CN108676856B - 人类x染色体str位点检测系统、dna样品分析方法及引物对 - Google Patents
人类x染色体str位点检测系统、dna样品分析方法及引物对 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108676856B CN108676856B CN201810344503.9A CN201810344503A CN108676856B CN 108676856 B CN108676856 B CN 108676856B CN 201810344503 A CN201810344503 A CN 201810344503A CN 108676856 B CN108676856 B CN 108676856B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- detection system
- dna
- primer pairs
- dna sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了一种用于人类X染色体STR位点的检测系统、DNA样品分析方法及引物对。本发明的检测系统可实现一次检测多个位点，快速高效。利用本发明检测系统构建的试剂盒，一次检测范围可以包含20个位点，扩增耗时在1个半小时以内，灵敏度高，能提供更多信息，将具有更好的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人类X染色体的STR位点检测系统，采用该系统进行DNA样品分析的方法，以及相关的引物对。
背景技术
人类基因组STR(短串联重复序列)是目前普遍应用的遗传标记，是以少数几个碱基为核心单位，串联重复形成的DNA遗传标记。其长度在几十到几百bp之间。这种串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，因此STR分型是现今国内外法医个体识别和亲子鉴定最主要的技术。
人类X染色体是一个中等大小的亚中着丝粒染色体。女性个体含有两条X染色体，男性个体只有一条X染色体。因此X染色体遗传标记在遗传过程中，因性别不同而存在着遗传方式的差异：母亲可将两条X染色体上的等位基因随机地遗传给她的子女，而父亲X染色体上的等位基因则只能遗传给女儿。女性的一对X染色体在卵细胞生成的过程中可以像常染体一样发生重组，但是在男性的精子细胞生成的过程中，X染色体和Y染色体不能随意重组。所以X染色体这种独特的遗传方式使得其在亲权鉴定中具有特殊的应用价值。比如双亲缺失的姐妹认亲、同父异母姐妹关系鉴定、祖母-孙女关系鉴定、乱伦关系鉴定、强奸案件的鉴定以及与X染色体相关的遗传疾病的鉴定等。另外，X染色体STR由于其单个位点的平均排除率优于常染色体，在腐败降解检材检测中有一定作用。
X染色体分为四个连锁群，最终计算的结果需要考虑连锁/不连锁、遗传距离等因素的影响。若存在连锁则要以单倍型来统计各种概率，不能简单地将各个位点的概率相乘。如果一组数据中含有来自同一连锁群的多个位点的信息，就需要将它们整合成一个单倍型进行分析。各个连锁群可认为是相互独立的，各个连锁群的数据可以运用乘积原理。
与现在市面上常染色体STR试剂盒的数量相比，X-STR试剂盒的数量仅有几家可供选择。国外主要有Qiagen公司的Argus X-8和Argus X-12试剂盒。国内主要有无锡中德美联研发的19X荧光检测试剂盒，苏州阅微基因的20X，以及北京基点认知的17X荧光检测试剂盒。中德美联主要选择几个连锁组；阅微基因及基点认知避免选择连锁组，主要考虑一些遗传距离较远的位点。
有研究表明，四个连锁组以外的一些位点彼此之间没有明显的连锁关系，因此本发明综合考虑从四个有代表性的连锁组中选取一些位点以及加入其他位置上一些彼此不连锁的位点，来综合计算遗传数据。现有X-STR试剂盒和X染色体相关的专利其针对的STR位点数量较少，且在遗传多态性、个体识别力方面有一定欠缺，因此有必要开发一种位点数量多、遗传多态性高、个体识别力强的X-STR试剂盒。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种用于人类X染色体STR位点的检测系统，该检测系统可以实现一次快速扩增就能得到多个位点的遗传信息。
因此，在第一方面，本发明提供一种人类X染色体STR位点检测系统，所述检测系统用于检测选自以下的STR位点及性别鉴定位点中的至少一种，
STR位点：DXS6803、DXS8378、DXS6807、DX10135、DXS6795、DXS9902、DXS7423、DXS10148、DXS6810、GATA165B12、GATA172D05、DXS7132、DXS10134、HPRTB、GATA31E08、DXS10159、DXS10103、DXS10101及DXS10079；
性别鉴定位点：AMEL。
在本发明优选的实施方式中，本发明的STR位点检测系统用于同时检测上述二十个位点。
具体地，本发明的人类X染色体STR位点检测系统，包括用于复合扩增以下STR位点或性别鉴定位点的至少一组引物对，
STR位点：DXS6803、DXS8378、DXS6807、DX10135、DXS6795、DXS9902、DXS7423、DXS10148、DXS6810、GATA165B12、GATA172D05、DXS7132、DXS10134、HPRTB、GATA31E08、DXS10159、DXS10103、DXS10101及DXS10079；
性别鉴定位点：AMEL。
在本发明具体的实施方式中，所述检测系统包括以下引物对中的至少一组：
SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12；
SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16；
SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24；
SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28；
SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.31与SEQ ID NO.32；
SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35与SEQ ID NO.36；
SEQ ID NO.37与SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39与SEQ ID NO.40。
在本发明优选的实施方式中，所述检测系统同时检测所述20个位点，同时包括有上述20组引物对。
