CN107099529A - 基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒及其专用引物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒及其专用引物组合。本发明提供的引物组合，由序列表中序列1至序列60所示的60种DNA分子组成。实验证明，采用本发明提供的基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒检测标准品2800M中30个基因座的STR分型，分型结果准确。本发明提供的试剂盒具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及法医学技术领域，具体涉及基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒及其专用引物组合。
背景技术
DNA物证在现代法医学中扮演着越来越重要的角色，目前主要是利用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)针对各STR基因座进行长度多态性方面的分型检测，但是在CE长度多态性分型系统下，核苷酸数量相等的所有等位基因被认为是同一个等位基因，容易导致一些杂合基因座中因等位基因序列不同但长度相同而被判别为纯合，而且由于毛细管电泳检测平台采用多色荧光复合扩增技术，为在各色荧光中安置更多的基因座，设计引物时需要为一些基因座保留较长的侧翼序列，导致其扩增效率降低，尤其不利于降解检材的分型。二代测序在法庭科学领域的应用尚处于起步阶段，但是随着办案过程中对于疑难生物样本检材比如降解样本检材分型的精确检测需求越来越高，需要利用二代测序技术(second generation sequencing，SGS)提供更为精确全面的检测结果。运用二代测序技术可针对生物样本微量检材，在一次测序实验中完成短串联重复序列多态性(shorttandem repeat，STR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、插入缺失多态性(insertion/deletion polymorphism，Indel)、mRNA等各种类型的大量的遗传标记信息的检测。利用二代测序技术可精确分析各STR基因座等位基因间的序列差异，发现获取稀有型等位基因，得到各个基因座等位基因的序列信息也有利于辅助分析混合样本数据。对STR基因座进行分型时，由于检测对象是片段的序列多态性，各基因座片段长度可在小片段区域相互重叠且互不干扰，非常有利于降解检材的精确分型检测，这是目前毛细管电泳平台技术无法做到的。
目前，Illumina公司和Thermo Fisher公司已分别推出基于二代测序技术的STR分型试剂盒。以上试剂盒价格昂贵，且均不支持用户自主选择适合中国人群的STR基因座，配套的数据分析程序只能针对各自试剂盒中固有基因座的测序数据进行分析，具有一定的局限性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何进行STR分型。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物组合。
本发明所提供的引物组合，可由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16、引物17、引物18、引物19、引物20、引物21和引物22组成；
所述引物1可为如下A1)或A2)：A1)序列表中的序列1所示的单链DNA分子；A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物2可为如下A3)或A4)：A3)序列表中的序列2所示的单链DNA分子；A4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物3可为如下A5)或A6)：A5)序列表中的序列3所示的单链DNA分子；A6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物4可为如下A7)或A8)：A7)序列表中的序列4所示的单链DNA分子；A8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物5可为如下A9)或A10)：A9)序列表中的序列5所示的单链DNA分子；A10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物6可为如下A11)或A12)：A11)序列表中的序列6所示的单链DNA分子；A12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物7可为如下A13)或A14)：A13)序列表中的序列7所示的单链DNA分子；A14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物8可为如下A15)或A16)：A15)序列表中的序列8所示的单链DNA分子；A16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物9可为如下A17)或A18)：A17)序列表中的序列9所示的单链DNA分子；A18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物10可为如下A19)或A20)：A19)序列表中的序列10所示的单链DNA分子；A20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物11可为如下B1)或B2)：B1)序列表中的序列11所示的单链DNA分子；B2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物12可为如下B3)或B4)：B3)序列表中的序列12所示的单链DNA分子；B4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
所述引物13可为如下B5)或B6)：B5)序列表中的序列13所示的单链DNA分子；B6)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物14可为如下B7)或B8)：B7)序列表中的序列14所示的单链DNA分子；B8)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物15可为如下B9)或B10)：B9)序列表中的序列15所示的单链DNA分子；B10)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物16可为如下B11)或B12)：B11)序列表中的序列16所示的单链DNA分子；B12)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物17可为如下B13)或B14)：B13)序列表中的序列17所示的单链DNA分子；B14)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物18可为如下B15)或B16)：B15)序列表中的序列18所示的单链DNA分子；B16)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
所述引物19可为如下B17)或B18)：B17)序列表中的序列19所示的单链DNA分子；B18)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物20可为如下B19)或B20)：B19)序列表中的序列20所示的单链DNA分子；B20)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
