CN102559933A - 乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明目的是利用高灵敏度的聚合酶链反应技术和反向点杂交技术相结合的基因检测技术，快速准确的区分乙型肝炎病毒基因型的方法。本发明技术方案为提供一种用于乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及其方法。所述试剂盒包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与乙型肝炎病毒各亚型的核酸杂交的核苷酸。本发明试剂盒具有快速、灵敏、准确、高通量的特点，一次杂交反应可以检测多种靶序列，取材方便，无需特殊设备，仪器投入低，具有快速简便、敏感度高和特异性强的特点。

Description

乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种乙型肝炎病毒基因分型检测的基因芯片和试剂盒及其方法，可用于人乙型肝炎病毒(HBV)基因型(B、C、D)三型感染的辅助诊断。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是主要的肝脏疾病致病因子。世界上有20亿人感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.8亿，其中慢性HBV携带者75％分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.5亿，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人已近50万。估计全球每年有100-200万人直接死于HBV持续感染。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，是一种DNA病毒，其基因组由长3.2kb的部分双链DNA组成，共有四个开放读码框(Open Readin Frame，ORF)：S、C、P、X，他们编码至少8个不同蛋白：表面抗原蛋白，DNA多聚酶蛋白，核心抗原蛋白，X蛋白等。HBV具有病毒复制产量高(1012-13病毒粒/天)和突变率高(1010-11个点突变/天)的特征，高突变是由于高复制，尤其是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功能所致。根据HBV全基因核苷酸序列异源性大于8％或S基因区核苷酸序列异源性大于4.1％，可将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H，8个基因型。

HBV基因型呈一定的地域性分布：在世界不同地区基因型分布不同，A型为全世界分布，B型、C型主要分布在亚洲，D型分布在南欧、美、澳大利亚和中东，E型分布在非洲，F型分布在美洲土著人和波利尼西亚，G型分布在美洲、欧洲，H型在美国发现。目前我国乙型肝炎患者的HBV基因型主要是B、C和D这三型，并以C型最多，其中在北方城市以C型为主，由北方至南方，B型感染率逐渐增高，在香港、广州等南部地区有少部分D型分布，另外，华北、新疆地区有A型存在。

众多的研究证实，不同基因型的乙肝病毒具有不同的致病性，人类感染乙肝病毒后的临床病情轻重、肝脏病变程度以及治疗效应与乙肝病毒的基因型存在着十分密切的关系。A型乙肝病毒的抗原性可能较弱，故免疫清除能力较弱，不过有报道指出A型乙肝病毒对标准干扰素治疗的应答率较其他基因型高；B型乙肝病毒则与慢性携带有关，并且年轻患者容易发展成肝细胞癌症；由于较容易发生CP变异和在迁延性感染时免疫清除期较长，C型乙肝病毒导致的肝脏炎症损害和纤维化较其他基因型严重；而D型乙肝病毒多见于重度肝炎。因此，对乙肝患者进行乙肝病毒分型测定，有助于患者早期治疗和指导临床医生制定针对性的治疗方案以及预后判断。

目前多采用基因型特异性引物PCR法、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)和基因序列测定法对HBV进行基因分型检测。

基因型特异性引物PCR法通常需要借助凝胶电泳判读结果，这种受到很多不可确定性因素制约的结果判读方法一直避免应用于临床检测，所以此法目前多限于科学研究领域。

RFLP操作繁琐而且重复性差，对检测人员技术要求较高，使得其无法在临床上得到广泛应用。

基因序列测定法是最准确可靠的方法，但是测序需要的设备和技术门槛使得测序只能局限在某些具有一定实力的单位进行，国家相关机构也无法对不同检测对象的测序结果进行质量控制，再加上测序费用较高，使得基因测序根本无法应用于临床检测。

