CN108624700B - 基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒及其专用引物对组合 - Google Patents

基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒及其专用引物对组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒及其专用引物对组合。本发明提供的引物对组合，由序列表中序列1至序列248所示的248种DNA分子组成。实验证明，采用本发明提供的基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒检测人类基因组DNA的124个微单倍型基因座，分型结果准确。本发明提供的试剂盒具有重要的应用价值。

Description

基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒 及其专用引物对组合
技术领域
本发明涉及法医学技术领域，具体涉及基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒及其专用引物对组合。
背景技术
以法医学和遗传学为基础学科背景的法医DNA技术在刑事案件侦查举证、打击拐卖妇女儿童、灾害遇难者及失踪人员身份认定、民事亲权关系鉴定等领域具有广泛应用。基于毛细管电泳平台进行STR分型是当今法庭科学领域个体识别的金标准。经过近三十年的积累，法医DNA学界已经可以很好的解决血液、唾液、精液、骨骼、肌肉等常规生物检材的DNA检验问题，但两人或多人混合DNA检验分型仍然是法医物证领域公认的技术难题之一。PCR扩增是STR检验的必要实验环节之一，然而由于STR是重复序列，在扩增过程中会由于复制滑脱伴随出现影子峰(stutter peak)。影子峰是重复序列复制的固有现象，没有办法去除。实际工作中发现，影子峰主要出现在比目的等位基因减少一个重复单元的位置，峰高或峰面积占目的等位基因的比例不等(通常在3％-15％)，但在比目的等位基因增加一个重复单元和减少两个重复单元的位置也可能出现。影子峰的存在，对单一样本的正确分型不会产生严重的影响，但对于混合样本分型的干扰非常严重。特别是在极端混合比例DNA样本中，微量成分的目的峰与主要成分的影子峰非常相似，雌雄莫辨，严重干扰混合分型拆分。因此，有必要考虑使用其它遗传标记辅助解决混合DNA样本的检验问题。
2010年，葛建业等人提出单倍型域(haplotype block)概念，单倍型域指包含一系列相邻、紧密连锁且共同遗传的SNP，若将多个SNP整合为一个遗传标记，将会显著提高SNP遗传标记的鉴别能力。2013年，美国耶鲁大学Kenneth Kidd教授的研究团队首次将微单倍型(microhaplotype)遗传标记引入法庭科学领域，其定义是在200bp范围内2-5个SNP的组合。SNP遗传标记不存在影子峰现象，在精准医疗、种族地域推断、表型特征刻画等领域应用广泛，但由于其是二等位基因遗传标记，在混合DNA分型中作用有限。微单倍型兼具STR和SNP遗传标记的优势。微单倍型为多等位基因遗传标记，且不存在影子峰干扰，在混合DNA检验领域具有巨大潜力，而且，比STR突变率更低，扩增子更短，适于法医遗传学应用。
微单倍型和SNP均属于序列多态性遗传标记。虽然SNP遗传标记可通过长度差异PCR引物或SNaPshot分型方法转化为长度多态性，进而利用毛细管电泳平台检测，但包含多个SNP的微单倍型遗传标记却很难转化为长度多态性，所以法医DNA常用的毛细管电泳方法并不适用于微单倍型遗传标记检测。一种可行的办法是首先检测实验样本的SNP位点，再通过Phase软件处理数据获得相应群体中微单倍型基因座的基因型以及等位基因频率等参数。以上方法属于间接的微单倍型分型方法，并不能直接获得微单倍型分型，在一定程度上减缓了研究的进程。
二代测序，也称下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)或大规模并行测序(Massively Parallel Sequencing，MPS)，在科研和临床诊断领域已得到广泛应用。相比传统的DNA测序方法，二代测序技术具有高通量、高速度、集成化、低成本等显著优势，在法医遗传学领域也具有重要应用前景。测序技术是序列多态性遗传标记最好的检测手段。微单倍型是SNP的线性组合，其本质仍然是SNP，二代测序技术能够一次性获得复合体系中SNP位点的全部基因分型，也同时获得全部微单倍型遗传标记的准确分型，学者普遍认为二代测序将会是微单倍型检测的金标准。目前已有研究团队采用二代测序平台对微单倍型进行研究，为微单倍型遗传多态性提供了初步数据，对微单倍型遗传标记应用于个体识别、亲权鉴定及种族推断的可行性进行评估。
美国Thermo Fisher公司正在测试评估包含微单倍型的二代测序试剂盒，即EarlyEvaluation Precision ID
Figure BDA0001642382380000021
Mixture ID Panel，但其中只包含了36个微单倍型基因座，且该试剂盒配套的数据分析程序只能针对试剂盒中固有基因座的测序数据进行分析，具有一定的局限性。鉴于微单倍型的特殊性及毛细管电泳技术的局限性，开发基于二代测序技术的检测微单倍型基因座的试剂盒具有重要价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供检测更多微单倍型基因座的试剂盒，从而对多人的混合DNA进行分型，有助于进行个体识别、亲权鉴定和种族推断。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物对组合，可包括用于扩增微单倍型基因座mh01KK-117的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-205的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-211的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-134的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-170的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-033的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-153的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-180的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-191的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-046的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-202的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-213的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-217的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-218的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-223的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-225的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-066的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-049的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-255的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-302的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh18KK-293的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-299的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh20KK-058的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh20KK-307的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh21KK-315的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh21KK-316的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh21KK-320的引物对和用于扩增微单倍型基因座mh21KK-324的引物对；每个引物对可由位于相应微单倍型基因座两侧的一对引物组成。
上述引物对组合中，所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-117的引物对可由序列表中序列9所示的引物9和序列表中序列10所示的引物10组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-205的引物对可由序列表中序列11所示的引物11和序列表中序列12所示的引物12组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-211的引物对可由序列表中序列15所示的引物15和序列表中序列16所示的引物16组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-134的引物对可由序列表中序列25所示的引物25和序列表中序列26所示的引物26组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-170的引物对可由序列表中序列77所示的引物77和序列表中序列78所示的引物78组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-033的引物对可由序列表中序列97所示的引物97和序列表中序列98所示的引物98组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-153的引物对可由序列表中序列105所示的引物105和序列表中序列106所示的引物106组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-180的引物对可由序列表中序列141所示的引物141和序列表中序列142所示的引物142组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-191的引物对可由序列表中序列145所示的引物145和序列表中序列146所示的引物146组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-046的引物对可由序列表中序列151所示的引物151和序列表中序列152所示的引物152组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-202的引物对可由序列表中序列157所示的引物157和序列表中序列158所示的引物158组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-213的引物对可由序列表中序列161所示的引物161和序列表中序列162所示的引物162组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-217的引物对可由序列表中序列163所示的引物163和序列表中序列164所示的引物164组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-218的引物对可由序列表中序列165所示的引物165和序列表中序列166所示的引物166组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-223的引物对可由序列表中序列167所示的引物167和序列表中序列168所示的引物168组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-225的引物对可由序列表中序列169所示的引物169和序列表中序列170所示的引物170组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-066的引物对可由序列表中序列179所示的引物179和序列表中序列180所示的引物180组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-049的引物对可由序列表中序列187所示的引物187和序列表中序列188所示的引物188组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-255的引物对可由序列表中序列191所示的引物191和序列表中序列192所示的引物192组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-302的引物对可由序列表中序列193所示的引物193和序列表中序列194所示的引物194组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh18KK-293的引物对可由序列表中序列215所示的引物215和序列表中序列216所示的引物216组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-299的引物对可由序列表中序列221所示的引物221和序列表中序列222所示的引物222组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh20KK-058的引物对可由序列表中序列225所示的引物225和序列表中序列226所示的引物226组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh20KK-307的引物对可由序列表中序列229所示的引物229和序列表中序列230所示的引物230组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-315的引物对可由序列表中序列231所示的引物231和序列表中序列232所示的引物232组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-316的引物对可由序列表中序列233所示的引物233和序列表中序列234所示的引物234组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-320的引物对可由序列表中序列235所示的引物235和序列表中序列236所示的引物236组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-324的引物对可由序列表中序列237所示的引物237和序列表中序列238所示的引物238组成。
