KR20200138505A - 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법 - Google Patents

양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 전자기기 또는 다른 기구 장치의 도움 없이 간편하고 신속하게 핵산을 분리할 수 있는 핵산추출장치 및 추출방법을 제공하기 위함이다.
본 발명은 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유, 및 내부에 상기 나노섬유가 삽입되며 혈액 시료를 흡입 및 배출할 수 있도록 상부 및 하부가 각각 돌출된 지지체를 포함하는 핵산정제 디스크; 입구가 상기 지지체의 상부와 연결되는 실린더, 및 피스톤을 포함하는 주사기; 및 일단이 상기 지지체의 하부와 연결되며, 타단을 통해 세척액 또는 용출 완충액을 상기 핵산정제 디스크로 전달하는 팁을 포함하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치를 제공한다.

Description

양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법{NUCLEIC ACID EXTRACTION APPARATUS AND EXTRACTION METHOD USING CATIONIC POLYMER}
본 발명은 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전자기기 또는 다른 기구장치의 도움 없이 간편하고 신속하게 핵산을 정제할 수 있는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법에 관한 것이다.
최근, 질병의 진단, 치료 전략 수립, 치료 모니터링 등의 분야에서, 유전체 (genome) 또는 DNA, 트랜스크립톰(transcriptome), RNA 등의 유전 정보의 분석 및 해석에 대한 연구의 중요성이 증진되고 있다.
생물학적 시료에서 핵산(DNA 및 RNA)의 분리는 생화학 연구 및 진단 프로세서에서 가장 중요한 단계이다. 시료에서 유전자 물질인 핵산을 분리하지 않으면 다음 단계인 유전자 검출, 유전자 클로닝, 유전자 시퀀싱, 유전자 증폭, cDNA 합성 등이 수행될 수 없기 때문이다. 여러 세포 혼합물에서 DNA 또는 RNA를 구별하기 위해서는 효과적이고 재현성 있는 분리방법이 필요하다.
핵산을 추출하기 위한 종래의 방법으로서, 마그네틱 비드를 사용하여 자석으로 흡착된 핵산을 분리하는 방법, 컬럼을 이용해서 용액을 용출하는 방법으로 컬럼에 공기를 가하여 용액을 밀어내는 방법, 컬럼 자체를 원심 분리하여 용액을 용출하는 방법 등이 있었다.
그러나 상기 방법을 이용한 핵산 추출 장비는 많은 시료를 처리하기 위해 상대적으로 큰 크기를 가지나, 시료 처리 기간이 지나치게 길어지는 문제점이 있다. 또한, 많은 시료를 처리하는 과정에서 각각의 시료로 인한 오염이 발생할 수 있으며, 이로 인해 처리 효율이 감소되고 사용자의 불편이 수반되었다.
일반적으로 가장 많이 사용되는 핵산 추출 방법은 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 원리를 이용한 핵산 추출 방법이다. 이는 추출 키트에 실리카 막(membrane)을 두거나 또는 실리카를 자석 비드에 코팅하여 흡착이 가능하도록 한다. 낮은 pH, 높은 이온 강도, chaotropic 염(chaotropic salts)을 포함한 추출 용액 환경에서 음성(-) 극성의 핵산은 실리카 표면에 흡착하게 되고, 흡착된 핵산을 세척 후 높은 pH와 낮은 이온 강도의 용출액(elution buffer)으로 용출하는 방법이다.
그러나 이러한 chaotropic 염은 핵산 정체산물에 포함될 경우 핵산을 최종적으로 사용하고자 하는 PCR 반응에서 반응저해물질로 작용하기 때문에 정제 과정에서 여러번의 세척과정을 거쳐야 하므로 공정이 번거로워진다는 문제점을 가지고 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1193765호 (2012.10.24. 공고)
본 발명의 목적은 전자기기 또는 다른 기구 장치의 도움 없이 간편하고 신속하게 핵산을 정제할 수 있는 핵산추출장치 및 추출방법을 제공하기 위함이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유, 및 내부에 상기 나노섬유가 삽입되며 혈액 시료를 흡입 및 배출할 수 있도록 상부 및 하부가 각각 돌출된 지지체를 포함하는 핵산정제 디스크; 입구가 상기 지지체의 상부와 연결되는 실린더, 및 피스톤을 포함하는 주사기; 및 일단이 상기 지지체의 하부와 연결되며, 타단을 통해 세척액 또는 용출 완충액을 상기 핵산정제 디스크로 전달하는 팁;을 포함하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치를 제공한다.
상기 핵산정제 디스크의 상기 지지체 내부에 상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유가 2개 이상 적층될 수 있다.
상기 적층된 나노섬유의 최하층에 프리필터(pre-filter)를 더 포함할 수 있다.
상기 혈액 시료는 핵산이 포함된 샘플을 비이온성 계면활성제에 용해시켜 제조될 수 있다.
상기 핵산이 포함된 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 및 혈액카드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유는 양이온성 폴리머의 용해액에 나노섬유를 침지하고 세척 및 건조한 후, 자외선을 조사하여 제조될 수 있다.
