JPH04505999A - 医学的健康状態の固相診断法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 医学的健康状態の固相診断法 本発明は、特定ＤＮＡの同定による医学的健康状態の固相診断法に関する。

目的とするＤＮＡ分子は細胞溶解物や他の原材料中に極めて微量にしか存在しな い場合が往々にしてあり、かかるＤＮＡを選択的に増幅させるためにポリメラー ゼチェーシリアクション（ＰＣＲ）法が開発されている。この方法では、目的と するＤＮＡの既知の配列に特異的で、コード鎖の５′末端もしくはその近くでハ イブリダイズするものと非コード鎖の５′末端もしくはその近くでハイブリダイ ズするものとの１対の重合用プライマーを選択して、それぞれのプライマーがポ リメラーゼ存在下で目的ＤＮＡ鋳型の全長にわたって伸びるＤＮＡ配列が生成す るようにする。生じたＤＮＡを次に鎖分離に付す（通常は約９０℃の温度で融解 して行なう）と、新たに生じた一本鎖ＤＮＡ配列が（通常は温度をアニーリング に適した範囲まで低下させた後）混合物中に存在する過剰のプライマーとハイブ リダイズするので、ポリメラーゼ存在下でＤＮＡ鎖がさらに合成される。このと きは２つのプライマーの端と端にはさまれた部分だけ伸長する。ポリメラーゼは 鎖の分離段階で用いる高温に耐え得るもの好ましいが、最近、これに適した好熱 性ポリメラーゼ、即ちＴａｑが入手可能になった。ＤＮＡ合成に必要な２種類の プライマーとヌクレオチドが媒質中に過剰に存在し続けるようにすると、単に上 記の個々の段階に最適な温度の間で温度を上下させるだけで、鎖を合成し、分離 し、プライマーにアニーリングし、さらに新しい鎖を合成するという反復循環過 程を行なうことが可能となる。このように、最初の目的ＤＮＡを指数関数的に増 幅させることができ、比較的短時間で濃度を百万倍も増加させることができる。

しかし、この方法は、プライマーが他のｆ）ＮＡ配列にもある割合で非特異的に 結合するために必ずしも十分な選択性を有するわけではなく、目的ＤＮＡ以外に も他のＤＮＡを増幅する結果となる。プライマーの非特異的結合によってＤＮＡ 試料の様々な部分が無作為に増幅されると、目的＋）Ｎ＾から得られる信号に対 してバックグラウンドとしてのノイズが増加する結果となる。本発明者の実験に よれば、多くの場合、バックグラウンドノイズのレベルが増大するとこの方法の 有用性が著しく損なわれることがある。

分子のクローニングに関して、第１のプライマ一対に取り込まれた第２のプライ マ一対を用いることによってかかるプライマーの非特異結合に関する問題が解決 できると示唆されている。４つの別々の開始反応が起こるようにすると非特異的 増幅をかなり減少させることができる（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋ、Ｂ、）及び ファローナ（Ｆａｌｏｏｎａ、Ｆ。

Ａ、）著メトッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｒｌｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｘ７ｍ ｏｌｏｇｙｌ　（１９８７）　１５５巻３３５〜３５０頁、リンスニック（Ｌｉ ｓｃｈｎｉｋ、Ｌ、＾、）他のニュークレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｈｕｅ 、　＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）　（１９８７Ｎ５巻５２９〜５４２頁、及び米国特 許第４６８３１９５号及び４６８３２０２号を参照）。エンゲルク　（Ｅｎｇｅ ｌｋｅ、　Ｄ、Ｒ，）他は、最初のプライマーのどちらかに取り込まれた１種類 の新しいプライマーだけが目的ＤＮＡのより大きくかつより着実な増幅を導くと 示唆している（プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ ・サイエンシズ・ニー・ニス・ニー（Ｐ＋ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）　（１９８８）　８５巻５４４〜５４８頁）。上記ムリスとファローナ 及び他の著者らの研究結果は主として分子クローニングと配列決定に関するもの である。この分野の研究者の中には、増幅されたＤＮＡがプライマーに対応した 末端を有すること、並びにプライマーが目的ＤＮＡには存在しないような制限酵 素部位を１力所以上組み込み得ることを十分に理解している者もいる。いったん 増幅させると、付着端を与えるような適当な１種類もしくは複数の制限酵素で増 幅ＤＮＡの末端を切断することができる。かかる付着端は次に適当なりローニン グ用ベクター中に目的ＤＮＡを導入するのに使用できる。

増幅された目的ＤＮＡの検出に関しては、ムリス他の米国特許第４６８３１９５ 号に記載されている。従来のサザンプロット法では増幅ＤＮＡを検出するのに標 識プローブが用いられている。この方法は非常に感度の高い効果的な方法である が、非常に時間がかかり（特に放射性標識を使用した場合）、高度の熟練を必要 とし、かつパックグラウンドノイズの原因となる非特異的相互作用を受けやすい 。