在本发明一个具体的实施方式中，所述引物对按以下分组分别进行差别标记，
第一组：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10；
第二组：SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20；
第三组：SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30；
第四组：SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40。
具体的，所述差别标记是指用不同荧光素分别标记不同组的引物对。
例如，在本发明优选的实施方式中，第一组引物对用6’-FAM蓝色荧光素进行标记，第二组引物对用HEX绿色荧光素进行标记：第三组引物对用TAMRA黄色荧光素进行标记，第四组引物对用ROX红色荧光素进行标记。为便于检测，本发明优选还包括分子量内标，所述分子量内标用不同于上述四种颜色的荧光素标记，譬如用Atto633的橙色荧光素标记。
在本发明具体的实施方式中，所述各引物对的使用浓度如下表1：
表1
进一步优化的方案如下表2：
表2上下游引物序列及浓度
本发明还提供了一种DNA样品分析方法，所述方法包括使用上述的检测系统对DNA样品进行复合扩增。
所述DNA样品可以是血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液或羊水中的任意一种或多种。
所述复合扩增是指利用所述引物对，对所述DNA样品进行PCR复合扩增。
在本发明优选的实施方式中，同时使用上表1或表2的20组引物对同时对DNA样品进行PCR复合扩增。
具体的，所述PCR反应的退火温度为57～60℃，优选58℃，退火时间45～75秒，优选60秒。
本发明还公开了一种引物对，所述引物对包括以下引物对中的至少一种：
SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12；
SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16；
SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24；
SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28；
SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.31与SEQ ID NO.32；
SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35与SEQ ID NO.36；
SEQ ID NO.37与SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39与SEQ ID NO.40，
优选的，所述引物对用于检测人类X染色体STR位点。
本发明的有益效果：
本发明的人类X染色体STR位点的检测系统，可用于快速扩增人类X染色体的STR位点。在本发明具体的实施方式中，本发明的检测系统可实现一次检测多个位点，耗时1个半小时以内，快速高效。利用本发明检测系统构建的试剂盒，一次检测范围可以包含20个位点，扩增耗时在1个半小时以内，高效准确，灵敏度高，Allelic Ladder可覆盖187个等位基因，能提供更多信息，将具有更好的市场前景。
附图说明
图1是本发明人类X染色体STR位点的检测系统所检测的20个位点在X染色体上的定位图显示。
图2是本发明实施例2的9947A检测图谱。
图3是本发明实施例2的9948检测图谱。
图4是本发明实施例2的2800M检测图谱。
图5至图10是本发明实施例3针对三个独立家系样本进行检测的结果图，分别为A家系(同父同母姐妹)，B家系(父女)，C家系(母女)，得到的检测图谱，其中，图5为A家系姐姐，图6是A家系妹妹，图7是B家系父亲，图8是B家系女儿，图9是C家系母亲，图10是C家系女儿。
图11是实施例4中的Allelic Ladder等位基因分型标准品图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明提供一种识别位点数量多、遗传多态性高、个体识别能力强的X-STR试剂盒。
有研究表明，X染色体的四个连锁组以外的一些位点彼此之间没有明显的连锁关系，因此本发明综合考虑从四个有代表性的连锁组中选取一些位点以及加入其他位置上一些彼此不连锁的位点，来综合计算遗传数据。现有X-STR试剂盒和X染色体相关的专利其针对的STR位点数量较少，且在遗传多态性、个体识别力和检测的准确性上有一定欠缺，因此有必要开发一种位点数量多、遗传多态性高、个体识别力强的X-STR试剂盒。
本发明提供一种适用于特殊亲权关系鉴定X-STR分型系统，比如双亲缺失的姐妹认亲、同父异母姐妹关系鉴定、祖母-孙女关系鉴定、乱伦关系鉴定、强奸案件的鉴定等，可以实现一次快速扩增就能得到20个位点的遗传信息。另外，X染色体STR由于其单个位点的位点平均排除率优于常染色体，在腐败降解检材检测中有一定作用。
本发明提供了一种能够快速扩增人类X染色体上19个STR位点和一个性别鉴定位点AMEL的五色荧光标记复合扩增试剂盒，所述检测试剂盒复合扩增下列20个位点：AMEL、DXS6803、DXS8378、DXS6807、DX10135、DXS6795、DXS9902、DXS7423、DXS10148、DXS6810、GATA165B12、GATA172D05、DXS7132、DXS10134、HPRTB、GATA31E08、DXS10159、DXS10103、DXS10101和DXS10079，可以一次快速得到20个位点信息。本发明将20个位点分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记，扩增产物大小在70-400bp之间。
这20个位点在X染色体上的分布如图1所示。
首先针对上述20个位点在其重复序列的侧翼分别设计特异性的引物。X染色体STR尤其是连锁群组中的位点，序列同源性较强，特异性引物设计较难，因此引物采用特殊设计方法，每条引物退火温度在60℃左右。不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，扩增产物长度均在400bp以内。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。引物序列及浓度见上表2。
根据扩增产物片段大小分为五组，分别为：
第一组FAM标记：AMEL、DXS6803、DXS8378、DXS6807、DXS10135；
第二组HEX标记：DXS6795、DXS9902、DXS7423、DXS10148、DXS6810；
