JPH0686699A - 微生物遺伝子増幅用プライマーセット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】微生物の種類とは無関係に共通の条件下で、多
くの微生物の遺伝子を増幅することが可能なプライマー
セットの提供を目的とする。 【構成】全ての微生物の遺伝子に共通する塩基配列を、
プライマーセットの塩基配列として利用する。このプラ
イマーセットによって増幅される遺伝子が、微生物の種
類を決定しうる特異的塩基配列を含むように設定する。 【効果】多くの微生物の遺伝子を、共通の条件でＰＣＲ
によって増幅することが可能となる。本発明によって増
幅された遺伝子の中には、同定に有用な微生物の種類に
特異的な塩基配列が存在する。したがって、遺伝子の増
幅の有無によって微生物の存在が確認できるのみなら
ず、ハイブリダイゼーションアッセイによる菌種の決定
も可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリメラーゼ・チェー
ン・リアクション（以下ＰＣＲと略す）による微生物遺
伝子の増幅に有用なプライマーセットに関するものであ
る。細菌、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチァ、
酵母等、各種微生物を検出し、更に同定するという作業
は、医学領域をはじめとする広い分野で行われている。
なかでも感染症の起因菌を分離・同定することは、治療
効果を大きく左右する重大な作業である。本発明は、感
染症起因菌を始めとする各種微生物の迅速な検出、ある
いは同定等に有用なプライマーセットと、その応用に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】細菌に代表される微生物の存在を確認
し、同定するためには、一般に選択培地による分離や増
殖用培地による増菌、顕微鏡観察や免疫学的な反応性、
あるいは多くの生化学的性状のチェック等、多種多様な
分析が行われている。これら一連の操作の中には、培養
をはじめとして時間のかかるものが多く含まれ、また操
作にも熟練が要求される。近年になって、いくつかの生
化学的性状を同時に確認し、機械的に菌種を特定するこ
とが可能なキットが開発された。これは、試料から分離
し増菌しておいた微生物を様々な試薬と接触させて生じ
る変化を観察し、菌種の特定に必要な生化学的性状を確
認するという操作を簡単に行えるようしたものである。
しかしこの種のキットでは熟練こそ要求されないもの
の、増菌のための培養時間は必須である。作業の中に培
養操作が含まれる限り、程度の差こそあるものの時間的
な障害を避けることは困難である。一般に微生物の分離
培養には１〜７日を要し、更に生化学的な性状の確認を
行えば数日が経過することも稀ではない。

【０００３】病原性微生物が血液中に増殖する敗血症の
ような全身感染症では、起因菌を可能な限り迅速に特定
して適切な処置を取らなければ生命に関わる事態を招
く。培養等による微生物の同定結果が得られるまでは、
抗菌スペクトルの広い薬剤による治療が行われるのが一
般的であるが、起因菌が特定できない状況下での治療に
は限界がある。また薬剤の汎用は、耐性菌の出現を促進
するため好ましくない。

【０００４】従前どおりの培養を前提とする微生物の検
出あるいは同定における時間的な障害を解消するため、
遺伝子配列を分析することによって微生物を検出・同定
する方法が提案されている。遺伝子配列の分析は、ＰＣ
Ｒと組み合わせることによってその感度を飛躍的に向上
させることができ、しかも培養を必要としないので時間
を大幅に節約することが可能となる。現在では多くの微
生物について遺伝子の塩基配列が明らかにされているの
で、各微生物に特異的な塩基配列をＰＣＲによって増幅
すれば、理論的には１個の細菌を検出、あるいは同定す
ることも可能となる。ところが、ＰＣＲにはプライマー
と呼ばれるオリゴヌクレオチドが不可欠である。プライ
マーには、増幅対象となる塩基配列の5'末端と3'末端に
相当する領域の配列を用いる。したがって、プライマー
の配列は菌種ごとに設定しなければならない。またＰＣ
Ｒの反応条件についても、菌種ごとに設定する必要があ
る。つまり予め決まった微生物のみを検出すれば良い場
合にＰＣＲは非常に強力なツールとなるが、未知の微生
物に対してはその能力を発揮しにくいのである。わが国
の感染症の主役は、強毒菌による感染症から弱毒性の微
生物によるいわゆる日和見感染へと移ってきている。免
疫能の低下にともなって病原性の弱い微生物が感染症を
引き起こす日和見感染では起因菌の種類が数１００種類
にも及び、これらの微生物全てについてプライマーとＰ
ＣＲの反応条件を設定することは事実上不可能である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＰＣＲを利
用した幅広い微生物の検出、あるいは同定を可能とする
プライマーセットの提供を課題とするものである。多く
の微生物に共通して利用することができるプライマーセ
ットを設定すれば、ＰＣＲを利用した微生物遺伝子の分
析はより実用的なものとなる。更に本発明は、多くの微
生物に対して共通して利用することが可能なプライマー
セットを利用して実際に微生物を検出、あるいは同定す
る方法の提供を課題としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記Ａ群から
選択された少なくとも１つの塩基配列を持つ5'プライマ
ーと、下記Ｃ群から選択された少なくとも１つの塩基配
列を持つ3'プライマーとで構成される微生物遺伝子増幅
用プライマーセットである。 Ａ群：5'-TGGCTCAGATTGAACGCT-3' 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' Ｃ群：5'-GATGCCCTCCGTCGTCACCC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAACC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAA-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAAAC-3'