所述引物21可为如下C1)或C2)：C1)序列表中的序列21所示的单链DNA分子；C2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物22可为如下C3)或C4)：C3)序列表中的序列22所示的单链DNA分子；C4)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19、所述引物20、所述引物21和所述引物22的摩尔比具体可为2:2:1:1:2:2:2:2:1:1:2:2:2:2:2:2:1:1:4:4:2:2。
所述引物组合中，还可包括引物23、引物24、引物25、引物26、引物27、引物28、引物29、引物30、引物31、引物32、引物33、引物34、引物35、引物36、引物37、引物38、引物39、引物40、引物41、引物42、引物43、引物44、引物45、引物46、引物47、引物48、引物49、引物50、引物51、引物52、引物53、引物54、引物55、引物56、引物57、引物58、引物59和引物60；
所述引物23可为如下C5)或C6)：C5)序列表中的序列23所示的单链DNA分子；C6)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物24可为如下C7)或C8)：C7)序列表中的序列24所示的单链DNA分子；C8)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；
所述引物25可为如下C9)或C10)：C9)序列表中的序列25所示的单链DNA分子；C10)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；
所述引物26可为如下C11)或C12)：C11)序列表中的序列26所示的单链DNA分子；C12)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；
所述引物27可为如下C13)或C14)：C13)序列表中的序列27所示的单链DNA分子；C14)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；
所述引物28可为如下C15)或C16)：C15)序列表中的序列28所示的单链DNA分子；C16)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子；
所述引物29可为如下C17)或C18)：C17)序列表中的序列29所示的单链DNA分子；C18)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子；
所述引物30可为如下C19)或C20)：C19)序列表中的序列30所示的单链DNA分子；C20)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子；
所述引物31可为如下D1)或D2)：D1)序列表中的序列31所示的单链DNA分子；D2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子；
所述引物32可为如下D3)或D4)：D3)序列表中的序列32所示的单链DNA分子；D4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子；
所述引物33可为如下D5)或D6)：D5)序列表中的序列33所示的单链DNA分子；D6)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的DNA分子；
所述引物34可为如下D7)或D8)：D7)序列表中的序列34所示的单链DNA分子；D8)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的DNA分子；
所述引物35可为如下D9)或D10)：D9)序列表中的序列35所示的单链DNA分子；D10)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的DNA分子；
所述引物36可为如下D11)或D12)：D11)序列表中的序列36所示的单链DNA分子；D12)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的DNA分子；
所述引物37可为如下D13)或D14)：D13)序列表中的序列37所示的单链DNA分子；D14)将序列37经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列37具有相同功能的DNA分子；
所述引物38可为如下D15)或D16)：D15)序列表中的序列38所示的单链DNA分子；D16)将序列38经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列38具有相同功能的DNA分子；
所述引物39可为如下D17)或D18)：D17)序列表中的序列39所示的单链DNA分子；D18)将序列39经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列39具有相同功能的DNA分子；
所述引物40可为如下D19)或D20)：D19)序列表中的序列40所示的单链DNA分子；D20)将序列40经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列40具有相同功能的DNA分子；
所述引物41可为如下E1)或E2)：E1)序列表中的序列41所示的单链DNA分子；E2)将序列41经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列41具有相同功能的DNA分子；
所述引物42可为如下E3)或E4)：E3)序列表中的序列42所示的单链DNA分子；E4)将序列42经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列42具有相同功能的DNA分子；
所述引物43可为如下E5)或E6)：E5)序列表中的序列43所示的单链DNA分子；E6)将序列43经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列43具有相同功能的DNA分子；
所述引物44可为如下E7)或E8)：E7)序列表中的序列44所示的单链DNA分子；E8)将序列44经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列44具有相同功能的DNA分子；
所述引物45可为如下E9)或E10)：E9)序列表中的序列45所示的单链DNA分子；E10)将序列45经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列45具有相同功能的DNA分子；
所述引物46可为如下E11)或E12)：E11)序列表中的序列46所示的单链DNA分子；E12)将序列46经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列46具有相同功能的DNA分子；
所述引物47可为如下E13)或E14)：E13)序列表中的序列47所示的单链DNA分子；E14)将序列47经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列47具有相同功能的DNA分子；
