫ９標的配列を含有する各ｓｉＲＮＡの部分を、表Ｂに示す。
Figure 2022546040000053
Figure 2022546040000054
実施例１で説明される１４種のｓｉＲＮＡと比較すると、これらの６０種のｓｉＲＮＡは、有意に低い割合の、ｈＰＣＳＫ９発現のノックダウンにおいて有効なｓｉＲＮＡを有した（実施例１の９／１４と比較して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において５／６０が有効であった）。理論に束縛されるものではないが、実施例１のｓｉＲＮＡは、それらのより低いＧ＋Ｃ含有量および／またはターゲティングされるＰＣＳＫ９の特異的領域（例えば、３’ＵＴＲ）のために、より高い効能を呈し得ると考えられる。これらの結果は、合わせると、ヒトＰＣＳＫ９発現の有効なｓｉＲＮＡノックダウンの予測不可能性をさらに例示する。さらに、６０種のｓｉＲＮＡ配列を使用して得た結果は、実施例１で説明されるｓｉＲＮＡの効能および低レベルの細胞毒性をさらに強調する。
ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ査定
方法
ｓｉＲＮＡ産生
陰性対照ｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡを、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して産生した。
細胞および組織培養
ヒトＣ３Ａ細胞を、３７℃、ＣＯ２ ５％、およびＲＨ９５％で増殖させ、１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１０９０）で培養した。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ヘパリンナトリウムでコーティングしたＶａｃｕｔａｉｎｅｒ管（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）に収集した、３人の健康なドナーの約１６ｍＬの血液から、製造業者の教示に従って単離した。
ヒトおよびカニクイザル初代肝細胞を、以下の通り培養した：凍結保存細胞を融解し、Ｐｌａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈａｗｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＴＫ－１、Ｐｒｉｍａｃｙｔ）を使用して播種し、３７℃、ＣＯ２ ５％、およびＲＨ９５％でインキュベートした。播種６時間後、培地を、１％ＦＢＳで補充した維持培地（ＫＬＣ－ＭＭ、ＫａＬｙ－Ｃｅｌｌ）に交換した。
トランスフェクション
Ｃ３Ａ細胞におけるノックダウン実験のために、９６ウェルプレートにおいて細胞２５，０００個／ウェルを使用した。細胞に、示される濃度のｓｉＲＮＡを、０．２μｌ／ウェルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して製造業者のプロトコールに従って逆トランスフェクション設定においてトランスフェクトし、培地交換なしで４８時間インキュベートした。通常、１つの試験サンプルにつき、Ｎ＝４回の技術的反復を行った。
ヒトＰＢＭＣのトランスフェクションのために、ｓｉＲＮＡ １００ｎＭを、ＰＢＭＣ １×１０５個に、全量１５０μＬの血清非含有ＲＰＭＩ培地中の９６ウェル（ｎ＝２）につき０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００により、２４時間逆トランスフェクトした。一本鎖ＲＮＡ（「Ｒ－０００６」）およびＤＮＡ（「ＣｐＧ ＯＤＮ」）オリゴヌクレオチド、ならびに二本鎖非修飾および２’－Ｏ－メチル修飾ｓｉＲＮＡ（「１３２／１６１」）を、対照として適用した。
ｍＲＮＡ発現分析
ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後、またはｓｉＲＮＡ自由取り込みの７２時間後、細胞ＲＮＡを、ＰｒｏｍｅｇａのＳＶ９６トータルＲＮＡ単離システム（カタログ番号Ｚ３５００）の利用により、手技中のＤＮアーゼステップを含み製造業者のプロトコールに従って回収した。
ｃＤＮＡ合成のために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（カタログ番号Ｎ８０８０２３４）を使用した。ＲＮＡ ３０ｎｇからのｃＤＮＡ合成を、１０ｘＲＴ緩衝液１．２μｌ、ＭｇＣｌ２ ２．６４μｌ（２５ｍＭ）、ｄＮＴＰ ２．４μｌ（１０ｍＭ）、ランダムヘキサマー０．６μｌ（５０μＭ）、オリゴ（ｄＴ）１６ ０．６μｌ（５０μＭ）、ＲＮアーゼ阻害剤０．２４μｌ（２０Ｕ／μｌ）、およびＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ０．３μｌ（５０Ｕ／μｌ）を使用して行った（全量１２μｌ）。サンプルを、２５℃で１０分間、および４２℃で６０分間インキュベートした。反応を９５℃で５分間加熱することにより停止させた。
ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３０５７１９）、ならびにヒトおよびカニクイザルサンプルについて、それぞれ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイＨｓ００５４５３９９＿ｍ１およびＭｆ０３４１８１８９＿ｍ１を使用してｑＰＣＲにより定量した。ＰＣＲを、技術上二連で、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００により以下のＰＣＲ条件下：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルにて行った。ＰＣＲを、１反応で標的遺伝子（ＰＣＳＫ９）、および第２の反応で正規化のためのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ３７Ａ）を検出するシンプレックスＰＣＲとして設定した。ＰＣＲ反応の最終体積は、１ｘＰＣＲマスターミックス中の１２．５μｌであり、ＲＰＬ３７Ａプライマーを５０ｎＭの最終濃度および２００ｎＭのプローブで使用した。ΔΔＣｔ法を適用して、標的転写物の相対的発現レベルを計算した。ＰＣＳＫ９発現の割合を、ＬＶ２非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照配列のレベルに基づいた正規化により計算した。
ＩＣ５０測定
Ｃ３Ａ細胞に、８倍希釈ステップを使用する２５ｎＭ～０．１ｐＭの範囲の濃度の、示されるｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。各ｓｉＲＮＡについての最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）を、Ｂｉｏｓｔａｔ－Ｓｐｅｅｄ統計計算ツールを適用することにより計算した。結果は、ＲａｔｋｏｖｓｋｙおよびＲｅｅｄｙ（１９８６）に従う４パラメーターロジスティックモデルを使用して得た。ＳＡＳ ｖ９．１．３ソフトウェアにおけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用する非線形回帰により、調節を行った。