상기 양이온성 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 3-aminopropyl trimethoxysilane(APTMS), 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)일 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 혈액 시료를 제조하는 단계; (b) 나노섬유에 양이온성 폴리머를 표면처리하는 단계; (c) 상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유를 2개 이상 적층하고 지지체에 삽입하여 핵산정제 디스크를 제조하는 단계; (d) 상기 핵산정제 디스크의 상부에 주사기를 연결하고 하부에 팁을 연결하는 단계; (e) 상기 혈액 시료를 상기 주사기의 실린더에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 밀어 상기 혈액 시료를 상기 핵산정제 디스크에 주입하는 단계; (f) 상기 팁을 세척액에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 상기 핵산정제 디스크를 세척하는 단계; 및 (g) 상기 팁을 용출 완충액에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 상기 핵산정제 디스크 내의 핵산을 분리하는 단계;를 포함하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 상기 혈액 시료는 핵산이 포함된 샘플을 비이온성 계면활성제에 용해시켜 제조될 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) X-100, 지방 알코올 에톡실레이트(Fatty acid ethoxylate, FAE), 폴리에톡실레이트 탈로우 아민(Polyethoxylated tallow amine, POEA), 코카마이드 모노에탄올아민(Cocamide monoethanolamine), 코카마이드 디에탄올아민(Cocamide diethanolamine), 글리세롤 모노스테아레이트(Glycerol monostearate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol monolaurate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan monostearate), 소르비탄 트리스테아레이트(Sorbitan tristearate), Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 데실 글루코사이드(Decyl glucoside), 라우릴 글루코사이드(Lauryl glucoside), 옥틸 글루코사이드(Octyl glucoside), 라우릴디메틸아민옥사이드(Lauryldimethylamine oxide), 및 포스핀옥사이드(Phosphine oxide)로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 핵산이 포함된 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 및 혈액카드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 (b) 단계의 상기 양이온성 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 3-aminopropyl trimethoxysilane(APTMS), 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 양이온성 폴리머의 용해액에 상기 나노섬유를 침지하고 세척 및 건조한 후, 자외선을 조사하여 상기 나노섬유에 상기 양이온성 폴리머를 표면처리할 수 있다.
상기 (c) 단계의 상기 적층된 나노섬유의 최하층에 프리필터(pre-filter)를 더 포함할 수 있다.
상기 (g) 단계의 상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)일 수 있다.
본 발명에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법을 이용하면, 정제과정에서 여러 번의 세척과정을 거칠 필요가 없어 신속하게 핵산을 추출할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법을 이용하면, 다른 전자기기나 기구장치의 도움을 받을 필요 없이 간편하게 핵산을 추출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산추출장치의 핵산정제 디스크의 확대도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법의 공정순서도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치를 이용한 핵산추출방법을 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산추출방법에 따라 Canine Parvo virus가 포함된 혈액 시료로부터 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출된 Canine Parvo virus DNA 샘플을 PCR에 의해 증폭시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산추출방법에 따라 Canine Distemper virus가 포함된 혈액 시료로부터 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출된 Canine Distemper virus RNA 샘플을 RT-PCR에 의해 증폭시킨 결과를 나타낸 사진이다.
하기의 설명에서는 본 발명의 실시예를 이해하는데 필요한 부분만이 설명되며, 그 이외 부분의 설명은 본 발명의 요지를 흩트리지 않는 범위에서 생략될 것이라는 것을 유의하여야 한다.
이하에서 설명되는 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념으로 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치의 개략도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산추출장치의 핵산정제 디스크의 확대도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명은 핵산정제 디스크(10), 주사기(50), 및 팁(70)을 포함하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치(100)를 제공한다.
상기 핵산정제 디스크(10)는 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유(17), 및 내부에 상기 나노섬유(17)가 삽입되며, 혈액 시료를 흡입 및 배출할 수 있도록 상부(13) 및 하부(15)가 각각 돌출된 지지체(11)를 포함한다. 상기 주사기(50)는 상기 지지체(11)의 상부(13)와 연결되는 실린더(57), 및 피스톤(53)을 포함한다. 상기 팁(70)은 일단이 상기 지지체(11)의 하부(15)와 연결되며, 타단을 통해 세척액 또는 용출 완충액을 상기 핵산정제 디스크(10)로 전달한다.
핵산정제 디스크(10)는 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유(17) 및 지지체(11)를 포함한다.
상기 나노섬유는 직경이 수백 나노미터(nm) 이하인 섬유로 복수개의 공극(pore)을 포함하고 있다. 따라서, 이러한 나노섬유를 핵산 추출용 필터로 사용하는 경우 수십 개의 나노 크기 이상의 입자를 분리시킬 수 있어 높은 핵산 포집능을 가질 수 있다.
상기 나노섬유는 PVdF(polyvinylidenefluoride), PMMA(poly-methylmethacrylate), PAN(polyacrylonitrile), PU(poly-urethane), PES(polyethersulfone), PAA(polyamicacid), PVA(polyvinylachol), PEO(polyethyleneoxide), PLA(polylacticacid), PGA(polyglycolic acid), PLA-PGA계의 고분자 물질 중 어느 하나 또는 이들을 둘 이상 혼합한 고분자 물질을 전기방사하여 제조된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 상기 나노섬유는 원반형으로 제작될 수 있으나 본 발명의 기술적 사상은 이에 제한되지 않는다. 즉 나노섬유의 형태는 다양할 수 있으며, 다각형의 형상을 가진 것을 사용하여도 무방하다.
나노섬유의 표면에는 양이온성 폴리머를 표면처리할 수 있다.
상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유(17)를 제조하기 위하여, 양이온성 폴리머를 용해한 용액에 상기 나노섬유를 침지한 다음 증류수로 세척하고 건조한 후, 자외선을 조사하여 상기 나노섬유의 표면에 양이온성 폴리머가 물리적으로 부착되도록 할 수 있다.
