CN114107298A - 一种应用氧化石墨烯筛选新型冠状病毒反义核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用氧化石墨烯筛选新型冠状病毒反义核酸的方法，属于医药领域。本发明的方法为先将新型冠状病毒核酸与氧化石墨烯结合：将荧光素标记的新型冠状病毒核酸SD‑1、SD‑2、SD‑3分别与氧化石墨烯溶液混匀、孵育；荧光检测：向混合溶液中加入反义核酸链混匀、孵育，得到待检测溶液，用酶标仪检测荧光光谱，实现了最高荧光恢复比例达75.35％～88.46％。本发明方法操作简单、检测快速，具有非常高的特异性。

Description

一种应用氧化石墨烯筛选新型冠状病毒反义核酸的方法
技术领域
本发明涉及一种应用氧化石墨烯筛选新型冠状病毒反义核酸的方法，属于医药领域。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)属于一种有义单链RNA病毒，RNA链直接被翻译生成RNA聚合酶，从而间接进行RNA的转录和复制以及病毒蛋白质的翻译合成。该病毒具有复制快、传染性强的特点。目前，新型冠状病毒感染的肺炎治疗方案(施行第五版)，在抗病毒治疗中建议使用α-干扰素，洛匹那韦和利托那韦。
反义核酸药物技术主要是根据碱基互补配对原则和核酸杂交原理，利用互补寡核苷酸片段与目的基因或mRNA的特定序列相结合，从而干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递，进一步抑制、封闭或破坏靶基因的目的。反义核酸药物技术在治疗病毒性感染疾病的特异性、有效性已被FDA认可，目前已上市的多个反义核酸药物均收获了良好效果。核酸药物是国际上重点关注的新型生物技术药物，也是人类历史上继小分子药物、单克隆抗体和蛋白药物之后的第三次浪潮。反义核酸作为精准的基因治疗药物，比常规药物更具有特异性，可靶向目标基因。由于其可实现从源头对疾病进行治疗，被认为是一种高选择性和高效率的治疗药物。因此，调控基因表达，从源头上阻碍病毒的快速复制，可望实现对疾病的治疗。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
本发明的第一个目的是提供一种反义核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供一种预防和/或治疗新冠病毒的反义药物，包括上述反义核酸分子。
在一种实施方式中，所述药物的剂型包括注射液、混悬剂、胶囊剂、丸剂和口服液。
在一种实施方式中，所述药物还可以包括药物载体。
在一种实施方式中，所述药物载体包括微囊、微球、纳米材料和脂质体。
在一种实施方式中，所述纳米材料包括但不限于ZIF-90和COF。
在一种实施方式中，所述药物还可以包括加入其他药理学活性相近的活性成分组合施用。
本发明提供一种基于氧化石墨烯筛选新型冠状病毒反义核酸的方法，所述方法为将5’端经荧光素修饰的靶基因与氧化石墨烯溶液混匀后加入待筛选的反义核酸，检测荧光强度。
在一种实施方式中，所述氧化石墨烯溶液的浓度为10～18μg/mL。
在一种实施方式中，所述荧光素包括但不限于5-异硫氰酸荧光素。
在一种实施方式中，所述靶基因的序列为ATTCTCCTCGGCGGGCACGTAG、ATTGCCACTAGTCTCTAGTCAG或GTTCTTGTGGATCCTGCTGCAA。
在一种实施方式中，所述荧光素修饰的靶基因的浓度为1×10-7～9×10-7mol/L。
在一种实施方式中，通过激发波长为488nm，检测522nm的荧光强度。
本发明还保护所述方法在筛选新冠冠状病毒反义核酸中的应用。
本发明还保护上述反义核酸分子在制备治疗和/或缓解新冠冠状病毒感染的药物中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明利用氧化石墨烯与荧光标记的新型冠状病毒核酸混匀孵育，再加入待筛选的反义核酸链混匀孵育后，使用酶标仪检测荧光值，通过荧光信号恢复的强弱筛选优势反义核酸链。实现了最高荧光恢复比例达75.35％～88.46％。
2、本发明方法操作简单、对新型冠状病毒反义核酸的筛选高效且特异性强，可实现不同纳米载体对所筛选反义核酸的细胞内递送。