ヒトおよびカニクイザル初代肝細胞におけるＩＣ５０測定のために、９６ウェルプレートにおいて７０，０００個の細胞を、５倍希釈ステップを使用する１０μＭ～０．００５ｎＭの範囲の濃度のｓｉＲＮＡの自由取り込み条件下で７２時間インキュベートした。
ＥＬＩＳＡアッセイ
示される濃度のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの４８時間後に、Ｃ３Ａ細胞の上清中のＰＣＳＫ９タンパク質濃度を、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＰＣＳＫ９ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＰＣ９００）により定量した。希釈していない細胞培養上清５０μｌを使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを、製造業者のプロトコールに従って行った。非サイレンシングｓｉＲＮＡ対照配列の平均レベルに基づく正規化により、ＰＣＳＫ９発現の割合を計算した。
ＰＢＭＣの上清中のＩＦＮαタンパク質濃度を、以下の通り定量した：２５μＬの細胞培養上清を、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの技術に基づく自己確立した電気化学発光アッセイを適用し、パンＩＦＮαモノクローナルキャプチャー抗体（ＭＴ１／３／５、Ｍａｂｔｅｃｈ）を使用する、ＩＦＮα濃度の測定のために使用した。
細胞毒性
ヒト初代肝細胞５０，０００個による自由取り込み条件下でのインキュベーションの７２時間後に、各サンプル中の細胞生存率／毒性の比を決定することにより、各ｓｉＲＮＡの細胞毒性を測定した。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用する製造業者のプロトコールに従う、細胞内ＡＴＰ含有量の決定により測定した。細胞毒性は、上清においてＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）アッセイ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＬＴ０７－２１７）を使用して製造業者のプロトコールに従って測定した。
ヌクレアーゼ安定性
ｓｉＲＮＡを、５０％マウス血清中でのヌクレアーゼ安定性について試験した。この目的のために、マウス血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ５９０５）１６０μＬを、３７℃で０、８、２４、３２、４８、５６、および７２時間インキュベートした。各時点において、反応から２１μＬを採取し、停止溶液２３μＬ（停止溶液３，０００μＬについて：Ｔｉｓｓｕｅ ＆ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＭＴＣ０９６Ｈ）１１２３μＬ、２０ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ２３０８）１８３μＬ、水１６９４μＬ）により６５℃で３０分間停止させた。Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅおよび２４８７ Ｄｕａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ＤｅｔｅｃｔｏｒでのＨＰＬＣ分析の前に、ＲＮアーゼ非含有水３３μＬを各サンプルに添加した。溶液５０μＬを、ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００分析カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号０６３０００）および以下の勾配を使用するＨＰＬＣにより分析した：
Figure 2022546040000055
マウスモデル
以下の実験で使用した雌マウスは、全長ヒトＰＣＳＫ９をコードする導入遺伝子を保有し、対応するマウスＰＣＳＫ９についてノックアウトされていた。導入遺伝子モデルである「ｈＴｇ－ｍＫＯ系２番」系統は、Ｕｎｉｖａｌｏｒ Ｉｎｃを介してＩＲＣＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ Ｃｌｉｎｉｑｕｅｓ ｄｏ Ｍｏｎｔｒｅａｌ）からライセンス許可された。
ｉｎ ｖｉｖｏ測定
ｓｉＲＮＡにより処置したマウスにおける血清ＰＣＳＫ９レベルを、同じＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＰＣＳＫ９ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＰＣ９００）を使用して１：４０事前希釈により決定した。投薬前値に対する相対的ＰＣＳＫ９血清レベルを計算した。
ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡにより処置したトランスジェニックマウスにおける血清総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールレベルを、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ器具およびＲｏｃｈｅのＬＤＬＣ３アッセイまたはＨｏｒｉｂａのＡＢＸ Ｐｅｎｔｒａ ＬＤＬ Ｄｉｒｅｃｔ ＣＰアッセイにより決定した。
血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびＢＵＮレベルを、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ器具による標準の臨床化学アッセイを使用して決定した。
結果
表ＡおよびＢで示される１０種のＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ配列を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでコンジュゲートし、特徴付けた。ヒトＣ３Ａ細胞を使用して、ｓｉＲＮＡについてＩＣ５０測定を行った（表Ｃ）。示されるｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＣ３Ａ細胞におけるＩＣ５０値は、９．７～１２５．０ｐＭに及んだ。
Figure 2022546040000056
３つの異なる濃度（２５、０．３９、および０．００６１ｎＭ）のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ３Ａ細胞の上清中のＰＣＳＫ９レベルの定量により、ＰＣＳＫ９タンパク質ノックダウンを確認した（図８）。
