CN1261594C - 泌尿生殖道炎症病原体和耐药性集成诊断基因芯片及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测泌尿生殖道炎症病原体淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体及其耐喹诺酮类抗生素、耐大观霉素和耐四环素的集成诊断基因芯片制备方法。该基因芯片包括检测系统和监控系统。检测系统根据三种病原体的特异片段序列和耐药基因的突变位点，设计相应的寡核苷酸探针，固定在芯片上的探针与标记的特异性的样本扩增产物杂交，根据杂交信号可检测尿道炎病原体的种类及其耐药类型。监测系统与检测系统的所有探针位于同一区域。本芯片应用特征在于可同时检测出上述三种性病病原体及其对三种药物的耐药性，具有极大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及检测泌尿生殖道炎症病原体及其耐药性的集成诊断基因芯片的制备和应用方法。
背景技术
性传播疾病是一类发病率极高、对人类健康危害极大的传染性疾病。在性传播疾病的临床症状中，最常见的临床表现为泌尿生殖道炎症，引起泌尿生殖道炎症最常见的病原体为淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体。对淋球菌的诊断，主要为直接镜检和细胞培养。直接镜检快速但准确性低，细胞培养准确性高但淋球菌培养需48小时。衣原体细胞培养：敏感性为80％-90％，阳性即可确诊，但是上述技术特殊，对操作人员及实验设备要求严格，在一般医院实行起来尚难完成。沙眼衣原体细胞学检查法：在感染细胞内可有衣原体的包涵体存在。从感染部位采取细胞标本作涂片，姬姆萨染色包涵体是蓝色或暗紫色，碘染色显示褐色。但敏感性差(40％)，目前已较少采用。解脲支原体感染的实验室诊断主要是支原体的培养和血清学鉴定，采用培养法需48小时并且假阳性率高。所有这些检查方法都有二大缺陷，一是效率低，一次只能检测一种病原体，对耐药性检测步骤多，操作复杂，花费时间长。二是对急性泌尿生殖道炎症期病原体检测阳性率较高，而对慢性泌尿生殖道炎症期病原体检测阳性率较低。目前国内临床上尚未常规开展淋球菌和支原体的耐药性检测，对泌尿生殖道炎症的治疗大多凭经验，易造成病情延误或病人花费过多。近年来发现在引起泌尿生殖道炎症的病原体中，单独一种病原体感染的比例较小，同时有多种病原体感染的比例较大。因此，急需研制一种快速、简便、准确的标准化的检测方法，能够一次性地检测出急性或慢性泌尿生殖道炎症的病原体种类及其耐药类型。基因芯片技术的出现，使这一难题迎刃而解。DNA芯片技术已在基因表达、基因突变检测、基因多态性研究和基因诊断领域获得广泛应用。但目前在国内只有部分科研机构和高科技公司掌握了DNA芯片技术，关于泌尿生殖道炎症病原体及其耐药性的集成诊断基因芯片目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于泌尿生殖道炎症的三种病原体及其对三种药物耐药性的集成诊断基因芯片及其应用方法，并具有检测监控体系保证质量。利用这种芯片，通过一次集成操作既提高了效率，又降低了成本，对诊断的符合率提高到95％以上。
本发明的构思如下；
1.一张芯片上同时固定淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体三种病原体保守序列的探针，及其对喹诺酮类抗生素、大观霉素和四环素耐药基因突变位点的多种探针，只用患者的一个泌尿生殖道分泌物棉拭子，仅需一次PCR和一次杂交反应，就可以在5小时内及时准确的确认被检者是否患有上述三种病原体及其对三种抗生素的耐药性。
2.多疾病诊断基因芯片涉及多种复杂的物理过程和生物化学反应，如点样，DNA模板的制备，聚合酶链反应(PCR)扩增、标记、杂交、洗涤、检测等过程，以及在各步骤中可能的污染，本发明在芯片上具有相应的质量保证和检测监控体系，采用阴性对照和阳性对照的方法确保检测准确性，减少误差。
3.由于多种病原体检测芯片是一种多基因的反应系统，需要我们通过计算机分析和实验筛选，设计扩增片段长度不同的高检出率的扩增引物。
4.使用单位如有荧光扫描仪，样本扩增产物标记使用Cy5或Cy3荧光标记，可以节省实验时间。如无荧光扫描仪，样本扩增产物标记使用Dig地高辛显色标记，减少实验成本。
技术方案如下；
本发明的集成诊断芯片是针对淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体三种性病病原体和对喹诺酮类、大观霉素和四环素三种抗生素的耐药基因。这些病原体和耐药基因在国内外已有大量的分子生物学方面的研究，其具有诊断意义的特征基因序列已公布，可以运用分子生物学的基因分离扩增技术来获取：取淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的标准菌株和药敏质控菌株，分别提取DNA作为模板，参照公布的基因序列设计引物，PCR扩增目的片段，然后克隆到质粒上在大肠杆菌中扩增，提质粒DNA备用。