所述引物48可为如下E15)或E16)：E15)序列表中的序列48所示的单链DNA分子；E16)将序列48经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列48具有相同功能的DNA分子；
所述引物49可为如下E17)或E18)：E17)序列表中的序列49所示的单链DNA分子；E18)将序列49经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列49具有相同功能的DNA分子；
所述引物50可为如下E19)或E20)：E19)序列表中的序列50所示的单链DNA分子；E20)将序列50经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列50具有相同功能的DNA分子；
所述引物51可为如下F1)或F2)：F1)序列表中的序列51所示的单链DNA分子；F2)将序列51经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列51具有相同功能的DNA分子；
所述引物52可为如下F3)或F4)：F3)序列表中的序列52所示的单链DNA分子；F4)将序列52经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列52具有相同功能的DNA分子；
所述引物53可为如下F5)或F6)：F5)序列表中的序列53所示的单链DNA分子；F6)将序列53经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列53具有相同功能的DNA分子；
所述引物54可为如下F7)或F8)：F7)序列表中的序列54所示的单链DNA分子；F8)将序列54经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列54具有相同功能的DNA分子；
所述引物55可为如下F9)或F10)：F9)序列表中的序列55所示的单链DNA分子；F10)将序列55经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列55具有相同功能的DNA分子；
所述引物56可为如下F11)或F12)：F11)序列表中的序列56所示的单链DNA分子；F12)将序列56经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列56具有相同功能的DNA分子；
所述引物57可为如下F13)或F14)：F13)序列表中的序列57所示的单链DNA分子；F14)将序列57经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列57具有相同功能的DNA分子；
所述引物58可为如下F15)或F16)：F15)序列表中的序列58所示的单链DNA分子；F16)将序列58经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列58具有相同功能的DNA分子；
所述引物59可为如下F17)或F18)：F17)序列表中的序列59所示的单链DNA分子；F18)将序列59经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列59具有相同功能的DNA分子；
所述引物60可为如下F19)或F20)：F19)序列表中的序列60所示的单链DNA分子；F20)将序列60经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列60具有相同功能的DNA分子。
所述的引物组合中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19、所述引物20、所述引物21、所述引物22、所述引物23、所述引物24、所述引物25、所述引物26、所述引物27、所述引物28、所述引物29、所述引物30、所述引物31、所述引物32、所述引物33、所述引物34、所述引物35、所述引物36、所述引物37、所述引物38、所述引物39、所述引物40、所述引物41、所述引物42、所述引物43、所述引物44、所述引物45、所述引物46、所述引物47、所述引物48、所述引物49、所述引物50、所述引物51、所述引物52、所述引物53、所述引物54、所述引物55、所述引物56、所述引物57、所述引物58、所述引物59和所述引物60的摩尔比具体可为2:2:1:1:2:2:2:2:1:1:2:2:2:2:2:2:1:1:4:4:2:2:4:4:2:2:2:2:2:2:1:1:2:2:2:2:2:2:2:2:4:4:1:1:2:2:2:2:1:1:2:2:4:4:2:2:2:2:2:2。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种基于STR基因座的复合扩增体系。
本发明所提供的基于STR基因座的复合扩增体系，可包括上述任一所述引物组合。
所述引物3、所述引物4、所述引物9、所述引物10、所述引物17、所述引物18、所述引物31、所述引物32、所述引物43、所述引物44、所述引物49和所述引物50在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.05μM。
所述引物1、所述引物2、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物21、所述引物22、所述引物25、所述引物26、所述引物27、所述引物28、所述引物29、所述引物30、所述引物33、所述引物34、所述引物35、所述引物36、所述引物37、所述引物38、所述引物39、所述引物40、所述引物45、所述引物46、所述引物47、所述引物48、所述引物51、所述引物52、所述引物55、所述引物56、所述引物57、所述引物58、所述引物59和所述引物60在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.1μM。
所述引物19、所述引物20、所述引物23、所述引物24、所述引物41、所述引物42、所述引物53和所述引物54在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.2μM。
所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
上述任一所述复合扩增体系可为20μL，由10μL Master Mix、9μL引物组合的水溶液和1μL模板组成。Master Mix具体可为公安部物证鉴定中心产品。所述模板具体可为浓度为1ng/mL的标准品2800M的水溶液。所述标准品2800M具体可为Promega公司的产品，产品目录号为DD7251。
含有上述任一所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)检测遗传标记。
本发明还保护上述任一所述复合扩增体系或所述试剂盒的制备方法；该制备方法可包括将上述任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)检测遗传标记。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系在检测STR分型和/或SNP分型和/或Indel分型和/或检测遗传标记中的应用。
实验证明，采用本发明提供的基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒检测标准品2800M中30个基因座的STR分型，分型结果准确。本发明提供的试剂盒具有重要的应用价值。
附图说明