【０００７】また本発明は、下記Ｂ群から選択された少
なくとも１つの塩基配列を持つ5'プライマーと、下記Ｃ
群から選択された少なくとも１つの塩基配列を持つ3'プ
ライマーとで構成されるグラム陰性細菌遺伝子増幅用プ
ライマーセットを提供する。 Ｂ群：5'-TGGCTCAGATTGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGATGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGTACGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGACGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGAATAAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGGTGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGATAAACGCT-3' Ｃ群：5'-GATGCCCTCCGTCGTCACCC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAACC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAA-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAAAC-3'

【０００８】本発明のプライマーセットのうち、Ａ群と
Ｃ群の組み合せからなる微生物遺伝子増幅用プライマー
セットは、グラム陽性細菌、陰性細菌、マイコプラズ
マ、クラミジア、リケッチァ、酵母等広範囲の微生物の
遺伝子の増幅に利用することができる。このＡ群とＣ群
の組み合せは、ＰＣＲの条件を適宜変更することによっ
てグラム陽性細菌の遺伝子増幅用プライマーセットとし
て利用することもできる。例えば、プライマーとテンプ
レートとなるＤＮＡとをアニールさせるときの温度を低
く設定すると、グラム陽性細菌、陰性細菌の他マイコプ
ラズマ等を含むほとんど全ての微生物遺伝子に対しプラ
イマーとして働く。一方、より高温下でアニールさせれ
ば、グラム陽性細菌の遺伝子のみが増幅される。このと
きの温度条件を例示すれば、４５℃以下ではグラム陽性
細菌の遺伝子が、５５℃以上ではほとんど全ての微生物
遺伝子が増幅される。温度条件は、利用するポリメラー
ゼの活性や緩衝液の組成等によっても左右される。例え
ば反応液中のＭｇＣｌ2等の塩濃度は、アニーリングに
影響を与える。

【０００９】本発明によるＡ群とＣ群の組み合せからな
る微生物遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のとお
りきわめて広範囲の微生物に対してプライマー活性を持
つ。増幅可能な菌種としては、抗酸菌属の全菌種、Stap
hyrococcus属の全菌種、Streptococcus属の全菌種等を
挙げられる。更に詳細には、例えば次のようなものを例
示できる。 グラム陽性細菌 Bacillus subtilis Clostridium ramosum Corynebacterium renale Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium kansasii Mycobacterium leprae Rhodococcus equi Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus pleomorphus Streptococcus sanguis Streptococcus parasanguis グラム陰性細菌 Achromobacter xylosoxidans Agrobacterium tumofaciens Alkaligenes faecalis Bacteroides fragilis Brucella abortus Chromobacterium violaceum Chromobacterium fluviatile Eikenella corrodens Erysipelothrix ruthiopathiae Escherichia coli Flavobacterium heparinum Kingella denitrificans Kingella kingae Neisseria gonorrhoeae Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas cepacia Pseudomonas testosteroni Vibrio anguillarum Vibrio cholerae マイコプラズマ Mycoplasma mycoides Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis Mycoplasma salivarium Mycoplasma hyopneumoniae Ureaplasma urealyticm リケッチア Coxiella burnetii Rickettsia prowazekii Rickettsia rickttsii Rickettsia typhi レプトスピラ Laptospira interrogans 放線菌 Actinomyces pyogenes

