CN111979351A - 乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒‑核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测。整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆标本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒‑核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免常规样本核酸提取过程中的环境污染，且整个步骤耗时短。本发明还提供一种用于乙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒，该试剂盒易于测定、操作方便。

Description

乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要致病因子，也是全世界最严重的公共卫生问题之一。全球约20亿人被证明有乙肝感染，3.5亿人为慢性感染者。我国属于世界上HBV感染高发区，全国约1.3亿人是HBV携带者，慢性肝炎患者2300万，每年乙肝的发病率在6000万人次以上。在中国、东南亚和非洲等国家和地区，有约50%的肝硬化和70%-90%的肝癌，是由慢性HBV感染引起，而感染了HBV变异体的HBV携带者有7%-30%。
乙肝病毒血清标志物(HBV-M)检测是诊断乙型肝炎最常用的指标,目前临床最常用的“两对半”指的是HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBsAb、HBeAb，主要反映人体对乙肝病毒感染的免疫状态，但不能直接反映HBV在患者体内的复制情况，更不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据。检测乙肝病毒DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”，HBV DNA的检测是衡量乙肝传染性的最精确的指标，HBV DNA阳性即反映有完整的病毒颗粒的复制，是判断患者具有传染性的最直接和最可靠的指标，同时，HBV DNA还可作为判定HBV药物疗效的一个极有意义的临床指标。如果检测值大于1000或者1 .0e+003拷贝/ML，说明乙肝病毒DNA呈阳性，提示HBV复制和有传染性。HBV-DNA越高表示病毒复制越厉害，传染性强。这对于乙肝治疗过程的监测，治疗效果的判断，治疗方案的制定都有着重要的意义。
PCR法包括有巢式聚合酶链式反应(nested PCR，nPCR)、多重PCR(mμLtiplex PCR，mPCR)、竞争性PCR(competitive PCR，cPCR)等多种方法。但都为定性检测方法，不能直接定量。
目前临床常用的实时荧光定量PCR技术是把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，可解决传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，但此方法定量不准确，并且操作时间久。
发明内容
由鉴于此，本发明确有必要提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒，以解决上述问题。
本发明所采用的技术方案是：一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针并配以PCR混合液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测；
其中，所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂包括氯化钾、十二烷基硫酸钠、环脂肽类生物表面活性剂或无水乙醇；
所述PCR混合液包括乙型肝炎病毒-PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液和乙型肝炎病毒内标；
所述PCR反应液包括引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCR butter；
所述乙型肝炎病毒-酶混合液由Tap酶和UNG酶组成；所述乙型肝炎病毒内标包括阳性内对照扩增靶序列。
基于上述，所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体包括以下步骤：
将待测血清或血浆标本在3000 rpm条件下离心1min，根据所述待测血清或血浆标本的数量，按照所述乙型肝炎病毒-PCR反应液38 μL/人份、所述乙型肝炎病毒-酶混合液2 μL/人份、所述乙型肝炎病毒内标0.2 μL/人份配制所述PCR混合液，并在3000 rpm条件下离心10 S；
然后先向每个PCR反应管中加入所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂5μL，再分别加入所述待测血清或血浆、阴性对照、阳性对照以及定量参考品各5μL，吸打5～8次混匀；最后在向每个PCR反应管加入所述PCR混合液40μL，盖上管盖 2000 rpm离心30 S；置于荧光定量PCR仪扩增，其中扩增循环条件设置为：
第一步：UNG 酶反应，50℃ 2分钟，1个循环；
第二步：Tap酶活化，94℃ 5分钟，1个循环；
第三步：包括变性、退火、延伸及荧光采集；变性，94℃ 5 秒，45 个循环；退火、延伸及荧光采集，57℃ 30秒，45个循环；
第四步：仪器冷却，25℃ 10秒，1个循环。
本发明还提供一种用于乙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒，该试剂盒含有以下组分：乙型肝炎病毒-核酸释放剂、乙型肝炎病毒PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液、乙型肝炎病毒内标。