第三组TAMRA标记：GATA165B12、GATA172D05、DXS7132、DXS10134、HPRTB；
第四组ROX标记：GATA31E08、DXS10159、DXS10103、DXS10101、DXS10079；
内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto 633。
同组引物采用同一荧光进行标记。其中6’-FAM(6’-羧基荧光素)为蓝色荧光素，HEX(六氯-6-甲基荧光素)为绿色荧光素，TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)为黄色荧光素，ROX(羧基-X-罗丹明)为红色荧光素，Atto 633为橙色荧光素。
每组之中各位点扩增产物根据长度差异分开，相邻两个位点不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验，确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。
最后将四组20个位点复合扩增，根据产物峰高情况调整各位点引物浓度，使各位点峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述20个位点复合扩增。
本发明PCR缓冲液包括：10mM DMSO，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3，25℃)，2.0mM MgCl2，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTPMix。dNTPMix是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
本发明扩增产物的检测可在单道或多道毛细管电泳遗传分析仪(3500、3130)上进行检测；本发明所用模板是从人类的血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液或含有胎儿细胞的羊水等检材中提取的DNA。
本发明所需Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以。本发明的每个扩增体系(25μL)需要1U至2U的Taq DNA聚合酶。
扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler、博日G-1000等)采用如下温度循环条件可以在一个半小时内得到较好的结果：91℃预变性1分钟；95℃变性10秒，58℃退火1分钟，70℃延伸20秒，该步骤重复28个循环；60℃继续延伸30分钟；4℃～12℃保存。
本发明采用荧光标记引物，在所述复合扩增体系按上述程序进行扩增后得到带有荧光标记的各位点扩增产物混合物，该荧光标记物在激光激发下可发出被测序仪或遗传分析仪(ABI 3130、3100、3500等)识别的光信号，因此所述扩增产物可通过测序仪或遗传分析仪进行检测分析。
在利用测序仪或遗传分析仪进行检测时复合扩增产物需要与甲酰胺、分子量内标按一定的比例进行混合变性后再进行毛细管电泳分离，其中分子量内标为荧光标记的多条已知片段大小的DNA片段混合物，以其为参照可计算复合扩增产物的片段大小并与等位基因阶梯进行比对，从而分析判断被检样本各位点的基因型。
电泳后的数据可以在GeneMapperIDx、GeneMarker等数据分析软件上分析得到STR基因分型图谱和数据。
本发明提供一种适用于特殊亲权关系鉴定X-STR分型系统，比如双亲缺失的姐妹认亲、同父异母姐妹关系鉴定、祖母-孙女关系鉴定、乱伦关系鉴定、强奸案件的鉴定等，可以实现一次快速扩增就能得到20个位点的遗传信息。另外，X染色体STR由于其单个位点的位点平均排除率优于常染色体，在腐败降解检材检测中有一定作用。
下面通过具体案例的方式进一步说明本发明。下面的案例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。
实施例1
位点的确定、引物设计、荧光标记和试剂盒扩增参数的建立
1、本发明提供一种能够快速扩增人类X染色体DNA上19个STR位点和一个性别鉴定位点AMEL的五色荧光标记复合扩增试剂盒，所述试剂盒扩增包含以下位点：AMEL、DXS6803、DXS8378、DXS6807、DX10135、DXS6795、DXS9902、DXS7423、DXS10148、DXS6810、GATA165B12、GATA172D05、DXS7132、DXS10134、HPRTB、GATA31E08、DXS10159、DXS10103、DXS10101和DXS10079，可以一次快速得到20个位点信息。
2、本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，构建了5色荧光组合方案。在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，设计出位点组合方式以及荧光标记类型。从生产成本及各位点引物扩增效率等方面考虑，将20个位点分成4组。分别为第一组FAM标记：AMEL、DXS6803、DXS8378、DXS6807、DXS10135；第二组HEX标记：DXS6795、DXS9902、DXS7423、DXS10148、DXS6810；第三组TAMRA标记：GATA165B12、GATA172D05、DXS7132、DXS10134、HPRTB；第四组ROX标记：GATA31E08、DXS10159、DXS10103、DXS10101、DXS10079；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto 633。这种位点组合方式使得标记5种荧光就可以实现20个位点同时检测分析。
3、本发明试剂盒中包括：
1)2.5×PCRMasterMix缓冲液
2)引物混合物5×PrimerSets
3)阳性对照品Control DNA 9947A、9948和2800M
4)Allelic Ladder等位基因分型标准品
5)FGI Salmon 500橙色荧光分子量内标
6)光谱校正标准物
上述2.5×PCRMasterMix缓冲液包括了：50mM KCl，10mM DMSO，10mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl2，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTPMix。dNTPMix是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物,可以实现兼容扩增市面常见各种检材。
上述引物混合物5×PrimerSets包括扩增20个位点的所有引物(序列及浓度见表2)，Taq酶、氯化镁等。