【００１０】本発明のもう一方の組み合せであるＢ群と
Ｃ群で構成されるグラム陰性細菌遺伝子増幅用プライマ
ーセットは、特に反応条件を考慮しなくてもグラム陰性
菌に対する特異的なプライマーセットとして利用するこ
とができる。Ｂ群とＣ群の組み合せからなる微生物遺伝
子増幅用プライマーセットは、前述のとおりきわめて広
範囲のグラム陰性細菌に対してプライマー活性を持つ
が、増幅可能な菌種を例示すれば次のようなものが挙げ
られる。 Achromobacter xylosoxidans Agrobacterium tumofaciens Alkaligenes faecalis Bacteroides fragilis Brucella abortus Chromobacterium violaceum Chromobacterium fluviatile Eikenella corrodens Erysipelothrix ruthiopathiae Escherichia coli Flavobacterium heparinum Kingella denitrificans Kingella kingae Neisseria gonorrhoeae Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas cepacia Pseudomonas testosteroni Salmonella typhi Salmonella typhimurium Vibrio anguillarum

【００１１】本発明においてＡ、Ｂ、Ｃの各群から選択
されるプライマーは、各群から１種のみを選択しても良
いし、複数種の配列を選択し混合物として用いることも
可能である。本発明のプライマーはそれぞれ目的とする
微生物間に共通の配列を選択したものであるが、現実に
は一部の微生物では若干の相違が存在する。しかしごく
少数の塩基が相違していても増幅は可能なため、複数種
の塩基配列が同様のプライマー活性を示す。このような
理由により、本発明では複数の塩基配列で構成される各
群からプライマーを選択できるのである。これらプライ
マーはＤＮＡ合成装置によって容易に合成することがで
きる。

【００１２】続いて本発明によるプライマーセットの利
用方法について述べる。本発明によるプライマーセット
は、ＰＣＲによる遺伝子の増幅に用いるものである。Ｐ
ＣＲの条件は特に限定されるものではないが、Ａ群とＣ
群の組み合せを用いるときには、前述のとおり反応条件
によって増幅される遺伝子が違ってくるので注意が必要
である。

【００１３】ＰＣＲによって増幅された遺伝子は、電気
泳動分析で確認すればよい。例えばＡ群とＣ群の組み合
せにより微生物共通の遺伝子をＰＣＲで増幅した場合、
微生物の種類には無関係に約３４０bpのＤＮＡが増幅さ
れるので、このＤＮＡを電気泳動で確認すれば何らかの
微生物が存在していることが証明される。同様にＢ群と
Ｃ群の組み合せでは、菌種にかかわらず約３３０bpのグ
ラム陰性菌に固有のＤＮＡが増幅され、このＤＮＡは電
気泳動分析によって確認することが可能である。ただ電
気泳動分析による確認では、微生物の存在が確認される
だけなので、試料が採取や前処理の過程で微生物によっ
て汚染されることのないように注意する必要が有る。実
際には微生物が存在していなくても、わずかな微生物の
混入によって存在するかのような結果が出てしまうおそ
れがあるためである。

【００１４】本発明のプライマーセットは微生物の同定
においても有用である。本発明によるプライマーセット
でＰＣＲを行って増幅されたＤＮＡ中に、菌群や菌種に
特異的な塩基配列、すなわち標的配列が存在するかどう
かを核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって確認
すれば良いのである。本発明のプライマーセットで増幅
されるＤＮＡは、5'端および3'端では共通の塩基配列を
持つが、中間部分にはそれぞれの微生物種に特異的な塩
基配列が存在する。ここでいう菌群に特異的な塩基配列
とは、限られた近縁の微生物群に共通して存在する塩基
配列を指す。現在、ある一定の菌群において共通して観
察される塩基配列がいくつか知られており、このような
塩基配列が本発明のプライマーセットで増幅される領域
に存在していれば菌群の特定に利用することができる。
他方、菌種に特異的な塩基配列は既に３００種以上の微
生物について報告されており、このような特異的塩基配
列を微生物の同定に利用することができる。

【００１５】本発明のプライマーセットによって増幅さ
れる領域において、菌種間で実際にどの程度塩基配列が
異なっているかを次に示す。各ケースで最初の行に示し
た菌種の増幅領域の塩基配列を１００としたときに、他
菌種の塩基配列がどの程度類似しているかを塩基配列デ
ータベースで算出し％で示したものである。なお分析の
対象とした菌は次の４１種である。 Achromobacter xylosoxidans Actinomyces pyogenes Agrobacterium tumofaciens Alkaligenes faecalis Bacteroides fragilis Brucella abortus Chromobacterium violaceum Chromobacterium fluviatile Clostridium ramosum Corynebacterium renale Coxiella burnetii Eikenella corrodens Erysipelothrix ruthiopathiae Escherichia coli Flavobacterium heparinum Kingella denitrificans Kingella kingae Laptospira interrogans Mycobacterium bovis Mycobacterium kansasii Mycobacterium leprae Mycoplasma mycoides Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis Mycoplasma salivarium Mycoplasma hyopneumoniae Neisseria gonorrhoeae Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas cepacia Pseudomonas testosteroni Rhodococcus equi Rickettsia prowazekii Rickettsia rickttsii Rickettsia typhi Streptococcus pleomorphus Streptococcus sanguis Streptococcus parasanguis Ureaplasma urealyticm Vibrio anguillarum