所说的基因芯片包括两个系统，第一部分为监控系统，第二部分为检测系统。监控系统由阴性和阳性各二个对照基因探针构成，检测系统根据淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的特殊片段序列和对喹诺酮类抗生素、大观霉素和四环素的耐药基因突变位点，设计相应的寡核苷酸探针；监测系统与检测系统的所有探针位于同一区域；标记的样本扩增产物在相同的杂交条件下同时与监控系统和检测系统的所有探针反应。
监控系统包括四个部分，分别为：1.点样液，为芯片阴性对照(1)，若杂交后检测无信号，表明正常；若有杂交信号，表明点样液有污染；2.植物基因探针A，为阴性对照(2)，若杂交后检测无信号，表明正常；若有杂交信号，表明系统有污染；1或2其中之一出现杂交信号，该芯片不能使用；3.植物基因探针B，为阳性对照(1)，该植物基因DNA在PCR扩增前按一定的比例加入到扩增体系中，以检测扩增效率。若杂交后检测有信号为正常；若无杂交信号，表明标记效果不理想。4.引物探针，为阳性对照(2)，若杂交后检测有信号为正常；若无杂交信号，表明杂交过程或洗涤过程有问题。
所说的植物基因可通过对来自艾属(Artemisia annua)苦艾(wormwood)的芳樟醇合成酶基因〔(3R)-linalool synthase(QH5)〕克隆获得，此为已有技术。
检测系统将三种病原体保守区的靶基因探针和耐药基因的突变位点探针固定在芯片上。若杂交后某个探针有信号，表明该样本中含有对应的病原体或对某种药物耐药。探针可采用常规方法点样于特殊处理的玻片上。
本发明根据集成诊断的三种性病病原体和三种抗生素的耐药性设计了七组针对靶基因的高检出率的扩增引物，其序列如下：
淋球菌 5’-GGATGATGAGTTGCTTTGTT-3’
5’-TAATTGGCTCATGTTGTATCTC-3’
沙眼衣原体 5’-TGCGGTTGCGTGTCCTGTGA
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解脲支原体 5’-GCGACGCTTTTGGATG-3’
5’-GCCTGCGCTCGTTTTAC-3’
淋球菌DNA螺旋酶 5’-ATCCGCCACGACCACAAAT-3’
5’-CGTCCACCGATCCGAAGTT-3’
淋球菌拓扑异构酶IV 5’-GCACGCTTCCCATACCGA-3’
5’-TCCACCGTCCCCTGATTG-3’
淋球菌耐大观霉素 5’-TCGTCAGCTCGTGTTGTG-3’
5’-ATTACTAGCGATTCCGACTTC-3’
淋球菌和支原体耐四环素 5’-GTGTGTGACGAACTTTACCGA-3’
5’-GGACCTCGATGTGTTGATGA-3’
上述引物可以采用DNA合成仪人工合成并经高性能液体色谱(HPLC)纯化，该方法为一种现有的技术，本发明不再赘述。基因芯片说明见附图。
用上述公开的引物扩增并标记探针，标记的样本扩增产物在相同的杂交条件下同时与监控系统和检测系统的所有探针反应，根据杂交结果，即可对泌尿生殖道炎症病原体及其耐药类型进行诊断。
附图说明
图1芯片示意图(荧光法)
图中1.阴性对照12.淋菌对喹诺酮敏感3.阳性对照14.淋菌5.衣原体6.支原体7.淋菌对大观霉素敏感8.淋菌对大观霉素耐药9.阳性对照210.淋菌对喹诺酮低度耐药11.淋菌对喹诺酮敏感12.淋菌对喹诺酮高度耐药13.淋菌和支原体对四环素耐药14.阴性对照2
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明的有关细节作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1
样品的处理和标记
从病人的泌尿生殖道取棉拭子，加入100ul裂解液，50℃，30min，再沸水浴10分钟。取上清作为模板DNA。
取制备好的DNA样品5ul与20ul PCR扩增体系混合(扩增体系包括2.5ul PCR反应缓冲液，5nmol dNTPs，各10pmol的上游及下游引物，1.25UpfuDNA聚合酶)通过以下热循环过程制备标记的DNA样品目的片段，首先94℃，5min，再以94℃，50S，52℃，50S，72℃，1min循环35次，最后72℃，延伸5min。荧光标记采用Cy5标记引物，显色标记采用Dig标记引物。
实施例2
芯片制作方法
稀释好的探针与2×Spoting Solution等体积混合，使终浓度为40pmols/μl，通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，置于75％的相对湿度、30℃条件下48-72小时进行固定。然后将芯片沸水浴30秒，取出室温充分干燥。
实施例3
荧光法杂交检测