目前，市场上仅有的两种乙肝病毒基因分型检测试剂盒都是采用PCR荧光法，但由于荧光染料和检测仪器的局限性，这两种分型试剂盒仅能对B型和C型进行分型。

1989年由Saiki等提出了反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)技术，该技术是在PCR技术的基础上进行了一个实用性的改进。Saiki及其同事在检测HLA时提出了一个有效的改进，该方法是将靶基因在PCR过程用放射性元素标记，然后与尼龙膜杂交，从而检测靶基因的突变情况。这一方法可将多个靶基因在同一条件下进行检测从而大大提高了检测的效率。随后，其它科学家证实了该方法可以区分单个碱基的突变，利用共价键的探针固定方法代替紫外交联以及使用非放射性的生物素标记引物的方法，RDB技术的稳定性有了明显的提高。目前Inogenetics的LiPA系列产品(通过CE认证)均是基于上述的原理。

从技术原理来说，RDB在本质上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的一种，但它不同于一般所说的玻璃DNA芯片，其信号特异性强，简便易行，技术要求低，仪器设备投入小，检测结果用肉眼就可直接判断，而无需购买昂贵的激光扫描仪，更符合中国目前的国情也更利于在基层医院推广。然而，目前RDB技术整个杂交过程的操作步骤比较多，操作时间也相对较长，成为大规模推广应用的阻力。基于此需求，虽然已经有相应的自动化杂交仪出现，但自动化杂交仪的价格昂贵，并非普通的基层医院可接受。而且，繁多的操作步骤，也对自动化仪器运行的稳定性提出了挑战。

目前，市场上尚无利用PCR-RDB法对乙肝病毒进行分型的诊断试剂盒。因此，研发乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)，具有较高的临床应用价值和可观经济效益。

发明内容

本发明采用PCR-RDB方法，在具备了PCR高灵敏度高特异性等优点的基础上，实现对HBV基因型的高通量多通道分析，这不仅有助于临床病情评估，治疗药物的选择和预后判断，还为追踪大范围乙肝暴发时的传染源提供了可行性。

本发明的技术方案为提供一种乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与乙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示：

探针B1：5’-AGTTGGCTTTGAATGCA-3’；

探针B2：5’-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3’；

探针B3：5’-GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3’；

探针P：5’-TGMGGGCTCCACCCCAA-3’；

探针PC：5’-TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3’；

探针CC：5’-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’。

优选的，上述基因芯片所述各探针5’进行氨基标记，探针CC的5’端进行生物素标记。

本发明的另一技术方案为提供一种乙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，包括权利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括扩增乙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示：

上游引物H-1：5’-GAGTTCCACTGCATGGCC-3’；

下游引物H-2：5’-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3’。

所述上游引物H-1的5’端进行生物素标记。

优选的，上述试剂盒所述PCR反应液还包括内标质粒，所述内标质粒的扩增引物为

上游引物H-3：5’-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3’；

下游引物H-4：5’-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3’；

所述上游引物H-3的5’端进行生物素标记。

优选的，上述试剂盒所述PCR反应液还包括：纯水、10×PCR buffer、25mM MgCl₂，20mM dNTP、Taq酶、UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP。

优选的，上述试剂盒的还包括杂交液，所述杂交液包括A液贮存液、B液贮存液、C液贮存液、D液贮存液、E液贮存液、F液贮存液。

本发明的又一技术方案为乙型肝炎病毒基因分型的方法，该方法包括下述具体步骤：

a、以乙型肝炎病毒基因组野生B、C、D型样本序列为主设计合成分型引物与分型探针，所述探针序列为：

B1：5’-AGTTGGCTTTGAATGCA-3’；

B2：5’-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3’；

B3：5’-GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3’；

P：5’-TGMGGGCTCCACCCCAA-3’；

PC：5’-TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3’；

CC：5’-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’；

所述CC探针3’端进行生物素标记；

所述引物序列为：

上游引物H-1：5’-GAGTTCCACTGCATGGCC-3’；

下游引物H-2：5’-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3’；

b、用活性氨基标记步骤a所述探针，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测膜条；

c、对步骤a所述上游引物H-1的5’端进行生物素标记，进行HBVDNA扩增；

d、将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶与四甲基联苯胺显色；

e、判断基因分型结果。

本发明试剂盒具有快速、灵敏、准确、高通量的特点，一次杂交反应可以检测多种靶序列，取材方便，无需特殊设备，仪器投入低，具有快速简便、敏感度高和特异性强的特点。

附图说明

图1：为膜条点阵基本尺寸；

图2：为膜条探针排列顺序；

图3：PCR扩增调节示意图；

图4：HBV-DNA阳性，HBV B型；

图5：HBV-DNA阳性，HBV D型；

图6：HBV-DNA阳性，HBV BC混合型；

图7：HBV-DNA阴性。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明是将高灵敏度的聚合酶链反应(PCR)技术和反向点杂交技术相结合的基因及基因突变检测技术。是将特异的探针分别固定到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再将经PCR特异性扩增的产物(在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。