附图说明
图1为不同浓度的氧化石墨烯对FITC-SD-1荧光淬灭的影响。
图2为不同浓度反义核酸链CD-1对荧光恢复的影响。
图3本发明针对FITC-SD-1所设计的反义核酸链的特异性实验结果图；A:MCD1-1，B:MCD1-2。
图4为不同浓度的氧化石墨烯对FITC-SD-2荧光淬灭的影响。
图5为不同浓度反义核酸链CD-2对荧光恢复的影响。
图6本发明针对FITC-SD-2所设计的反义核酸链的特异性实验结果图；A:MCD2-1，B:MCD2-2。
图7为不同浓度的氧化石墨烯对FITC-SD-3荧光淬灭的影响。
图8为不同浓度反义核酸链CD-3对荧光恢复的影响。
图9本发明针对FITC-SD-3所设计的反义核酸链的特异性实验结果图；A:MCD3-1，B:MCD3-2。
图10为不同纳米材料负载FITC-CD-1的荧光成像情况。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
为不同浓度的氧化石墨烯对FITC-SD-1荧光淬灭的影响。
1.用超纯水将氧化石墨烯稀释至100μg/mL，混匀。
2.用超纯水溶解被荧光标记的SD-1(序列为5’-FITC-ATTCTCCTCGGCGGGCACGTAG-3’)，配置成1×10-4mol/L的溶液，混匀。
3.用Tris-HCl缓冲溶液稀释FITC-SD-1溶液至100×10-9mol/L，混匀。
4.在含有FITC-SD-1的Tris-HCl缓冲溶液中加入不同浓度的氧化石墨烯溶液(0、2、4、6、8、10、12、14μg/mL)，混匀，室温孵育10min。
5.使用酶标仪检测荧光。激发波长为488nm，检测522nm的荧光强度。
本发明Tris Buffer配方：20×10-3mol/LTris，100×10-3mol/LNaCl，10×10-3mol/L MgCl2，PH值为7.2。
实验结果如图1所示，可以看出，随着氧化石墨烯浓度升高，荧光信号会显著减弱，且在10μg/mL之后荧光信号几乎被完全淬灭，因此，淬灭FITC-SD-1的最佳氧化石墨烯浓度为10μg/mL。
实施例2：
加入不同浓度反义核酸链CD-1、MCD-1-1和MCD-1-2对荧光恢复的影响。
实验步骤：
1.用超纯水将氧化石墨烯稀释至100μg/mL，混匀。
2.用超纯水溶解被荧光标记的SD-1(序列为5’-FITC-ATTCTCCTCGGCGGGCACGTAG-3’)，配置成1×10-4mol/L的溶液，混匀。
3.用Tris-HCl缓冲溶液稀释FITC-SD-1溶液至100×10-9mol/L，混匀。
4.在含有100×10-9mol/L FITC-SD-1的Tris-HCl缓冲溶液中加入10μg/ml的氧化石墨烯，混匀，孵育10min。
5.在混合溶液中分别加入不同浓度(0，50，100，150，200，250，300×10-9mol/L)的反义核酸链CD-1(序列为5’-CTACGTGCCCGCCGAGGAGAAT-3’)、反义核酸链MCD-1-1(序列为5’-CTACGTGCCCGCCGATCCGAAT-3’)和反义核酸链MCD-1-2(序列为5’-CTACGACGCCGCCGAGGAGAAT-3’)，混匀，室温孵育30min。
6.使用酶标仪检测荧光。激发波长为488nm，检测522nm的荧光强度。
实验结果如图2所示，可以看出，随着反义核酸链CD-1浓度的升高，荧光信号会显著增大，最高荧光恢复比例可达83.80％，说明，反义核酸链CD-1具备与FITC-SD-1结合的能力，且荧光恢复与浓度呈正相关。
实验结果如图3所示，可以看出，随着反义核酸链MCD-1-1和MCD-1-2浓度的增大，荧光信号变化不明显，因此，反义核酸链CD-1的特异性较强显著高于反义核酸链MCD-1-1和MCD-1-2。
实施例3：
为不同浓度的氧化石墨烯对FITC-SD-2荧光淬灭的影响。
实施步骤：
1.用超纯水将氧化石墨烯稀释至100μg/mL，混匀。
2.用超纯水溶解被荧光标记的SD-2(序列为5’-FITC-ATTGCCACTAGTCTCTAGTCAG-3’)，配置成1×10-4mol/L的溶液，混匀。