所述所述引物对组合中，所述引物9、所述引物10、所述引物11、所述引物12、所述引物15、所述引物16、所述引物25、所述引物26、所述引物77、所述引物78、所述引物97、所述引物98、所述引物105、所述引物106、所述引物141、所述引物142、所述引物145、所述引物146、所述引物151、所述引物152、所述引物157、所述引物158、所述引物161、所述引物162、所述引物163、所述引物164、所述引物165、所述引物166、所述引物167、所述引物168、所述引物169、所述引物170、所述引物179、所述引物180、所述引物187、所述引物188、所述引物191、所述引物192、所述引物193、所述引物194、所述引物215、所述引物216、所述引物221、所述引物222、所述引物225、所述引物226、所述引物229、所述引物230、所述引物231、所述引物232、所述引物233、所述引物234、所述引物235、所述引物236、所述引物237和所述引物238的摩尔比具体可为2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：4：4：2：2：4：4：4：4：2：2：4：4：4：4：4：4：4：4：10：10：4：4：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2。
所述引物对组合还可包括用于扩增微单倍型基因座mh01KK-002的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-070的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-072的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-106的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-210的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-003的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-005的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-073的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-102的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-136的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-201的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-202的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-213的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-006的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-007的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-008的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-009的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-150的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-010的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-011的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-013的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-015的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-016的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-017的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-019的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-021的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-028的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-029的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-074的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-022的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-023的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-062的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-078的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-079的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-025的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-026的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-080的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-101的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-030的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-031的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-081的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-082的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh08KK-032的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-034的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-035的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-152的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-157的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-083的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-084的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-085的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-086的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-087的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-088的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-101的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-036的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-037的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-038的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-039的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-040的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-041的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-089的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-090的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-091的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-187的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-043的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-045的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-092的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-093的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-047的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-226的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh14KK-048的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh14KK-068的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh14KK-101的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-067的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-095的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-104的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-096的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-052的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-053的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-054的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-055的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-076的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-077的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-105的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-110的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-272的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh18KK-285的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-056的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-057的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-301的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh20KK-059的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-060的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-061的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-064的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-069的引物对和用于扩增微单倍型基因座mh22KK-303的引物对；每个引物对由位于相应微单倍型基因座两侧的一对引物组成。