また、各ｓｉＲＮＡのＩＣ５０を、初代細胞への自由取り込みを使用して測定した。カニクイザル初代肝細胞をｓｉＲＮＡで処理し、各ｓｉＲＮＡについてのＩＣ５０を計算した（表Ｄ）。ＩＣ５０値は、９４．２～４８６．０ｎＭに及んだ。ｓｉＲＮＡ配列Ｃ０３２．００４およびＣ０３２．００５（カニクイザルＰＣＳＫ９に対するミスマッチを有しない）は、優れた用量依存的ノックダウン活性を示し、配列Ｃ０３２．０１２（マカク種に対する１つのミスマッチを有する）は、より劣っていたが用量依存的ノックダウン活性を示した。
Figure 2022546040000057
また、ヒト初代肝細胞をｓｉＲＮＡで処理し、このヒト初代細胞種における各ｓｉＲＮＡについてのＩＣ５０を計算した（表Ｅ）。ＩＣ５０値は、９．４～１８９．０ｎＭに及んだ。また、このヒト初代細胞種における自由取り込み条件下でのｓｉＲＮＡの細胞毒性を調査した（図９）。試験したｓｉＲＮＡのいずれについても、用量依存的細胞毒性効果は観察されなかった。
Figure 2022546040000058
３人の異なる健康なドナーから単離したヒト初代ＰＢＭＣから、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションに応答して分泌されるインターフェロンαの産生を調査することにより、ヒト初代細胞におけるｓｉＲＮＡに対する免疫応答を測定した（図１０）。試験したｓｉＲＮＡのいずれについても、ヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激の徴候は観察されなかった。
また、１０種のＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡを、５０％マウス血清中でのそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏヌクレアーゼ安定性について試験し、相対的安定性および半減期を決定した（図１１）。すべてのｓｉＲＮＡは少なくとも２４時間安定であったが、化合物Ｃ０３２．００５は、測定した最後の時点（７２時間）においてほとんどまたは全く分解を伴わず、最も安定であると特定された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析からの結果の要約を、図１２に示す。次に、非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡと比較した、１０ｍｇ／ｋｇの１０種のコンジュゲートしたｓｉＲＮＡの単回皮下注射について、血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベル（図１３Ａ）および血清総コレステロールレベル（図１３Ｂ）に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を調査した。ｉｎ ｖｉｖｏ効能実験において使用したマウスは、全長ヒトＰＣＳＫ９をコードする導入遺伝子を保有し、対応するマウスＰＣＳＫ９についてノックアウトされていた。ｓｉＲＮＡ Ｃ０３２．００５、Ｃ０３２．００７、およびＣ０３２．０１２は、ＰＣＳＫ９低減についてほぼ同一のパターンを有し、最大ＰＣＳＫ９ノックダウンは、３日目～７日目の間で約４９～５２％であり、１７日目～２１日目の間に基線に戻った。ｓｉＲＮＡ Ｃ０３２．００６は、ＰＣＳＫ９レベルに対して最も活性であり、最大ノックダウンは、１０日目に６５％であり、５２日目に基線レベルに戻った。総コレステロールレベルの最も高い低減は、ｓｉＲＮＡ Ｃ０３２．００５およびＣ０３２．０１２を使用して得られ、最大低減は、それぞれ、１９％および２２％であった。興味深いことに、ｓｉＲＮＡ Ｃ０３２．００６は、ＰＣＳＫ９レベルに対する最大効果を有するにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ Ｃ０３２．００６について、コレステロールレベルに対する主要な効果は観察されなかった。
ヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスにおける同じｉｎ ｖｉｖｏ研究の３日目（図１３Ｃ）および１０日目（図１３Ｄ）に、急性毒性パラメーターを、血清サンプルにおいて測定した。試験した化合物のいずれについても、明らかな肝毒性（ＡＳＴおよびＡＬＴレベルにより決定される）または腎毒性（ＢＵＮレベルにより決定される）は検出されなかった。また、合わせると、ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ Ｃ０３２．０１２の優れたｉｎ ｖｉｔｒｏプロファイルは、関連するトランスジェニックマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ設定に変換された。さらに、ｓｉＲＮＡ Ｃ０３２．００５は、ＰＣＳＫ９および総コレステロール阻害に対して優れたｉｎ ｖｉｖｏプロファイルを呈した。２種のさらなるｓｉＲＮＡ、Ｃ０３２．００６およびＣ０３２．００７は、ｉｎ ｖｉｖｏで強力なＰＣＳＫ９阻害を有すると特定されたが、興味深いことに、これらの２種のｓｉＲＮＡは、コレステロールレベルを低下させることにおいて主要な効果を有しなかった。
さらなる試験ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ査定
方法
別に示されない限り、すべての実験は、上記の実施例で説明される通りに行われた。
結果
ＰＣＳＫ９をターゲティングするｓｉＲＮＡの追加の組を、より緩いオフターゲットフィルター基準を使用して、ｓｉＲＮＡ長のより大きな変動（１９、２１、および２３マー）を可能にして設計し、これらの追加のｓｉＲＮＡを合成した。次に、それらの、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（図１４Ａ）およびヒトＣ３Ａ細胞（図１４Ｂ）においてＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現をノックダウンする能力を、０．１および１ｎＭ ｓｉＲＮＡトランスフェクションを使用して試験した。また、トランスフェクトしたｓｉＲＮＡの相対的細胞毒性を、これらの２種のヒト細胞種において５および５０ｎＭ濃度で試験した（図１５）。ｓｉＲＮＡ Ｃ２０９．０２１で処理した場合、両方のヒト細胞種において毒性効果が観察された。ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（表Ｆ）およびヒトＣ３Ａ細胞（表Ｇ）を使用して、１５種の最も活性かつ非毒性の配列について、ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を計算した。ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＩＣ５０値は、３．３～４５．２ｐＭに及び、一方で、ヒトＣ３Ａ細胞におけるＩＣ５０値は、１４．１～１０２．０ｐＭに及んだ。両方の細胞種における最も優れた最大ノックダウンは、ｓｉＲＮＡ Ｃ２０９．０１６を使用して得られた。
