CN114425053B - 化合物阿瑞吡坦在制备预防或治疗非洲猪瘟药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及化合物阿瑞吡坦在预防或治疗非洲猪瘟中的应用。本发明发现化合物阿瑞吡坦能够显著抑制ASFV复制，并且发现阿瑞吡坦不仅抑制D1133L的转录和蛋白表达，而且可以降低p30和p72的转录和蛋白表达水平，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早、晚期感染。因此，化合物阿瑞吡坦可用于预防或治疗非洲猪瘟。

Description

化合物阿瑞吡坦在制备预防或治疗非洲猪瘟药物中的应用

技术领域

本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及一种化合物阿瑞吡坦用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的的一种急性、高度接触性传染性疾病，死亡率高达100％。自2018年传入中国，对国内养猪业造成了重大的经济损失。目前还无商业化疫苗，所以以合理的成本开发有效的抗病毒药物对治疗非洲猪瘟具有重要意义。尽管目前已报道了各种类型的活性抗ASFV药物，但尚未对这些化合物的体内药效进行评估。

ASFV是一种双链DNA病毒，主要在单核细胞和巨噬细胞中复制，编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。

阿瑞吡坦(Aprepitant或Emend)别名阿瑞匹坦，分子式为C₂₃H₂₁F₇N₄O₃。CAS号为170729-80-3。化学名为5-[2(R)-[1(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3(S)-(4-氟苯基)吗啉-4-基甲基]-3,4-二氢-2H-1,2,4-三唑-3-酮。结构式为

阿瑞吡坦2003年获FDA批准用于治疗化疗引起的呕吐，是首个上市的NK-1受体拮抗剂，且通过NK-1受体实现特异性抗肿瘤作用，可作为广谱抗肿瘤药物。除此之外阿瑞吡坦还表现出抗HIV-1活性。

Miguel和Manak Mark M等研究学者在学术文章中报道过该化合物，(具体参见

Miguel,Rosso Marisa,The NK-1 receptor antagonistaprepitant as a broad spectrum antitumor drug.[J].Invest New Drugs,2010,28:187-93.；Manak Mark M,Moshkoff Dmitry A,Nguyen Lequan T et al.Anti-HIV-1activity of the neurokinin-1receptor antagonist aprepitant and synergisticinteractions with other antiretrovirals.[J].AIDS,2010,24:2789-96.)但目前并未有研究表明阿瑞吡坦具有抗ASFV的作用。

发明内容

本发明发现化合物阿瑞吡坦能够显著抑制ASFV复制。并且发现阿瑞吡坦不仅抑制D1133L的转录和蛋白表达，而且可以降低p30和p72的转录和蛋白表达水平，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早、晚期感染。因此，化合物阿瑞吡坦可用于预防或治疗非洲猪瘟。

所述化合物阿瑞吡坦的分子式为C₂₃H₂₁F₇N₄O₃。CAS号为170729-80-3。化学名为5-[2(R)-[1(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3(S)-(4-氟苯基)吗啉-4-基甲基]-3,4-二氢-2H-1,2,4-三唑-3-酮，结构式如下式(Ⅰ)所示：

首先，本发明的目的之一在于提供化合物阿瑞吡坦在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用。

其次，本发明的另一目的在于提供化合物阿瑞吡坦在制备预防非洲猪瘟药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供化合物阿瑞吡坦在制备抑制非洲猪瘟病毒基因转录药物中的应用。所述基因为非洲猪瘟病毒D1133L基因、p30基因、p72基因。

本发明的再一目的在于提供化合物阿瑞吡坦在制备抑制非洲猪瘟病毒蛋白表达药物中的应用。所述蛋白为非洲猪瘟病毒D1133L蛋白、p30蛋白、p72蛋白。

优选地，所述药物为化合物阿瑞吡坦加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。

本发明的有益效果是：

本发明发现化合物阿瑞吡坦能够显著抑制ASFV复制，并且发现阿瑞吡坦不仅能抑制D1133L的转录和蛋白表达，而且可以降低p30和p72的转录和蛋白表达水平，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早、晚期感染。因此，化合物阿瑞吡坦可用于预防或治疗非洲猪瘟。