所述引物对组合中，所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-002的引物对可由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-070的引物对可由序列表中序列3所示的引物3和序列表中序列4所示的引物4组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-072的引物对可由序列表中序列5所示的引物5和序列表中序列6所示的引物6组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-106的引物对可由序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-210的引物对可由序列表中序列13所示的引物13和序列表中序列14所示的引物14组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-003的引物对可由序列表中序列17所示的引物17和序列表中序列18所示的引物18组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-005的引物对可由序列表中序列19所示的引物19和序列表中序列20所示的引物20组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-073的引物对可由序列表中序列21所示的引物21和序列表中序列22所示的引物22组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-102的引物对可由序列表中序列23所示的引物23和序列表中序列24所示的引物24组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-136的引物对可由序列表中序列27所示的引物27和序列表中序列28所示的引物28组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-201的引物对可由序列表中序列29所示的引物29和序列表中序列30所示的引物30组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-202的引物对可由序列表中序列31所示的引物31和序列表中序列32所示的引物32组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-213的引物对可由序列表中序列33所示的引物33和序列表中序列34所示的引物34组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-006的引物对可由序列表中序列35所示的引物35和序列表中序列36所示的引物36组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-007的引物对可由序列表中序列37所示的引物37和序列表中序列38所示的引物38组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-008的引物对可由序列表中序列39所示的引物39和序列表中序列40所示的引物40组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-009的引物对可由序列表中序列41所示的引物41和序列表中序列42所示的引物42组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-150的引物对可由序列表中序列43所示的引物43和序列表中序列44所示的引物44组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-010的引物对可由序列表中序列45所示的引物45和序列表中序列46所示的引物46组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-011的引物对可由序列表中序列47所示的引物47和序列表中序列48所示的引物48组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-013的引物对可由序列表中序列49所示的引物49和序列表中序列50所示的引物50组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-015的引物对可由序列表中序列51所示的引物51和序列表中序列52所示的引物52组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-016的引物对可由序列表中序列53所示的引物53和序列表中序列54所示的引物54组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-017的引物对可由序列表中序列55所示的引物55和序列表中序列56所示的引物56组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-019的引物对可由序列表中序列57所示的引物57和序列表中序列58所示的引物58组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-021的引物对可由序列表中序列59所示的引物59和序列表中序列60所示的引物60组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-028的引物对可由序列表中序列61所示的引物61和序列表中序列62所示的引物62组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-029的引物对可由序列表中序列63所示的引物63和序列表中序列64所示的引物64组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-074的引物对可由序列表中序列65所示的引物65和序列表中序列66所示的引物66组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-022的引物对可由序列表中序列67所示的引物67和序列表中序列68所示的引物68组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-023的引物对可由序列表中序列69所示的引物69和序列表中序列70所示的引物70组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-062的引物对可由序列表中序列71所示的引物71和序列表中序列72所示的引物72组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-078的引物对可由序列表中序列73所示的引物73和序列表中序列74所示的引物74组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-079的引物对可由序列表中序列75所示的引物75和序列表中序列76所示的引物76组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-025的引物对可由序列表中序列79所示的引物79和序列表中序列80所示的引物80组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-026的引物对可由序列表中序列81所示的引物81和序列表中序列82所示的引物82组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-080的引物对可由序列表中序列83所示的引物83和序列表中序列84所示的引物84组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-101的引物对可由序列表中序列85所示的引物85和序列表中序列86所示的引物86组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-030的引物对可由序列表中序列87所示的引物87和序列表中序列88所示的引物88组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-031的引物对可由序列表中序列89所示的引物89和序列表中序列90所示的引物90组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-081的引物对可由序列表中序列91所示的引物91和序列表中序列92所示的引物92组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-082的引物对可由序列表中序列93所示的引物93和序列表中序列94所示的引物94组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh08KK-032的引物对可由序列表中序列95所示的引物95和序列表中序列96所示的引物96组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-034的引物对可由序列表中序列99所示的引物99和序列表中序列100所示的引物100组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-035的引物对可由序列表中序列101所示的引物101和序列表中序列102所示的引物102组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-152的引物对可由序列表中序列103所示的引物103和序列表中序列104所示的引物104组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-157的引物对可由序列表中序列107所示的引物107和序列表中序列108所示的引物108组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-083的引物对可由序列表中序列109所示的引物109和序列表中序列110所示的引物110组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-084的引物对可由序列表中序列111所示的引物111和序列表中序列112所示的引物112组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-085的引物对可由序列表中序列113所示的引物113和序列表中序列114所示的引物114组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-086的引物对可由序列表中序列115所示的引物115和序列表中序列116所示的引物116组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-087的引物对可由序列表中序列117所示的引物117和序列表中序列118所示的引物118组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-088的引物对可由序列表中序列119所示的引物119和序列表中序列120所示的引物120组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-101的引物对可由序列表中序列121所示的引物121和序列表中序列122所示的引物122组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-036的引物对可由序列表中序列123所示的引物123和序列表中序列124所示的引物124组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-037的引物对可由序列表中序列125所示的引物125和序列表中序列126所示的引物126组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-038的引物对可由序列表中序列127所示的引物127和序列表中序列128所示的引物128组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-039的引物对可由序列表中序列129所示的引物129和序列表中序列130所示的引物130组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-040的引物对可由序列表中序列131所示的引物131和序列表中序列132所示的引物132组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-041的引物对可由序列表中序列133所示的引物133和序列表中序列134所示的引物134组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-089的引物对可由序列表中序列135所示的引物135和序列表中序列136所示的引物136组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-090的引物对可由序列表中序列137所示的引物137和序列表中序列138所示的引物138组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-091的引物对可由序列表中序列139所示的引物139和序列表中序列140所示的引物140组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-187的引物对可由序列表中序列143所示的引物143和序列表中序列144所示的引物144组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-043的引物对可由序列表中序列147所示的引物147和序列表中序列148所示的引物148组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-045的引物对可由序列表中序列149所示的引物149和序列表中序列150所示的引物150组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-092的引物对可由序列表中序列153所示的引物153和序列表中序列154所示的引物154组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-093的引物对可由序列表中序列155所示的引物155和序列表中序列156所示的引物156组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-047的引物对可由序列表中序列159所示的引物159和序列表中序列160所示的引物160组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-226的引物对可由序列表中序列171所示的引物171和序列表中序列172所示的引物172组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh14KK-048的引物对可由序列表中序列173所示的引物173和序列表中序列174所示的引物174组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh14KK-068的引物对可由序列表中序列175所示的引物175和序列表中序列176所示的引物176组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh14KK-101的引物对可由序列表中序列177所示的引物177和序列表中序列178所示的引物178组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-067的引物对可由序列表中序列181所示的引物181和序列表中序列182所示的引物182组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-095的引物对可由序列表中序列183所示的引物183和序列表中序列184所示的引物184组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-104的引物对可由序列表中序列185所示的引物185和序列表中序列186所示的引物186组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-096的引物对可由序列表中序列189所示的引物189和序列表中序列190所示的引物190组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-052的引物对可由序列表中序列195所示的引物195和序列表中序列196所示的引物196组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-053的引物对可由序列表中序列197所示的引物197和序列