【００１６】ケース１： Escherichia coli １００% Proteus vulgaris ８２% Pseudomonas aeruginosa ６８% Alkaligenes faecalis ６７% Achromobacter xylosoxidans ６７% Pseudomonas testosteroni ６７% Coxiella burnetii ６６% その他の菌種は６０%以下

【００１７】ケース２： Streptococcus sanguis １００% Streptococcus parasanguis ９３% その他の菌種は６０%以下

【００１８】ケース３： Agrobacterium tumofaciens １００% Rickettsia typhi ７０% その他の菌種は６０%以下

【００１９】ケース４： Chromobacterium violaceum １００% Chromobacterium fluviatile ９１% Eikenella corrodens ７７% Alkaligenes faecalis ７６% Achromobacter xylosoxidans ７６% Kingella kingae ７２% Kingella denitrificans ７２% Pseudomonas aeruginosa ７０% その他の菌種は７０%未満

【００２０】例えばケース１でEscherichia coliに対し
てProteus vulgarisで８２%の類似度があったが、その
他の菌種では７０％以下の類似度しかなく容易に識別で
きることが分かる。つまり本発明のプライマーセットに
相当する5'および3'末端部分は菌種間で高度に共通して
いるが、プライマー間の塩基配列は菌種間でかなり相違
しているのである。本発明のプライマーは、１６ｓリボ
ソームＲＮＡに由来する塩基配列をもとに設定されてい
る。この領域は微生物の種に特異的な塩基配列を含むこ
とが知られているので、微生物の同定には好都合なので
ある。（Woese,C.R.,Microbiol.Rev.,51:221-271,1987
参照） 一般にオリゴヌクレオチドによる核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイでは２０塩基中の１塩基の違いを鑑別で
きる条件を設定することが可能と言われており、ここで
示した類似度の相違によって充分に菌種の識別を行うこ
とができる。

【００２１】核酸ハイブリダイゼーションアッセイは常
法にしたがって行う。つまり既知の微生物の核酸を予め
用意しておき、これにサンプルからＰＣＲで増幅したＤ
ＮＡをハイブリダイズさせ、その程度を観察するのであ
る。臨床材料から分離されることが多い微生物はある程
度限られているので、常に一連の核酸パネルを用意して
おき、これに対してサンプルからＰＣＲで増幅したＤＮ
Ａを同時にハイブリダイズさせる方法を採るとよい。あ
るいはＰＣＲで増幅したＤＮＡを標的配列に相補的な特
異プローブと接触させ、ハイブリダイゼーションの有無
を確認するようにしてもよい。

【００２２】核酸ハイブリダイゼーションアッセイとし
ては具体的には、例えば次に示すようなアッセイ系を利
用することができる。ここで例示したアッセイ系で標識
として利用可能な成分は、ラジオアイソトープ、酵素、
発光物質、蛍光物質等が挙げられ、これら標識成分は公
知の方法によって直接導入することもできるし、免疫反
応やアビジン−ビオチンの反応等によって間接的に結合
させても良い。また固相としては、ニトロセルロース等
からなるフィルター、マイクロタイタープレート等のプ
ラスティック製プレート、あるいはスライドグラス等、
一般に用いられているものをそのまま利用することがで
きる。

【００２３】核酸ハイブリダイゼーションアッセイの
例： ＊増幅したＤＮＡと標識したプローブとをハイブリダイ
ズ後、液体クロマトグラフィー等で未反応の標識プロー
ブを分離する方法。 ＊ＰＣＲの基質としてビオチン等で標識したヌクレオチ
ドを利用して増幅ＤＮＡに標識を導入しておき、これを
固相に固定したプローブと接触させハイブリダイズによ
って固相に捕捉された増幅ＤＮＡの標識を検出する方
法。（Michael A.他、PCR Protocols;Academic Press.
参照） ＊増幅ＤＮＡを、ＰＣＲに用いたプライマーと同じ塩基
配列を持つプローブ、および標的配列に相補的な塩基配
列を持つプローブと接触させ、両方のプローブとのハイ
ブリダイズを検出する方法。この場合、一方を固相上の
捕捉プローブに、他方を標識プローブとすれば便利であ
る。