附图说明

图1为化合物阿瑞吡坦抑制非洲猪瘟病毒的荧光图。GFP和TRANS行分别表示在绿色荧光和白光下观察，ASFV列、DMSO列、18μM、22μM、24μM表示细胞分别用ASFV荧光毒、ASFV荧光毒+DMSO、ASFV荧光毒混合用DMSO溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(18μM、22μM、24μM)处理。

图2为化合物阿瑞吡坦抑制非洲猪瘟病毒基因组拷贝数结果图。

图3为化合物阿瑞吡坦抑制非洲猪瘟病毒TCID₅₀结果图。

图4为化合物阿瑞吡坦抑制非洲猪瘟病毒D1133L转录。

图5为化合物阿瑞吡坦抑制非洲猪瘟病毒p30和p72转录。图5A为化合物阿瑞吡坦对非洲猪瘟病毒p30转录的抑制情况，图5B为化合物阿瑞吡坦对非洲猪瘟病毒p72转录的抑制情况。

图6为化合物阿瑞吡坦抑制非洲猪瘟病毒D1133L蛋白表达。

图7为化合物阿瑞吡坦抑制非洲猪瘟病毒p30和p72蛋白表达。

图8为化合物阿瑞吡坦细胞毒性检测结果图。图中0表示阴性对照，20、40、80表示DMSO溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(20μM、40μM、80μM)。

保藏信息：

保藏时间：2020年12月21日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:V202096；

保藏单位地址：中国武汉大学；

分类命名：II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

以下实施例中所述的实验细胞、病毒来源：

原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自5周龄左右的仔猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自Gibco公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

ASFV为病毒株CN/GS 2018，ASFV CN/GS2018分离株来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因II型，病毒效价为5×10⁷TCID₅₀/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:V202096。ASFV荧光毒为含有eGFP筛选表达盒基因片段、缺失了MGF-360-9L基因的ASFV荧光病毒，其制备方法参考公开号为CN 111593028 A的中国发明专利申请。

化合物阿瑞吡坦购自上海陶术生物科技有限公司。

实施例中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实施例中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。

实施例1化合物阿瑞吡坦对非洲猪瘟病毒复制和基因的转录表达的影响

1.荧光下观察化合物阿瑞吡坦对ASFV感染和复制的影响

在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×10⁶/孔)，实验组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合用DMSO(＜1％)溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(18μM、22μM、24μM)处理细胞，感染对照组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合DMSO(＜1％)处理细胞。另外，将只用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)处理细胞的作为感染空白组。然后将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养48h后显微镜下观察荧光变化。

结果如图1所示，图1A表明，在荧光下，感染对照组和感染空白组均没有显著差异，表明DMSO对病毒的感染和复制没有影响。

图1B显示，感染对照组(DMSO)中荧光较亮，而用不同浓度的阿瑞吡坦处理后荧光逐渐变暗，其中当用24μM的阿瑞吡坦处理后，荧光已完全消失。上述结果表明，化合物阿瑞吡坦能够显著抑制ASFV的感染和复制，且随着化合物浓度的增加，抑制效果愈加明显。

2.化合物阿瑞吡坦对ASFV感染和复制过程中的病毒基因组拷贝数的影响

在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×10^6/孔)，实验组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合用DMSO(＜1％)溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(18μM、20μM、22μM)处理细胞，感染对照组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合DMSO(＜1％)处理细胞。另外，将只用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)处理细胞的孔作为感染空白组。然后将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养48h，然后将细胞板置于-80℃冻融三次灭活后用实时荧光定量PCR检测病毒基因组拷贝数。RT-qPCR反应体系总体积20μL，包括10μL的Premix Ex Taq(2×)，0.2μL的ROX Reference DyeⅡ(50×)，0.6μL的引物，0.1μL的ASFV探针引物，2μL的模板，补充无菌去离子水到20μL。反应条件为：50℃，2min；95℃，2min；95℃，15s；58℃，1min；共45个循环。