表中序列198所示的引物198组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-054的引物对可由序列表中序列199所示的引物199和序列表中序列200所示的引物200组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-055的引物对可由序列表中序列201所示的引物201和序列表中序列202所示的引物202组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-076的引物对可由序列表中序列203所示的引物203和序列表中序列204所示的引物204组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-077的引物对可由序列表中序列205所示的引物205和序列表中序列206所示的引物206组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-105的引物对可由序列表中序列207所示的引物207和序列表中序列208所示的引物208组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-110的引物对可由序列表中序列209所示的引物209和序列表中序列210所示的引物210组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-272的引物对可由序列表中序列211所示的引物211和序列表中序列212所示的引物212组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh18KK-285的引物对可由序列表中序列213所示的引物213和序列表中序列214所示的引物214组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-056的引物对可由序列表中序列217所示的引物217和序列表中序列218所示的引物218组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-057的引物对可由序列表中序列219所示的引物219和序列表中序列220所示的引物220组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-301的引物对可由序列表中序列223所示的引物223和序列表中序列224所示的引物224组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh20KK-059的引物对可由序列表中序列227所示的引物227和序列表中序列228所示的引物228组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-060的引物对可由序列表中序列239所示的引物239和序列表中序列240所示的引物240组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-061的引物对可由序列表中序列241所示的引物241和序列表中序列242所示的引物242组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-064的引物对可由序列表中序列243所示的引物243和序列表中序列244所示的引物244组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-069的引物对可由序列表中序列245所示的引物245和序列表中序列246所示的引物246组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-303的引物对可由序列表中序列247所示的引物247和序列表中序列248所示的引物248组成。
所述引物对组合中，所述引物1至所述引物248的摩尔比具体可为10：10：2：2：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：4：4：2：2：6：6：2：2：4：4：6：6：4：4：2：2：2：2：6：6：10：10：2：2：10：10：2：2：2：2：2：2：2：2：6：6：2：2：10：10：2：2：2：2：1：1：4：4：2：2：2：2：4：4：2：2：4：4：2：2：10：10：2：2：10：10：2：2：10：10：2：2：2：2：4：4：6：6：2：2：6：6：2：2：4：4：2：2：2：2：2：2：1：1：2：2：4：4：6：6：4：4：1：1：4：4：4：4：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2：1：1：10：10：4：4：2：2：2：2：6：6：2：2：4：4：10：10：2：2：4：4：10：10：2：2：4：4：4：4：4：4：4：4：4：4：6：6：2：2：28：28：10：10：2：2：2：2：4：4：4：4：2：2：4：4：2：2：10：10：1：1：2：2：10：10：1：1：2：2：10：10：2：2：10：10：4：4：2：2：4：4：2：2：2：2：4：4：2：2：2：2：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2：4：4：1：1：2：2：2：2：1：1。
上述任一所述引物对组合具体可由引物9、引物10、引物11、引物12、引物15、引物16、引物25、引物26、引物77、引物78、引物97、引物98、引物105、引物106、引物141、引物142、引物145、引物146、引物151、引物152、引物157、引物158、引物161、引物162、引物163、引物164、引物165、引物166、引物167、引物168、引物169、引物170、引物179、引物180、引物187、引物188、引物191、引物192、引物193、引物194、引物215、引物216、引物221、引物222、引物225、引物226、引物229、引物230、引物231、引物232、引物233、引物234、引物235、引物236、引物237和引物238组成。该引物对组合用于检测28个微单倍型基因座。
上述任一所述引物对组合具体可由引物1至引物248组成。该引物对组合用于检测124个微单倍型基因座。
本发明还保护一种检测28个微单倍型基因座的复合扩增体系，包括所述引物对组合。
本发明还保护一种检测124个微单倍型基因座的复合扩增体系，包括所述引物对组合。
引物63、引物64、引物111、引物112、引物121、引物122、引物137、引物138、引物197、引物198、引物203、引物204、引物241、引物242、引物247和引物248在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.02μM。
引物3、引物4、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16、引物17、引物18、引物21、引物22、引物25、引物26、引物33、引物34、引物35、引物36、引物41、引物42、引物45、引物46、引物47、引物48、引物49、引物50、引物51、引物52、引物55、引物56、引物59、引物60、引物61、引物62、引物67、引物68、引物69、引物70、引物73、引物74、引物77、引物78、引物81、引物82、引物85、引物86、引物89、引物90、引物91、引物92、引物97、引物98、引物101、引物102、引物105、引物106、引物107、引物108、引物109、引物110、引物113、引物114、引物129、引物130、引物131、引物132、引物133、引物134、引物135、引物136、引物143、引物144、引物145、引物146、引物149、引物150、引物155、引物156、引物161、引物162、引物175、引物176、引物181、引物182、引物183、引物184、引物189、引物190、引物193、引物194、引物199、引物200、引物205、引物206、引物209、引物210、引物215、引物216、引物219、引物220、引物221、引物222、引物225、引物226、引物227、引物228、引物231、引物232、引物233、引物234、引物235、引物236、引物237、引物238、引物243、引物244、引物245和引物246在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.04μM。
引物5、引物6、引物19、引物20、引物27、引物28、引物31、引物32、引物65、引物66、引物71、引物72、引物75、引物76、引物93、引物94、引物103、引物104、引物115、引物116、引物119、引物120、引物123、引物124、引物125、引物126、引物127、引物128、引物141、引物142、引物151、引物152、引物157、引物158、引物163、引物164、引物165、引物166、引物167、引物168、引物169、引物170、引物171、引物172、引物185、引物186、引物187、引物188、引物191、引物192、引物213、引物214、引物217、引物218、引物223、引物224、引物229、引物230、引物239和引物240在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.08μM。
引物23、引物24、引物29、引物30、引物37、引物38、引物53、引物54、引物95、引物96、引物99、引物100、引物117、引物118、引物147、引物148、引物173和引物174在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.12μM。
引物1、引物2、引物39、引物40、引物43、引物44、引物57、引物58、引物79、引物80、引物83、引物84、引物87、引物88、引物139、引物140、引物153、引物154、引物159、引物160、引物179、引物180、引物195、引物196、引物201、引物202、引物207、引物208、引物211和引物212在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.2μM。
引物177和引物178在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.56μM。
所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
上述任一所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物对组合和进行PCR扩增反应所需的试剂组成。
上述任一所述复合扩增体系可包括Master Mix、引物对组合的水溶液和人类基因组DNA(作为模板)。
上述任一所述复合扩增体系可为20μL，包括10μL Master Mix、4μL引物对组合的水溶液和1ng人类基因组DNA(作为模板)。
上述任一所述复合扩增体系可为20μL，具体可由10μL Master Mix、4μL引物对组合的水溶液、5μL“浓度为0.2ng/μL的女性口腔上皮细胞的基因组DNA水溶液”或“浓度为0.2ng/μL的男性血卡样本的基因组DNA水溶液”和1μL ddH2O组成。
上述任一所述Master Mix具体可为公安部物证鉴定中心产品。
本发明还保护含有上述任一所述引物对组合、或、上述任一所述复合扩增体系的试剂盒；所述试剂盒的用途可为(h1)至(h11)中的任一种：(h1)微单倍型分型；(h2)SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)DNA分型；(h5)混合DNA分型；(h6)单一DNA分型；(h7)检测遗传标记；(h8)检测微单倍型遗传标记；(h9)个体识别；(h10)亲权鉴定；(h11)种族推断。
本发明还保护上述任一所述复合扩增体系或所述试剂盒的制备方法；该制备方法可包括将上述任一所述引物对组合中的各条引物单独包装的步骤。
X1)或X2)也属于本发明的保护范围：
X1)上述任一所述引物对组合，或，上述任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为(h1)至(h11)中的任一种：(h1)微单倍型分型；(h2)SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)DNA分型；(h5)混合DNA分型；(h6)单一DNA分型；(h7)检测遗传标记；(h8)检测微单倍型遗传标记；(h9)个体识别；(h10)亲权鉴定；(h11)种族推断；
X2)上述任一所述引物对组合，或，上述任一所述复合扩增体系的应用，可为(h1)至(h11)中的任一种：(h1)微单倍型分型；(h2)SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)DNA分型；(h5)混合DNA分型；(h6)单一DNA分型；(h7)检测遗传标记；(h8)检测微单倍型遗传标记；(h9)个体识别；(h10)亲权鉴定；(h11)种族推断。
本发明还保护一种微单倍型分型方法，可包括如下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物对组合或上述任一所述复合扩增体系进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(2)完成步骤(1)后，将所述PCR扩增产物进行二代测序，得到待测样本的基因组DNA的微单倍型基因座的基因型，进而获得待测样本的微单倍型分型结果。
上述方法中，所述微单倍型基因座为28个微单倍型基因座或124个微单倍型基因座。
上述方法中，所述待测样本的基因组DNA可为从人类组织中提取的基因组DNA或检材中提取的DNA。所述组织可为血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液或含有胎儿细胞的羊水。所述组织具体可为口腔上皮细胞。
上述任一所述28个微单倍型基因座可为mh01KK-117、mh01KK-205、mh01KK-211、mh02KK-134、mh05KK-170、mh09KK-033、mh09KK-153、mh11KK-180、mh11KK-191、mh12KK-046、mh12KK-202、mh13KK-213、mh13KK-217、mh13KK-218、mh13KK-223、mh13KK-225、mh15KK-066、mh16KK-049、mh16KK-255、mh16KK-302、mh18KK-293、mh19KK-299、mh20KK-058、mh20KK-307、mh21KK-315、mh21KK-316、mh21KK-320和mh21KK-324。