3.用Tris-HCl缓冲溶液稀释FITC-SD-2溶液至100×10-9mol/L，混匀。
4.在含有FITC-SD-2的Tris-HCl缓冲溶液中加入不同浓度的氧化石墨烯溶液(0、2、4、6、8、10、12、14μg/mL)，混匀，室温孵育10min。
5.使用酶标仪检测荧光。激发波长为488nm，检测522nm的荧光强度。
实验结果如图4所示，可以看出，随着氧化石墨烯浓度升高，荧光信号会显著减弱，且在14μg/mL之后荧光信号几乎被完全淬灭，因此，淬灭FITC-SD-2的最佳氧化石墨烯浓度为14μg/mL。
实施例4：
加入不同浓度反义核酸链CD-2、MCD-2-1和MCD-2-2对荧光恢复的影响。
实验步骤：
1.用超纯水将氧化石墨烯稀释至100μg/mL，混匀。
2.用超纯水溶解被荧光标记的SD-2(序列为5’-FITC-ATTGCCACTAGTCTCTAGTCAG-3’)，配置成1×10-4mol/L的溶液，混匀。
3.用Tris-HCl缓冲溶液稀释FITC-SD-2溶液至100×10-9mol/L，混匀。
4.在含有100×10-9mol/L FITC-SD-2的Tris-HCl缓冲溶液中加入14μg/ml的氧化石墨烯，混匀，孵育10min。
5.在混合溶液中分别加入不同浓度(0，50，100，150，200，250，300×10-9mol/L)的反义核酸链CD-2(序列为5’-CTGACTAGAGACTAGTGGCAAT-3’)、反义核酸链MCD-2-1(序列为5’-CTGACTAGAGTGAAGTGGCAAT-3’)和反义核酸链MCD-2-2(序列为5’–CTGACTAGAGACTTCAGGCAAT-3’)，混匀，室温孵育30min。
6.使用酶标仪检测荧光。激发波长为488nm，检测522nm的荧光强度。
实验结果如图5所示，可以看出，随着反义核酸链CD-2浓度的升高，荧光信号会显著增大，最高荧光恢复比例可达75.35％，说明，反义核酸链CD-2具备与FITC-SD-2结合的能力，且荧光恢复与浓度呈正相关。
结果如图6所示，可以看出，随着反义核酸链MCD-2-1和MCD-2-2浓度的增大，荧光信号变化不明显，因此，反义核酸链CD-2的特异性较强显著高于反义核酸链MCD-2-1和MCD-2-2。
实施例5：
为不同浓度的氧化石墨烯对FITC-SD-3荧光淬灭的影响。
实施步骤：
1.用超纯水将氧化石墨烯稀释至100μg/mL，混匀。
2.用超纯水溶解被荧光标记的SD-3(序列为5’-FITC-GTTCTTGTGGATCCTGCTGCAA-3’)，配置成1×10-4mol/L的溶液，混匀。
3.用Tris-HCl缓冲溶液稀释FITC-SD-3溶液至100×10-9mol/L，混匀。
4.在含有FITC-SD-3的Tris-HCl缓冲溶液中加入不同浓度的氧化石墨烯溶液(0、3、6、9、12、15、18μg/mL)，混匀，室温孵育10min。
5.使用酶标仪检测荧光。激发波长为488nm，检测522nm的荧光强度。
实验结果如图7所示，可以看出，随着氧化石墨烯浓度升高，荧光信号会显著减弱，且在18μg/mL之后荧光信号几乎被完全淬灭，因此，淬灭FITC-SD-3的最佳氧化石墨烯浓度为18μg/mL。
实施例6：
加入不同浓度反义核酸链CD-3对荧光恢复的影响。
实验步骤：
1.用超纯水将氧化石墨烯稀释至100μg/mL，混匀。
2.用超纯水溶解被荧光标记的SD-3(序列为5’-FITC-ATTCTCCTCGGCGGGCACGTAG-3’)，配置成1×10-4mol/L的溶液，混匀。
3.用Tris-HCl缓冲溶液稀释FITC-SD-3溶液至100×10-9mol/L，混匀。
4.在含有100×10-9mol/L FITC-SD-3的Tris-HCl缓冲溶液中加入18μg/ml的氧化石墨烯，混匀，孵育10min。
5.在混合溶液中分别加入不同浓度(0，50，100，150，200，250，300×10-9mol/L)的反义核酸链CD-3(序列为5’-TTGCAGCAGGATCCACAAGAAC-3’)、反义核酸链MCD-3-1(序列为5’-TTGCAGCACCTTCCACAAGAAC-3’)和反义核酸链MCD-3-2(序列为5’-TTGCAGCAGGAAGGACAAGAAC-3’)，混匀，室温孵育30min。
