JP2006191817A - 細菌数測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】迅速で簡便に食品中の細菌数を測定する方法を提供する。
【解決手段】食品など試験検体中に存在する細菌の細菌数を測定する際、まず、試験検体と同種の複数の標準検体を粉砕処理して得られる標準検体抽出物を用いて、rpoB遺伝子を標的としてリアルタイムＰＣＲを行ってCt値を求める一方、実際に標準検体抽出物またはその希釈液を培地に播種することにより細菌の菌濃度を測定し、Ct値と菌濃度をプロットした検量線を作成する。そして、試験検体を同様に粉砕処理して得られる検体抽出物を用いて、同じ条件でリアルタイムＰＣＲを行ってCt値を求め、検量線を用いて、このCt値に対する菌濃度を測定し、総菌数を算出する。
【選択図】なし

Description

本発明は、食品などの検体において、細菌数を測定する方法に関する。

食品中の細菌数は、その食品の衛生度の指標になり、ある程度以上の細菌が検出されれば、腐敗していると判断される。従って、食品の衛生管理において、食中毒を起こす細菌などの特定の病原微生物の汚染や増殖を防止するとともに、細菌全般の増殖を防止することが重要である。

近年、調理済みで低温流通されている、いわゆるReady-to eat食品は、消費者のニーズに従い、増加傾向にあるが、このような食品の腐敗が報告されており、それを防止するために出荷や流通時の汚染度をモニタリングする必要がある。

現在細菌数の測定には、混釈培養法や平板塗抹法のような培養法を用いた方法が用いられる。これらの方法では、検体の希釈列を数段に渡り作製する必要がある。混釈培養法では、各々の希釈列を加温溶解した寒天培地と混和し冷却固形化し培養する。平板塗抹法では、各々の希釈列を培地上に塗抹する。これらはいずれも48時間以上の培養時間を要するため、結果が得られるまでに最低２日はかかり、途中の操作も煩雑である。また、混釈培養法では加温溶解した寒天培地との混和時に温度による最近の死滅が考えられ、測定結果の信頼性が低い場合がある。

そこで、本発明は、食品などにおいて、迅速で簡便に、また正確に細菌数を測定する方法を提供することを目的としてなされた。

発明者らは、市販のパパイヤ、トウミョウ、ホウレンソウ（生食用）、サラダ（パプリカ、レタス、ラディッシュ）、サラダ（大根、ワカメ、キャベツ、トマト）、サラダ（ホウレンソウ、ルッコラ、レタスなど生食用青菜）から、種々の細菌を単離し、rpoB遺伝子を標的としてリアルタイムＰＣＲを行ったところ、全ての細菌種においてＰＣＲ産物が得られ、rpoB遺伝子が、全細菌種を同定するのに適していることを明らかにし、本発明を完成した。

本発明にかかる測定方法は、試験検体中に存在する細菌の細菌数を測定する方法であって、前記試験検体と同種の複数の標準検体を粉砕処理して得られる標準検体抽出物を用いて、rpoB遺伝子を標的としてリアルタイムＰＣＲを行う一方、前記標準検体抽出物中の菌濃度を培養法を用いて測定し、前記リアルタイムＰＣＲの結果と前記菌濃度の相関関係を求める工程と、前記試験検体を前記標準検体と同様に粉砕処理して得られる試験検体抽出物を用いて、前記標準検体と同様にリアルタイムＰＣＲを行う工程と、前記相関関係より、前記試験検体抽出物の前記リアルタイムＰＣＲの結果から、前記試験検体抽出物中の前記細菌の菌濃度を算出し、その菌濃度から前記試験検体中に存在する細菌数を算出する工程と、を含む。この方法において、前記リアルタイムＰＣＲの結果が、Ct （threshold cycle）値であってもよい。また、前記検体が食品であることが好ましい。