【００２４】本発明によるプライマーセットは、微生物
の迅速、かつ確実な検出、あるいは同定が要求される場
合、特に有用である。中でも、本来無菌であるべき試料
が微生物による汚染（感染）を受けているかどうかを確
認したい場合等には大きな効果を示す。本発明によるプ
ライマーセットを用いてＰＣＲを行えば、血液１ml当り
１個という非常に少ない細菌を検出することもできる。
また逆転写酵素を利用してリボソームＲＮＡから誘導し
たｃＤＮＡについてＰＣＲを行えば、更に高感度（１ml
当り０．０１個程度）な検出も可能である。これは、細
菌１個中にＤＮＡ上では１つしか存在しない塩基配列
が、リボソームＲＮＡでは数千個にもおよぶコピーとし
て存在するためである。高感度化が要求される場合に
は、リボソームＲＮＡの利用の他、試料の濃縮を併用す
ることも可能である。微生物の濃縮としてはいくつかの
方法が知られているが、試料として血液を用いるときに
は、溶血遠沈による微生物の濃縮（Henry,N.K.他,J.Cli
n.Microbiol. 20:413-416,1984.参照）、あるいはショ
糖やフィコールを用い比重差を利用した血中微生物の濃
縮のような方法が好適である。

【００２５】微生物の核酸を分析する際には、通常なん
らかの手段により細胞を破壊して核酸を取り出す操作が
必要である。本発明によるプライマーセットを血中微生
物の検出・同定に適用する場合、細胞の破壊にはリゾチ
ーム等による酵素的な方法や、ビーズを利用して機械的
につぶす方法等を採用すると良い。本発明によるプライ
マーセットを用いた微生物の検出、あるいは同定は、ヒ
トの感染症の検出の他、食品、バイオリアクター、環境
中の無菌状態をチェックする場合等にも有用である。以
下実施例により、本発明を更に詳細に説明する。

【００２６】

【作用】本発明のプライマーセットは、多種類の微生物
遺伝子を共通の条件下で増幅するためのものである。本
発明におけるプライマーセットは多くの微生物遺伝子に
共通して保存されている領域の塩基配列を利用している
ので、ＰＣＲによる増幅も共通の条件で行うことができ
る。またこのプライマーセットを用いる微生物の検出あ
るいは同定は、微生物の種とは関係なくＰＣＲによる増
幅操作を共通の条件下で行うことを可能とするものであ
る。

【００２７】

【実施例】

１．微生物共通プライマーセット 次の塩基配列を持つ各プライマーを、ＤＮＡ合成装置
（アプライドバイオシステムズ社製、DNA/RNAシンセサ
イザー３９７）により常法にしたがって合成した。合成
したプライマーは液体クロマトグラフィーによって精製
し、２０pMとなるように１×Ｔａｑ緩衝液に溶解してＰ
ＣＲに用いた。 塩基配列： プライマーセットＡ （微生物共通またはグラム陽性細菌共通プライマーセッ
ト、Ａ群とＣ群の組み合せ） 5'側：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 3'側：5'-GATGCCCTCCGTCGTCAACC-3' プライマーセットＢ （グラム陰性細菌共通プライマーセット、Ｂ群とＣ群の
組み合せ） 5'側：5'-TGGCTCAGATTGAACGCT-3' 3'側：5'-GATGCCCTCCGTCGTCAACC-3' １×Ｔａｑ緩衝液： １０mM Ｔｒｉｓ・塩酸緩衝液、pH８．３ １．５mM ＭｇＣｌ2 ５０mM ＫＣｌ ０．０１% ゼラチン