与现有技术相比，本发明提供的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法具有突出的实质性特点和显著的进步，具体地，本发明所述提供的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒，本试剂盒采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测。整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆标本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒-核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免常规样本核酸提取过程中的环境污染。
PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。同时与现有技术相比在变性、退火、延伸阶段的耗时和对温度的要求均有所降低，降低了阶段耗时和最高温度要求。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。实施例
本实施例提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR混合液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测；
其中，所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂包括氯化钾、十二烷基硫酸钠、环脂肽类生物表面活性剂或无水乙醇；
所述PCR混合液包括乙型肝炎病毒-PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液和乙型肝炎病毒内标；
所述PCR反应液包括引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCR butter；
所述乙型肝炎病毒-酶混合液由Tap酶和UNG酶组成；所述乙型肝炎病毒内标包括阳性内对照扩增靶序列。
具体地，所述乙型肝炎病毒核酸定量检测方法包括以下步骤：
将待测血清或血浆标本在3000 rpm条件下离心1 min，根据待测血清或血浆标本的数量，按照PCR反应液38 μL/人份+酶混合液2 μL/人份+内标0.2 μL/人份配好PCR混合液并在3000 rpm条件下离心10 S；
然后先向每个PCR反应管中加入乙型肝炎病毒-核酸释放剂5 μL，再分别加入待测血清或血浆、阴性对照、阳性对照以及定量参考品各5 μL，吸打5～8次混匀；最后在向每个PCR反应管加入所述PCR混合液40 μL，盖上管盖 2000 rpm离心30 S；置于荧光定量PCR仪扩增，其中扩增循环条件设置为：
第一步：UNG 酶反应，50℃ 2分钟，1个循环；
第二步：Tap酶活化，94℃ 5分钟，1个循环；
第三步：包括变性、退火、延伸及荧光采集；变性，94℃ 5 秒，45 个循环；退火、延伸及荧光采集，57℃ 30秒，45个循环；
第四步：仪器冷却，25℃ 10秒，1个循环。
本发明还提供一种用于乙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒，该试剂盒含有以下组分：乙型肝炎病毒-核酸释放剂、乙型肝炎病毒PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液、乙型肝炎病毒内标。
更具体地，利用本实施例提供的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法进行检测时，针对不同的样本具体操作步骤如下：
1、血液或血浆采集和验收：
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2 mL，注入不含抗凝剂的无菌管中，室温放置不超过4小时，1600 rpm离心20分钟；吸取上层血清转移至1.5 mL灭菌离心管。血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2 mL，注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌玻璃管中，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5～10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5 mL灭菌离心管。分离后的标本在2-8℃保存不应超过24个小时，零下20℃保存不超过三个月，零下70℃以下长期保存。
2、试剂配制
（1）从冰箱拿出试剂，取出包装盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀备用；设所需要的管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管空白对照+2质控对照+4管定量参考品）。根据所需管数，按比例（PCR反应液38 μL/人份+酶混合液2 μL/人份+内标0.2 μL/人份），配好PCR混合液，充分混匀，3000 rpm离心10 S，通过传递窗转移至样本处理区。将样本离心，3000 rpm离心1 min。
（2）每个PCR反应管中加入乙型肝炎病毒-核酸释放剂5 μL（深吸浅打，避免出现气泡），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A-D各5 μL，吸打5～8次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）；间隔10分钟以上，每管加入PCR混合液40 μL，盖上管盖2000 rpm离心30 S。