本発明によると、食品などにおいて、迅速で簡便に細菌数を測定する方法を提供することができる。

以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

本発明は、食品などの試験検体中に存在する細菌数を迅速にかつ簡便に測定する方法である。ここで、対象となる細菌種は大腸菌(Escherichia coli)、サルモネラ(Salmonella)、エンテロバクター(Enterobacter)、エルウィニア(Erwinia)、シュードモナス(Pseudomonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)などであるが、食品などの試験検体中で増殖できる細菌であれば、どんなものにも適用できる。試験検体は、特に食品など、迅速に細菌数の測定が必要なものが好ましいが、特にそういうものにはかぎらない。以下、方法の具体的詳細を述べる。

まず、複数の標準検体を粉砕処理して標準検体抽出物を得る。標準検体は、試験検体と同種のものであることが好ましい。粉砕処理は、すり鉢で擂る、ホモゲナイザーでホモゲナイズする、など、検体を細かく粉砕できればよく、液状になるまで粉砕するのが好ましい。粉砕する際、バッファーなどの溶液を加え、溶液中で検体を粉砕してもよい。その後、検体抽出物を得るのに、フェノール処理などのＤＮＡ抽出処理をしても良いが、ＰＣＲによって結果が得られる程度の抽出処理であればよく、場合によってはさらなる抽出処理は必要ない。

この標準検体抽出物を用い、細菌の有するrpoB遺伝子を対象にリアルタイムＰＣＲを行う。このrpoB遺伝子は、すべての細菌が共通に持っているため、この目的には有効な検出対象の遺伝子となる。

このrpoB遺伝子内で、すべての細菌種で保存されている領域を利用して、リアルタイムＰＣＲを行うように、プライマーやプローブなどの設定をする。図１に、rpoB遺伝子における、そのような領域の一例を示す（図１の黒塗りに白抜き字の部分）。この領域中で、多型を有する塩基を含まないように、リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーやプローブなどの塩基配列を決定すれば、全ての細菌種において、ＤＮＡを増幅させることができる。本実施例では、図１の矢印の部分の配列をＰＣＲプライマーに用いた。

リアルタイムＰＣＲの方法には、5′末端を蛍光物質（FAMなど）で、3′末端をクエンチャー物質（TAMRA など）で修飾したオリゴヌクレオチド（TaqManプローブ）をＰＣＲ反応系に加えるTaqMan法、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター：SYBR Green I）をＰＣＲ反応系に加えるインターカレーター法、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせを利用するサイクリングプローブ法などが開発されているおり、定量的ＰＣＲであれば、ＰＣＲ法の種類を問わない。以下の実施例では、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行った。

このようにして決定したプライマー配列やプローブ配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それらを用いて、検体抽出物に対し、リアルタイムＰＣＲを行う。

一方、標準検体抽出物中の菌濃度を、培養法を用いて実際に測定する。この測定は、混釈培養法を用いてもよく、標準検体抽出物を段階希釈し、実際に培地に播種して成育するコロニー数を数えてもよい。こうして得られた菌濃度と、リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係を求める。

つぎに、試験検体に対しても、標準検体に対して行ったのと同様に検体抽出物を作成し、リアルタイムＰＣＲを行う。上記相関関係より、試験検体抽出物に対して得られたリアルタイムＰＣＲの結果から、試験検体抽出物中の菌濃度を算出し、その菌濃度から検体中に存在する細菌数を算出する。

リアルタイムＰＣＲの結果としては、例えばCt値を用いることができる。例えば、複数の標準検体抽出物に対し、それぞれリアルタイムＰＣＲを行い、各Ct値を得るとともに、実際に培養法を用いて菌濃度を測定する。その菌濃度とCt値との相関を表す検量線を作成し、この検量線を用いて、試験検体抽出物で行ったリアルタイムＰＣＲのCt値から、試験検体抽出物中の菌濃度を算出する。この菌濃度から、試験検体抽出物中の細菌数を算出できる。

［実施例］食品中の細菌数の測定
標準検体として、表１に示す約３８種類の市販の野菜及び果物を用いた。

各検体の２５ｇに２２５ｍｌのＰＢＳ（２％ＮａＣｌ含有）を加え、ストマッカーを用いてホモゲナイズし、標準検体抽出物を得た。この標準検体抽出物を１０倍ずつ段階希釈し、各希釈試料０．１ｍｌを２枚のＴＳＡ（２％ＮａＣｌ含有）プレートに播種し、生じるコロニーを数え、各標準検体中の菌濃度を測定した。その結果（cfu/ml）を表に示した。