上述任一所述124个微单倍型基因座可为mh01KK-002、mh01KK-070、mh01KK-072、mh01KK-106、mh01KK-117、mh01KK-205、mh01KK-210、mh01KK-211、mh02KK-003、mh02KK-005、mh02KK-073、mh02KK-102、mh02KK-134、mh02KK-136、mh02KK-201、mh02KK-202、mh02KK-213、mh03KK-006、mh03KK-007、mh03KK-008、mh03KK-009、mh03KK-150、mh04KK-010、mh04KK-011、mh04KK-013、mh04KK-015、mh04KK-016、mh04KK-017、mh04KK-019、mh04KK-021、mh04KK-028、mh04KK-029、mh04KK-074、mh05KK-022、mh05KK-023、mh05KK-062、mh05KK-078、mh05KK-079、mh05KK-170、mh06KK-025、mh06KK-026、mh06KK-080、mh06KK-101、mh07KK-030、mh07KK-031、mh07KK-081、mh07KK-082、mh08KK-032、mh09KK-033、mh09KK-034、mh09KK-035、mh09KK-152、mh09KK-153、mh09KK-157、mh10KK-083、mh10KK-084、mh10KK-085、mh10KK-086、mh10KK-087、mh10KK-088、mh10KK-101、mh11KK-036、mh11KK-037、mh11KK-038、mh11KK-039、mh11KK-040、mh11KK-041、mh11KK-089、mh11KK-090、mh11KK-091、mh11KK-180、mh11KK-187、mh11KK-191、mh12KK-043、mh12KK-045、mh12KK-046、mh12KK-092、mh12KK-093、mh12KK-202、mh13KK-047、mh13KK-213、mh13KK-217、mh13KK-218、mh13KK-223、mh13KK-225、mh13KK-226、mh14KK-048、mh14KK-068、mh14KK-101、mh15KK-066、mh15KK-067、mh15KK-095、mh15KK-104、mh16KK-049、mh16KK-096、mh16KK-255、mh16KK-302、mh17KK-052、mh17KK-053、mh17KK-054、mh17KK-055、mh17KK-076、mh17KK-077、mh17KK-105、mh17KK-110、mh17KK-272、mh18KK-285、mh18KK-293、mh19KK-056、mh19KK-057、mh19KK-299、mh19KK-301、mh20KK-058、mh20KK-059、mh20KK-307、mh21KK-315、mh21KK-316、mh21KK-320、mh21KK-324、mh22KK-060、mh22KK-061、mh22KK-064、mh22KK-069和mh22KK-303。
相比于美国Thermo Fisher公司的Early Evaluation Precision ID
Figure BDA0001642382380000111
MixtureID Panel，本发明提供的基于二代测序技术检测微单倍型基因座的试剂盒包含124个微单倍型基因座提供更多新的遗传信息。实验证明，采用本发明提供的基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒检测女性口腔上皮细胞的基因组DNA和男性血卡样本的基因组DNA的124个微单倍型基因座，分型结果准确。本发明提供的试剂盒具有重要的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Figure BDA0001642382380000122
M48DNA Manual Kit(200)为QIAGEN公司的产品，产品目录号为1064605。QubitTM dsDNA HS Assay Kit，500assays为Thermo Fisher Scientific公司的产品，产品目录号为Q32584。
Figure BDA0001642382380000123
PCR Purification Kit(250)为QIAGEN公司的产品，产品目录号为28006。NanoDrop 2000定量仪为Thermo Fisher Scientific公司的产品。Miseq FGx二代测序仪为Illumina公司的产品。TruSeq DNA PCR-Free HT Library PrepKit为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-3003。KAPA Library QuantificationKit为KAPA公司的产品，产品目录号为KK4824。Miseq Reagent Nano Kit v2为Illumina公司的产品，产品目录号为MS-103-1001。
hg19人类基因组的信息见网址：
http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/hg19.2bit。
实施例1、基于二代测序技术的检测微单倍型基因座的试剂盒的制备
一、引物对组合的制备
引物对组合由248条引物组成，用于检测124个微单倍型基因座。各个微单倍型基因座的名称、扩增微单倍型基因座对应的引物名称、引物的核苷酸序列和等位基因基因型等信息详见表1。各个微单倍型基因座对应的引物在hg19人类参考基因组中的PCR扩增产物的长度和核苷酸序列详见表2。
表1
Figure BDA0001642382380000121
Figure BDA0001642382380000131
Figure BDA0001642382380000141
Figure BDA0001642382380000151
表2
Figure BDA0001642382380000152
Figure BDA0001642382380000161
Figure BDA0001642382380000171
Figure BDA0001642382380000181
Figure BDA0001642382380000191
Figure BDA0001642382380000201
二、基于二代测序技术的检测微单倍型基因座的试剂盒的制备
基于二代测序技术的检测微单倍型基因座的试剂盒包括引物混合物。引物混合物由步骤一制备的248条引物混合而成。
实施例2、基于二代测序技术检测微单倍型基因座的试剂盒的应用
一、DNA样本准备
按照
Figure BDA0001642382380000202
M48 DNA Manual Kit(200)的说明书操作步骤提取一女性口腔上皮细胞样本的基因组DNA。取1μL DNA模板，利用QubitTM dsDNA HS Assay Kit，500assays进行样本DNA定量，然后用超纯水稀释，获得浓度为0.2ng/μL的女性口腔上皮细胞的基因组DNA水溶液，简称女性的基因组DNA溶液。
按照
Figure BDA0001642382380000203
M48 DNA Manual Kit(200)的说明书操作步骤提取一男性血卡样本的基因组DNA。取1μL DNA模板，利用QubitTM dsDNA HS Assay Kit，500 assays进行样本DNA定量，然后用超纯水稀释，获得浓度为0.2ng/μL的男性血卡的基因组DNA水溶液，简称男性的基因组DNA溶液。
二、文库制备
1、PCR扩增
分别以步骤一获得的女性的基因组DNA溶液或男性的基因组DNA溶液为模板，以实施例1步骤二制备的引物混合物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系为20μL，由10μL Master Mix(公安部物证鉴定中心的产品)、4μL引物混合物、5μL女性的基因组DNA溶液或男性的基因组DNA溶液和1μL ddH2O组成。该反应体系中，引物63、引物64、引物111、引物112、引物121、引物122、引物137、引物138、引物197、引物198、引物203、引物204、引物241、引物242、引物247和引物248的浓度均为0.02μM，引物3、引物4、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16、引物17、引物18、引物21、引物22、引物25、引物26、引物33、引物34、引物35、引物36、引物41、引物42、引物45、引物46、引物47、引物48、引物49、引物50、引物51、引物52、引物55、引物56、引物59、引物60、引物61、引物62、引物67、引物68、引物69、引物70、引物73、引物74、引物77、引物78、引物81、引物82、引物85、引物86、引物89、引物90、引物91、引物92、引物97、引物98、引物101、引物102、引物105、引物106、引物107、引物108、引物109、引物110、引物113、引物114、引物129、引物130、引物131、引物132、引物133、引物134、引物135、引物136、引物143、引物144、引物145、引物146、引物149、引物150、引物155、引物156、引物161、引物162、引物175、引物176、引物181、引物182、引物183、引物184、引物189、引物190、引物193、引物194、引物199、引物200、引物205、引物206、引物209、引物210、引物215、引物216、引物219、引物220、引物221、引物222、引物225、引物226、引物227、引物228、引物231、引物232、引物233、引物234、引物235、引物236、引物237、引物238、引物243、引物244、引物245和引物246的浓度均为0.04μM，引物5、引物6、引物19、引物20、引物27、引物28、引物31、引物32、引物65、引物66、引物71、引物72、引物75、引物76、引物93、引物94、引物103、引物104、引物115、引物116、引物119、引物120、引物123、引物124、引物125、引物126、引物127、引物128、引物141、引物142、引物151、引物152、引物157、引物158、引物163、引物164、引物165、引物166、引物167、引物168、引物169、引物170、引物171、引物172、引物185、引物186、引物187、引物188、引物191、引物192、引物213、引物214、引物217、引物218、引物223、引物224、引物229、引物230、引物239和引物240的浓度均为0.08μM，引物23、引物24、引物29、引物30、引物37、引物38、引物53、引物54、引物95、引物96、引物99、引物100、引物117、引物118、引物147、引物148、引物173和引物174的浓度均为0.12μM，引物1、引物2、引物39、引物40、引物43、引物44、引物57、引物58、引物79、引物80、引物83、引物84、引物87、引物88、引物139、引物140、引物153、引物154、引物159、引物160、引物179、引物180、引物195、引物196、引物201、引物202、引物207、引物208、引物211和引物212的浓度均为0.2μM，引物177和引物178的浓度均为0.56μM。
反应程序：95℃11min；94℃30s，60℃2min，72℃1min，28个循环；60℃60min；4℃保存。
2、纯化和定量
(1)取PCR扩增产物，按照
Figure BDA0001642382380000211
PCR Purification Kit(250)的说明书步骤进行纯化。
(2)完成步骤(1)后，将PCR扩增产物采用NanoDrop 2000定量仪进行定量，得到PCR纯化产物。
3、文库制备
取PCR纯化产物，按照TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit的说明书操作步骤依次进行末端修复、末端修复产物纯化、连接A-tail、连接Adapter和连接产物的纯化，然后按照KAPA Library Quantification Kit的说明书步骤进行文库定量及文库标准化，完成文库制备。
三、上样测试
取步骤二制备的文库，利用测序试剂Miseq Reagent Nano Kit v2在Miseq FGx二代测序仪进行测序。
四、数据分析
BWA(Burrows-Wheeler Alignment Tool)序列比对工具的信息见网址：
https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/。
1、比对
使用BWA序列比对工具将步骤三得到的测序序列比对到参考序列(hg19人类基因组)，得到比对结果。
2、获得扩增子序列
根据比对结果(.bam格式)中测序序列在参考序列的位置，筛选出目标序列，即扩增子序列。
3、获得扩增子的单倍型
步骤2获得的各个扩增子序列都存在若干多态性位点SNP，根据比对结果，判断每个扩增子序列的SNP位点是否突变，进而获得每个扩增子的单倍型。
4、质控
如果SNP位点出现在双端测序的重叠区域且不一致，将被视为低质量序列过滤掉。如果SNP位点没有被单端测序或者双端测序覆盖到，将被标示为“N”。
5、确定扩增子的单倍型丰度
每个扩增子序列都有其单倍型，将所有属于同一个扩增子的序列，根据其序列数量，确定每个扩增子的单倍型丰度。
6、统计
将每个扩增子的单倍型丰度统计到一个文本文件中(.txt格式)，其中，单倍型丰度为0表示无扩增结果，单倍型丰度低于10或者在杂合子分型中或者单倍型丰度低于最大丰度的1％均认为是测序错误,不出现在分型统计的txt文件中。
女性口腔上皮细胞样本的基因组DNA的实验结果见表3。男性血卡样本的基因组DNA的实验结果见表4。结果表明，该女性口腔上皮细胞样本的基因组DNA和该男性血卡样本的基因组DNA均得到了完整的微单倍型分型，完全能够满足法医物证检验的要求。
表3
Figure BDA0001642382380000221
Figure BDA0001642382380000231
注：-T表示插入/缺失位点Indel与SNP位点T构成微单倍型分型，-C表示插入/缺失位点Indel与SNP位点C构成微单倍型分型。
表4
Figure BDA0001642382380000232
Figure BDA0001642382380000241
注：-T表示插入/缺失位点Indel与SNP位点T构成微单倍型分型。
Figure RE-IDA0001689273270000011
Figure RE-IDA0001689273270000021
Figure RE-IDA0001689273270000031
Figure RE-IDA0001689273270000041
Figure RE-IDA0001689273270000051
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Figure RE-IDA0001689273270000071
Figure RE-IDA0001689273270000081
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Figure RE-IDA0001689273270000191
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Figure RE-IDA0001689273270000291
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Figure RE-IDA0001689273270000811
Figure RE-IDA0001689273270000821
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Figure RE-IDA0001689273270000841
Figure RE-IDA0001689273270000851
Figure RE-IDA0001689273270000861
Figure RE-IDA0001689273270000871
Figure RE-IDA0001689273270000881
Figure RE-IDA0001689273270000891
Figure RE-IDA0001689273270000901
Figure RE-IDA0001689273270000911