상기 양이온성 폴리머로는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 3-aminopropyl trimethoxysilane(APTMS), 키토산(chitosan)으로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이 때, 양이온성 폴리머를 용해한 용액에 상기 나노섬유를 3~10 시간 동안 침지하는 것이 바람직하다.
양이온성 폴리머를 용해할 수 있는 용매는 트리플루오로아세트산(TFA)과 디클로로메탄의 혼합용매, 헥사플루오로이소프로판올 및 트리플루오로 아세트산 혼합용매와 같은 산성 용액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양이온성 폴리머가 용해된 용액의 농도는 1.0~3.0 %(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유의 건조는 60~80 ℃에서 5~7 시간 동안 건조할 수 있다. 건조가 완료된 상기 나노섬유는 290~320 nm의 파장으로 30 분 내지 1 시간 동안 자외선 조사시켜 상기 나노섬유의 표면에 양이온성 폴리머가 물리적으로 부착되도록 할 수 있다.
본 발명에 따라 나노섬유의 표면에 양이온성 폴리머를 처리하는 경우, (+) 전하를 띄는 양이온성 폴리머가 (-) 전하를 띄는 핵산과 서로 응축(condense)되어 혈액 내에 포함된 핵산을 용이하게 포집하여 추출할 수 있다.
지지체(11)의 내부에는 상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유(17)가 삽입될 수 있다. 또한, 지지체(11)의 내부에는 상기 나노섬유(17)가 2개 이상 삽입될 수 있으며, 2개 이상의 나노섬유(17)가 삽입되는 경우 나노섬유(17)가 지지체(11) 내부에 적층되어 삽입될 수 있다. 본 발명에 따르면 2개 이상의 나노섬유(17)를 사용하여 핵산을 신속하게 포집하여 추출할 수 있다.
지지체(11)는 상기 나노섬유(17)의 형상에 대응하는 형상으로 이루어질 수 있다. 즉, 상기 나노섬유(17)가 원반형일 경우 지지체(11)의 단면도 원반형이 되며, 상기 나노섬유(17)가 다각형의 형상일 경우 지지체(11)의 단면도 다각형 형상일 수 있다.
또한, 상기 지지체(11)의 내부에 나노섬유(17)가 적층되는 경우, 최하층에 프리필터(pre-filter)(19)를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 나노섬유(17)의 최하층에 프리필터(19)를 적층시키는 경우 나노섬유(17)의 적층 구조를 안정적으로 지지해줄수 있으며, 혈액 시료를 효과적으로 거를 수 있다는 장점이 있다.
지지체(11)의 상부(13)는 돌출되어 있어 주사기(50)의 실린더(57) 입구와 연결될 수 있다. 이를 통해 상기 실린더(57) 내부에 투입된 혈액 시료를 핵산정제 디스크(10)로 주입할 수 있다.
지지체(11)의 하부(15)는 돌출되어 있어 팁(70)과 연결될 수 있다. 이를 통해 상기 핵산정제 디스크(10)로 세척액 또는 용출 완충액을 흡입 또는 배출하거나, 상기 핵산정제 디스크(10)로부터 혈액 시료를 배출시킬 수 있다.
주사기(50)는 실린더(57) 및 피스톤(53)으로 구성된다.
상기 실린더(57)에는 혈액 시료가 수용되며, 입구가 지지체(11)의 상부(13)와 연결되어 실린더(57) 내에 수용된 혈액 시료를 핵산정제 디스크(10)로 주입하거나, 핵산정제 디스크(10)로부터 혈액 시료를 흡입할 수 있다.
상기 피스톤(53)은 상하 왕복운동을 통하여 밀고 당겨져 음압과 양압을 형성할 수 있다. 이를 통해 상기 실린더(57) 내에 수용된 혈액 시료를 핵산정제 디스크(10)로 주입하거나, 핵산정제 디스크(10)로부터 실린더(57)로 혈액 시료를 흡입할 수 있다.
팁(70)은 일단이 지지체(11)의 하부(15)와 연결되며, 타단을 통해 세척액 또는 용출 완충액을 핵산정제 디스크(10)로 전달시킬 수 있다.
상기에서 설명한 본 발명에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치(100)를 이용하는 경우 정제과정에서 여러 번의 세척과정을 거칠 필요가 없이 신속하게 핵산을 추출할 수 있다. 또한, 다른 전자기기나 기구장치의 도움을 받을 필요 없이 간편하게 핵산을 추출할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산추출장치(100)에 투입되는 혈액 시료는 핵산이 포함된 샘플을 용해액에 용해시켜 제조될 수 있다. 상기 용해액은 버퍼 수용액 및 비이온성 계면활성제가 물 또는 버퍼 수용액에 용해된 비이온계 계면활성제 용액일 수 있다.
본 발명에 따르면 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유(17)에 핵산이 포집되도록 함으로써 핵산을 추출할 수 있으므로, 핵산 분리에 통상적으로 사용되는 proteinase K와 같은 단백질분해효소를 용해액에 첨가하여 혈액 시료를 제조할 필요가 없어 비용이 절감되고 추출공정이 간편하다.
상기 핵산이 포함된 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 및 혈액카드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 핵산이 포함된 샘플은 핵산을 함유할 소지가 있는 모든 시료를 지칭하며, 인간 및 동물의 혈액, 식물의 체액, 인간 및 동물의 배성물, 미생물 배양액, 세포 배양액, 바이러스 배양액 등을 모두 포함할 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)일 수 있다.