Figure 2022546040000059
Figure 2022546040000060
最後に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞対Ｃ３Ａ細胞における計算したＩＣ５０値間の相関（図１６Ａ）、およびこれらの２種の細胞種におけるＩｍａｘ値間の相関（図１６Ｂ）を理解するために、比較を行った。
この実施例で得られたデータは、合わせると、２種の追加のＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ配列、Ｃ２０９．０１６およびＣ２１８．０１２は、適用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのすべてにおいて優れた活性プロファイルを有したことを示す。Ｃ２１８．０１２は、Ｃ０３２．０１２と比較して１ヌクレオチド延長した配列である。
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ配列のリード最適化
方法
別に示されない限り、すべての実験は、上記の実施例で説明される通りに行われた。上記に説明されるヌクレオチドアナログを含むＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを含む、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを、ＷＯ２０１９／１７０７３１で説明される通り、示される配列（上記の配列表を参照されたい）に基づいて生成した。
結果
実施例３および４からの結果に基づいて、３種の親ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ配列を選択し（ｓｉＲＮＡ番号Ｂ０１４／Ｃ０３２．０１２／Ｃ２１７．０１４、Ｂ００６／Ｃ０３２．００６／Ｃ２１７．００１、およびＣ２０９．０１６／Ｃ２１７．００７）、各分子を、各々のｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端に３つの連続ＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドアナログを伴って合成した（ｓｉＲＮＡ番号Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３；上記の表４）。その後、ｓｉＲＮＡ番号Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３の親配列を、１つのｓｉＲＮＡ配列につき６６種の異なる化学修飾を含む最適化活動に使用した。得られる配列および修飾パターンを、上記表４に示す。
これらの最適化ライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、凍結保存したヒト初代肝細胞において、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ濃度のＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを使用する自由取り込み条件下で試験した。図１７で示される通り、親配列Ｃ０２７．００１およびＣ０２７．００３に基づく最適化ライブラリーは、親配列Ｃ０２７．００２と比較して、全体的により高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を呈すると特定された。注目すべきことに、分子のｓｉＲＮＡ活性を強く損なう多くの修飾パターンが、特に親配列Ｃ０２７．００２について、特定された。他方で、各々の親分子と比較してノックダウン活性の改善をもたらす多数の配列修飾が特定された。
最適化されたＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡの安定性特色の改善を査定するために、最適化ライブラリーを、５０％マウス血清におけるそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期についてアッセイした。表Ｈにおいて実証される通り、各々の親分子と比較して、ヌクレアーゼ安定性の改善を有する多数の修飾が特定され、ヌクレアーゼ安定性の改善は、親ｓｉＲＮＡ番号Ｃ０２７．００１の最適化ライブラリーについて最も明らかであった。
Figure 2022546040000061
Figure 2022546040000062
ｉｎ ｖｉｖｏ活性試験の前に、ｓｉＲＮＡ活性、安定性、および化学的考慮に基づいて、ｓｉＲＮＡ番号Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３の３種の異なる親配列の各々について、１４種のｓｉＲＮＡ修飾を選択した。上清へのＩＦＮα２ａ分泌をリードアウトとして使用するヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、免疫刺激潜在性を測定した（図１８）。試験したＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡのいずれについても、ヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激の徴候は観察されなかった。
次に、３種の異なる親配列に基づく１９８種の最適化ＰＣＳＫ９ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡのうちの全部で４２種を、ヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ薬理学試験に使用し、各々の親分子Ｃ０２７．００１、Ｃ０２７．００２、およびＣ０２７．００３と比較した（図１９Ａ～Ｃ）。選択された化合物の単回の６ｍｇ／ｋｇ用量での皮下投与後、ＰＢＳ媒体対照で処置した動物と比較した場合、３種の各々の最適化ライブラリーについて７～１４日目の間に８６％（Ｃ０２７．００１ ５８番）、６２％（Ｃ０２７．００２ １９番）、および８２％（Ｃ０２７．００３ ０８番）の最大標的ＰＣＳＫ９タンパク質ノックダウン（ＫＤｍａｘ）が達成された。ｉｎ ｖｉｖｏ活性の増加は、親配列Ｃ０２７．００１およびＣ０２７．００３のライブラリーについて最も著しく、それらは、それぞれ、３２％および３１％のＫＤｍａｘ値、ならびに投薬３週間後に基線への戻りを呈した。興味深いことに、親配列Ｃ０２７．００２のライブラリーについての効力の増加（ＫＤｍａｘ＝５２％）は、あまり明白でなかった。また、これは、ＫＤ５０レベル（最大ノックダウンの５０％）に反映され、ＫＤ５０レベルは、ライブラリーＣ０２７．００２の最も優れた分子（Ｃ０２７．００２ １９番）について約２０日目に達成された。その代わりに、ライブラリーＣ０２７．００１およびＣ０２７．００３は、分子Ｃ０２７．００１ ４０番およびＣ０２７．００３ ０８番について、それぞれ、約２６日目および約３０日目にＫＤ５０に達した。この研究におけるＰＣＳＫ９レベルに対する全体的に最も優れたｉｎ ｖｉｖｏ薬理学プロファイル（ＫＤｍａｘおよびＫＤ５０）により特定された分子は、Ｃ０２７．００１ ４０番、Ｃ０２７．００１ ５８番、Ｃ０２７．００３ ０３番、Ｃ０２７．００３ ０６番、Ｃ０２７．００３ ０８番、およびＣ０２７．００３ ４７番であった。