图1为30个基因座的PCR扩增产物的长度范围分布。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
9947A人类基因组DNA为Promega公司产品。标准品2800M为Promega公司的产品，产品目录号为DD7251。Agencourt AMPure XP 5mL Kit为Beckman Coulter公司的产品，产品目录号为A63880。NanoDrop 2000定量仪为Thermo Fisher Scientific公司的产品。TruSeqDNA PCR-Free HT Library Prep Kit为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-3003。Miseq FGx二代测序仪为Illumina公司的产品。KAPA Library Quantification Kit为KAPA公司的产品，产品目录号为KK4824。GlobalFiler PCR Amplification Kit为ThermoFisher Scientific公司的产品。
实施例1、基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒的制备
一、常染色体STR基因座的筛选
1、本发明的发明人首先以现有试剂盒(如Illumina MiseqFGx二代测序仪配套的试剂盒)中的基因座和适合中国人的基因座为参考，筛选出50个常染色体STR基因座；然后将50个常染色体STR基因座的核心及侧翼区序列(长度为1000-1500bp)整理成Fasta格式，设置9个文件夹，分别对应60bp、80bp、100bp、120bp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp 9个预期核心片段长度梯度，每个文件夹中均包含预先整理好的全序列FSTA文件，针对每个文件夹内的FASTA文件分别运行GMATA Marker designing功能；从引物设计结果中选取扩增产物片段长度为251bp以下的引物对，并对相应引物附加荧光。
2、以9947A的基因组DNA为样本，采用步骤1设计的引物依次进行单个基因座引物扩增、多个带同色荧光的基因座引物扩增和多色荧光的基因座引物扩增，以50个STR基因座的扩增稳定性。根据检测结果，进一步筛选获得如下29个常染色体STR基因座：CSF1PO、D5S818、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、FGA、TH01、TPOX、vWA、D10S1435、D11S4463、D14S1434、D18S853、D1GATA113、D1S1627、D1S1656、D1S1677、D20S1082、D20S482、D22S1045、D2S1776、D2S441、D3S3053、D3S4529、D6S1017、D6S1043、D6S474和D9S2157。
二、引物组合的制备
引物组合由60条引物组成，用于检测步骤一筛选的29个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amelogenin。各个基因座、扩增基因座对应的引物名称和序列、等位基因等信息详见表1。各基因座对应的引物在hg19人类参考基因组(hg19人类基因组的信息见网址http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/hg19.2bit)中的PCR扩增产物的长度和核苷酸序列详见表2。各基因座的PCR扩增产物的长度范围分布见图1。
表1
表2
三、基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒的制备
基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒包括引物混合物。引物混合物由步骤二制备的60条引物混合而成。
实施例2、基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒的应用
一、DNA样本准备
取标准品2800M，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/mL的标准品2800M水溶液。
二、文库制备
1、PCR扩增
以步骤一获得的标准品2800M水溶液为模板，以实施例1步骤三制备的引物混合物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系为20μL，由10μL Master Mix(公安部物证鉴定中心产品)、9μL引物混合物和1μL标准品2800M水溶液组成。该反应体系中，引物3、引物4、引物9、引物10、引物17、引物18、引物31、引物32、引物43、引物44、引物49和引物50的浓度为0.05μM，引物1、引物2、引物5、引物6、引物7、引物8、引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16、引物21、引物22、引物25、引物26、引物27、引物28、引物29、引物30、引物33、引物34、引物35、引物36、引物37、引物38、引物39、引物40、引物45、引物46、引物47、引物48、引物51、引物52、引物55、引物56、引物57、引物58、引物59和引物60的浓度为0.1μM；引物19、引物20、引物23、引物24、引物41、引物42、引物53和引物54的浓度为0.2μM。
反应程序：95℃11min；94℃30s，60℃2min，72℃1min，28个循环；60℃60min；4℃保存。
2、纯化和定量
(1)取PCR扩增产物，按照Agencourt AMPure XP 5mL Kit的说明书步骤进行纯化
(2)完成步骤(1)后，将PCR扩增产物采用NanoDrop 2000定量仪进行定量，得到PCR纯化产物。
3、文库制备
取PCR纯化产物，按照TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit的说明书操作步骤依次进行末端修复、末端修复产物纯化、连接A-tail、连接Adapter和连接产物的纯化，然后按照KAPA Library Quantification Kit的说明书步骤进行文库定量及文库标准化，完成文库制备。
三、上样测试
取步骤二制备的文库，使用Miseq FGx二代测序仪进行测序。
实验结果见表3。结果表明，标准品2800M得到了完整的STR分型，完全能够满足法医STR检验的要求。
表3
注：“-”表示不存在；“'”表示等位基因的不同亚型，具体解释如下：STR之前的分型标准是基于序列长度多态性，其等位基因命名即为其核心重复单元的重复数，如基因座D3S4529的STR重复核心为ATCT，其等位基因6意指其STR核心长度为24bp，但是二代测序展现了具有更多细节的序列多态性，即等位基因6的序列可能为ATCTATCTATCTATCTATCTATCT，也可能为ATCTATCTATCTATCTATCTATCC，这时其长度多态的表现仍为24bp，其基因分型仍为6，而在二代测序数据分析中为了展现序列多态性所带来的同一等位基因的不同亚型，在其基因命名后加上“’”以进行区别。
实施例3、基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒的准确性验证
取1ng标准品2800M，按照GlobalFiler PCR Amplification Kit的说明书步骤进行毛细管电泳检测，得到基因座的等位基因基因型。分型结果详见表4第2列。
按照实施例2的步骤检测标准品2800M，得到基因座的等位基因基因型。分型结果详见表4第3列。