상기 용해액은 DNA/RNA분리 효율에 따라 그 조성을 적절하게 조절할 수 있다. 상기 버퍼는 생체 적합한 모든 버퍼 중에서 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않지만, 생체 적합성을 고려하여 pH 7.0 내지 8.5인 것을 사용할 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제(nonionic surfactant)는 한 분자 내에 친수성과 소수성 부분을 함께 가지고 있는 물질으로 해리 시 비이온성 특징을 나타내는 물질이다.
상기 비이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) X-100, 지방 알코올 에톡실레이트(Fatty acid ethoxylate, FAE), 폴리에톡실레이트 탈로우 아민(Polyethoxylated tallow amine, POEA), 코카마이드 모노에탄올아민(Cocamide monoethanolamine), 코카마이드 디에탄올아민(Cocamide diethanolamine), 글리세롤 모노스테아레이트(Glycerol monostearate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol monolaurate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan monostearate), 소르비탄 트리스테아레이트(Sorbitan tristearate), Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 데실 글루코사이드(Decyl glucoside), 라우릴 글루코사이드(Lauryl glucoside), 옥틸 글루코사이드(Octyl glucoside), 라우릴디메틸아민옥사이드(Lauryldimethylamine oxide), 포스핀옥사이드(Phosphine oxide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비이온성 계면활성제의 가장 효과적인 농도는 계면활성제의 종류에 따라 달라지지만, 상기 핵산이 포함된 샘플의 총 중량을 기준으로 1 내지 20 %인 것이 바람직하다. 1 % 미만이거나 20 %를 초과하는 경우는 핵산의 추출율이 저해될 수 있기 때문이다. 계면활성제(고체 또는 액체)에 따라, %는 각각 w/v % 또는 v/v %를 말한다.
용해가 적절히 이루어지도록 하기 위하여, 혈액이 포함된 샘플에 용해액을 처리한 후， 0 내지 35 ℃ 또는 10 내지 30 ℃에서, 1 내지 60 분, 3 내지 30 분, 또는 5 내지 20 분 동안 반응시킬 수 있다. 그러나 본 발명의 기술적 사상은 이에 제한되지 않으며, 혈액 시료의 종류, 사용된 용해액의 종류 또는 농도 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있다.
양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법의 공정순서도이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치를 이용한 핵산추출방법을 나타낸 그림이다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 본 발명은 (a) 혈액 시료를 제조하는 단계; (b) 나노섬유에 양이온성 폴리머를 표면처리하는 단계; (c) 상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유를 2개 이상 적층하고 지지체에 삽입하여 핵산정제 디스크를 제조하는 단계; (d) 상기 핵산정제 디스크의 상부에 주사기를 연결하고 하부에 팁을 연결하는 단계; (e) 상기 혈액 시료를 상기 주사기의 실린더에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 밀어 상기 혈액 시료를 상기 핵산정제 디스크에 주입하는 단계; (f) 상기 팁을 세척액에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 상기 핵산정제 디스크를 세척하는 단계; 및 (g) 상기 팁을 용출 완충액에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 상기 핵산정제 디스크 내의 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법을 제공한다.
이하 도 3 및 도 4를 참조하여, 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 혈액 시료를 제조하는 단계이다(S100).
상기 단계에서 혈액 시료는 핵산이 포함된 샘플을 용해액에 용해시켜 제조될 수 있다. 상기 용해액은 버퍼 수용액 및 비이온성 계면활성제가 물 또는 버퍼 수용액에 용해된 비이온계 계면활성제 용액일 수 있다.
상기 핵산이 포함된 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 및 혈액카드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 핵산이 포함된 샘플은 핵산을 함유할 소지가 있는 모든 시료를 지칭하며, 인간 및 동물의 혈액, 식물의 체액, 인간 및 동물의 배성물, 미생물 배양액, 세포 배양액, 바이러스 배양액 등을 모두 포함할 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)일 수 있다.
상기 용해액은 DNA/RNA분리 효율에 따라 그 조성을 적절하게 조절할 수 있다. 상기 버퍼는 생체 적합한 모든 버퍼 중에서 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않지만, 생체 적합성을 고려하여 pH 7.0 내지 8.5인 것을 사용할 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제(nonionic surfactant)는 한 분자 내에 친수성과 소수성 부분을 함께 가지고 있는 물질으로 해리 시 비이온성 특징을 나타내는 물질이다.
상기 비이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) X-100, 지방 알코올 에톡실레이트(Fatty acid ethoxylate, FAE), 폴리에톡실레이트 탈로우 아민(Polyethoxylated tallow amine, POEA), 코카마이드 모노에탄올아민(Cocamide monoethanolamine), 코카마이드 디에탄올아민(Cocamide diethanolamine), 글리세롤 모노스테아레이트(Glycerol monostearate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol monolaurate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan monostearate), 소르비탄 트리스테아레이트(Sorbitan tristearate), Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 데실 글루코사이드(Decyl glucoside), 라우릴 글루코사이드(Lauryl glucoside), 옥틸 글루코사이드(Octyl glucoside), 라우릴디메틸아민옥사이드(Lauryldimethylamine oxide), 포스핀옥사이드(Phosphine oxide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비이온성 계면활성제의 가장 효과적인 농도는 계면활성제의 종류에 따라 달라지지만, 상기 핵산이 포함된 샘플의 총 중량을 기준으로 1 내지 20 %인 것이 바람직하다. 1 % 미만이거나 20 %를 초과하는 경우는 핵산의 추출율이 저해될 수 있기 때문이다. 계면활성제(고체 또는 액체)에 따라, %는 각각 w/v % 또는 v/v %를 말한다.