6.使用酶标仪检测荧光。激发波长为488nm，检测522nm的荧光强度。
实验结果如图8所示，可以看出，随着反义核酸链CD-3浓度的升高，荧光信号会显著增大，最高荧光恢复比例可达88.46％，说明，反义核酸链CD-3具备与FITC-SD-3结合的能力，且荧光恢复与浓度呈正相关。
实验结果如图9所示，可以看出，随着反义核酸链MCD-3-1和MCD-3-2浓度的增大，荧光信号变化不明显，因此，反义核酸链CD-3的特异性较强显著高于反义核酸链MCD-3-1和MCD-3-2。
实施例7：
不同纳米材料负载FITC-CD-1的荧光成像情况。
实验步骤：
1.用超纯水将纳米材料ZIF-90和COF稀释至1mg/ml，混匀。
2.用超纯水溶解被荧光标记的反义核酸FITC-CD-1(序列为5’-FITC-CTACGTGCCCGCCGAGGAGAAT-3’)，配置成1×10-4mol/L的溶液，混匀。
3.取MDA-MB-231细胞接种于12孔板中，其中，接种细胞数为5×105个，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
4.浓度为200×10-9mol/L的FITC-CD-1分别与ZIF-90、COF混合2h，以确保FITC-CD-1完全吸附在两种纳米材料表面。
5.混合体系与MDA-MB-231细胞共培养6h，用500μL PBS洗涤细胞5次。
6.用荧光显微镜在488nm激发波长下对其进行荧光成像。
实验结果如图10所示，可以看出，细胞均呈现绿色荧光，证明不同的纳米载体均可以实现对荧光标记的反义核酸FITC-CD-1胞内递送。
本发明方法操作简单、筛选快速且灵敏度高，本发明筛选的新型冠状病毒反义核酸具有非常高的特异性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种应用氧化石墨烯筛选新型冠状病毒反义核酸的方法
<130> BAA211500A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctacgtgccc gccgaggaga at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgactagag actagtggca at 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgcagcagg atccacaaga ac 22

Claims (10)

1.一种反义核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
2.一种基于氧化石墨烯筛选新型冠状病毒反义核酸的方法，其特征在于，所述方法为将5’端经荧光素修饰的靶基因与氧化石墨烯溶液混匀后加入待筛选的反义核酸，检测荧光强度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化石墨烯溶液的浓度为10～18μg/mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光素包括但不限于5-异硫氰酸荧光素。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述靶基因的序列为ATTCTCCTCGGCGGGCACGTAG、ATTGCCACTAGTCTCTAGTCAG或GTTCTTGTGGATCCTGCTGCAA。
6.权利要求2～5任一所述方法在筛选新型冠状病毒反义核酸中的应用。
7.一种预防和/或治疗新冠病毒的反义药物，其特征在于，包括权利要求1所述反义核酸分子。
8.根据权利要求7所述的反义药物，其特征在于，所述药物还可以包括药物载体。
9.根据权利要求7所述的反义药物，其特征在于，所述药物载体包括微囊、微球、纳米材料和脂质体。
10.根据权利要求7～9任一所述的反义药物，其特征在于，所述药物还可以包括加入其他药理学活性相近的活性成分组合施用。
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