结果表明，实施例1制备的基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒与GlobalFiler PCR Amplification Kit重合的基因座，在标准品2800M样本中的分型结果完全一致。
表4
注：“-”表示不存在；“'”表示等位基因的不同亚型，具体解释见表3。
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒及其专用引物组合
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ttgctaacca ccctgtgt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 2
tgcacacttg gacagcat 18
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
aagggtgatt ttcctcttt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 4
gattccaatc atagccaca 19
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 5
acacggcctg gcaactta 18
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 6
tatcgtatcc cattgcg 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggactctga cccatcta 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 8
aacttgggtt gagccata 18
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<212> DNA
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<400> 9
gctcttcctc ttccctaga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 10
gcgtttgtgt gtgcatct 18
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ctctggtgtg tggagatgt 19
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<212> DNA
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tgttcatgcc actgcact 18
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<212> DNA
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caaatgcccc ataggtttt 19
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aaaggaagaa aggaaggaa 19
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<213> 人工序列
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ggcctgttcc tcccttat 18
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<213> 人工序列
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cacagggaac acagactc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 17
tggcacagaa caggcact 18
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<212> DNA
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cttctgtcct tgtcagcg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtgaaagcc ctagtggat 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 20
cataggatgg atggatagat g 21
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ccctgggctc tgtaaagaat a 21
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<212> DNA
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atcagagctt aaactgggaa gc 22
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acgttgggtt tcctgact 18
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agccagaccc tgtctcaaa 19
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<212> DNA
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ctgtgtctcc cacgtgaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 26
tcctatggaa gccatcaga 19
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<212> DNA
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gccaattcct tgtaataact c 21
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<212> DNA
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<400> 28
aataggaggt ggatggat 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 29
acgagttaat gggtgcaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 30
ggcaaatctg gctttacat 19
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<212> DNA
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cacatgcctc tttgttgc 18
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<212> DNA