【００２８】２．プライマーセットによるＰＣＲ 表１に示す１６種の微生物をサンプルとし、１の各プラ
イマーセットがサンプルとした微生物の遺伝子に対して
共通のプライマー活性を示すことを確認した。操作は次
に示すとおりである。種の判明している微生物１６種
（表１）を用意し、それぞれ増菌用培地で増菌後、コロ
ニーをかき取って滅菌水に浮遊させ菌数をMacFarland標
準懸濁液No.1(108cells/mlとなるように調整した。増菌
用培地にはハートインフュージョン寒天培地（栄研化学
製、一般細菌用）、並びに１％小川培地（栄研化学製、
Mycobacterium属用）を用いた。各菌液１００μlにリゾ
チーム（和光純薬工業製、５mg/ml生理食塩水）を１０
μl加えて室温で１５分間反応させ、更にアクロモペプ
チダーゼ（和光純薬工業製、５mg/ml水溶液）を１０μl
加え５５℃で１５分間反応させた後、界面活性剤（５%
ＮＯＮＩＤＥＴ、５%Ｔｗｅｅｎ２０水溶液）とプロテ
ィナーゼＫ（和光純薬工業製、２mg/ml・１０mMＴｒｉ
ｓ緩衝液、pH８．３）を各１０μl加え５５℃、１５分
間の反応に続いて１００℃で５分間煮沸後に氷冷し溶菌
〜核酸抽出した。 この核酸抽出液を８０００rpmで１
秒間遠心分離し、上清１０μlを採って次の成分を加え
ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、変性：９４℃／３０
秒、アニール：５５℃（または４５℃）／１２０秒、伸
長：７２℃／６０秒を１サイクルとし、３０サイクル行
った。アニール時の温度条件は、プライマーセットＡを
微生物共通用として用いる場合には４５℃、グラム陽性
菌用に用いる場合は５５℃とした。 ＰＣＲ用の反応液成分： 超純水：３８μl ２mMｄＮＴＰ混合物：１０μl １０×Ｔａｑ緩衝液：５．５μl ２U/μlＶｅｎｔポリメラーゼ：１μl （宝酒造社製） ミネラルオイル：１００μlを重層 ＰＣＲ後、反応液５μlについて電気泳動分析し、目的
とするＤＮＡが増幅されているかどうかを確認した結果
が表１である。プライマーセットＡを５５℃で用いた場
合にグラム陽性菌の、プライマーセットＢでグラム陰性
菌の、そしてプライマーセットＡを４５℃で用いた場合
にサンプル微生物全てのＤＮＡが増幅されていることが
確認された。

【表１】

【００２９】３．血中微生物の検出感度 正常なヒト血液に一定量の微生物を加えたものをサンプ
ルとし、本発明のプライマーセットを用いて血中微生物
の検出を試みた。添加微生物には、Staphylococcus aur
eusとSalmonella typhimuriumを用いた。各微生物を増
菌用培地で培養後、コロニーを滅菌水に浮遊させて菌液
とし、正常ヒト血液に１０００cells/ml、１００cells/
ml、１０cells/ml、１cell/mlとなるように添加した。
微生物添加血液１mlに対して１mlの溶血緩衝液を加え、
１５０００rpmで３０秒遠心分離して上清を傾斜除去し
た。得られた沈でん分画に再度１mlの溶血緩衝液を加え
１５０００rpmで３０秒間遠心分離後、上清を傾斜除去
するという操作を３回繰り返した。最終的に得られた沈
でんに、５mMのＥＤＴＡ水溶液を１００μl加えて懸濁
させて菌液とした。なお用いた溶血緩衝液の組成は、
０．３２Mシュクロース、１０mMＴｒｉｓ塩酸緩衝液・p
H７．５、５mMＭｇＣｌ2、１%ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、０．１%アジ化ナトリウムである。この菌液５μlを
取り、２．と同じ操作によって溶菌〜核酸抽出しＰＣＲ
用のサンプルとした。こうして用意したＰＣＲ用サンプ
ルを、前述のＰＣＲと同じ条件で増幅した。加えて、同
時に逆転写酵素を利用したＲＮＡからの検出を試みた。
すなわち、溶血・溶菌・核酸抽出を終えた前記ＰＣＲサ
ンプル１０μlに対して２０pMの各プライマー溶液１０
μlを加え、９５℃で５分間加熱後、氷冷して８０００r
pmで１秒間遠心分離した。１０μlの基質（２mMのｄＮ
ＴＰ混合物）溶液ならびに１μlの逆転写酵素（寶酒造
製、ＲＡＶ−２、１０U）を４．５μlのＰＣＲ緩衝液
（２と同じ）とともに加え、４２℃で３０分間のアニー
ル後、９５℃で５分間逆転写酵素による反応を行い、氷
冷してＲＮＡに相補なＤＮＡを誘導した。誘導されたＤ
ＮＡに対して、前述のＰＣＲを行い遺伝子を増幅した。
結果は表２に示す。ＰＣＲによって１cell/mlのS.aureu
sを、また逆転写酵素の組み合せによって１cell/mlのS.
typhimuriumuを検出できることが確認された。