上述阳性对照品Control DNA 9947A、9948和2800M是购买的商品化人类基因组DNA。
上述Allelic Ladder等位基因分型标准品是各个等位基因在一定数量人群中的分布情况。
上述FGI Salmon 500橙色荧光分子量内标是一系列用于标定一定片段大小的扩增产物。
所需的Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以。本发明的每个扩增体系(25μL)需要1U至2U的Taq DNA聚合酶。
扩增位点及其产物检测的实验过程
1)反应体系的配置(见表3)
表3反应体系的配置
| 组分 | 体积(μL) |
| 引物混合物(5×PrimerSets) | 5 |
| 缓冲液(2.5×PCRMasterMix) | 10 |
| 热启动Taq酶 | 0.4(2U) |
| DNA | 0.2ng-5ng |
| 无核酸酶水 | 补充至25μL |
2)PCR温度循环条件(见表4)
表4 PCR温度循环条件
扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)采用表4的温度循环条件可以在1个半小时内得到较好的结果。
3)扩增产物在遗传分析仪上荧光检测由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(FGISalmon 500)组成上样混合物，比例约为9:0.3，将9μL上样混合物与1μL扩增产物或系统中等位基因分型标准物(Allelic ladder)混合，避免产生气泡，尽快电泳。用3500遗传分析仪检测，结果参见以下实施例2。
实施例2
按照实施例1的操作流程，应用本发明扩增系统对标准品9947A、9948和2800M分型
1、标准品准备：将商用DNA标准品浓度稀释至1ng/μl。
2、扩增检测：按照实施例1进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测，选用同是本发明的特异性寡核苷酸扩增引物对的试剂盒，得到标准品9947A、9948和2800M的分型结果见表5，9947A检测图谱见图2，9948检测图谱见图3，2800M检测图谱见图4。
表5 9947A、9948和2800M的检测结果
结论：对三个标准品进行样本扩增的分型结果如图2、图3、图4所示，从图中可以看出，各个位点都有良好的扩增峰出现，与其基因型一致，且无非特异扩增峰出现。
实施例3
三个独立家系样本检测
本实施例针对三个独立家系样本进行检测，分别为A家系(同父同母姐妹)，B家系(父女)，C家系(母女)，得到分型结果见表6，表格中下划线提示遗传关系，检测图谱见图5、图6、图7、图8、图9、图10。
表6三个独立家系样本检测
结论：对三个独立家系样本进行检测，分型结果如图5(A家系姐姐)、图6(A家系妹妹)、图7(B家系父亲)、图8(B家系女儿)、图9(C家系母亲)、图10(C家系女儿)所示，从图中可以看出，三个家系的所有位点均满足遗传学规律，故不排除生物学亲缘关系。
实施例4
Allelic Ladder等位基因分型标准品的制备
本实施例经过群体样本的筛选调查，选出各位点常见的等位基因，经扩增、纯化及载体链接等步骤，制备出Allelic Ladder等位基因分型标准品，得到检测图谱见图11，该图谱是本发明优越性能的重要体现，表现出其具有丰富的遗传多态性、卓越的个体识别力和准确的检测性能。
以上应用了具体实例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大法医科技有限公司
<120> 人类X染色体STR位点检测系统、DNA样品分析方法及引物对
<130> 18I26182
<160> 40
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctttgaag tggtaccaga gca 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcatgcctaa tattttcagg gaata 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caaaaaggaa catatgctac tttatctc 28
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaatgtgct ttgacaggaa 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggtgccac tgaactccag cctggg 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttccatcctg ggacagttca cccctc 26
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatatatagt aaaaatactc ccacc 25
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcaccaatgc atgcatgttc acataac 27
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggttagtatt tcaataagcc aagaac 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gagctaaggg gtgacacctc tctgga 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acaaggagtt atgtttttaa cttaa 25
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtgactggga gaaaaatctc ttcagtg 27
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgaaattat ttccaaacat tttaac 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tttgttatta taaaaagcaa tacaca 26
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcgcctggca catagtaggt gccca 25
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cccctccaga atgcgagccc actc 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gctgaaaaag ggggaaggaa ggaag 25