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ctcattggca aaaggaa 17
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<212> DNA
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tcgaggttac catgaggt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacacacacg cacacaca 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 35
ttgctcaagg gtcaactgt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagaaataga atcactaggg a 21
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<212> DNA
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gtagtgctgg tgcagcgt 18
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gtgacaggaa ggacggaa 18
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<212> DNA
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tgtagcaaac ctgcacat 18
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gcagaaggga aaattga 17
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cagagacacc gaaccaata 19
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cagcctccat atccacat 18
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ggctagattt tccccga 17
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ttacctgtga gtatgtgtgc 20
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aggctctgag gtggacagt 19
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ggaactgtgg ctcatctatg 20
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<212> DNA
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tgacagtgta gctgagaaga aa 22
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aacagatgtg aaaccaaacg 20
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tgtatgagcc acttcccat 19
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<213> 人工序列
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tcatcatgtg agccaatt 18
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<213> 人工序列
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gagatcacgc cacggta 17
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gggaaaatgc tatcctctt 19
Claims (10)
1.引物组合，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16、引物17、引物18、引物19、引物20、引物21和引物22组成；
所述引物1为如下A1)或A2)：
A1)序列表中的序列1所示的单链DNA分子；
A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物2为如下A3)或A4)：
A3)序列表中的序列2所示的单链DNA分子；
A4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物3为如下A5)或A6)：
A5)序列表中的序列3所示的单链DNA分子；
A6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物4为如下A7)或A8)：
A7)序列表中的序列4所示的单链DNA分子；
A8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物5为如下A9)或A10)：
A9)序列表中的序列5所示的单链DNA分子；
A10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物6为如下A11)或A12)：
A11)序列表中的序列6所示的单链DNA分子；
A12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物7为如下A13)或A14)：
A13)序列表中的序列7所示的单链DNA分子；
A14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物8为如下A15)或A16)：
A15)序列表中的序列8所示的单链DNA分子；
A16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物9为如下A17)或A18)：
A17)序列表中的序列9所示的单链DNA分子；
A18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物10为如下A19)或A20)：
A19)序列表中的序列10所示的单链DNA分子；
A20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物11为如下B1)或B2)：
B1)序列表中的序列11所示的单链DNA分子；
B2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物12为如下B3)或B4)：
B3)序列表中的序列12所示的单链DNA分子；
B4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
所述引物13为如下B5)或B6)：
B5)序列表中的序列13所示的单链DNA分子；
B6)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物14为如下B7)或B8)：