其中，加样本时打开装有样本的离心管盖，拇指不得碰到盖内部，防交叉污染。注意八联管上空不得有物品经过，以防交叉污染。盖八联管管盖时要垂直压下。
（3） PCR扩增（扩增和产物分析区）
取出在传递窗内的反应管，置于PCR仪上，记录样本摆放顺序。循环条件设置：
第一步：UNG 酶反应，50℃ 2分钟，1个循环；
第二步：Tap酶活化，94℃ 5分钟，1个循环；
第三步：包括变性、退火、延伸及荧光采集；变性，94℃ 5 秒，45 个循环；退火、延伸及荧光采集，57℃ 30秒，45个循环；
第四步：仪器冷却，25℃ 10秒，1个循环。
取出在传递窗内的反应管，将PCR反应管按顺序放入扩增仪样品槽。
按顺序点击以下程序进行操作：New Experiment →选择需要做的项目HBV-DNA→点击窗口右下角的对号→输入实验文件名→Start Run，仪器开始检测。
（4）样本编辑
编辑子集，点击Subset Editor→点击左下角的加号→新增加本次实验→按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔→点击Apply应用。
编辑样本，点击Sample Editor→选择Abs Quant→Subset选择本次实验→在Sample Name中根据样本个数编辑样本号如Sample1、2、3……，空白对照、阴性对照、高低值质控、4个标准品。
实验结束后，点击Analysis进行结果分析。仪器会自动调节阈值线，也可以根据实验情况手动调节，调节阈值线应遵循以下几点原则：（1）在阴性线之上；（2）与所有曲线相交；（3）相交在平滑区；（4）符合上述三条原则的情况下，阈值线的位置尽可能地低。
保存实验结果，选择Reports，打印出原始结果。
（5）质量控制
乙型肝炎病毒阴性对照：无Ct值显示；但乙型肝炎病毒-内标检测为阳性（Ct值≤40）。
乙型肝炎病毒阳性对照：检测浓度值介于1.26×105~1.26×106 IU/mL。
五个乙型肝炎病毒定量参考品：均检测为阳性，且标准曲线相关系数∣r∣≥0.98。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
（6）结果判断
对于测定值在1.0×102～5.0×109 IU/mL之间的标本，且扩增曲线成明显的S型，报告相应的测定结果；
对于测定值>5.0×109 IU/mL样本，且扩增曲线成明显的S型，报告注明>5.0×109 IU/mL。若需精确定量可根据结果，将样本稀释至5.0×109 IU/mL以下在复测；
检测样本HBV-DNA<1.0×102IU/mL时，检测值仅供参考，报告为<100 IU/mL。注意观察内对照Ct值。
需要说明的是，该检测方法中肯存在以下干扰因素影响：样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关，其中任何失误都将会导致结果不准确。如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (3)

1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针并配以PCR混合液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测；
其中，所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂包括氯化钾、十二烷基硫酸钠、环脂肽类生物表面活性剂或无水乙醇；
所述PCR混合液包括乙型肝炎病毒-PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液和乙型肝炎病毒内标；
所述PCR反应液包括引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCR butter；
所述乙型肝炎病毒-酶混合液由Tap酶和UNG酶组成；所述乙型肝炎病毒内标包括阳性内对照扩增靶序列。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
将待测血清或血浆标本在3000 rpm条件下离心1min，根据所述待测血清或血浆标本的数量，按照所述乙型肝炎病毒-PCR反应液38 μL/人份、所述乙型肝炎病毒-酶混合液2 μL/人份、所述乙型肝炎病毒内标0.2 μL/人份配制所述PCR混合液，并在3000 rpm条件下离心10 S；
然后先向每个PCR反应管中加入所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂5 μL，再分别加入所述待测血清或血浆、阴性对照、阳性对照以及定量参考品各5 μL，吸打5～8次混匀；最后在向每个PCR反应管加入所述PCR混合液40 μL，盖上管盖 2000 rpm离心30 S；置于荧光定量PCR仪扩增，其中扩增循环条件设置为：
第一步：UNG 酶反应，50℃ 2分钟，1个循环；
第二步：Tap酶活化，94℃ 5分钟，1个循环；
第三步：包括变性、退火、延伸及荧光采集；变性，94℃ 5 秒，45 个循环；退火、延伸及荧光采集，57℃ 30秒，45个循环；
第四步：仪器冷却，25℃ 10秒，1个循环。
3.一种用于乙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有以下组分：乙型肝炎病毒-核酸释放剂、乙型肝炎病毒PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液、乙型肝炎病毒内标。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114250325A (zh) * 2021-12-31 2022-03-29 广西壮族自治区疾病预防控制中心 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法

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