特定ＤＮＡの同定による医学的健康状態の診断法としては、上記以外にも、ＤＮ Ａ多型に基づく方法がある。ＤＮＡ多型に基づく　２つの主な方法は、制限断片 長子型ｒＲＦＬＰＪ並びにミニサテライト冬型である。両方法共にＰＣＲ法と組 合わせて用いることがで５きる。両方法共に制限酵素消化にたよっており、これ を電気泳動法及び１つもしくはそれ以上のプローブと組合わせていわゆる「遺伝 学的指紋」を作成するが、遺伝学的指紋を読み取るには電気泳動法の熟練技術者 （特に他の電気泳動ゲルとの比較を要する場合）を必要とする。

従来技術の中で、特定ＤＮＡの同定によって医学的健康状態を診断する単純かつ 迅速な方法で、しかも通常のＰＣＲ法及び電気泳動ゲルの関与する方法の双方に 存在する非特異的結合という欠点のない方法を与えるものはなかった。

二段階ＰＣＲ増幅法と増幅された目的ＤＮＡの固相単離法とを組合わせることに よって、本発明者らは、初期濃度が非常に低い場合であっても格段に減少したバ ックグラウンドノイズの下で、従って従来の診断法よりも格段に正確に、しかも サザンプロット法のような時間のかかる検出段階を行なわずに、目的ＤＮＡを同 定することができることを見出だした。

ＤＮＡを得るためにビオチニル化ｄＵＴＰ用いてＰＣＲ法を行なうことを記載し ている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ第５ｅａｒｃｈ９頁（ １９８８））。ただし、固定化のためにビオチニル基を用いることを示唆する記 載はなく、しかもこの方法においては、末端ビオチン基だけが存在するのではな くて、すべてのウリジン残基にビオチン基が存在する。

モレキュラー・ダイアグノスティックス　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓ ｔｉｃｓ）社の欧州特許第１９２１６８号には、選択性を高めるために、固定化 手段を保有するプローブと検出手段を保有するプローブとの、二重ハイブリダイ ゼーション（目的ＤＮＡとの）プローブを使用することが記載されている。しか し、かかるプローブをＰＣＲ増幅法におけるプライマーとして使用することを示 唆する記載はない。

しかし、かかる系においては、固体担体に固定化できるか或いは標識となり得る ようなプライマーは、ＤＮＡ以外のものと結合した目的ＤＪＩＡに特異的なりＮ Ａ配列を含んでなる場合がほとんどで、かかるＤＮＡ以外のものを化学的手段に よって別個に結合させなければならない。

本発明は特にある方法を与えるが、この方法によれば、ＰＣＲ増幅の最終段階で 用いられるプライマーは、どんな目的ＤＮＡの増幅にも使用できる標準もしくは 汎用ＤＮＡ配列に連結した非ＤＮＡ部分を含み得る。これは、第２段階のＰＣＲ プライマーの少なくとも１つを、目的ＤＮＡとはハイブリダイズしないＤＮＡ配 列を含んでなる「ハンドル」の付いたものにすることによって達成されるが、こ のハンドルは不活性担体又は標識と結合した汎用ＤＮＡ配列に特異的であるので 、後者を種々のアッセイに用いることができ、しかも特定の目的ＤＮＡ配列のた めに特別に合成する必要がない。ハンドルを有する１種もしくはそれ以上のプラ イマーはある特定の目的ＤＮＡに対応するように合成する必要があるが、不活性 担体標識を結合するための化学的方法をわざわざ用いなくとも標準ＤＮＡ合成系 で合成を完了させることができる。特に有用なことは、標準結合リガンドもしく はプローブに予め結合させておいた放射性同位体を用いることができることで、 しかもそれによって放射性物質の局所での化学的取扱い操作を必要とせずにすむ ことである。

この技術は固定化増幅核酸検出（ＤＩＡＮＡＩ法と呼ぶことができる。

本発明においては、特定ＤＮＡの同定による医学的健康状態の診断方法にして、 検体中のＤＮＡを、目的ＤＮＡに特異的な第１プライマ一対を用いたポリメラー ゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法による第１段階の増幅に付し、このよ うにして生じた増幅ＤＮＡを、第２プライマ一対を用いたＰＣＲ法によってさら に増幅しくここで該第２プライマ一対の一方又は両方は、上記第１プライマ一対 のいずれとも異なり、目的ＤＮＡの上記第１プライマ一対とのハイブリダイゼー ション部位間の１力所以上の配列に特異的なものであって、該第２プライマ一対 の一つは固体担体上に固定化されているか或いは後で固体担体に結合させるため の手段を与えられており、かつ第２プライマーのもう一方は標識を保有している か或いは後で標識に結合させるための手段を与えられている）、かかる増幅後に 上記増幅ＤＮＡを保有する固体担体を分離して、それに結合した標識を検出する （ここで上記後で結合させるための手段の一方もしくは両方は、当該プライマー によって保有される遠位ＤＮＡ配列にして目的ＤＮＡとは）１イブリダイズしな いが固体担体又は標識のいずれかに結合した結合パートナ−に対して選択的親和 性を有するような遠位ＤＮＡ配列を含んでなる）ことを特徴とする方法が供せら れる。