同じ研究において、ｓｉＲＮＡ投薬後１４および２８日目に、血清ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－ｃ）を測定した（図１９Ｄおよび１９Ｅ）。この分析は、各々の親配列と比較してｉｎ ｖｉｖｏ薬理学プロファイルの改善を有する多数の最適化分子の特定を確認した。３２％の最大ＬＤＬ－ｃ低減は、ｓｉＲＮＡ番号Ｃ０２７．００３ ０６番について投薬後１４日目に達成された。
実施例において使用した、選択されたｓｉＲＮＡの要約を、以下の表Ｉに示す。
Figure 2022546040000063
上記開示は、理解を明確にする目的のために例示および実施例の手段によりいくらか詳細に説明されているが、説明および実施例は、本開示の範囲の限定と解釈されるべきではない。

Claims (29)

  1. 二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列は相補的であり、第１の配列は、配列番号６～１１および３１０～３２１からなる群から選択される配列を含み、ｄｓＲＮＡは、場合により、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡは、場合により、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する、ｄｓＲＮＡ。
  2. ｄｓＲＮＡは、
    （１）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号１７６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号１７７）を含むか、
    （２）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８１）を含むか、
    （３）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号１８３）を含むか、
    （４）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号１８４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号１８５）を含むか、
    （５）センス鎖中にＣＣＡＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号１８６）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８７）を含むか、
    （６）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１８８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号１８９）を含むか、
    （７）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号３２３）を含むか、
    （８）センス鎖中にＣＣＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号３２４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵｄｔｄｔ（配列番号３２５）を含むか、
    （９）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号３２７）を含むか、
    （１０）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３２８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３２９）を含むか、
    （１１）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３３１）を含むか、
    （１２）センス鎖中にＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号３３２）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡｄＴｄＴ（配列番号３３３）を含むか、
    （１３）センス鎖中にＣＣＡＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３４）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵｄＴｄＴ（配列番号３３５）を含むか、
    （１４）センス鎖中にＣＣＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣｄＴｄＴ（配列番号３３７）を含むか、
    （１５）センス鎖中にＣＣＡＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３３８）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号３３９）を含むか、
    （１６）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵｉｎｖｄＴ（配列番号３４０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４１）を含むか、
    （１７）センス鎖中にＣＣＡＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡｉｎｖｄＴ（配列番号３４２）を含み、アンチセンス鎖中にＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４３）を含むか、
    または
    （１８）センス鎖中にＣＣＡＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＵＡＡｉｎｖｄＴ（配列番号３４４）を含み、アンチセンス鎖中にＵＵＡＡＡＡＡＧＵＣＡＣＣＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡｄＴｄＴ（配列番号３４５）を含む、