용해가 적절히 이루어지도록 하기 위하여, 혈액이 포함된 샘플에 용해액을 처리한 후， 0 내지 35 ℃ 또는 10 내지 30 ℃에서, 1 내지 60 분, 3 내지 30 분, 또는 5 내지 20 분 동안 반응시킬 수 있다. 그러나 본 발명의 기술적 사상은 이에 제한되지 않으며, 혈액 시료의 종류, 사용된 용해액의 종류 또는 농도 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있다.
상기 (b) 단계는, 나노섬유에 양이온성 폴리머를 표면처리하는 단계이다(S200).
상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유를 제조하기 위하여, 양이온성 폴리머를 용해한 용액에 나노섬유를 침지한 다음 증류수로 세척하고 건조한 후, 자외선을 조사하여 나노섬유의 표면에 양이온성 폴리머가 물리적으로 부착되도록 할 수 있다.
상기 나노섬유는 직경이 수백 나노미터(nm) 이하인 섬유로 복수개의 공극(pore)을 포함하고 있다. 따라서, 이러한 나노섬유를 핵산 추출용 필터로 사용하는 경우 수십 개의 나노 크기 이상의 입자를 분리시킬 수 있어 높은 핵산 포집능을 가질 수 있다.
상기 나노섬유는 PVdF(polyvinylidenefluoride), PMMA(poly-methylmethacrylate), PAN(polyacrylonitrile), PU(poly-urethane), PES(polyethersulfone), PAA(polyamicacid), PVA(polyvinylachol), PEO(polyethyleneoxide), PLA(polylacticacid), PGA(polyglycolic acid), PLA-PGA계의 고분자 물질 중 어느 하나 또는 이들을 둘 이상 혼합한 고분자 물질을 전기방사하여 제조된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양이온성 폴리머로는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 3-aminopropyl trimethoxysilane(APTMS), 키토산(chitosan)으로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이 때, 양이온성 폴리머를 용해한 용액에 상기 나노섬유를 3~10 시간 동안 침지하는 것이 바람직하다.
양이온성 폴리머를 용해할 수 있는 용매는 트리플루오로아세트산(TFA)과 디클로로메탄의 혼합용매, 헥사플루오로이소프로판올 및 트리플루오로 아세트산 혼합용매와 같은 산성 용액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양이온성 폴리머가 용해된 용액의 농도는 1.0~3.0 %(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유의 건조는 60~80 ℃에서 5~7 시간 동안 건조할 수 있다. 건조가 완료된 상기 나노섬유는 290~320 nm의 파장으로 30 분 내지 1 시간 동안 자외선 조사시켜 상기 나노섬유의 표면에 양이온성 폴리머가 물리적으로 부착되도록 할 수 있다.
본 발명에 따라 나노섬유의 표면에 양이온성 폴리머를 처리하는 경우, (+) 전하를 띄는 양이온성 폴리머가 (-) 전하를 띄는 핵산과 서로 응축(condense)되어 혈액 내에 포함된 핵산을 용이하게 포집하여 추출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유에 핵산이 포집되도록 함으로써 핵산을 추출할 수 있으므로, 핵산 분리에 통상적으로 사용되는 proteinase K와 같은 단백질분해효소를 용해액에 첨가하여 혈액 시료를 제조할 필요가 없어 비용이 절감되고 추출공정이 간편하다는 장점이 있다.
상기 (c) 단계는, 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유를 2개 이상 적층하고 지지체에 삽입하여 핵산정제 디스크를 제조하는 단계이다(S300).
지지체의 내부에는 상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유가 삽입될 수 있다. 또한, 지지체의 내부에는 상기 나노섬유가 2개 이상 삽입될 수 있으며, 2개 이상의 나노섬유가 삽입되는 경우 나노섬유가 지지체 내부에 적층되어 삽입될 수 있다. 본 발명에 따르면 2개 이상의 나노 섬유를 사용하여 핵산을 신속하게 포집하여 추출할 수 있다.
또한, 상기 지지체의 내부에 나노섬유가 적층되는 경우, 최하층에 프리필터(pre-filter)를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 나노섬유의 최하층에 프리필터를 적층시키는 경우 나노섬유의 적층 구조를 안정적으로 지지해줄수 있으며, 혈액 시료를 효과적으로 거를 수 있다는 장점이 있다.
상기 (d) 내지 (e) 단계는, 핵산정제 디스크의 상부에 주사기를 연결하고, 하부에 팁을 연결하고, 혈액 시료를 주사기의 실린더에 투입하고, 주사기의 피스톤을 밀어 혈액 시료를 핵산정제 디스크에 주입하는 단계이다(S400~500).
지지체의 상부는 돌출되어 있어 주사기의 실린더 입구와 연결될 수 있다. 이를 통해 상기 실린더 내부에 투입된 혈액 시료를 핵산정제 디스크로 주입시킬 수 있다. 핵산정제 디스크로 주입된 혈액 시료 내에 포함된 핵산은 (-) 전하를 띄므로, (+) 전하를 띄는 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유에 포집된다.
또한, 지지체의 하부는 돌출되어 있어 팁과 연결될 수 있다. 이를 통해 하기에서 설명하는 바와 같이, 팁으로부터 핵산정제 디스크로 세척액 또는 용출 완충액을 전달할 수 있다.