生物素(Biotin)：本发明生物素标记，优选地高辛标记。

以尼龙膜为载体的DNA芯片技术，采用的是微量点样DNA微阵列技术。其主要的基本原理如下：DNA探针为含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端带有氨基标记。经活化处理的尼龙膜带有负电荷基团，可以与氨基形成共价结合。利用这种方法可将DNA探针按一定的排列规律永久的固定在尼龙膜的表面。其主要优点是简便易行，技术要求低，并且探针不受探针分子大小种类的限制，能根据使用者的要求简便地制出符合目的的芯片。在此基础上结合PCR技术对微量待测样品进行大量快速扩增，扩增后含有相应标记物的待测样品与芯片上的探针进行特异性杂交，此后对杂交信号强弱和有无进行分析，即可判断样品中靶分子的数量和性质。

实施例1 本发明试剂盒的组成

膜条生产工艺

将尼龙膜经EDC.HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)预处理30分钟后激活表面羧基；同时，将5’端带有氨基标记的探针用缓冲液稀释到适当的浓度，按阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上，氨基与活化的羧基发生反应生成稳定的“-CO-NH-”共价键，从而将探针固定在尼龙膜表面，最后用0.1N的NaOH处理尼龙膜，封闭未结合探针的表面羧基，膜条制作完成，具体流程如下

1、将将膜条裁成适当大小，用激光打印机打上1×6的格子，每格大小为：4.5×5.0mm；

2、配探针稀释液(0.5mol/L NaHCO3，pH8.4)；

3、将所有6条探针分别用探针稀释液稀释至5μmol/L；

4、配32％的EDC溶液等比例混合EDC和探针稀释液；

5、用八通道连续移液器取0.6μL稀释好的探针点于尼龙膜相应的格子上膜条自然晾干30min；

6、配制0.1mol/L NaOH，二次泡膜5分钟；

7、纯水洗膜3次；

8、膜条烘干30min；

9、二次裁剪备用。

请参阅图1，图2，图1为膜条点阵基本尺寸(单位：毫米)，1的长度为4.5±0.25，2的长度为5.0±0.25，3的长度为36.5±0.254的长度为7.5±0.25，图2为膜条探针排列顺序。上述探针的名称及序列如表1(M＝A+C)。

表1

杂交试剂的配置方法

A液贮存液配制：

在1L的20×SSC溶液瓶中，加入10g SDS，混匀，配成1LA液贮存液；

B液贮存液配制：

取1L溶液瓶，加20×SSC 250mL，10％SDS 100mL，加水至1L，混匀，配成1L B液贮存液；

C液贮存液配制：

取500mL溶液瓶，加氧化物酶Streptavidin POD 2500U，600mL水，溶解，混匀，配成600mL C液贮存液；

D液贮存液配制：

取1L溶液瓶，加1L 1M柠檬酸钠溶液，配成1L D液贮存液；

E液贮存液配制：

取500mL溶液瓶，称取1g四甲基联苯胺(TMB)，加无水乙醇至500ml，溶解，混匀，配成500mL E液贮存液；

F液贮存液配制：

取500mL溶液瓶，取30％H2O217.5ul，加水至350ml溶解，混匀，配成350mL F液贮存液；

PCR反应液的配置，引物序列如表2。

表2

本试剂盒PCR反应液配液单如表3。

表3

试剂	1人份(μL)
		纯水	34.5
10×PCR buffer	5
		25mM MgCl2	4
dN(U)TP(20、40mM)	0.5
		H-1(10uM)	1
H-2(1uM)	1
		H-3(2.5uM)	1
H-4(0.5uM)	1
		内标模版	1
At-Taq酶/UNG酶系	1
		总量	47