    請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. 二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含み、第１の配列および第２の配列のみが相補的であり、第１の配列は、配列番号３、４、および１３の内の１つであり、ｄｓＲＮＡは、場合により、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡは、場合により、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する、ｄｓＲＮＡ。
  4. ｄｓＲＮＡは、
    （１９）センス鎖中にＣＣＡＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１６２）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣＡＡｄＴｄＴ（配列番号１６３）を含むか、
    （２０）センス鎖中にＣＣＡＧＵＡＧＣＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＡＵＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号１６６）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＵＧＣＵＡＣｄＴｄＴ（配列番号１６７）を含むか、
    または
    （２１）センス鎖中にＣＣＡＧＡＧＵＧＵＧＡＡＡＧＧＵＧＣＵＧＡＵｉｎｖｄＴ（配列番号２９０）を含み、アンチセンス鎖中にＡＵＣＡＧＣＡＣＣＵＵＵＣＡＣＡＣＵＣｄＴｄＴ（配列番号２９１）を含む、
    請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. 第１の鎖および第２の鎖は、それぞれ長さが３０個以下のヌクレオチドであり、場合により、第１の鎖および第２の鎖は、それぞれ長さが少なくとも１９個および２３個以下のヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み；
    １つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドの内の少なくとも１つは、場合により、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、５’－ホスホロチオエートヌクレオチド、またはコレステロール誘導体もしくは親油性部分に連結された末端ヌクレオチドであり；
    １つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドの内の少なくとも１つは、場合により、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メトキシエチル、拘束エチル（ｃＥｔ）、デオキシ、逆位デオキシ、逆位ジデオキシ、ロックド核酸、脱塩基、２’－アミノ、２’－アルキル、モルホリノ、ホスホルアミデート、または非天然の塩基含有ヌクレオチドであり；
    ｄｓＲＮＡは、場合により、１つまたはそれ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと、１つまたはそれ以上の２’－フルオロヌクレオチドとを含み；
    ｄｓＲＮＡは、場合により、２つ以上の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと、２つ以上の２’－フルオロヌクレオチドとを、下記のパターン
    ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ－ＦまたはＦ－ＯＭｅ－Ｆ－ＯＭｅ
    （式中、ＯＭｅは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを表し、Ｆは、２’－フルオロヌクレオチドを表す）で含み：
    ｄｓＲＮＡは、場合により、それぞれ２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである最大１０個の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれぞれ２’－フルオロヌクレオチドである最大１０個の連続したヌクレオチドを含む、
    請求項１～５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. （ａ）ｄｓＲＮＡは、１つもしくはそれ以上のホスホロチオエート基を含むか
    または
    （ｂ）ｄｓＲＮＡは、ホスホロチオエート基を含まない、
    請求項１～６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. （ａ）ｄｓＲＮＡは、１つもしくはそれ以上のホスホトリエステル基を含むか、
    または
    （ｂ）ｄｓＲＮＡは、ホスホトリエステル基を含まない、
    請求項１～７のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. ｄｓＲＮＡは、リンカーを介して１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に付着しており、場合により、ｄｓＲＮＡは、三価分枝リンカーを介して３つのＧａｌＮＡｃ誘導体に付着しており、場合により、１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体の内の少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、またはセンス鎖の５’末端に付着している、請求項１～８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  10. センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方は、
    （ａ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングであって、場合により、１つもしくはそれ以上のチミンを含む５’オーバーハング；
    および／または
    （ｂ）１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングであって、場合により、２つのヌクレオチドを含み、場合により、１つもしくはそれ以上のチミンを含む３’オーバーハング
    をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. ｄｓＲＮＡの鎖の一方または両方は、式（Ｉ）：
    Figure 2022546040000064
     （式中、
    － Ｂは、複素環式核酸塩基であり；