상기 (f) 단계는, 팁을 세척액에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 핵산정제 디스크를 세척하는 단계이다(S600).
상기 세척액은 상기 나노섬유에 포집된 비핵산 성분을 선택적으로 세척할 수 있는 용액이다.
상기 세척액으로는 Tris-HCl, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 트리톤(Triton) X-100 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척 단계는 1회 이상 반복하여 수행할 수 있다.
상기 (g) 단계는, 팁을 용출 완충액에 투입하고 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 핵산정제 디스크 내의 핵산을 분리하는 단계이다(S700).
상기 용출 완충액은 상기 나노섬유에 포집된 핵산을 분리하기 위해서 사용될 수 있는 용액이다.
상기 용출 완충액으로는 정제수, 바이신, 트리신, Tris, HEPES, CHAPS, 포스페이트, 아세테이트, MES, 피리딘, 피페라진, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, 보레이트, TAPS, CHES, CAPS, 에탄올아민, 피페리딘 등을 사용할 수 있다.
상기 용출 완충액의 농도는 바람직하게는 1~200 mM, 더 바람직하게는 5~50 mM, 가장 바람직하게는 30~70 mM일 수 있다. 또한, 상기 용출 완충액의 pH는 바람직하게는 5~12, 더 바람직하게는 7~10, 가장 바람직하게는 8~10인 것을 사용할 수 있다.
상기 단계를 통해 분리된 DNA 또는 RNA는 통상적인 수단 및/또는 방법을 통하여 정량 및/또는 정성 분석이 가능하다. 따라서, 상기 단계의 수행 이후에 분리된 DNA 또는 RNA의 정량 및/또는 정성 분석 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 DNA 또는 RNA의 분석은 통상적인 방법에 의하여 증폭하는 단계에 의하여 수행될 수 있다.
상기의 증폭하는 단계는 중합효소 연쇄반응(PCR; 예컨대 quantitative polymerase chain reaction (qPCR), Real-time PCR 등), multiple displacement amplification(MDA), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭, 또는 이 외에도 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 모든 적당한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기에서 설명한 본 발명에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법을 이용하는 경우 정제과정에서 여러 번의 세척과정을 거칠 필요가 없이 신속하게 핵산을 추출할 수 있다. 또한, 다른 전자기기나 기구장치의 도움을 받을 필요 없이 간편하게 핵산을 추출할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
<핵산 정제 디스크의 준비>
나노섬유(Cellulose Mixed Esters, 25mm, #CM045025, Macherey-Nagel)를 준비한다.
1번 나노섬유 시트에는 1.25 % 내지 2.5 % (w/v)의 PEI (Poly(ethyleneimine))를 처리한다. 2번 나노섬유 시트에는 1.25 % 내지 2.5 % (w/v)의 3-aminopropyl trimethoxysilane을 처리한다. 3번 나노섬유 시트에는 1.25 % 내지 2.5 % (w/v)의 chitosan을 처리한다.
나노섬유 시트를 70 ℃에서 6 시간 동안 건조하고, 건조가 완료된 나노섬유의 표면을 자외선 조사기를 이용하여 320 nm 파장에서 30 분간 자외선 처리해주었다. 상기 표면 처리된 1 내지 3번의 나노섬유 시트를 종류별로 조합하여 서로 다른 조합이 되도록 원반형 플라스틱 디스크 용기에 삽입하였다.
각 조합별로 최하층에는 Sterlitech 사의 glass fiber membrane filter(Grade TSS 25mm; #TSS2500)를 프리필터(pre-filter)로 넣어주었다. 각각의 플라스틱 디스크는 초음파를 이용하여 접착하였다.
<용해액 준비>
100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 5 % TX-100, 2 % TW-20, 3 % Glycerol monolaurate, 0.5 % Sorbitan monostearate, 0.25 % Lauryldimethylamine oxide이 되도록 용해액을 제조하였다.
<세척액 준비>
1차 세척액으로는 100 mM Tris-HCl(pH 7.0), 5 mM EDTA, 1 % TX-100을, 2차 세척액으로는 50 mM Tris-HCl(pH 7.0)을, 3차 세척액으로는 10 mM Tris-HCl(pH 7.0)을 사용하였다. 용출 완충액(Elution buffer)으로는 3차 정제수를 사용하였다.
<핵산추출방법>
혈액 100 μl을 용해액 400 μl과 혼합하였다. 상기 혼합액을 1 분간 vortex한 후, 실온에서 5 분간 정치하였다. 그 후 핵산정제 디스크를 주사기와 결합하고, 주사기의 실린더에 혈액 시료를 투입한 후 주사기 피스톤을 상하 1회 왕복하였다.
핵산정제 디스크를 1차 세척액으로 5회 왕복하여 세척하고, 2차 세척액으로 1회 왕복하여 세척한 뒤, 마지막으로 3차 세척액으로 1회 왕복하여 세척해주었다. 다음으로 핵산정제 디스크를 용출 완충액으로 1회 왕복하여 핵산을 분리해주었다.
<실험예 1> Canine Parvo virus DNA의 추출
<1-1> Virus DNA의 정제
Canine Parvo virus(중앙백신연구소, CPV, 780916-LP, 105. 0TCID50)가 혼합된 혈액 100 μl를 1000 μl의 용해액과 혼합한 후, vortex mixer를 이용하여 30 초 간 강하게 혼합한 후 5 분 동안 실온에 방치하여 혈액을 용해하였다. 용해된 혈액을 주사기의 실린더로 투입한 후, 주사기의 피스톤을 밀어주어 혈액 시료가 핵산정제 디스크를 통과하도록 하였다.