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gacaatatgg gttaatatgt gcaactc 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aattctcctg cctcaccctc ccaagta 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccttaagtaa aatgtcctgc ccaaaat 27
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gaataatcta tgtatcatca atcat 25
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
attcctggtt tatatctatt t 21
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtttaaccag tacaaagttt tattttg 27
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggattcaaaa agatctatat ctatag 26
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgatgacatt agagagccag ttct 24
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aatcccctct catctatctg a 21
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ctgccctgca ctccagcctg ggtga 25
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ataactggtt gagcccctgc tttc 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acatctcccc attttctcac ttgc 24
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tctcacccct gtctatggtc tcg 23
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tggtgatgat agatgataga gataga 26
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gctcactttt atgtgtgtat gtatctc 27
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
aacctggatg acataagcga aactctatct 30
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gttgctggat ttggttagct ac 22
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tcatgggact tctcagcctt cataat 26
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cacacaccat tgtattaggg ctctcca 27
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gctgataatt gttgaagctg gg 22
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tgtcaccttc ttatttaggc ttatcctg 28
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgaggcagga gaatggcttg aacctgg 27
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
tatccttcat tttgctgcta taatatg 27
Claims (5)
1.一种人类X染色体STR位点检测系统，其特征在于：所述检测系统用于检测以下的STR位点及性别鉴定位点，其中：
STR位点：DXS6803、DXS8378、DXS6807、DX10135、DXS6795、DXS9902、DXS7423、DXS10148、DXS6810、GATA165B12、GATA172D05、DXS7132、DXS10134、HPRTB、GATA31E08、DXS10159、DXS10103、DXS10101及DXS10079；
性别鉴定位点：AMEL；
所述检测系统包括用于复合扩增所述STR位点和性别鉴定位点的引物对，所述引物对包括：
SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12；
SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16；
SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24；
SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28；
SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.31与SEQ ID NO.32；
SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35与SEQ ID NO.36；
SEQ ID NO.37与SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39与SEQ ID NO.40；
所述引物对按以下分组分别进行差别标记，
第一组：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10；
第二组：SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20；
第三组：SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30；