    － Ｌ１およびＬ２の一方は、式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｌ１およびＬ２の他方は、Ｈ、保護基、リン部分、または式（Ｉ）の化合物をポリヌクレオチドに連結するヌクレオシド間連結基であり、
    － Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、またはＮ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、ここで、Ｒ１は、
    （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であって、場合により、ハロゲン原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基、－Ｏ－Ｚ１、－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、－Ｓ－Ｚ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｏ－Ｚ１、－Ｏ－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ１、－Ｃ（＝Ｊ）－Ｎ（Ｚ１）（Ｚ２）、および－Ｎ（Ｚ１）－Ｃ（＝Ｊ）－Ｚ２から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されており、ここで、
    Ｊは、ＯまたはＳであり、
    Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基、
    （Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、
    基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３であって、ここで、
    ｍは、０または１を意味する整数であり、
    ｐは、０～１０の範囲の整数であり、
    Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、場合により、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、－Ｏ－Ｚ３、－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、－Ｓ－Ｚ３、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｏ－Ｚ３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ３、－Ｃ（＝Ｋ）－Ｎ（Ｚ３）（Ｚ４）、または－Ｎ（Ｚ３）－Ｃ（＝Ｋ）－Ｚ４で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキレン基であり、ここで、
    Ｋは、ＯまたはＳであり、
    Ｚ３およびＺ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
    Ｒ３は、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ基、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基、（Ｃ３～Ｃ１４）複素環、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基、もしくは（Ｃ５～Ｃ１４）ヘテロアリール基からなる群から選択されるか、またはＲ３は、細胞ターゲティング部分である、基－［Ｃ（＝Ｏ）］ｍ－Ｒ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ－Ｒ３
    であり、
    － Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基であり、
    － Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄのそれぞれは、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基である）
    の構造を有する１つまたはそれ以上の化合物を含むか、またはその薬学的に許容できる塩である、
    請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. 式（Ｉ）（式中、Ｙは、
    ａ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
    ｂ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であって、メチル、イソプロピル、ブチル、オクチル、およびヘキサデシルを含む群から選択されるアルキル基を含む非置換（Ｃ１～Ｃ１６）アルキル基であり；
    ｃ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であって、場合により、ハロゲン原子および（Ｃ１～Ｃ６）アルキル基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換されている（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル基であり；
    ｄ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、シクロヘキシル基であり；
    ｅ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、（Ｃ６～Ｃ１４）アリール基で置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であり；
    ｆ）ＮＲ１であり、Ｒ１は、フェニル基で置換されているメチル基であり；
    ｇ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、場合により置換されている（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル基であるか、
    または
    ｈ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ１であり、Ｒ１は、メチルもしくはペンタデシルである）
    の１つまたはそれ以上の化合物を含む、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 式（Ｉ）（式中、Ｂは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリン、および置換プリンからなる群から選択される）の１つもしくはそれ以上の化合物またはその薬学的に許容できる塩を含む、請求項１１または１２に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. Ｒ３は、式（ＩＩ）