핵산정제 디스크를 1차 세척액으로 5회 왕복하여 세척하고, 2차 세척액으로 1회 왕복하여 세척한 뒤, 마지막으로 3차 세척액으로 1회 왕복하여 세척해주었다. 마지막으로 핵산정제 디스크를 용출 완충액으로 1회 왕복하여 핵산을 분리해주었다. 최종 용출된 정제 시료는 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
<1-2> PCR 실시
상기 실시예 1-1에서 정제된 virus DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 본 발명에 따른 핵산추출방법의 대조군으로는 (주) 위즈바이오솔루션의 WizPure™ Viral DNA/RNA Mini Kit(Cat# W73050-100)를 사용한 CPV DNA를 추출방법을 사용하였다.
PCR은 Canine Parvo virus의 VP2 유전자(630bp)로 정방향 프라이머 5'-CAGGTGATGAATTTGCTACA-3'(서열번호 1), 역방향 프라이머 5'-CATTTGGATAAACTGGTGGT-3'(서열번호 2)를 사용하여 수행하였다.
PCR은 95 ℃에서 5 분 동안 열을 가한 후, 다시 1) 95 ℃에서 30 초 동안 열을 가하는 단계, 2) 58 ℃에서 30 초 동안 열을 가하는 단계, 3) 72 ℃에서 40 초 동안 열을 가하는 단계를 총 35 회 반복해주었다. 다음으로 이를 72 ℃에서 5 분간 열을 더 가해준 다음 최종적으로 4 ℃에서 방치하였다.
이렇게 PCR을 실시한 후, 반응산물을 1 %로 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 다음 형광 테이블(UV transilluminator)을 이용하여 증폭된 산물의 결과를 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산추출방법에 따라 Canine Parvo virus가 포함된 혈액 시료로부터 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 사진이고, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출된 Canine Parvo virus DNA 샘플을 PCR에 의해 증폭시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 5의 1번 용액은 용해액으로 핵산이 포함된 시료를 용해시킨 혈액 시료를 나타낸 것이고, 2번 내지 4번 용액은 1차 내지 3차 세척액으로 혈액 시료를 세척한 결과이며, 5번 용액은 virus DNA를 용출시킨 용출액을 나타낸 결과이다. 도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 핵산추출방법 및 추출장치는 혈액 시료로부터의 virus DNA 분리정도가 우수함을 알 수 있다.
도 6의 대조군은 (주)위즈바이오솔루션의 WizPure™ Viral DNA/RNA Mini Kit(Cat# W73050-100)을 사용한 PCR 결과이며, Test 1은 1번 나노섬유와 2번 나노섬유를 순차로 적층한 경우의 PCR 결과이며, Test 2는 1번 나노섬유와 3번 나노섬유를 순차로 적층한 경우의 PCR 결과이며, Test 3은 2번 나노섬유와 3번 나노섬유를 순차로 적층한 경우의 PCR 결과이다.
도 6을 참조하면, Test 1 내지 3의 결과가 대조군으로 사용한 (주)위즈바이오솔루션의 WizPure?? Viral DNA/RNA Mini Kit(Cat# W73050-100)의 PCR 결과와 비교하였을 때 큰 차이가 없으므로, 본원발명에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 방법의 virus DNA 추출 효율이 우수함을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> Canine Distemper virus DNA의 추출
<2-1> Virus RNA의 정제
Canine Distemper virus(중앙백신연구소, CDV, Rockborn, 103. 5TCID50)가 혼합된 혈액 100 μl를 1000 μl의 용해액과 혼합한 후 vortex mixer를 이용하여 30 초간 강하게 혼합한 후 5 분 동안 실온에 방치하여 혈액을 용해하였다.
핵산정제 디스크를 1차 세척액으로 5회 왕복하여 세척하고, 2차 세척액으로 1회 왕복하여 세척한 뒤, 마지막으로 3차 세척액으로 1회 왕복하여 세척해주었다. 마지막으로 핵산정제 디스크를 용출 완충액으로 1회 왕복하여 핵산을 분리해주었다. 최종 용출된 정제 시료는 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
<2-2> RT-PCR 실시
상기 실시예 2-1에서 정제된 virus RNA의 주형으로 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR 반응의 대조군으로는 ㈜ 위즈바이오솔루션의 WizPure™ Viral DNA/RNA Mini Kit(Cat# W73050-100)를 이용한 CDV RNA를 추출방법을 사용하였다.
RT-PCR은 Canine Distemper virus의 H 유전자(544bp)로 정방향 프라이머 5’-CATRGATGTCTTGACACCGCT-3’(서열번호 3)과 역방향 프라이머 5’-GGTTGTCTGGAGTAAWGGCAT-3’(서열번호 4)를 사용하여 수행하였다.
RT-PCR은 95 ℃에서 5 분 동안 열을 가한 후, 다시 1) 95 ℃에서 30 초 동안 열을 가하는 단계, 2) 58 ℃에서 30 초 동안 열을 가하는 단계, 3) 72 ℃에서 40 초 동안 열을 가하는 단계를 총 35 회 반복해주었다. 다음으로 이를 72 ℃에서 5 분간 열을 더 가해준 다음 최종적으로 4 ℃에서 방치하였다.