B7)序列表中的序列14所示的单链DNA分子；
B8)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物15为如下B9)或B10)：
B9)序列表中的序列15所示的单链DNA分子；
B10)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物16为如下B11)或B12)：
B11)序列表中的序列16所示的单链DNA分子；
B12)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物17为如下B13)或B14)：
B13)序列表中的序列17所示的单链DNA分子；
B14)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物18为如下B15)或B16)：
B15)序列表中的序列18所示的单链DNA分子；
B16)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
所述引物19为如下B17)或B18)：
B17)序列表中的序列19所示的单链DNA分子；
B18)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物20为如下B19)或B20)：
B19)序列表中的序列20所示的单链DNA分子；
B20)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
所述引物21为如下C1)或C2)：
C1)序列表中的序列21所示的单链DNA分子；
C2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物22为如下C3)或C4)：
C3)序列表中的序列22所示的单链DNA分子；
C4)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19、所述引物20、所述引物21和所述引物22的摩尔比为2:2:1:1:2:2:2:2:1:1:2:2:2:2:2:2:1:1:4:4:2:2。
3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括引物23、引物24、引物25、引物26、引物27、引物28、引物29、引物30、引物31、引物32、引物33、引物34、引物35、引物36、引物37、引物38、引物39、引物40、引物41、引物42、引物43、引物44、引物45、引物46、引物47、引物48、引物49、引物50、引物51、引物52、引物53、引物54、引物55、引物56、引物57、引物58、引物59和引物60；
所述引物23为如下C5)或C6)：
C5)序列表中的序列23所示的单链DNA分子；
C6)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物24为如下C7)或C8)：
C7)序列表中的序列24所示的单链DNA分子；
C8)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；
所述引物25为如下C9)或C10)：
C9)序列表中的序列25所示的单链DNA分子；
C10)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；
所述引物26为如下C11)或C12)：
C11)序列表中的序列26所示的单链DNA分子；
C12)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；
所述引物27为如下C13)或C14)：
C13)序列表中的序列27所示的单链DNA分子；
C14)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；
所述引物28为如下C15)或C16)：
C15)序列表中的序列28所示的单链DNA分子；
C16)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子；
所述引物29为如下C17)或C18)：
C17)序列表中的序列29所示的单链DNA分子；
C18)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子；
所述引物30为如下C19)或C20)：
C19)序列表中的序列30所示的单链DNA分子；
C20)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子；
所述引物31为如下D1)或D2)：
D1)序列表中的序列31所示的单链DNA分子；
D2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子；
所述引物32为如下D3)或D4)：
D3)序列表中的序列32所示的单链DNA分子；
D4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子；
所述引物33为如下D5)或D6)：
D5)序列表中的序列33所示的单链DNA分子；
D6)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的DNA分子；
所述引物34为如下D7)或D8)：
D7)序列表中的序列34所示的单链DNA分子；
D8)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的DNA分子；
所述引物35为如下D9)或D10)：
D9)序列表中的序列35所示的单链DNA分子；
D10)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的DNA分子；
所述引物36为如下D11)或D12)：
D11)序列表中的序列36所示的单链DNA分子；
D12)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的DNA分子；
所述引物37为如下D13)或D14)：
D13)序列表中的序列37所示的单链DNA分子；
D14)将序列37经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列37具有相同功能的DNA分子；
所述引物38为如下D15)或D16)：
D15)序列表中的序列38所示的单链DNA分子；
D16)将序列38经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列38具有相同功能的DNA分子；
所述引物39为如下D17)或D18)：
D17)序列表中的序列39所示的单链DNA分子；
D18)将序列39经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列39具有相同功能的DNA分子；
所述引物40为如下D19)或D20)：
D19)序列表中的序列40所示的单链DNA分子；
D20)将序列40经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列40具有相同功能的DNA分子；
所述引物41为如下E1)或E2)：
E1)序列表中的序列41所示的单链DNA分子；
E2)将序列41经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列41具有相同功能的DNA分子；
所述引物42为如下E3)或E4)：
E3)序列表中的序列42所示的单链DNA分子；
E4)将序列42经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列42具有相同功能的DNA分子；