取一配液瓶，按配液单上每种试剂的量乘以配制人份数，混合均匀。使用单通道连续移液器将上述PCR反应液分装到PCR管中，每管47μL。

配液前准备

(1)dN(U)TP

将购买的100mM的dATP、dUTP、dGTP、dCTP，按照1∶2∶1∶1(体积比)混合，混合液各成分浓度分别为：20mM、40mM、20mM、20mM取0.5mL离心管，分装成每管100μL dN(U)TP的母液。

(2)引物

将合成的引物13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将引物溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的引物母液。进行生产前，H1、H2需加入适量纯水配制成10μM使用液。

(3)探针

将合成的探针13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将探针溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的探针母液。进行生产前，H3、H4、H5、H6、H7需加入适量纯水配制成10μM使用液。

(4)At-Taq酶/UNG酶系配液

2.5U/μL At-Taq酶与UNG酶(1U/μL)按照100∶2(体积比)混合，配制成At-Taq DNA聚合酶/UNG酶系，-20±5℃以下冰箱中保存。

HBV野生B型样本用引物H-1和H-2扩增片段如下SEQ ID NO：11：(5’→3’)：

GAACAAGAGCTACAGCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGAACAGGCATGGGTACAAATCTTTCTGTCCCCAATCCCCTGGGATTCTTCCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCAAAGCCAACTCAGAAAATCCAGATTGGGACCTCAACCCGCACAAGGACAACTGGCCGGACGCCAACAAGGTGGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACCCCTCCCCATGGGGGTCTGTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCCTACTCACAACTGTGCCAGCAGCTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCTTATCTCCACCTCTAAGGGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAACTCCACCACTTTCCATCAAACTCTTCAAGATCCCAGAGTCAGGGCTCTGTACTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC

HBV野生C型样本用引物H-1/H-2扩增片段如下SEQ ID NO：12：(5’→3’)：

GAACAAGAGCTACAGCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGACAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCGTTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCAACAAGGATCACTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACCCCACCACACGGCGGTCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACAACAGTGCCAGCAGCACCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAACTCCAGCACATTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGGCCTATACGTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC

HBV野生D型样本用引物H-1/H-2扩增片段如下SEQ ID NO：13：(5’→3’)：

GAACAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACCGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGATTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACCTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAACTCAACAACATTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAAAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC

内标质粒用内标引物H-3/H-4扩增片段如下SEQ ID NO：15：(5’→3’)：

TCATCGTCGCTGGAGCTGGTTTAGTCACCGTTGCTGTTTTCCTTATCGGTTACGCTGCCGATATAGGTCACAGCATGGGCGATCAGCTTGACAAACCGCCG

实施例2 本发明试剂盒的使用

1.标本处理

将血清或血浆100μl转移到1.5ml离心管中，加100μl DNA浓缩液(如表4)混匀，12,000rpm离心10分钟，弃上清(用枪头吸尽上清)。加入30μl DNA提取液，振荡数秒充分溶解沉淀。4,000rpm离心30秒。100℃保温10分钟(误差不超过1分钟)。12,000rpm离心5分钟，备用。

表4

DNA提取液组分成分	每1000ml
		NaOH	1g
1mol/L Tris HCl pH 8.3	10ml
		NP 40	10ml
Triton X 100	10ml
		Chelex 100	20g
0.5mol/L EDTA pH 8.0	0.2ml
		灭菌纯化水	定容至1000ml

2.阳性、阴性质控品

取阳、阴性质控品100μl，加100μl DNA浓缩液(如表5)如混匀，12,000rpm离心10分钟，弃上清(用枪头吸尽上清)。加入30μl DNA提取液，振荡数秒充分溶解沉淀。4,000rpm离心30秒。100℃保温10分钟(误差不超过1分钟)。12,000rpm离心5分钟，备用。

表5

DNA浓缩液组分成分	每1000ml
		PEG6000	100g
NaCl	25g
		灭菌纯化水	定容至1000ml

3.PCR扩增

请参阅图3，取PCR反应管若干，然后分别加入处理后样品、阳阴性质控品3μl，加入PCR反应管中，6,000rpm瞬时(3秒)离心，将各反应管放入市售PCR仪，按下列条件，如图3所示调节扩增：