第四组：SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40；
所述差别标记是指用不同荧光素分别标记不同组的引物对；
所述引物对的使用浓度如下：
2.根据权利要求1所述的一种人类X染色体STR位点检测系统，其特征在于：所述第一组引物对用FAM进行标记，第二组引物对用HEX进行标记，第三组引物对用TAMRA进行标记，第四组引物对用ROX进行标记。
3.根据权利要求1所述的一种人类X染色体STR位点检测系统，其特征在于：所述引物对的使用浓度如下：
4.一种DNA样品分析方法，所述方法包括使用权利要求1～3任意一项所述的检测系统对DNA样品进行复合扩增；所述DNA样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液或羊水中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的DNA样品分析方法，其特征在于：所述复合扩增是指利用所述引物对，对所述DNA样品进行PCR复合扩增，所述PCR反应的退火温度为57～60℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810344503.9A CN108676856B (zh) | 2018-04-17 | 2018-04-17 | 人类x染色体str位点检测系统、dna样品分析方法及引物对 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810344503.9A CN108676856B (zh) | 2018-04-17 | 2018-04-17 | 人类x染色体str位点检测系统、dna样品分析方法及引物对 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108676856A CN108676856A (zh) | 2018-10-19 |
| CN108676856B true CN108676856B (zh) | 2022-07-22 |
Family
ID=63801017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810344503.9A Active CN108676856B (zh) | 2018-04-17 | 2018-04-17 | 人类x染色体str位点检测系统、dna样品分析方法及引物对 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108676856B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101475993A (zh) * | 2009-01-21 | 2009-07-08 | 中国政法大学 | X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN101608233A (zh) * | 2009-07-21 | 2009-12-23 | 西安交通大学 | 一种x染色体str基因位点分型的荧光检测方法 |
| CN103614361A (zh) * | 2013-08-20 | 2014-03-05 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种人基因组dna24个基因座的复合扩增的试剂盒 |
| CN104059980A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-24 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 人x染色体dna19个基因座复合扩增试剂盒及应用 |
| CN105177125A (zh) * | 2015-08-21 | 2015-12-23 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 人类x染色体20个短串联重复序列复合扩增体系及应用 |
| CN106868150A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-06-20 | 广州市刑事科学技术研究所 | 一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及其应用 |
| CN107841566A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-27 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 |
| CN107841567A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-27 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 28个短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101956004A (zh) * | 2010-08-13 | 2011-01-26 | 司法部司法鉴定科学技术研究所 | 一种荧光标记的16重x-str基因座复合扩增系统及其应用 |
| US20170226594A1 (en) * | 2016-02-08 | 2017-08-10 | Wafa Ali Rashed Altayari | Short tandem repeat (str) dna fingerprint method and kit |
-
2018
- 2018-04-17 CN CN201810344503.9A patent/CN108676856B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101475993A (zh) * | 2009-01-21 | 2009-07-08 | 中国政法大学 | X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN101608233A (zh) * | 2009-07-21 | 2009-12-23 | 西安交通大学 | 一种x染色体str基因位点分型的荧光检测方法 |
| CN103614361A (zh) * | 2013-08-20 | 2014-03-05 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种人基因组dna24个基因座的复合扩增的试剂盒 |