一方、Mag Extractor（TOYOBO社）を用い、以下のように、標準検体からＤＮＡを抽出した。まず、１ｍｌの標準検体抽出物を遠心し（10k x g、10分）、沈殿物を850μｌの溶解液（キットに付属）に再懸濁し、40μｌの磁気ビーズを加え、１０分間激しく撹拌した。遠心して磁気ビーズを沈殿させ、900μｌの洗浄液（キットに付属）で２回、900μｌの70%エタノールで１回洗浄し、100μｌのTris/EDTAバッファー（10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA(pH 8.0)）に懸濁した。１０分間激しく撹拌した後、磁気ビーズを遠心して沈殿させ、上清を回収した。

これらのＤＮＡに対し、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。反応液２５μｌは以下のように調整した；１２．５μｌ SYBR Premix Taq（Takara Bio社）、２μｌ鋳型ＤＮＡ（10ng/μl）、５ｐｍｏｌ下記各プライマー。
rpoB-f-4: ＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＣＴＣ（配列番号１）
rpoB-r-2: ＧＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴ（配列番号２）

こうして調製された反応液に対し、ABI PRISM 7000 sequence detector （アプライド・バイオシステム社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。条件は、５０℃２分、９５℃１０分処理後、９５℃５秒−５５℃２０秒−７２℃３０秒を４０サイクル行った。ＰＣＲを行っている最中の蛍光強度の測定は自動的に行われた。また、ＤＮＡ増幅データは、ABI PRISM 7000 SDS softwareによって解析された。各試料において、検出した蛍光強度が検出閾値に達した時（ここでは０．２５）のサイクル数（Ct）を表１に示した。

各試料においてＴＳＡ（２％ＮａＣｌ含有）プレートに生じたコロニー数から計算した菌濃度に対し、検出した蛍光強度が検出閾値に達した時（ここでは０．２５）のサイクル数（Ct）をプロットし、検量線を作成した（図２）ところ、菌濃度とCtは有意に相関した。この検量線の比例式は、
ｙ＝−１．２４９Ln(x)＋４１．４９９
で、相関係数Ｒ^２は、０．８７であった。

従って、菌濃度が未知の試験検体から、標準検体と同様にＤＮＡを抽出し、同様にリアルタイムＰＣＲを行い、Ct値を求めれば、上記検量線より、この検体に存在する細菌の菌濃度を求めることができ、試験検体中の細菌数を算出できる。

各細菌種において、rpoB遺伝子内で保存されている領域を示すゲノムマップである。 本発明にかかる一実施例において、試料中でＴＳＡ（２％ＮａＣｌ含有）プレートに生じたコロニー数から計算した細菌数に対し、リアルタイムＰＣＲで検出した蛍光強度が検出閾値に達した時（ここでは０．２５）のサイクル数（Ct）をプロットして作成した検量線を示したグラフである。

Claims (3)

1. 試験検体中に存在する細菌の細菌数を測定する方法であって、
   前記試験検体と同種の複数の標準検体を粉砕処理して得られる標準検体抽出物を用いて、rpoB遺伝子を標的としてリアルタイムＰＣＲを行う一方、前記標準検体抽出物中の菌濃度を培養法を用いて測定し、前記リアルタイムＰＣＲの結果と前記菌濃度の相関関係を求める工程と、
   前記試験検体を前記標準検体と同様に粉砕処理して得られる試験検体抽出物を用いて、前記標準検体と同様にリアルタイムＰＣＲを行う工程と、
   前記相関関係より、前記試験検体抽出物の前記リアルタイムＰＣＲの結果から、前記試験検体抽出物中の前記細菌の菌濃度を算出し、その菌濃度から前記試験検体中に存在する細菌数を算出する工程と、
   を含む方法。
2. 前記リアルタイムＰＣＲの結果が、Ct （threshold cycle）値であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記検体が食品であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
   
   

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