4.杂交操作

杂交前准备：

A液加80mL蒸馏水，B、D液各加160ml蒸馏水稀释，摇匀；A、B液若在低温出现结晶，需先预热溶解再稀释。

将待检样本及质控品的编号标注在HBV膜片上。

1)杂交：

取5mL离心管，放入标记膜条1张，加2ml A液、对应的PCR产物40ul，盖紧管盖，放入振荡水槽(或空气浴摇床)，50℃下轻摇(约100转/分)40分钟。同时预热B液。

2)偶联：

杂交结束后，将膜条从杂交管里取出，放入50mL离心管中(最多可在同一管里处理10张膜片)；

加预热B液20ml，C液1ml，混匀，使膜条充分展开。50℃轻摇(40～50转/分)10分钟，弃去液体；

加预热B液40ml，50℃轻摇3分钟，弃去液体；重复1次；

加D液40ml，室温轻摇3分钟，弃去液体。

3)显色：

取50ml离心管，加D液20ml，E液1ml，F液1ml，混匀即为显色液。

放入膜条后水平混匀，使膜条充分展开后在室温避光静置8分钟，弃去液体。(注：显色液根据实际用量按上述比例配制，现配现用；如出现配制后已经变蓝，请重新配制；如果显色反应控制点(CC)颜色较浅，可以适当延长显色时间3～5分钟，至充分显色。)加D液40ml，轻摇3分钟，弃去液体。取出杂交膜条，显色完成。

5.结果分析

用吸水纸吸去膜条表面水分，在扫描仪上尽快扫描(若不能立即进行扫描，密封冻存于-20℃)。按照自动点杂交分析软件(福建泰普生物科学有限公司研制)操作说明书的要求，导入膜片扫描图，选择“HBVgenotype”程序，设定相应的参数并进行数据分析，导出检测结果及报告单。详见软件使用操作说明书。

6.质控标准

显色反应控制点(CC)：信号值应≥cutoff值，表示偶联和显色过程正常，否则需要重新检查杂交过程

PCR反应体系控制点(PC)：信号值应≥cutoff值，表示PCR体系正常。

阳性质控品：膜条上B，P，PC，CC号位点为阳性；其它位点应为阴性。

阴性质控品：CC和PC点阳性，其他位点应为阴性。

以上各项同时满足的条件下本次实验有效，否则全部试验应重新进行。

7、请参阅图4、图5、图6、图7为膜条杂交正常结果示意图，图4为HBV-DNA阳性，HBV B型；图5为HBV-DNA阳性，HBV D型；图6为HBV-DNA阳性，HBV BC混合型；图7为HBV-DNA阴性。

实施例3 本发明试剂盒使用优点和效果：

1、临床研究结果及分析

1.1、阳性检出率统计

在所有1015例有效临床病例中，乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)检出阳性病例153例(阳性率为50.5％)，而测序法共检出阳性病例160例(阳性率为52.8％)。统计结果见表1。

如表6乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)与测序法阳性检出率统计。

表6

	泰普试剂盒	测序
			阳性例数	622	631
阴性例数	393	384
			合计例数	1015	1015
阳性检出率	61.3％	62.2％

1.2、各基因型统计

在622例阳性样品中，共发现有4种基因型，具体见表7所示HBV阳性样品中基因型统计。

表7

	泰普试剂盒	测序
			阳性例数	622	631
阴性例数	393	384
			合计例数	1015	1015
阳性检出率	61.3％	62.2％

1.3、受试产品和对照产品临床结果统计表如表8。

表8

1.4、经计算，待考核试剂盒临床研究结果如下，按以下公式计算后列出结果。

待考核试剂盒性能指标计算公式如下：

1)灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)

2)特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)

3)符合率(粗一致性)＝(真阳性+真阴性)/(真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)

4)阳性结果预示值＝真阳性/(真阳性+假阳性)

5)阴性结果预示值＝真阴性/(真阴性+假阴性)