【表２】

【００３０】４．基準株ＤＮＡ固定フィルターの調製 微生物の同定に必要な、基準株となる微生物のＤＮＡを
調製した。基準株としては表３に示す７種の微生物を用
いた。各微生物を増菌用培地で増菌し、２と同様の操作
によって溶菌〜核酸の抽出を行い核酸抽出液とした。こ
の核酸抽出液１０μlに対し、次に示すプライマーセッ
トを各４μM、超純水を５９μl加え、１００℃で５分間
加熱変性させた。この反応液に、１０×ＰＣＲ緩衝液１
０μl、ｄＮＴＰを各２mMずつ含む混合物５μl、Ｔａｑ
ポリメラーゼ（寶酒造社製、１U/ml）１μlを加え、ミ
ネラルオイル１００μlを重層してＰＣＲを行った。Ｐ
ＣＲの条件は、９５℃で３０秒間変性、５０℃で３０秒
間アニール、７２℃で２分間伸長とし、３０サイクル繰
り返した。 １０×ＰＣＲ緩衝液：１００mMトリス塩酸緩衝液pH８．
３、５００mMＫＣｌ、１５mMＭｇＣｌ2、０．１%ゼラチ
ン 5'側プライマー：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' 3'側プライマー：5'-GATGCCCTCCGTCGTCACCC-3' こうしてＰＣＲにより増幅したＤＮＡを、ニトロセルロ
ース製フィルターＨＡＴＦ（ミリポア製、商品名）に２
μlずつスポットして乾燥させた。さらに８０℃で１時
間処理して基準株ＤＮＡ固定フィルターを得た。このフ
ィルターは、使用前にサケ精子ＤＮＡで４５℃、１時間
のpre-hybridizationを行った。pre-hybridization液
は、ホルムアミド５．０ml、２０×ＳＳＣ１．０ml、１
００×Denhardt液０．２ml、１０mg/ml熱変性サケ精子
ＤＮＡ０．２ml、蒸留水３．３mlからなるものを用い
た。

【００３１】５．微生物の同定 ３と同じ微生物を試料とし、４の基準株ＤＮＡ固定フィ
ルターによって菌種の同定が可能であることを確認し
た。３と同じ操作によりＰＣＲ用試料を調製した。なお
微生物の細胞数は1000 cells/mlとし、逆転写酵素によ
るＲＮＡからの転写は行わなかった。ＰＣＲ用試料２、
５、１０μlを取り、ｄＮＴＰ混合物中のｄＵＴＰを除
いて11ビオチン−ｄＵＴＰ（シグマ社製）０．４mMを５
μl用いる他は４と同じプロトコールでＰＣＲを行っ
た。このＰＣＲによってビオチンで標識されたＤＮＡが
増幅される。ＰＣＲ後、反応液の１００μlを３mlのバ
イブリダイゼーション液と混合し、基準株ＤＮＡ固定フ
ィルターを浸し、７０℃で２時間ハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーション液の組成は、ホルムアミド５．
０ml、２０×ＳＳＣ１．０ml、１００×Denhardt液０．
１ml、１０mg/ml熱変性サケＤＮＡ０．１ml、硫酸デキ
ストラン０．３g、蒸留水３．８mlからなる。ハイブリ
ダイズしたフィルターは、３％に仔牛血清アルブミンを
添加した反応緩衝液（０．１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．
１M ＮａＣｌ、２mg ＭｇＣｌ2、０．０５％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．５）に４２℃、２０分間浸
し、洗浄を行う。５mlの反応緩衝液にstreptoavidin-al
kaline phosphatase (ZYMED社製)を５units加えたもの
にフィルターを３７℃で１０分間反応させた後、反応緩
衝液で２回洗浄後、さらに洗浄緩衝液（０．１M Ｔｒｉ
ｓ塩酸、０．１M ＮａＣｌ、５０mg ＭｇＣｌ2、ｐＨ
９．５）で洗浄した。洗浄緩衝液１０mlに発色基質（ニ
トロブルーテトラゾリウム２．５mg、５−ブロム−４−
クロロ−３−インドリール−フォスフェイト１．２５m
g）を添加した液にフィルターを浸し、３０分間反応後
カラーグラフィクアナライザー（オリンパス光学社製）
でスポットの発色を測定し、ハイブリダイズの有無を判
定した。S. aureusに関しては、Staphylococcus属特異
に検出することが可能であり、S. typhimuriumについて
も起因菌の判断は可能であった。