이렇게 PCR을 실시한 후, 반응산물을 1 %로 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 다음 형광 테이블(UV transilluminator)을 이용하여 증폭된 산물의 결과를 확인하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산추출방법에 따라 Canine Distemper virus가 포함된 혈액 시료로부터 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 사진이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출된 Canine Distemper virus RNA 샘플을 RT-PCR에 의해 증폭시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 7의 1번 용액은 용해액으로 핵산이 포함된 시료를 용해시킨 혈액 시료를 나타낸 것이고, 2번 내지 4번 용액은 1차 내지 3차 세척액으로 혈액 시료를 세척한 결과이며, 5번 용액은 virus RNA를 용출시킨 용출액을 나타낸 결과이다. 도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 핵산추출방법 및 추출장치는 혈액 시료로부터 virus RNA의 분리정도가 우수함을 알 수 있다.
도 8의 대조군은 (주)위즈바이오솔루션의 WizPure™ Viral DNA/RNA Mini Kit(Cat# W73050-100)를 사용한 RT-PCR 결과이며, Test 1은 1번 나노섬유와 2번 나노섬유를 순차로 적층한 경우의 RT-PCR 결과이며, Test 2는 1번 나노섬유와 3번 나노섬유를 순차로 적층한 경우의 RT-PCR 결과이며, Test 3은 2번 나노섬유와 3번 나노섬유를 순차로 적층한 경우의 RT-PCR 결과이다.
도 8을 참조하면, Test 1 내지 3의 결과가 대조군으로 사용한 (주)위즈바이오솔루션의 WizPure™ Viral DNA/RNA Mini Kit(Cat# W73050-100)의 RT-PCR 결과와 비교하였을 때 큰 차이가 없으므로, 본원발명에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 방법의 virus RNA 추출 효율이 우수함을 확인할 수 있었다.
지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
10 : 핵산정제 디스크
11 : 지지체
13 : 지지체의 상부
15 : 지지체의 하부
17 : 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유
19 : 프리필터
50 : 주사기
53 : 피스톤
57 : 실린더
70 : 팁
100 : 핵산추출장치

Claims (16)

  1. 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유, 및 내부에 상기 나노섬유가 삽입되며 혈액 시료를 흡입 및 배출할 수 있도록 상부 및 하부가 각각 돌출된 지지체를 포함하는 핵산정제 디스크;
    입구가 상기 지지체의 상부와 연결되는 실린더, 및 피스톤을 포함하는 주사기; 및
    일단이 상기 지지체의 하부와 연결되며, 타단을 통해 세척액 또는 용출 완충액을 상기 핵산정제 디스크로 전달하는 팁;
    을 포함하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산정제 디스크의 상기 지지체 내부에
    상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유가 2개 이상 적층된 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 적층된 나노섬유의 최하층에 프리필터(pre-filter)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 시료는 핵산이 포함된 샘플을 비이온성 계면활성제에 용해시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 핵산이 포함된 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 및 혈액카드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유는
    양이온성 폴리머의 용해액에 나노섬유를 침지하고 세척 및 건조한 후, 자외선을 조사하여 제조되는 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 양이온성 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 3-aminopropyl trimethoxysilane(APTMS), 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)인 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치.
  9. (a) 혈액 시료를 제조하는 단계;
    (b) 나노섬유에 양이온성 폴리머를 표면처리하는 단계;
    (c) 상기 양이온성 폴리머가 표면처리된 나노섬유를 2개 이상 적층하고 지지체에 삽입하여 핵산정제 디스크를 제조하는 단계;
    (d) 상기 핵산정제 디스크의 상부에 주사기를 연결하고 하부에 팁을 연결하는 단계;
    (e) 상기 혈액 시료를 상기 주사기의 실린더에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 밀어 상기 혈액 시료를 상기 핵산정제 디스크에 주입하는 단계;
    (f) 상기 팁을 세척액에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 상기 핵산정제 디스크를 세척하는 단계; 및
    (g) 상기 팁을 용출 완충액에 투입하고, 상기 주사기의 피스톤을 상하로 왕복하여 상기 핵산정제 디스크 내의 핵산을 분리하는 단계;
    를 포함하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (a) 단계의
    상기 혈액 시료는 핵산이 포함된 샘플을 비이온성 계면활성제에 용해시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 비이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) X-100, 지방 알코올 에톡실레이트(Fatty acid ethoxylate, FAE), 폴리에톡실레이트 탈로우 아민(Polyethoxylated tallow amine, POEA), 코카마이드 모노에탄올아민(Cocamide monoethanolamine), 코카마이드 디에탄올아민(Cocamide diethanolamine), 글리세롤 모노스테아레이트(Glycerol monostearate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol monolaurate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan monostearate), 소르비탄 트리스테아레이트(Sorbitan tristearate), Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 데실 글루코사이드(Decyl glucoside), 라우릴 글루코사이드(Lauryl glucoside), 옥틸 글루코사이드(Octyl glucoside), 라우릴디메틸아민옥사이드(Lauryldimethylamine oxide), 및 포스핀옥사이드(Phosphine oxide)로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 핵산이 포함된 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 및 혈액카드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계의
    상기 양이온성 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 3-aminopropyl trimethoxysilane(APTMS), 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서
    양이온성 폴리머의 용해액에 상기 나노섬유를 침지하고 세척 및 건조한 후, 자외선을 조사하여 상기 나노섬유에 상기 양이온성 폴리머를 표면처리하는 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계의
    상기 적층된 나노섬유의 최하층에 프리필터(pre-filter)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 (g) 단계의
    상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)인 것을 특징으로 하는 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출방법.
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