    Figure 2022546040000065
     （式中、
    Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、ＯＨであり、
    Ａ４は、ＯＨもしくはＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ５であり、ここで、Ｒ５は、（Ｃ１～Ｃ６アルキル基であって、場合により、ハロゲン原子で置換されている（Ｃ１～Ｃ６）アルキルである）
    またはその薬学的に許容できる塩である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. Ｒ３は、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンまたはその薬学的に許容できる塩である、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. 表Ａからの１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む請求項１１～１５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. 式（Ｉ）の２～１０個の化合物またはこれらの薬学的に許容できる塩を含む請求項１１～１６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. 式（Ｉ）の２～１０個の化合物は、センス鎖上に存在する、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. センス鎖は、５’末端に式（Ｉ）の２～５個の化合物を含み、および／または３’末端に式（Ｉ）の１～３個の化合物を含む、請求項１１～１８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. ａ）センス鎖の５’末端における式（Ｉ）の２～５個の化合物は、ｌｇＴ３を含み、場合により、３個の連続したｌｇＴ３ヌクレオチドを含み；
    および／または
    ｂ）センス鎖の３’末端における式（Ｉ）の１～３個の化合物は、ｌＴ４を含み；場合により、２個の連続したｌＴ４を含む、
    請求項１１～１９のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  21. １つまたはそれ以上のヌクレオシド間連結基であって、独立して、ホスホジエステル骨格連結基、ホスホトリエステル骨格連結基、ホスホロチオエート骨格連結基、ホスホロジチオエート骨格連結基、アルキル－ホスホネート骨格連結基、およびホスホルアミデート骨格連結基からなる群から選択されるヌクレオシド間連結基、またはその薬学的に許容できる塩を含む請求項１～２０のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  22. 表２～４中のｄｓＲＮＡから選択される請求項１～２１のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  23. ａ）センス鎖は、配列番号５７８、５８５、５８７、６２０、６２１、６２２、および６２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；
    ならびに／または
    ｂ）アンチセンス鎖は、配列番号５８９、５９１、６３１、６３２、６３４、６３５、および６３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
    請求項１～２２のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
  24. ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、
    ａ）配列番号５７８および５８９；［Ｃ０２７．００１］
    ｂ）配列番号６２０および６３１；［Ｃ０２７．００３］
    ｃ）配列番号５８５および５９１；［Ｃ０２７．００１＃４０］
    ｄ）配列番号５８７および５９１；［Ｃ０２７．００１＃５８］
    ｅ）配列番号６２１および６３４；［Ｃ０２７．００３＃０３］
    ｆ）配列番号６２２および６３２；［Ｃ０２７．００３＃０６］
    ｇ）配列番号６２２および６３５；［Ｃ０２７．００３＃０８］
    ならびに
    ｈ）配列番号６２７および６３９；［Ｃ０２７．００３＃４７］
    のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のｄｓＲＮＡ。
  25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡをコードするベクター。
  26. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のｄｓＮＲＡまたは請求項２５に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
  27. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含む組成物であって、場合により、該組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含み、場合により、前記組成物は、送達ビヒクルをさらに含み、場合により、該送達ビヒクルは、リポソーム、リポプレックス、複合体、およびナノ粒子からなる群から選択される、組成物。
  28. 対象中でＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法における使用のための請求項１～２４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項２７に記載の組成物であって、場合により、対象の肝臓中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、ｄｓＲＡＮにより阻害され、場合により、対象はヒトである、ｄｓＲＮＡまたは組成物。
  29. 必要な対象のＰＣＳＫ９媒介疾患を処置するかまたは予防する方法での使用のための請求項１～２４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項２７に記載の組成物であって、場合により、ＰＣＳＫ９媒介障害は高コレステロール血症であり、場合により、対象の肝臓中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡにより阻害され、場合により、対象はヒトである、ｄｓＲＮＡまたは組成物。
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