取荧光标记的目的DNA片段5ul，99℃变性5min，然后与20ul杂交液混匀，取10ul滴于已经固定探针的芯片表面，盖上盖玻片，置于40℃湿盒中杂交30min，然后于洗液I中荡洗10min，洗液II中荡洗1min，凉干。最后用General Scanning芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果。(Cy5对光敏感，操作时尽量避光。)
实施例4
显色法杂交检测
1.标记的目的DNA片段5ul，99℃变性5min，然后与20ul杂交液混匀，取10ul滴于已经固定探针的芯片表面，盖上盖玻片，置于40℃湿盒中杂交30min。
2.从湿盒中取出芯片，去除盖玻片，迅速投入试剂6中，室温(25℃)下摇床荡洗10min〔60-100次/min〕。然后把芯片放入试剂7中，1min后取出芯片，用吸水纸吸除点样区以外的多余液体。
3.取0.2ml eppendorf管，依次加入25μl的试剂8、1μl的试剂9，充分混匀后，滴于芯片的点样区，盖上盖玻片静置30min。
4.去除盖玻片，吸除多余液体，放入试剂7中荡洗30s，取出芯片，吸除多余液体。
5.吸取50μl的试剂10滴于芯片的点样区，静置1min，吸除多余液体。
6.取一片膜放入试剂11中，浸泡10s后，然后将膜取出，小心将尼龙膜一角接触于吸水纸上，以吸除吸附于尼龙膜表面的多余试剂，并小心覆盖于芯片的点样区〔注意尼龙膜不能移动〕，迅速倒置于湿盒中，轻轻压实〔注意芯片不能移动〕，避光静置30min。
7.取出芯片，小心揭起膜，双蒸水轻轻荡洗几秒钟，并将其自然晾干，用放大镜观察可见杂交信号呈暗紫色圆点，或普通光学扫描仪扫描后在电脑荧屏观察，并用相应的软件对结果进行分析。
Claims (5)
1.一种泌尿生殖道炎症病原体及其耐药的集成诊断基因芯片，其特征在于，该集成基因芯片由监控系统和检测系统构成，监控系统由阴性和阳性各二个对照基因探针构成，检测系统根据淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的特殊片段序列和对喹诺酮类抗生素、大观霉素和四环素的耐药基因突变位点，设计相应的寡核苷酸探针；监测系统与检测系统的所有探针位于同一区域；标记的样本扩增产物在相同的杂交条件下同时与监控系统和检测系统的所有探针反应；所设计七组针对靶基因的高检出率的扩增引物，他们分别是：
淋球菌 5’-GGATGATGAGTTGCTTTGTT-3’
5’-TAATTGGCTCATGTTGTATCTC-3’
沙眼衣原体 5’-TGCGGTTGCGTGTCCTGTGA
5’-GATCGCCCAGACAATGCTCCA
解脲支原体 5’-GCGACGCTTTTGGATG-3’
5’-GCCTGCGCTCGTTTTAC-3’
淋球菌DNA螺旋酶 5’-ATCCGCCACGACCACAAAT-3’
5’-CGTCCACCGATCCGAAGTT-3’
淋球菌拓扑异构酶IV 5’-GCACGCTTCCCATACCGA-3’
5’-TCCACCGTCCCCTGATTG-3’
淋球菌耐大观霉素 5’-TCGTCAGCTCGTGTTGTG-3’
5’-ATTACTAGCGATTCCGACTTC-3’
淋球菌和支原体耐四环素 5’-GTGTGTGACGAACTTTACCGA-3’
5’-GGACCTCGATGTGTTGATGA-3’。
2.按权利要求1所述的泌尿生殖道炎症病原体及其耐药的集成诊断基因芯片，其特征在于，监控系统包括四个部分，分别为：(1)芯片阴性对照点样液，(2)阴性对照为植物基因探针A，(3)阳性对照为植物基因探针B，(4)芯片阳性对照引物探针；检测系统包括三种性病病原体核酸的保守区序列探针和三种耐药决定区序列探针；分别为：(1)根据淋球菌隐蔽质粒序列设计探针检测淋球菌，(2)根据沙眼衣原体质粒序列设计探针检测衣原体，(3)根据解脲支原体16sRNA设计探针检测支原体，(4)根据淋球菌螺旋酶基因序列突变位点设计探针检测对喹诺酮低度耐药性，(5)根据淋球菌拓扑异构酶IV基因序列突变位点设计探针检测对喹诺酮高度耐药性，(6)根据淋球菌16srRNA基因序列突变位点设计探针检测耐大观霉素的耐药性，(7)根据淋球菌和解脲支原体的共同tetM基因序列设计探针检测对四环素的耐药性。
3.如权利要求1所述的泌尿生殖道炎症病原体及其耐药的集成诊断基因芯片的应用方法，其特征在于，同时检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体三种性病病原体和对喹诺酮类、大观霉素和四环素三种抗生素的耐药性。
4.如权利要求3所述的泌尿生殖道炎症病原体及其耐药的集成诊断基因芯片的应用方法，其特征在于，在整个检测过程中，仅需一次PCR，一次杂交反应。
5.如权利要求3或4所述的泌尿生殖道炎症病原体及其耐药的集成诊断基因芯片的应用方法，其特征在于，样本扩增产物标记为荧光素Cy5或Cy3荧光标记，或为地高辛显色标记。
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