| CN104059980A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-24 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 人x染色体dna19个基因座复合扩增试剂盒及应用 |
| CN105177125A (zh) * | 2015-08-21 | 2015-12-23 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 人类x染色体20个短串联重复序列复合扩增体系及应用 |
| CN106868150A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-06-20 | 广州市刑事科学技术研究所 | 一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及其应用 |
| CN107841566A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-27 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 |
| CN107841567A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-27 | 苏州阅微基因技术有限公司 | 28个短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 16个X染色体STR基因座在亲缘关系鉴定中的应用价值研究;刘俊宏;《中国优秀硕士学位论文全文数据库，医药卫生科技辑，华东政法大学硕士学位论文》;20140215;第E076-59页 * |
| 亲权鉴定中性染色体STR基因座异常分型的研究;赖力等;《中国优生与遗传杂志》;20160107;第23卷(第11期);第7~9页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108676856A (zh) | 2018-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109750110B (zh) | 47个人类常染色体与y染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN109880912B (zh) | 44个人类y染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN107385064B (zh) | 一种同时扩增人常染色体snp和str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN109880911A (zh) | 25个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN109880913B (zh) | 38个人类y染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN107619870B (zh) | 能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对和应用 | |
| US20130084568A1 (en) | Probe, and polymorphism detection method using the same | |
| US20130078631A1 (en) | Probe, and polymorphism detection method using the same | |
| CN105385763B (zh) | 一种同时分析人基因组dna 24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用 | |
| Marmiroli et al. | Advanced PCR techniques in identifying food components | |
| CN111850158B (zh) | 用于普通小麦常规种品种纯度鉴定的特异性snp位点组合以及鉴定方法 | |
| CN110863056A (zh) | 一种人类dna精准分型的方法、试剂和应用 | |
| CN104745691A (zh) | 一种同时分析人基因组dna 27个基因座的荧光标记复合扩增的引物组、试剂盒及应用 | |
| CN106906292A (zh) | 一种22个短串联重复序列复合扩增方法及其试剂盒 | |
| CN106939334B (zh) | 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法 | |
| WO1999061659A1 (en) | A novel str marker system for dna fingerprinting | |
| CN106755448A (zh) | 人类y染色体29个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 | |
| CN109486964B (zh) | 用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法 | |
| CN103789414B (zh) | 17个x染色体短串联重复序列的复合扩增试剂盒 | |
| CN110066792A (zh) | 一种同步检测23个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒 | |
| CN110295218B (zh) | 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法 | |
| CN109929936B (zh) | 一种检测人类y染色体快速突变str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及应用 | |
| CN108676856B (zh) | 人类x染色体str位点检测系统、dna样品分析方法及引物对 | |
| CN107937493B (zh) | 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物 | |
| CN108251537B (zh) | 一种同时扩增人常染色体和y染色体str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |