CN104673907A - 一种用于高通量检验str分型的系统及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种用于高通量检验STR分型系统及其检测方法，其方法包括步骤(S100)提取样本基因组DNA；(S200)制备基于高通量测序的STR复合扩增生物混合体系，以用于复合扩增所述样本基因组DNA的STR基因座；以及(S300)高通量测序技术检测所述STR基因座的基因型，以用于个体的识别与鉴定，适用于法庭科学领域的STR分型检验。

Description

一种用于高通量检验STR分型的系统及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体地说，是一种基于高通量测序短串联重复序列(short tandem repeats，STR)基因型的检测系统及其方法。

背景技术

近年来通过生物检测技术来识别生物体信息的技术手段已经越来越普遍，法庭科学DNA检验的基本任务是解决司法实践中的个体识别和亲权鉴定问题。无论在刑事案件、民事案件、重大事故或灾害中，DNA分型对于明确案件性质以及查明嫌疑人、当事人或受害者，都起着至关重要的作用。基于毛细管电泳的短串联重复序列(STR)分型检验技术，因其自动化程度高、快速、灵敏、准确、稳定、重复性好等特点，已广泛应用于法庭科学DNA分型实验室，成为当前揭示案件线索、锁定嫌疑人的主要手段。

STR是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，由2-6bp的核心序列组成，通常重复15-60次，片段大小一般为100-300bp。STR主要由于核心序列重复次数不同而具有高度多态性，绝大多数不受选择压力的影响，且较均匀地分布于人类全基因组中。随着生物科学技术的发展及司法实践需求的进一步提高，法庭科学DNA检验技术在传统STR检测技术基础上，出现了新的理论和方法。传统的基于毛细管电泳的STR检验技术通过检测STR基因座的长度多态性获取不同个体的DNA分型信息，所含信息量有限，对于解决混合样本检验、复杂亲缘关系鉴定等疑难问题存在一定的难度。同时，传统的STR检验技术通过检测同一基因型DNA分子的总荧光强度来实现该基因型的判读，只能做到对基因型的定性分析，无法对该基因型所占比例进行准确的定量分析，存在着较大的信息风险。

Y染色体(除拟常染区外)在减数分裂中不发生交换重组，呈单倍型独立向下传递，父亲传递给儿子，具有父系遗传特征，序列的变异完全由累积的突变所致，并非重组引起。Y染色体短串联重复序列(Y-STR)的研究不仅在人类学、古生物学等方面意义重大，而且在法医学的个人识别及亲子鉴定中亦具有重要而独特的应用价值。由于父系遗传没有重组，多个Y-STR标记应用时不能像常染色体那样使用相乘原则，因此必须检测足够多的Y-STR基因座，使得Y染色体单倍型包含尽量多的多态基因座信息，以达到足够的个体识别统计学效力。

传统的STR基因型检测方法通过毛细管电泳对STR片段长度进行荧光检测，反馈出与核心重复数相应的荧光峰位，所述方法通量较低，无法对海量的DNA信息进行快速检测，且该方法仅仅能获取STR长度多态性信息，无法同时对STR的序列多态性进行测定。同时，利用荧光检测需要对用于扩增的引物进行荧光标记，增加荧光检测的误差性，并会限制STR分型的可检测基因座数量。采用信息含量更大、数据准确性更高的新技术替代传统的DNA检验技术是科技发展的必然趋势。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于高通量检验STR分型的系统及其检测方法，其通过高通量测序技术实现染色体上STR复合扩增分型检测，提高检测准确性以及个体识别的辨识度。

本发明的主要目的在于提供一种用于高通量检验STR分型的系统及其检测方法，其通过选取多个常染色体和/或Y染色体上的STR基因座进行复合扩增以及高通量检测，不需要任何荧光和化学发光的标记步骤，实现对人类STR基因座的复合扩增及分型的准确检测。

本发明的主要目的在于提供一种用于高通量检验STR分型的系统及其检测方法，其通过选取多个常染色体上的STR基因座进行复合扩增以及高通量检测，获取所述STR基因型的核心重复次数和具体序列信息，实现对人类STR基因座分型的准确检测，适用于法庭科学中的DNA鉴定。

本发明的另一目的在于提供一种用于高通量检验STR分型的系统及其检测方法，其通过选取多个Y染色体上的STR基因座进行复合扩增以及高通量检测，提高男性样本间的个体识别力，从而，有助于提高Y-STR基因座在无关个体甚至近亲个体中的辨识度。

本发明的另一目的在于提供一种用于高通量检验STR分型的系统及其检测方法，其通过对所述Y-STR基因座的多组引物对设计，同时，高通量测序检验Y-STR分型，获取所述Y-STR基因型的核心重复次数及具体序列信息，检测信息准确，适用于法庭科学以及亲子鉴定Y-STR基因座的分型检验。

为了实现以上提到的目的，本发明提供一种用于高通量检验STR分型的系统，其包括生物混合体系，所述生物混合体系包括至少一种样品溶液以及STR基因座的至少1种不同引物对，其中，所述引物对可用于扩增至少1种所述STR基因座，所述STR基因座选自常染色体和/或Y染色体；复合扩增系统，所述复合扩增系统用于所述至少1种不同引物对复合扩增所述STR基因座，形成至少1种STR基因座扩增产物；以及检测系统，所述检测系统为高通量测序装置，以用于检测至少1种所述STR基因座分型。

根据本发明的实施例，所述常染色体STR提供至少16个基因座，所述基因座中的至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

根据本发明的实施例，所述Y染色体STR提供至少12个基因座，所述基因座中的至少一个选自：DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

一种高通量STR分型的检测方法，以用于个体的识别，其包括步骤：

(S100)提取样本基因组DNA；

(S200)制备基于高通量测序的STR复合扩增生物混合体系，以用于复合扩增所述样本基因组DNA的STR基因座；以及

(S300)高通量测序技术检测所述STR基因座的分型，以用于个体的识别与鉴定。

根据本发明的实施例，所述步骤(S200)包括步骤：

(S210)确定多个STR基因座，其中，所述STR基因座选自常染色体和/或Y染色体；

(S220)设计所述DNA的扩增引物对组，以用于提供所述STR基因座的专用扩增引物对；

(S230)制备所述STR复合扩增生物混合体系，所述生物混合体系由所述引物组或其中任意一对引物及多对引物组合、扩增反应物、水和所述基因组DNA组成；以及

(S240)通过复合扩增系统对所述基因组DNA进行一个或多个STR复合扩增反应。

根据本发明的实施例，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个常染色体STR基因座，所述常染色体STR基因座至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

根据本发明的实施例，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个Y染色体STR基因座，所述Y染色体STR基因座至少一个选自DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

根据本发明的实施例，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个常染色体和Y染色体STR基因座，所述常染色体STR基因座至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA，其中，所述Y染色体STR基因座至少一个选自DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

根据本发明的实施例，在所述步骤(S230)中所述扩增反应物包含DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、BSA。

根据本发明的实施例，所述检测方法使用的高通量测序技术是Ion Torrent测序技术。

附图说明

图1是根据本发明的一种优选实施例的检测方法的流程示意图。

具体实施方式

根据本发明的权利要求和说明书所公开的内容，本发明的技术方案具体如下文所述。

实施例1

一种用于高通量检验STR分型的系统包括生物混合体系，所述生物混合体系包括至少一种样品溶液以及STR基因座的至少1种不同引物对，其中，所述引物对可用于扩增至少1种所述STR基因座，所述STR选自常染色体和/或Y染色体；复合扩增系统，所述复合扩增系统用于所述至少1种不同引物对复合扩增所述STR基因座，形成至少1种STR基因座扩增产物；以及检测系统，所述检测系统为高通量测序装置，以用于检测至少1种所述STR基因座分型。从而，通过高通量测序技术实现常染色体和/或Y染色体STR复合扩增分型检测，提高检测准确性以及个体识别的辨识度。

其中，当所述STR选自常染色体时，所述常染色体STR提供至少16个基因座，所述基因座中的至少1个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

所述常染色体STR基因座通过不同引物对进行复合扩增，所述引物对的序列从SEQID NO.1(sq1)到SEQ ID NO.32(sq32)，其中为方便标记将SEQ ID NO.简写为sq。其中，用于扩增常染色体STR基因座CSF1PO的引物对分别为sq1和sq2；用于扩增常染色体STR基因座D13S317的引物对分别为sq3和sq4；用于扩增常染色体STR基因座D16S539的引物对分别为sq5和sq6；用于扩增常染色体STR基因座D18S51的引物对分别为sq7和sq8；用于扩增常染色体STR基因座D21S11的引物对分别为sq9和sq10；用于扩增常染色体STR基因座D22S1045的引物对分别为sq11和sq12；用于扩增常染色体STR基因座D2S441的引物对分别为sq13和sq14；用于扩增常染色体STR基因座D3S1358的引物对分别为sq15和sq16；用于扩增常染色体STR基因座D5S818的引物对分别为sq17和sq18；用于扩增常染色体STR基因座D6S1043的引物对分别为sq19和sq20；用于扩增常染色体STR基因座D7S820的引物对分别为sq21和sq22；用于扩增常染色体STR基因座D8S1179的引物对分别为sq23和sq24；用于扩增常染色体STR基因座FGA的引物对分别为sq25和sq26；用于扩增常染色体STR基因座TH01的引物对分别为sq27和sq28；用于扩增常染色体STR基因座TPOX的引物对分别为sq29和sq30；用于扩增常染色体STR基因座vWA的引物对分别为sq31和sq32。其中，序列号从sq1到sq32的引物对序列具体如表1所示。

表1、16个常染色体STR基因座引物对序列

常染色体STR基因座的获取种类与所述引物对得以根据具体的实际需要进行调整，不限制于实施例中所选自的CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。同时，在检测时也可以任选其中1到16个基因座进行复合扩增反应检测，优选地，应用于法庭科学检测时，所述常染色体STR提供16个基因座，以达到个体识别所要求的统计学效力。

在本实施例中，将所述引物对sq1和sq2记为常染色体STR基因座CSF1PO的引物对，通过复合扩增反应，形成CSF1PO基因座扩增产物；

将所述引物对sq3和sq4记为常染色体STR基因座D13S317的引物对，通过复合扩增反应，形成D13S317基因座扩增产物；

将所述引物对sq5和sq6记为常染色体STR基因座D16S539的引物对，通过复合扩增反应，形成D16S539基因座扩增产物；

将所述引物对sq7和sq8记为常染色体STR基因座D18S51的引物对，通过复合扩增反应，形成D18S51基因座扩增产物；

将所述引物对sq9和sq10记为常染色体STR基因座D21S11的引物对，通过复合扩增反应，形成D21S11基因座扩增产物；

将所述引物对sq11和sq12记为常染色体STR基因座D22S1045的引物对，通过复合扩增反应，形成D22S1045基因座扩增产物；

将所述引物对sq13和sq14记为常染色体STR基因座D2S441的引物对，通过复合扩增反应，形成D2S441基因座扩增产物；

将所述引物对sq15和sq16记为常染色体STR基因座D3S1358的引物对，通过复合扩增反应，形成D3S1358基因座扩增产物；

将所述引物对sq17和sq18记为常染色体STR基因座D5S818的引物对，通过复合扩增反应，形成D5S818基因座扩增产物；

将所述引物对sq19和sq20记为常染色体STR基因座D6S1043的引物对，通过复合扩增反应，形成D6S1043基因座扩增产物；

将所述引物对sq21和sq22记为常染色体STR基因座D7S820的引物对，通过复合扩增反应，形成D7S820基因座扩增产物；

将所述引物对sq23和sq24记为常染色体STR基因座D8S1179的引物对，通过复合扩增反应，形成D8S1179基因座扩增产物。

将所述引物对sq25和sq26记为常染色体STR基因座FGA的引物对，通过复合扩增反应，形成FGA基因座扩增产物。

将所述引物对sq27和sq28记为常染色体STR基因座TH01的引物对，通过复合扩增反应，形成TH01基因座扩增产物。

将所述引物对sq29和sq30记为常染色体STR基因座TPOX的引物对，通过复合扩增反应，形成TPOX基因座扩增产物。

将所述引物对sq31和sq32记为常染色体STR基因座vWA的引物对，通过复合扩增反应，形成vWA基因座扩增产物。

1、生物混合体系的制备

(a)样本溶液制备

提取人源基因组DNA。样本为以血液采集卡采集的中国汉族人群离体外周血液样本，取自上海市公安局物证鉴定中心。实验时，选取5例样本，使用一定方法提取所述样本的基因组DNA，再使用一定方法对提取的所述基因组DNA进行浓度测定。其中，提取所述样本的基因组DNA使用的是DNAMini Kit(Qiagen公司，货号：51304)。测定所述基因组DNA的浓度使用的是Qubit^TM dsDNAHS Assay Kit(Thermo Fisher公司，货号：Q32851)。

(b)基于高通量测序的常染色体STR复合扩增反应试剂的制备

(b.1)常染色体STR基因座的确定

基于常染色体STR基因座的序列特征以及高通量测序技术平台的性能特点，确定至少1个常染色体STR基因座纳入研究。优选地，选取16个常染色体STR基因座，所述常染色体STR基因座分别为：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

(b.2)常染色体STR复合扩增系统专用扩增引物对

(b.2.1)设计DNA检验引物组，用于16个常染色体STR基因座的复合扩增。引物对的设计：根据确定的所述常染色体STR基因座设计复合扩增引物，所述常染色体STR基因座的不同引物对如表1所示，序列分别从sq1到sq32的16对常染色体STR基因座的不同引物对，即所述扩增引物对组，其包括至少一个选自以下基因座的引物对：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

(b.2.2)引物对混合物的配制：将所述不同的引物对按照各个最终浓度配制成10×引物组混合物。

用于扩增所述至少1个所述常染色体STR基因座的引物对中各条引物在所述生物混合体系的最终浓度均为0-1.2μM，分别如下所示：

所述CSF1PO的引物对sq1和sq2的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D13S317的引物对sq3和sq4的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D16S539的引物对sq5和sq6的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D18S51的引物对sq7和sq8的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D21S11的引物对sq9和sq10的最终浓度均为0-1.2μM；

所述D22S1045的引物对sq11和sq12的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D2S441的引物对sq13和sq14的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D3S1358的引物对sq15和sq16的最终浓度均为0-0.8μM；

所述D5S818的引物对sq17和sq18的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D6S1043的引物对sq19和sq20的最终浓度均为0-1.0μM；

所述D7S820的引物对sq21和sq22的最终浓度均为0-0.6μM；

所述D8S1179的引物对sq23和sq24的最终浓度均为0-1.2μM；

所述FGA的引物对sq25和sq26的最终浓度均为0-1.0μM；

所述TH01的引物对sq27和sq28的最终浓度均为0-1.0μM；

所述TPOX的引物对sq29和sq30的最终浓度均为0-0.6μM；

所述vWA的引物对sq31和sq32的最终浓度均为0-1.2μM。

根据所述引物对与所述常染色体STR基因座进行的复合扩增反应结果，优选地，用于扩增16个常染色体STR基因座的引物对中各条引物在所述生物混合体系的最终浓度分别如下所述：

用于扩增CSF1PO的引物对中各条引物sq1和sq2在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增D13S317的引物对中各条引物sq3和sq4在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.4μM；

用于扩增D16S539的引物对中各条引物sq5和sq6在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增D18S51的引物对中各条引物sq7和sq8在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增D21S11的引物对中各条引物sq9和sq10在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.3-0.6μM；

用于扩增D22S1045的引物对中各条引物sq11和sq12在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增D2S441的引物对中各条引物sq13和sq14在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增D3S1358的引物对中各条引物sq15和sq16在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.4μM；

用于扩增D5S818的引物对中各条引物sq17和sq18在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增D6S1043的引物对中各条引物sq19和sq20在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增D7S820的引物对中各条引物sq21和sq22在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增D8S1179的引物对中各条引物sq23和sq24在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.3-0.6μM；

用于扩增FGA的引物对中各条引物sq25和sq26在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增TH01的引物对中各条引物sq27和sq28在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.2-0.5μM；

用于扩增TPOX的引物对中各条引物sq29和sq30在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增vWA的引物对中各条引物sq31和sq32在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.3-0.6μM。

(b.3)制备常染色体STR复合扩增系统扩增反应试剂

用于所述常染色体STR基因座复合扩增反应试剂所述扩增反应试剂包括所述引物组或其中任意一对引物及多对引物组合、扩增反应物和水组成，其中，所述扩增反应物选取的是QIAGEN Multiplex PCR Master Mix(Qiagen公司，货号：206143)，所述扩增反应物包含DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、BSA。

(c)常染色体STR复合扩增生物混合体系

经过实验优选，20μL常染色体STR复合扩增生物混合体系包含：2μL10×引物组混合物、10μL2×扩增反应物(DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、BSA)、1.0ng到4.0ng基因组DNA，其余用水补足体积。其中，所述引物组混合物的各条引物在扩增反应试剂中的最终优选浓度如步骤(b.2)所示。其中，所述基因组DNA选取的是2.5ng。

换句话说，将所述5例样本的基因组DNA，分别取2.5ngDNA加入到步骤(c)的常染色体STR复合扩增系统扩增反应试剂中，制备成20μL反应体系，以进行后续的常染色体STR复合扩增反应。

2、常染色体STR复合扩增系统扩增反应

一种或多种常染色体STR复合扩增生物混合体系在所述常染色体STR复合扩增系统扩增反应程序如下：第一反应阶段，约1至约150℃，进行约1至约30分钟；第二反应阶段，约1至约150℃，进行约1至60秒，约1至约100℃，进行约30至约150秒，约1至约140℃，进行约1至约120秒，其中，所述第二反应阶段进行约1至20个循环；第三反应阶段，约1至约150℃，进行约1至60秒，约1至约100℃，进行约30至约150秒，约1至约150℃，进行约1至约120秒，其中，所述第三反应阶段进行约1至40个循环；第四反应阶段，约1至约120℃，进行约1至约60分钟。最后，使复合扩增反应溶液保持在最终状态，以提供一种或多种经复合扩增的核酸产物，低温保存。

优选地，所述常染色体STR复合扩增反应程序如下：95℃15分钟；进行10个循环的94℃30秒，62℃90秒，72℃60秒；进行20个循环的94℃30秒，60℃90秒，72℃60秒；60℃30分钟；4℃保存。所述样本的基因组DNA通过所述扩增反应程序进行一个或多个的常染色体STR复合扩增反应，形成所述常染色体STR基因座的扩增产物。

3、高通量测序进行所述常染色体STR基因座的分型检测

对所述常染色体STR复合扩增产物使用高通量测序技术进行检测，使用的仪器是IonTorrent个人化操作基因组测序仪(Personal Genome Machine，PGM，Thermo Fisher公司)。常染色体STR分型检测结果如表2所示。所述5例样本中的任意两个样本的STR核心重复序列及长度存在个体差异性，可以有效识别个体，不需要任何荧光和化学发光的标记步骤。通过高通量测序技术实现对人类STR基因座分型的准确检测，适用于法庭科学中的DNA测定。

其中，高通量测序技术可同时进行几百万条单分子DNA片段的序列测定，获得所测STR基因座及其侧翼的具体序列信息，一方面，可通过高通量数据分析获取所述常染色体STR基因座长度多态性分型，以所检测到的同一分型的DNA分子数目进行所述常染色体STR基因型的量化分析，在实现与法庭科学DNA数据库无缝兼容的同时，极大地提高STR分型的准确性和灵敏度；另一方面，所述高通量测序可实现STR及其周边其他遗传标志物(如SNP、InDel)的多态性信息组合，在获取STR长度多态性信息的基础上获得更多的遗传信息，对于提高混合样本检验中个体识别的辨识度，以及探索解决复杂亲缘关系鉴定等法医学疑难问题具有很大的优势。

高通量测序技术包括Roche 454焦磷酸测序技术、IlluminaSolexa测序技术以及Thermo Fisher Ion Torrent测序技术。在本发明中，使用的高通量测序技术是Ion Torrent测序技术，Ion Torrent技术通过专有大规模并行半导体感应器，对于DNA复制时产生的离子流，实现直接和实时检测，当试剂通过集成的流体通路进入Ion Torrent半导体芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系，这种独特的流体体系，微体系机械设计和半导体的技术组合，得以快速直接的将遗传信息翻译成数码的DNA测序结果，得到海量的高质量测序数据。Ion Torrent技术平台的PGM测序仪单次反应可检测约5百万条DNA分子，测序读长可达400bp。本发明选取位于人类常染色体上的16个STR基因座，通过高通量测序技术检验STR基因型，操作快捷，适用于刑事案件中的DNA鉴定。

4、以毛细管电泳法对所述常染色体STR分型结果进行验证

使用Plus PCR Amplification Kit(Thermo Fisher公司，货号：4427368)，PCR Amplification Kit(Thermo Fisher公司，货号：4476135)及System(Promega公司，货号：DC8902)对上述5例样本基因组DNA进行STR片段扩增，以3500基因分析仪(Thermo Fisher公司)进行毛细管电泳，对高通量测序法检测的16个STR基因座的分型结果进行验证。结果显示，两种方法对5个样本总共80个STR基因座分型检测的结果完全一致。

表2、5例样本STR分型检测结果

实施例2

一种用于高通量检验STR分型的系统包括生物混合体系，所述生物混合体系包括至少一种样品溶液以及STR基因座的至少1种不同引物对，其中，所述引物对可用于扩增至少1种所述STR基因座，所述STR选自常染色体和/或Y染色体；复合扩增系统，所述复合扩增系统用于所述至少1种不同引物对复合扩增所述STR基因座，形成至少1种STR基因座扩增产物；以及检测系统，所述检测系统为高通量测序装置，以用于检测至少1种所述STR基因座分型。从而，通过高通量测序技术实现常染色体和/或Y染色体上STR分型的快速检测，提高检测准确性以及个体识别的辨识度。

其中，当所述STR选自Y染色体时，所述Y染色体STR提供至少12个基因座，所述基因座中的至少1个选自：DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

所述Y-STR基因座通过不同引物对进行复合扩增，所述引物对的序列从SEQ IDNO.33(sq33)到SEQ ID NO.56(sq56)。其中，用于扩增Y-STR基因座DYS19的引物对分别为sq33和sq34；用于扩增Y-STR基因座DYS393的引物对分别为sq35和sq36；用于扩增Y-STR基因座DYS437的引物对分别为sq37和sq38；用于扩增Y-STR基因座DYS439的引物对分别为sq39和sq40；用于扩增Y-STR基因座DYS456的引物对分别为sq41和sq42；用于扩增Y-STR基因座DYS635的引物对分别为sq43和sq44；用于扩增Y-STR基因座Y-GATA-H4的引物对分别为sq45和sq46；用于扩增Y-STR基因座DYS390的引物对分别为sq47和sq48；用于扩增Y-STR基因座DYS391的引物对分别为sq49和sq50；用于扩增Y-STR基因座DYS392的引物对分别为sq51和sq52；用于扩增Y-STR基因座DYS438的引物对分别为sq53和sq54；用于扩增Y-STR基因座DYS448的引物对分别为sq55和sq56。其中，序列号从sq33到sq56的引物对序列具体如表3所示。

表3、12个Y-STR基因座的引物对序列

Y-STR基因座的获取种类与所述引物对得以根据具体的实际需要进行调整，并不限制于实施例中所选自的DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。在本实施例中，将所述引物对sq33和sq34记为Y-STR基因座DYS19的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS19基因座扩增产物；将所述引物对sq35和sq36记为Y-STR基因座DYS393的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS393基因座扩增产物；将所述引物对sq37和sq38记为Y-STR基因座DYS437的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS437基因座扩增产物；将所述引物对sq39和sq40记为Y-STR基因座DYS439的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS439基因座扩增产物；将所述引物对sq41和sq42记为Y-STR基因座DYS456的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS456基因座扩增产物；将所述引物对sq43和sq44记为Y-STR基因座DYS635的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS635基因座扩增产物；将所述引物对sq45和sq46记为Y-STR基因座Y-GATA-H4的引物对，通过复合扩增反应，形成Y-GATA-H4基因座扩增产物；将所述引物对sq47和sq48记为Y-STR基因座DYS390的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS390基因座扩增产物；将所述引物对sq49和sq50记为Y-STR基因座DYS391的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS391基因座扩增产物；将所述引物对sq51和sq52记为Y-STR基因座DYS392的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS392基因座扩增产物；将所述引物对sq53和sq54记为Y-STR基因座DYS438的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS438基因座扩增产物；将所述引物对sq55和sq56记为Y-STR基因座DYS448的引物对，通过复合扩增反应，形成DYS448基因座扩增产物。

1、生物混合体系的制备

(a)样本溶液制各

提取人源基因组DNA。样本为以血液采集卡采集的中国汉族男性人群离体外周血液样本，取自上海市公安局物证鉴定中心。实验时，选取5例样本，通过一定方法提取所述样本的基因组DNA，再通过一定方法对提取的所述基因组DNA进行浓度测定。其中，提取所述样本的基因组DNA使用的是DNA Mini Kit(Qiagen公司，货号：51304)。测定所述基因组DNA的浓度使用的是Qubit^TM dsDNAHS Assay Kit(Thermo Fisher公司，货号：Q32851)。

(b)基于高通量测序的Y-STR复合扩增反应试剂的制备

(b.1)Y-STR基因座的确定

基于Y-STR基因座的序列特征以及高通量测序技术平台的性能特点，确定至少1个Y-STR基因座纳入研究。优选地，选取12个Y-STR基因座，所述Y-STR基因座分别为：DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

(b.2)Y-STR复合扩增系统专用扩增引物对

(b.2.1)设计DNA检验引物组，用于12个Y-STR基因座复合扩增。引物对的设计：根据确定的所述Y-STR基因座设计复合扩增引物，所述Y-STR基因座的不同引物对如表3所示，序列分别从sq33到sq56的12对Y-STR基因座的不同引物对，即男性识别的扩增引物对组，其包括至少一个选自以下Y染色体STR基因座的引物对：DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

(b.2.2)引物对混合物的配制：将所述不同的引物对按照各个最终浓度配制成10×引物组混合物。

用于扩增所述至少1个Y-STR基因座的引物对中各条引物在所述生物混合体系的最终浓度均为0-1.0μM，分别如下所示：

所述DYS19的引物对sq33和sq34的最终浓度均为0-1.0μM；

所述DYS393的引物对sq35和sq36的最终浓度均为0-1.0μM；

所述DYS437的引物对sq37和sq38的最终浓度均为0-0.5μM；

所述DYS439的引物对sq39和sq40的最终浓度均为0-0.6μM；

所述DYS456的引物对sq41和sq42的最终浓度均为0-0.6μM；

所述DYS635的引物对sq43和sq44的最终浓度均为0-1.0μM；

所述Y-GATA-H4的引物对sq45和sq46的最终浓度均为0-0.6μM；

所述DYS390的引物对sq47和sq48的最终浓度均为0-0.6μM；

所述DYS391的引物对sq49和sq50的最终浓度均为0-0.5μM；

所述DYS392的引物对sq51和sq52的最终浓度均为0-1.0μM；

所述DYS438的引物对sq53和sq54的最终浓度均为0-0.6μM；

所述DYS448的引物对sq55和sq56的最终浓度均为0-0.6μM。

根据所述引物对与所述Y-STR基因座进行的复合扩增反应结果，优选地，用于扩增12个Y-STR基因座的引物对中各条引物在所述生物混合体系的最终浓度分别如下所述：

用于扩增DYS19的引物对中各条引物sq33和sq34在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.3-0.5μM；

用于扩增DYS393的引物对中各条引物sq35和sq36在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.3-0.5μM；

用于扩增DYS437的引物对中各条引物sq37和sq38在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.08-0.2μM；

用于扩增DYS439的引物对中各条引物sq39和sq40在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增DYS456的引物对中各条引物sq41和sq42在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增DYS635的引物对中各条引物sq43和sq44在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增Y-GATA-H4的引物对中各条引物sq45和sq46在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增DYS390的引物对中各条引物sq47和sq48在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增DYS391的引物对中各条引物sq49和sq50在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.08-0.2μM；

用于扩增DYS392的引物对中各条引物sq51和sq52在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.4-0.6μM；

用于扩增DYS438的引物对中各条引物sq53和sq54在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM；

用于扩增DYS448的引物对中各条引物sq55和sq56在所述生物混合体系中的最终浓度均为0.1-0.3μM。

(b.3)制备Y-STR复合扩增系统扩增反应试剂

用于所述Y-STR基因座复合扩增反应试剂所述扩增反应试剂包括所述引物组或其中任意一对引物及多对引物组合、扩增反应物和水组成，其中，所述扩增反应物选取的是QIAGEN Multiplex PCR Master Mix(Qiagen公司，货号：206143)，所述扩增反应物包含DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、BSA。

(c)Y-STR复合扩增生物混合体系

经过实验优选，20μLY-STR复合扩增生物混合体系包含：2μL10×引物组混合物、10μL2×扩增反应物(DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、BSA)、1.0ng到4.0ng基因组DNA，其余用水补足体积。其中，所述引物组混合物的各条引物在扩增反应试剂中的最终优选浓度如步骤(b.2)所示。其中，所述基因组DNA选取的是2.5ng。

换句话说，将所述5例样本的基因组DNA，分别取2.5ngDNA加入到步骤(c)的Y-STR复合扩增系统扩增反应试剂中，制备成20μL反应体系，以进行后续的Y-STR复合扩增反应。

2、Y-STR复合扩增系统扩增反应

一种或多种Y-STR复合扩增生物混合体系在所述Y-STR复合扩增系统扩增反应程序如下：第一反应阶段，约1至约150℃，进行约1至约30分钟；第二反应阶段，约1至约150℃，进行约1至60秒，约1至约100℃，进行约30至约150秒，约1至约140℃，进行约1至约120秒，其中，所述第二反应阶段进行约1至20个循环；第三反应阶段，约1至约150℃，进行约1至60秒，约1至约100℃，进行约30至约150秒，约1至约150℃，进行约1至约120秒，其中，所述第三反应阶段进行约1至40个循环；第四反应阶段，约1至约120℃，进行约1至约60分钟。最后，使复合扩增反应溶液保持在最终状态，以提供一种或多种经复合扩增的核酸产物，低温保存。

优选地，所述Y-STR复合扩增反应程序如下：95℃15分钟；进行10个循环的94℃30秒，62℃90秒，72℃60秒；进行20个循环的94℃30秒，60℃90秒，72℃60秒；60℃30分钟；4℃保存。其中，所述样本的基因组DNA通过所述扩增反应程序进行一个或多个的Y-STR复合扩增反应，形成所述Y-STR基因座的扩增产物。

3、高通量测序进行所述Y-STR基因座的分型检测

对所述Y-STR复合扩增产物使用高通量测序技术进行检测，选用的高通量测序技术是Ion Torrent测序技术，使用的仪器是Ion Torrent PGM测序仪(Thermo Fisher公司)，检测结果如表4所示。从表4中，可知所述5例样本中的任意两个样本的STR基因型序列及长度存在个体差异性，其通过选取多个Y-STR基因座进行复合扩增以及高通量检测，可以提高男性样本间的个体识别力，从而，有助于提高Y-STR在无关个体甚至近亲个体中的辨识度。

Ion Torrent测序技术采用大规模并行的半导体传感器阵列，使DNA测序反应依托于半导体芯片而进行，直接对DNA复制过程中产生的离子流进行实时测定，实现DNA序列信息的实时读取，具有测序读长长、反应速度快、操作简便、数据质量较高等诸多优点。

通过对所述Y-STR基因座进行多重扩增及高通量测序检验，定量获取所述Y-STR基因型的核心重复次数及具体序列信息，检测信息准确，适用于法庭科学Y-STR的分型检验。

4、以毛细管电泳法对所述Y染色体STR分型结果进行验证

使用Plus PCR Amplification Kit(Thermo Fisher公司，货号：4359513)，对上述5例样本基因组DNA进行Y-STR片段扩增，以3500基因分析仪(ThermoFisher公司)进行毛细管电泳，对高通量测序法检测的12个Y-STR基因座的分型结果进行验证。结果显示，5例样本总共60个Y-STR基因座的分型检测结果完全一致。

表4、5例样本Y-STR分型检测结果

实施例3

一种用于高通量检验STR分型的系统包括生物混合体系，所述生物混合体系包括至少一种样品溶液以及STR基因座的至少1种不同引物对，其中，所述引物对可用于扩增至少1种所述STR基因座，所述STR选自常染色体和/或Y染色体；复合扩增系统，所述复合扩增系统用于所述至少1种不同引物对复合扩增所述STR基因座，形成至少1种STR基因座扩增产物；以及检测系统，所述检测系统为高通量测序装置，以用于检测至少1种所述STR基因座分型。从而，通过高通量测序技术实现常染色体和/或Y染色体STR复合扩增分型检测，提高检测准确性以及个体识别的辨识度。

其中，当所述STR选自常染色体和Y染色体时，所述常染色体STR提供的一个或多个基因座至少1个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。所述Y染色体STR提供的一个或多个基因座至少1个选自：DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

所述常染色体STR基因座与所述Y染色体STR基因座通过不同引物对进行复合扩增，所述引物对的序列从SEQ ID NO.1(sq1)到SEQ ID NO.56(sq56)，如表1和表3所示。

一种高通量STR分型的检测方法，以用于个体的识别，其包括步骤：

(S100)提取样本基因组DNA；

(S200)制备基于高通量测序的STR复合扩增生物混合体系，以用于复合扩增所述样本基因组DNA的STR基因座；以及

(S300)高通量测序技术检测所述STR基因座的分型，以用于个体的识别与鉴定。

其中，所述步骤(S200)包括步骤：

(S210)确定多个STR基因座，其中，所述STR选自常染色体和/或Y染色体；

(S220)设计所述DNA的扩增引物对组，以用于提供所述STR基因座的专用扩增引物对；

(S230)制备所述STR复合扩增生物混合体系，所述生物混合体系由所述引物组或其中任意一对引物及多对引物组合、扩增反应物、水和所述基因组DNA组成；以及

(S240)通过复合扩增系统将所述基因组DNA进行一个或多个的STR复合扩增反应，形成所述STR基因座的扩增产物。

其中，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个常染色体STR基因座，所述常染色体STR基因座至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

其中，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个Y染色体STR基因座，所述Y染色体STR基因座至少一个选自DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

其中，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个常染色体和Y染色体STR基因座，所述常染色体STR基因座至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA，其中，所述Y染色体STR基因座至少一个选自DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

其中，在所述步骤(S230)中所述扩增反应物包含DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、BSA。

其中，所述检测方法使用的高通量测序技术是Ion Torrent测序技术。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的设备和结构，应当理解为采取本领域已有的通用设备及通用方法来予以实施。

同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同设备等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。

Claims (10)

1.一种用于高通量检验STR分型系统，其特征在于，包括：

生物混合体系，所述生物混合体系包括至少一种样品溶液以及STR基因座的至少1种不同引物对，其中，所述引物对可用于扩增至少1种所述STR基因座，所述STR基因座选自常染色体和/或Y染色体；

复合扩增系统，所述复合扩增系统用于所述至少1种不同引物对复合扩增所述STR基因座，形成至少1种STR基因座扩增产物；以及

检测系统，所述检测系统为高通量测序装置，以用于检测至少1种所述STR基因座分型。

2.根据权利要求1所述的用于高通量检验STR分型系统，所述常染色体STR提供至少16个基因座，所述基因座中的至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

3.根据权利要求1或2所述的用于高通量检验STR分型系统，所述Y染色体STR提供至少12个基因座，所述基因座中的至少一个选自：DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

4.一种高通量STR分型的检测方法，以用于个体的识别，其特征在于，包括步骤：

(S100)提取样本基因组DNA；

(S200)制备基于高通量测序的STR复合扩增生物混合体系，以用于复合扩增所述样本基因组DNA的STR基因座；以及

(S300)高通量测序技术检测所述STR基因座的基因型，以用于个体的识别与鉴定。

5.根据权利要求4所述的方法，所述步骤(S200)包括步骤：

(S210)确定多个STR基因座，其中，所述STR基因座选自常染色体和/或Y染色体；

(S220)设计所述DNA的扩增引物对组，以用于提供所述STR基因座的专用扩增引物对；

(S230)制备所述STR复合扩增生物混合体系，所述生物混合体系由所述引物组或其中任意一对引物及多对引物组合、扩增反应物、水和所述基因组DNA组成；以及

(S240)通过复合扩增系统对所述基因组DNA进行一个或多个STR基因座复合扩增反应。

6.根据权利要求5所述的方法，所述检测方法使用的高通量测序技术是Ion Torrent测序技术。

7.根据权利要求6所述的方法，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个常染色体STR基因座，所述常染色体STR基因座至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA。

8.根据权利要求6所述的方法，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个Y染色体STR基因座，所述Y染色体STR基因座至少一个选自DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

9.根据权利要求6所述的方法，所述步骤(S210)包括步骤：确定至少1个常染色体和Y染色体STR基因座，所述常染色体STR基因座至少一个选自：CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D22S1045、D2S441、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA，其中，所述Y染色体STR基因座至少一个选自DYS19、DYS393、DYS437、DYS439、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4、DYS390、DYS391、DYS392、DYS438、DYS448。

10.根据权利要求4到9中任一所述的方法，在所述步骤(S230)中所述扩增反应物包含DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、BSA。