Figure RE-IDA0001689273270000921
Figure RE-IDA0001689273270000931
Figure RE-IDA0001689273270000941
Figure RE-IDA0001689273270000951
Figure RE-IDA0001689273270000961
Figure RE-IDA0001689273270000971
Figure RE-IDA0001689273270000981
Figure RE-IDA0001689273270000991
Figure RE-IDA0001689273270001001
Figure RE-IDA0001689273270001011
Figure RE-IDA0001689273270001021

Claims (1)

1.一种微单倍型分型方法，包括如下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用引物对组合进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；所述待测样本为人类组织或检材；
(2)将所述PCR扩增产物进行二代测序，得到待测样本的基因组DNA的124个微单倍型基因座的基因型，进而获得待测样本的微单倍型分型结果；
所述引物对组合，由用于扩增微单倍型基因座mh01KK-117的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-205的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-211的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-134的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-170的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-033的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-153的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-180的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-191的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-046的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-202的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-213的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-217的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-218的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-223的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-225的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-066的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-049的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-255的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-302的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh18KK-293的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-299的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh20KK-058的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh20KK-307的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh21KK-315的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh21KK-316的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh21KK-320的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh21KK-324的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-002的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-070的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-072的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-106的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh01KK-210的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-003的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-005的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-073的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-102的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-136的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-201的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-202的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh02KK-213的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-006的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-007的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-008的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-009的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh03KK-150的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-010的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-011的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-013的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-015的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-016的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-017的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-019的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-021的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-028的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-029的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh04KK-074的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-022的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-023的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-062的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-078的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh05KK-079的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-025的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-026的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-080的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh06KK-101的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-030的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-031的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-081的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh07KK-082的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh08KK-032的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-034的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-035的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-152的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh09KK-157的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-083的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-084的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-085的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-086的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-087的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-088的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh10KK-101的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-036的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-037的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-038的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-039的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-040的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-041的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-089的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-090的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-091的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh11KK-187的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-043的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-045的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-092的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh12KK-093的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-047的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh13KK-226的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh14KK-048的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh14KK-068的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh14KK-101的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-067的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-095的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh15KK-104的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh16KK-096的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-052的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-053的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-054的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-055的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-076的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-077的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-105的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-110的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh17KK-272的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh18KK-285的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-056的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-057的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh19KK-301的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh20KK-059的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-060的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-061的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-064的引物对、用于扩增微单倍型基因座mh22KK-069的引物对和用于扩增微单倍型基因座mh22KK-303的引物对组成；
所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-117的引物对由序列表中序列9所示的引物9和序列表中序列10所示的引物10组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-205的引物对由序列表中序列11所示的引物11和序列表中序列12所示的引物12组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-211的引物对由序列表中序列15所示的引物15和序列表中序列16所示的引物16组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-134的引物对由序列表中序列25所示的引物25和序列表中序列26所示的引物26组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-170的引物对由序列表中序列77所示的引物77和序列表中序列78所示的引物78组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-033的引物对由序列表中序列97所示的引物97和序列表中序列98所示的引物98组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-153的引物对由序列表中序列105所示的引物105和序列表中序列106所示的引物106组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-180的引物对由序列表中序列141所示的引物141和序列表中序列142所示的引物142组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-191的引物对由序列表中序列145所示的引物145和序列表中序列146所示的引物146组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-046的引物对由序列表中序列151所示的引物151和序列表中序列152所示的引物152组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-202的引物对由序列表中序列157所示的引物157和序列表中序列158所示的引物158组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-213的引物对由序列表中序列161所示的引物161和序列表中序列162所示的引物162组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-217的引物对由序列表中序列163所示的引物163和序列表中序列164所示的引物164组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-218的引物对由序列表中序列165所示的引物165和序列表中序列166所示的引物166组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-223的引物对由序列表中序列167所示的引物167和序列表中序列168所示的引物168组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-225的引物对由序列表中序列169所示的引物169和序列表中序列170所示的引物170组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-066的引物对由序列表中序列179所示的引物179和序列表中序列180所示的引物180组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-049的引物对由序列表中序列187所示的引物187和序列表中序列188所示的引物188组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-255的引物对由序列表中序列191所示的引物191和序列表中序列192所示的引物192组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-302的引物对由序列表中序列193所示的引物193和序列表中序列194所示的引物194组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh18KK-293的引物对由序列表中序列215所示的引物215和序列表中序列216所示的引物216组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-299的引物对由序列表中序列221所示的引物221和序列表中序列222所示的引物222组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh20KK-058的引物对由序列表中序列225所示的引物225和序列表中序列226所示的引物226组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh20KK-307的引物对由序列表中序列229所示的引物229和序列表中序列230所示的引物230组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-315的引物对由序列表中序列231所示的引物231和序列表中序列232所示的引物232组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-316的引物对由序列表中序列233所示的引物233和序列表中序列234所示的引物234组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-320的引物对由序列表中序列235所示的引物235和序列表中序列236所示的引物236组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh21KK-324的引物对由序列表中序列237所示的引物237和序列表中序列238所示的引物238组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-002的引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-070的引物对由序列表中序列3所示的引物3和序列表中序列4所示的引物4组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-072的引物对由序列表中序列5所示的引物5和序列表中序列6所示的引物6组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-106的引物对由序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh01KK-210的引物对由序列表中序列13所示的引物13和序列表中序列14所示的引物14组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-003的引物对由序列表中序列17所示的引物17和序列表中序列18所示的引物18组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-005的引物对由序列表中序列19所示的引物19和序列表中序列20所示的引物20组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-073的引物对由序列表中序列21所示的引物21和序列表中序列22所示的引物22组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-102的引物对由序列表中序列23所示的引物23和序列表中序列24所示的引物24组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-136的引物对由序列表中序列27所示的引物27和序列表中序列28所示的引物28组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-201的引物对由序列表中序列29所示的引物29和序列表中序列30所示的引物30组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-202的引物对由序列表中序列31所示的引物31和序列表中序列32所示的引物32组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh02KK-213的引物对由序列表中序列33所示的引物33和序列表中序列34所示的引物34组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-006的引物对由序列表中序列35所示的引物35和序列表中序列36所示的引物36组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-007的引物对由序列表中序列37所示的引物37和序列表中序列38所示的引物38组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-008的引物对由序列表中序列39所示的引物39和序列表中序列40所示的引物40组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-009的引物对由序列表中序列41所示的引物41和序列表中序列42所示的引物42组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh03KK-150的引物对由序列表中序列43所示的引物43和序列表中序列44所示的引物44组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-010的引物对由序列表中序列45所示的引物45和序列表中序列46所示的引物46组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-011的引物对由序列表中序列47所示的引物47和序列表中序列48所示的引物48组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-013的引物对由序列表中序列49所示的引物49和序列表中序列50所示的引物50组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-015的引物对由序列表中序列51所示的引物51和序列表中序列52所示的引物52组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-016的引物对由序列表中序列53所示的引物53和序列表中序列54所示的引物54组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-017的引物对由序列表中序列55所示的引物55和序列表中序列56所示的引物56组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-019的引物对由序列表中序列57所示的引物57和序列表中序列58所示的引物58组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-021的引物对由序列表中序列59所示的引物59和序列表中序列60所示的引物60组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-028的引物对由序列表中序列61所示的引物61和序列表中序列62所示的引物62组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-029的引物对由序列表中序列63所示的引物63和序列表中序列64所示的引物64组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh04KK-074的引物对由序列表中序列65所示的引物65和序列表中序列66所示的引物66组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-022的引物对由序列表中序列67所示的引物67和序列表中序列68所示的引物68组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-023的引物对由序列表中序列69所示的引物69和序列表中序列70所示的引物70组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-062的引物对由序列表中序列71所示的引物71和序列表中序列72所示的引物72组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-078的引物对由序列表中序列73所示的引物73和序列表中序列74所示的引物74组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh05KK-079的引物对由序列表中序列75所示的引物75和序列表中序列76所示的引物76组