所述引物43为如下E5)或E6)：
E5)序列表中的序列43所示的单链DNA分子；
E6)将序列43经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列43具有相同功能的DNA分子；
所述引物44为如下E7)或E8)：
E7)序列表中的序列44所示的单链DNA分子；
E8)将序列44经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列44具有相同功能的DNA分子；
所述引物45为如下E9)或E10)：
E9)序列表中的序列45所示的单链DNA分子；
E10)将序列45经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列45具有相同功能的DNA分子；
所述引物46为如下E11)或E12)：
E11)序列表中的序列46所示的单链DNA分子；
E12)将序列46经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列46具有相同功能的DNA分子；
所述引物47为如下E13)或E14)：
E13)序列表中的序列47所示的单链DNA分子；
E14)将序列47经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列47具有相同功能的DNA分子；
所述引物48为如下E15)或E16)：
E15)序列表中的序列48所示的单链DNA分子；
E16)将序列48经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列48具有相同功能的DNA分子；
所述引物49为如下E17)或E18)：
E17)序列表中的序列49所示的单链DNA分子；
E18)将序列49经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列49具有相同功能的DNA分子；
所述引物50为如下E19)或E20)：
E19)序列表中的序列50所示的单链DNA分子；
E20)将序列50经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列50具有相同功能的DNA分子；
所述引物51为如下F1)或F2)：
F1)序列表中的序列51所示的单链DNA分子；
F2)将序列51经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列51具有相同功能的DNA分子；
所述引物52为如下F3)或F4)：
F3)序列表中的序列52所示的单链DNA分子；
F4)将序列52经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列52具有相同功能的DNA分子；
所述引物53为如下F5)或F6)：
F5)序列表中的序列53所示的单链DNA分子；
F6)将序列53经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列53具有相同功能的DNA分子；
所述引物54为如下F7)或F8)：
F7)序列表中的序列54所示的单链DNA分子；
F8)将序列54经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列54具有相同功能的DNA分子；
所述引物55为如下F9)或F10)：
F9)序列表中的序列55所示的单链DNA分子；
F10)将序列55经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列55具有相同功能的DNA分子；
所述引物56为如下F11)或F12)：
F11)序列表中的序列56所示的单链DNA分子；
F12)将序列56经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列56具有相同功能的DNA分子；
所述引物57为如下F13)或F14)：
F13)序列表中的序列57所示的单链DNA分子；
F14)将序列57经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列57具有相同功能的DNA分子；
所述引物58为如下F15)或F16)：
F15)序列表中的序列58所示的单链DNA分子；
F16)将序列58经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列58具有相同功能的DNA分子；
所述引物59为如下F17)或F18)：
F17)序列表中的序列59所示的单链DNA分子；
F18)将序列59经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列59具有相同功能的DNA分子；
所述引物60为如下F19)或F20)：
F19)序列表中的序列60所示的单链DNA分子；
F20)将序列60经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列60具有相同功能的DNA分子。
4.如权利要求3所述的引物组合，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19、所述引物20、所述引物21、所述引物22、所述引物23、所述引物24、所述引物25、所述引物26、所述引物27、所述引物28、所述引物29、所述引物30、所述引物31、所述引物32、所述引物33、所述引物34、所述引物35、所述引物36、所述引物37、所述引物38、所述引物39、所述引物40、所述引物41、所述引物42、所述引物43、所述引物44、所述引物45、所述引物46、所述引物47、所述引物48、所述引物49、所述引物50、所述引物51、所述引物52、所述引物53、所述引物54、所述引物55、所述引物56、所述引物57、所述引物58、所述引物59和所述引物60的摩尔比为2:2:1:1:2:2:2:2:1:1:2:2:2:2:2:2:1:1:4:4:2:2:4:4:2:2:2:2:2:2:1:1:2:2:2:2:2:2:2:2:4:4:1:1:2:2:2:2:1:1:2:2:4:4:2:2:2:2:2:2。
5.一种基于STR基因座的复合扩增体系，包括权利要求1至4任一所述引物组合。
6.如权利要求5所述复合扩增体系，其特征在于：所述复合扩增体系还包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
7.含有权利要求1至4任一所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)检测遗传标记。
8.权利要求5或6所述复合扩增体系或权利要求7所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1至4任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
9.权利要求1至4任一所述引物组合，或，权利要求5或6所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)检测遗传标记。
10.权利要求1至4任一所述引物组合，或，权利要求5或6所述复合扩增体系，在检测STR分型和/或SNP分型和/或Indel分型和/或检测遗传标记中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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