【表３】

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、一定の塩基配列を持つ
１組のプライマーセットで多くの微生物遺伝子を増幅す
ることが可能となる。プライマーの配列を微生物に併せ
て用意しなくてもよいので経済的であり、また多くの微
生物に対して同じ条件でＰＣＲを行うことができる。本
来無菌であるべき血液等を試料とするときには、微生物
の種類を問わず常に同じ条件で感染の有無をチェックす
ることができるので非常に有用である。一方、本発明に
よる微生物の同定方法は、ＰＣＲで遺伝子を増幅する操
作を菌種間で共通化できるため経済性、並びに簡便性の
点で大きな利点を持つ。このような効果は、菌種毎にプ
ライマーセットを用意しなければならない従来の方法で
は決して実現できない。

【００３３】本発明のプライマーセットで増幅された遺
伝子の中の菌種に特異的な配列をハイブリダイゼーショ
ンアッセイで確認すれば、迅速に菌種を決定することが
できる。このとき、予めビオチン等の非放射性物質で標
識したヌクレオチドをＰＣＲの基質に用いれば、操作の
全てを特殊な設備無しでも行うことができる。したがっ
て、感染症が疑われる患者からの試料採取、微生物感染
の有無の確認、そして微生物の同定という治療方針の決
定に必要な一連の作業をどこででも迅速に行える。試料
を特殊な検査施設に輸送しなくてもよいうえに、本発明
による微生物同定方法が半日程度で完了することを考え
合わせると、培養を前提とする従来の診断・治療では不
可欠であった一時的な抗菌スペクトルの広い薬剤の利用
を省略することさえ可能である。更に、本発明のプライ
マーセットで増幅される遺伝子領域の中には、菌種を決
定することが可能な塩基配列が含まれている。そのため
検出される微生物がある程度予想されるときには、基準
となる微生物の遺伝子を予め取り揃えてパネルとしたも
のを利用し、増幅遺伝子とのハイブリダイゼーションの
程度を比較・観察することによって、より簡便な同定が
可能となる。このように、本発明によるプライマーセッ
ト、並びにそれを利用した微生物の検出あるいは同定方
法は、従来の方法では不可能であった簡便で迅速な分析
を可能とし、ＰＣＲの応用範囲を大きく広げるものであ
る。

Claims (7)

【整理番号】 Ｐ−０００２５２ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記Ａ群から選択された少なくとも１つの
   塩基配列を持つ5'プライマーと、下記Ｃ群から選択され
   た少なくとも１つの塩基配列を持つ3'プライマーとで構
   成される微生物遺伝子増幅用プライマーセット Ａ群：5'-TGGCTCAGATTGAACGCT-3' 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' Ｃ群：5'-GATGCCCTCCGTCGTCACCC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAACC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAA-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAAAC-3'
2. 【請求項２】下記Ａ群から選択された少なくとも１つの
   塩基配列を持つ5'プライマーと、下記Ｃ群から選択され
   た少なくとも１つの塩基配列を持つ3'プライマーとで構
   成されるグラム陽性細菌遺伝子増幅用プライマーセット Ａ群：5'-TGGCTCAGATTGAACGCT-3' 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' Ｃ群：5'-GATGCCCTCCGTCGTCACCC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAACC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAA-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAAAC-3'
3. 【請求項３】下記Ｂ群から選択された少なくとも１つの
   塩基配列を持つ5'プライマーと、下記Ｃ群から選択され
   た少なくとも１つの塩基配列を持つ3'プライマーとで構
   成されるグラム陰性細菌遺伝子増幅用プライマーセット Ｂ群：5'-TGGCTCAGATTGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGATGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGTACGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGACGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGAATAAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGGTGAACGCT-3' 5'-TGGCTCAGGATAAACGCT-3' Ｃ群：5'-GATGCCCTCCGTCGTCACCC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAACC-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCACAA-3' 5'-GATGCCCTCCGTCGTCAAAC-3'
4. 【請求項４】請求項１、２または３に記載のプライマー
   セットによって増幅した微生物遺伝子中の、標的配列の
   有無をハイブリダイゼーション・アッセイにより確認
   し、微生物を検出または同定する方法
5. 【請求項５】標的配列が種に特異的な塩基配列であるこ
   とを特徴とする、請求項４の微生物を検出または同定す
   る方法
6. 【請求項６】標的配列として複数種の配列を用い、複数
   の微生物を同時に検出または同定することを特徴とす
   る、請求項４の微生物を検出または同定する方法
7. 【請求項７】増幅に用いるヌクレオチドが、標識されて
   いることを特徴とする請求項４の微生物を検出または同
   定する方法