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-025的引物对由序列表中序列79所示的引物79和序列表中序列80所示的引物80组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-026的引物对由序列表中序列81所示的引物81和序列表中序列82所示的引物82组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-080的引物对由序列表中序列83所示的引物83和序列表中序列84所示的引物84组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh06KK-101的引物对由序列表中序列85所示的引物85和序列表中序列86所示的引物86组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-030的引物对由序列表中序列87所示的引物87和序列表中序列88所示的引物88组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-031的引物对由序列表中序列89所示的引物89和序列表中序列90所示的引物90组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-081的引物对由序列表中序列91所示的引物91和序列表中序列92所示的引物92组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh07KK-082的引物对由序列表中序列93所示的引物93和序列表中序列94所示的引物94组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh08KK-032的引物对由序列表中序列95所示的引物95和序列表中序列96所示的引物96组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-034的引物对由序列表中序列99所示的引物99和序列表中序列100所示的引物100组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-035的引物对由序列表中序列101所示的引物101和序列表中序列102所示的引物102组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-152的引物对由序列表中序列103所示的引物103和序列表中序列104所示的引物104组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh09KK-157的引物对由序列表中序列107所示的引物107和序列表中序列108所示的引物108组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-083的引物对由序列表中序列109所示的引物109和序列表中序列110所示的引物110组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-084的引物对由序列表中序列111所示的引物111和序列表中序列112所示的引物112组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-085的引物对由序列表中序列113所示的引物113和序列表中序列114所示的引物114组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-086的引物对由序列表中序列115所示的引物115和序列表中序列116所示的引物116组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-087的引物对由序列表中序列117所示的引物117和序列表中序列118所示的引物118组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-088的引物对由序列表中序列119所示的引物119和序列表中序列120所示的引物120组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh10KK-101的引物对由序列表中序列121所示的引物121和序列表中序列122所示的引物122组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-036的引物对由序列表中序列123所示的引物123和序列表中序列124所示的引物124组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-037的引物对由序列表中序列125所示的引物125和序列表中序列126所示的引物126组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-038的引物对由序列表中序列127所示的引物127和序列表中序列128所示的引物128组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-039的引物对由序列表中序列129所示的引物129和序列表中序列130所示的引物130组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-040的引物对由序列表中序列131所示的引物131和序列表中序列132所示的引物132组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-041的引物对由序列表中序列133所示的引物133和序列表中序列134所示的引物134组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-089的引物对由序列表中序列135所示的引物135和序列表中序列136所示的引物136组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-090的引物对由序列表中序列137所示的引物137和序列表中序列138所示的引物138组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-091的引物对由序列表中序列139所示的引物139和序列表中序列140所示的引物140组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh11KK-187的引物对由序列表中序列143所示的引物143和序列表中序列144所示的引物144组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-043的引物对由序列表中序列147所示的引物147和序列表中序列148所示的引物148组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-045的引物对由序列表中序列149所示的引物149和序列表中序列150所示的引物150组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-092的引物对由序列表中序列153所示的引物153和序列表中序列154所示的引物154组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh12KK-093的引物对由序列表中序列155所示的引物155和序列表中序列156所示的引物156组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-047的引物对由序列表中序列159所示的引物159和序列表中序列160所示的引物160组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh13KK-226的引物对由序列表中序列171所示的引物171和序列表中序列172所示的引物172组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh14KK-048的引物对由序列表中序列173所示的引物173和序列表中序列174所示的引物174组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh14KK-068的引物对由序列表中序列175所示的引物175和序列表中序列176所示的引物176组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh14KK-101的引物对由序列表中序列177所示的引物177和序列表中序列178所示的引物178组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-067的引物对由序列表中序列181所示的引物181和序列表中序列182所示的引物182组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-095的引物对由序列表中序列183所示的引物183和序列表中序列184所示的引物184组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh15KK-104的引物对由序列表中序列185所示的引物185和序列表中序列186所示的引物186组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh16KK-096的引物对由序列表中序列189所示的引物189和序列表中序列190所示的引物190组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-052的引物对由序列表中序列195所示的引物195和序列表中序列196所示的引物196组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-053的引物对由序列表中序列197所示的引物197和序列表中序列198所示的引物198组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-054的引物对由序列表中序列199所示的引物199和序列表中序列200所示的引物200组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-055的引物对由序列表中序列201所示的引物201和序列表中序列202所示的引物202组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-076的引物对由序列表中序列203所示的引物203和序列表中序列204所示的引物204组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-077的引物对由序列表中序列205所示的引物205和序列表中序列206所示的引物206组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-105的引物对由序列表中序列207所示的引物207和序列表中序列208所示的引物208组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-110的引物对由序列表中序列209所示的引物209和序列表中序列210所示的引物210组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh17KK-272的引物对由序列表中序列211所示的引物211和序列表中序列212所示的引物212组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh18KK-285的引物对由序列表中序列213所示的引物213和序列表中序列214所示的引物214组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-056的引物对由序列表中序列217所示的引物217和序列表中序列218所示的引物218组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-057的引物对由序列表中序列219所示的引物219和序列表中序列220所示的引物220组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh19KK-301的引物对由序列表中序列223所示的引物223和序列表中序列224所示的引物224组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh20KK-059的引物对由序列表中序列227所示的引物227和序列表中序列228所示的引物228组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-060的引物对由序列表中序列239所示的引物239和序列表中序列240所示的引物240组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-061的引物对由序列表中序列241所示的引物241和序列表中序列242所示的引物242组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-064的引物对由序列表中序列243所示的引物243和序列表中序列244所示的引物244组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-069的引物对由序列表中序列245所示的引物245和序列表中序列246所示的引物246组成；所述用于扩增微单倍型基因座mh22KK-303的引物对由序列表中序列247所示的引物247和序列表中序列248所示的引物248组成；
进行PCR扩增的反应体系中，所述引物1至所述引物248的摩尔比为10：10：2：2：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：2：4：4：2：2：6：6：2：2：4：4：6：6：4：4：2：2：2：2：6：6：10：10：2：2：10：10：2：2：2：2：2：2：2：2：6：6：2：2：10：10：2：2：2：2：1：1：4：4：2：2：2：2：4：4：2：2：4：4：2：2：10：10：2：2：10：10：2：2：10：10：2：2：2：2：4：4：6：6：2：2：6：6：2：2：4：4：2：2：2：2：2：2：1：1：2：2：4：4：6：6：4：4：1：1：4：4：4：4：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2：1：1：10：10：4：4：2：2：2：2：6：6：2：2：4：4：10：10：2：2：4：4：10：10：2：2：4：4：4：4：4：4：4：4：4：4：6：6：2：2：28：28：10：10：2：2：2：2：4：4：4：4：2：2：4：4：2：2：10：10：1：1：2：2：10：10：1：1：2：2：10：10：2：2：10：10：4：4：2：2：4：4：2：2：2：2：4：4：2：2：2：2：4：4：2：2：2：2：2：2：2：2：4：4：1：1：2：2：2：2：1：1。
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CN107099529A (zh) * 2017-07-05 2017-08-29 公安部物证鉴定中心 基于二代测序技术的检测基因座的试剂盒及其专用引物组合

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