其中，ASFV-p72上游引物：5’-GATACCACAAGATCAGCCGT-3’；下游引物：5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3’；ASFV探针引物：5’-CCACGGGAGGAATACCAA CCCAGTG-3’。

ASFV基因组拷贝数检测结果如图2所示，图2A是感染对照组与感染空白组病毒复制的比较图，该图表明DMSO对病毒复制的抑制效果与空白组相比差异不显著。

图2B是不同浓度化合物阿瑞吡坦对ASFV复制的抑制效果对比图，该图表明，加入化合物阿瑞吡坦后ASFV基因组拷贝数有所降低，且化合物阿瑞吡坦剂量为22μM时，对ASFV基因组拷贝数的抑制率高于50％。

3.化合物阿瑞吡坦对ASFV的TCID₅₀的影响

在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪骨髓巨噬细胞(BMDM，1×10⁶/孔)，实验组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合用DMSO(＜1％)溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(22μM、44μM)处理细胞，感染对照组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合DMSO(＜1％)处理细胞。然后将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养48h后将细胞板置于-80℃冻融三次后作为样品，分别用无血清RPMI 1640连续10倍稀释，做6个稀释度，每个稀释度重复8个孔，接种到BMDM细胞进行培养，将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养5天，每天观察各细胞培养孔中荧光变化，计算TCID₅₀。

结果如图3所示，22μM、44μM化合物阿瑞吡坦均可降低ASFV荧光毒TCID₅₀，当化合物阿瑞吡坦浓度为44μM时，ASFV荧光毒TCID₅₀最低。

4.化合物阿瑞吡坦对ASFV的D1133L RNA转录水平的影响

在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×10⁶/孔)；实验组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合用DMSO(＜1％)溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(22μM、44μM)处理细胞，感染对照组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合DMSO(＜1％)处理细胞。然后将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养48h后收集细胞培养物，离心，弃上清。用Trizol法提取总RNA，使用RT Primer Mix试剂盒合成cDNA后，用RT-qPCR方法检测D1133LRNA的表达差异。

RT-qPCR反应体系总体积10μL，包括0.4μL的上下游引物，2μL的cDNA，5μL的TBGreen^TM Premix Ex Taq(TaKaRa)，补充无菌去离子水到10μL。反应条件为：95℃，2min；95℃，10s，60℃，34s，40个循环。

其中，扩增D1133L的引物序列为：上游引物：5’-CTTCTGGAAAACGGGGTACA-3’；下游引物：5’-CAAGATAAGAACCCCCGACA-3’。

结果如图4所示，化合物阿瑞吡坦能够抑制非洲猪瘟病毒基因中D1133L的RNA表达水平，当化合物阿瑞吡坦剂量为22μM时，对D1133L RNA表达水平的抑制率高于50％。

5.化合物阿瑞吡坦对ASFV的p30和p72的RNA转录水平的影响

在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×10⁶/孔)；实验组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合用DMSO(＜1％)溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(22μM和44μM)处理细胞，感染对照组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合DMSO(＜1％)处理细胞。然后将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养48h后收集细胞培养物，离心，弃上清。用Trizol法提取总RNA，使用RT Primer Mix试剂盒合成cDNA后，用RT-qPCR方法检测p30和p72 RNA的表达差异。

RT-qPCR反应体系总体积10μL，包括0.4μL的上下游引物，2μL的cDNA，5μL的TBGreen^TM Premix Ex Taq(TaKaRa)，补充无菌去离子水到10μL。反应条件为：95℃，2min；95℃，10s，60℃，34s，40个循环。

其中，扩增p30的引物序列为：上游引物：5’-CTCCGATGAGGGCTCTTGCT-3’；下游引物：5’-AGACGGAATCCTCAGCATCTTC-3’；