6)假阳性率(误诊率)＝假阳性/(真阴性+假阳性)

7)假阴性率(漏诊率)＝假阴性/(真阳性+假阴性)

8)约登指数(正确指数)＝(灵敏度+特异度)-1

9)检出率＝阳性人数/全部受检人数

以DNA序列测定法的结果作为乙型肝炎病毒基因分型检测的金标准，泰普乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒的考核结果如表9。

表9

灵敏度	98.6％
		特异度	100％
一致性(符合率)	99.1％
		阳性预示值	100％
阴性预示值	97.7％
		假阳性率	0％
假阴性率	2.3％
		约登指数	0.986
检出率	61.3％

通过同步盲法试验验证泰普公司研制的乙型肝炎病毒分型检测试剂盒具有其所述的功能特点，结果准确可靠，操作方便，适用于慢性HBV感染的临床诊疗。通过统计分析，我们还发现该试剂盒对于不同基因型的混合感染的检测灵敏而准确，具有很强的优势。

发明具有通量高、特异性强、灵敏度高、快速的特点，能够在一次实验中对患者感染的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型进行区分，为慢性HBV感染患者的诊疗提供科学的依据。通过对本产品准确性、特异性、重复性、稳定性、灵敏度和精密度进行研究，显示其具备以下性能：

(1)准确性：检测105例临床慢性HBV感染阳性样本，结果与测序比较显示相应的基因型，准确率为100％。

(2)特异性：检测40例临床HBV阴性样本结果全部为阴性；检测非HBV感染性病原体DNA，包括丙型肝炎病毒(HCV)、乙型脑炎病毒、梅毒螺旋体和HIV，结果全部为阴性。

(3)灵敏度：能稳定检测血清HBV的最低检出限为1.0×103Copies/mL。

(4)精密度：检测HBV-B型的阳性参考品P1，批内和批间的一致性为100％。

(5)重复性：各种实验条件下能反复多次稳定检出临床HBV基因型，重复性为100％。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，其特征在于，包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与乙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示：

探针B1：5’-AGTTGGCTTTGAATGCA-3’；

探针B2：5’-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3’；

探针B3：5’-GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3’；

探针P：5’-TGMGGGCTCCACCCCAA-3’；

探针PC：5’-TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3’；

探针CC：5’-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’；

所述各探针5’进行氨基标记，所述探针CC的3’端进行生物素标记。

2.乙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括扩增乙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示：

上游引物H-1：5’-GAGTTCCACTGCATGGCC-3’；

下游引物H-2：5’-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3’；

所述上游引物H-1的5’端进行生物素标记。

3.如权利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括内标质粒，所述内标质粒的扩增引物为

上游引物H-3：5’-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3’；

下游引物H-4：5’-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3’；

所述上游引物H-3的5’端进行生物素标记。

4.如权利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述探针CC的3’端进行地高辛标记，所述上游引物H-1的5’端进行地高辛标记，所述上游引物H-3的5’端进行地高辛标记。

5.如权利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括：纯水、10×PCR buffer、25mM MgCl₂，20mM dNTP、Taq酶、UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP。

6.如权利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括杂交液，所述杂交液包括A液贮存液、B液贮存液、C液贮存液、D液贮存液、E液贮存液、F液贮存液。

7.乙型肝炎病毒基因分型的的方法，其特征在于，该方法包括下述具体步骤：

a、以乙型肝炎病毒基因组野生B、C、D型样本序列为主设计合成分型引物与分型探针，所述探针序列为：

B1：5’-AGTTGGCTTTGAATGCA-3’；

B2：5’-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3’；

B3：5’-GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3’；

P：5’-TGMGGGCTCCACCCCAA-3’；

PC：5’-TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3’；

CC：5’-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’；

所述CC探针3’端进行生物素标记；

所述引物序列为：

上游引物H-1：5’-GAGTTCCACTGCATGGCC-3’；

下游引物H-2：5’-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3’；

b、用活性氨基标记步骤a所述探针，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测膜条；

c、对步骤a所述上游引物H-1的5’端进行生物素标记，进行HBVDNA扩增；

d、将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶与四甲基联苯胺显色；

e、判断基因分型结果。

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