扩增p72的引物序列为：上游引物：5’-TGCGATGATGATTACCTT-3’；下游引物：5’-ATTCTCTTGCTCTGGATAC-3’。

结果如图5所示，化合物阿瑞吡坦能够抑制非洲猪瘟病毒基因中p30和p72的RNA表达水平，且化合物阿瑞吡坦剂量为22μM时，对p30 RNA表达水平的抑制率高于50％，化合物阿瑞吡坦剂量为44μM时，对p30 RNA表达水平的抑制率高于95％；化合物阿瑞吡坦剂量为22μM时，对p72 RNA表达水平的抑制率高于50％，化合物阿瑞吡坦剂量为44μM时，对p72 RNA表达水平的抑制率高于95％。

6.化合物阿瑞吡坦对ASFV的D1133L的蛋白水平的影响

在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×10⁶/孔)，实验组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合用DMSO(＜1％)溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(20μM、22μM)处理细胞，感染对照组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合DMSO(＜1％)处理细胞。另外，将只用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)处理细胞的作为感染空白组。然后将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养48h后收集细胞培养物，离心，弃上清。提取总蛋白，用western-blotting方法检测D1133L蛋白的表达差异。

结果如图6所示，与未感染对照组(Mock组)相比，感染空白组(ASFV)、感染对照组(DMSO)和实验组(阿瑞吡坦+ASFV)的D1133L蛋白表达水平增加；但是，相对于感染对照组(DMSO)，实验组(阿瑞吡坦+ASFV)中D1133L蛋白表达水平显著降低。结果表明，化合物阿瑞吡坦能够显著抑制非洲猪瘟病毒基因中D1133L蛋白表达水平。

7.化合物阿瑞吡坦对ASFV的P30和P72的蛋白表达水平的影响

在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×10⁶/孔)，实验组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合用DMSO(＜1％)溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(p30：4.5μM、9μM、12μM、18μM；p72：20μM、22μM)处理细胞后，感染对照组用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)混合DMSO(＜1％)处理细胞。另外，将只用ASFV荧光毒(MOI＝0.1)处理的细胞作为感染空白组。然后将细胞板置于37℃，5％CO₂条件培养48h后收集细胞培养物，离心，弃上清。提取总蛋白，用western-blotting方法检测p30和p72蛋白的表达差异。

结果如图7所示，与未感染对照组(Mock组)相比，感染空白组(ASFV)、感染对照组(DMSO)和实验组(阿瑞吡坦+ASFV)的p30和p72蛋白表达水平增加；但是，相对于感染对照组(DMSO)，实验组(阿瑞吡坦+ASFV)中p30和p72蛋白表达水平显著降低。结果表明，化合物阿瑞吡坦能够显著抑制非洲猪瘟病毒基因中p30和p72蛋白表达水平。

上述结果表明，化合物阿瑞吡坦能够显著抑制ASFV的RNA转录和蛋白表达水平，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早、晚期感染。

实施例2化合物阿瑞吡坦的细胞毒性

在PAM细胞上用MTT法对小分子化合物阿瑞吡坦进行细胞毒性检测。在96孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，2×10⁵/孔)，向孔中加入DMSO溶解的不同浓度的阿瑞吡坦(20μM、40μM、80μM)处理细胞作为实验组，同时设置空白对照组(培养基+DMSO)和阴性对照组(细胞+培养基+DMSO)。将培养板在培养箱中孵育48后，向板的每个孔中加入10μL的MTT溶液，将培养板在培养箱中继续孵育4小时后，向板的每个孔中加入100μL的Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解。然后读取酶标仪测量570nm处的吸光度，根据公式[((OD_实验组-OD_{空白对照组})/(OD_{阴性对照组}-OD_{空白对照组}))×100％]计算每种浓度的细胞存活率。

结果如图8所示，化合物阿瑞吡坦对细胞的毒性较小，甚至使用剂量达到80μM时，细胞存活率活依然可达到50％以上，细胞毒性小，安全性较好。

综上所述，本发明所述化合物阿瑞吡坦对非洲猪瘟病毒具有较好的抑制作用，并且细胞毒性小，安全性较好，可用于预防或治疗非洲猪瘟。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

Claims (2)

1.化合物阿瑞吡坦在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用，其特征在于，所述化合物阿瑞吡坦的结构式如下式(Ⅰ)所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为化合物阿瑞吡坦加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂或混悬剂。

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