適当なポリメラーゼであればどんなものを用いてもよいが、Ｔｇｑポリメラーゼ のような好熱性酵素を用いるのが好ましく、こうすると、各サイクル毎に例えば フレノウフラグメントのようなポリメラーゼをわざわざ添加しなくても上述の温 度サイクルを繰返すことができる。

目的ＤＮＡは、検体中のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであってもよく、本発 明の方法はある特徴的なｍＲＮＡに基づいた診断にも適用できる。かかる予備合 成は逆転写酵素を用いる予備処理によって行なうことができるが、好適にはその 後のＰＣＲ段階で用いられる緩衝液及び塩基と同じ系の中で行なう。ＰＣＲ法は 鎖を分離させるために加熱処理を要するので、逆転写酵素が１回目のＰＣＲサイ クルで不活性化してしまう。ｍＲＮＡが目的とする核酸であれば、最初の検体、 例えば血清検体を、すべてのｍＲＮＡをその末端ポリＡ配列を介して回収するた めに、固定化ポリｄＴオリゴヌクレオチドで処理するのが有利であろう。国際特 許出願ＰＣＴ／ＥＰ８９１００３０４号に記載されているように、上記オリゴヌ クレオチドを次にｃＤＮＡ合成用プライマーとして作用させることができる。

本発明の一つの具体的態様においては、上記のように最初の２段階の増幅を行な った後もＰＣＲ操作を継続し、遠位ＤＮＡ配列もしくは「ハンドル」を有する少 なくとも１つのプライマーを、該ハンドルとハイブリダイズするような第３段階 プライマーで置換もしくは補充し・て、さらに増幅させたときに第３段階プライ マーが増幅された目的ＤＮＡに取み込まれるようにする。かかる第３段階プライ マーは、固体担体に結合しているかもしくは固体担体と結合する手段を保有して いるか、又は標識を保有もしくは標識と結合する手段を保有しているのが有利で ある。上述の通り、この第３段階プライマーは、目的ＤＮＡとは無関係にどんな アッセイにおいても同じまま使用できるような標準ＤＮＡであるのが有利である 。第２段階プライマ一対が共に「ハンドル」を保有していてもよく、ＰＣＲ増幅 の前記第３段階において、かかるプライマーの一方をそのハンドル部分とハイブ リダイズしかつ固体担体（又は固体担体と結合する手段）に結合しているような プライマーで置き換え、もう一方をそのハンドルとハイブリダイズしかつ標識（ 又は標識と結合する手段）に結合しているような別のプライマーで置き換えるで もよ標識は、）２ｐＳｌ（：又は３Ｈのような放射性原子で、上記第２のプライ マ一対の１つに導入すればよい。当然ながら、第２段階のＰＣＲの最後の重合段 階で放射性ヌクレオシドを導入して、第２プライマーに標識を加えることも可能 である。また、標識は、プライマーと直接結合しているか又は例えばプライマー に結合した抗体によって間接的に結合しているような従来の酵素又は蛍光物質で あってもよい。

固体担体又は標識との結合手段は、ビオチン／アビジンもしくはストレプトアビ ジンなどの親和性結合基又は例えばカルボキシルと相互作用をするアミノ基もし くは末端ヌクレオシドでよく、２段階のＰＣＲで得られる二本鎖ＤＮＡが不溶性 担体にその５′末端で強く結合するような手段を末端に有する目的ＤＮＡとＩＩ ｃＩのようなタン１＜り質を介して標識にその３′末端で結合するようなり　Ｎ 　Ａ　／）ンドルとを含んでなる場合には、増幅された目的ＤＮＡは標識によっ て容易に検出でき（例えば酵素着色反応で）、次いで鎖分離に付すと導入した担 体上に固定化された一本鎖ＤＮＡが残る。このようにして固定化されたＤＮＡを さらに操作することができる。例えば、３′末端の標識プライマーを用いて、標 識された２本目の鎖の合成を行なうことができ、そこで鎖分離すると標識一本鎖 ＤＮＡが溶液中に遊離される。同様に、適当な変異導入用プライマーを用いてイ ンビトロ変異導入を行なうことができる。

本発明の特に好ましい具体的態様においては、固定化一本鎖ＤＮＡは、例えば国 際特許出願ＷＯ３９１０９２８２号に記載されているように、例えばサンガー（ Ｓａｎｇｅｒ）他の方法（Ｐ＋ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（ １９７７）　７４巻５４６２〜５４６７頁）を用いて、配列決定に付すことがで きる。また、最初の検出段階を省略し、ＰＣＲ増幅段階で最終的に得られた固定 化一本鎖ＤＮＡについて配列決定することもできる。

どちらの場合にも、一本鎖ＤＮ＾の３′末端に汎用ハンドルを与えることによっ て汎用配列決定プライマーの使用が可能になり、また、嵌込プライｖ−（ｎｅｓ ｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）技術を用いることによって該方法の特異性が増大して非 特異的結合に起因するバックグラウンド「ノイズ」が低下する。

ＰＣＲ増幅法では、極めて少量の目的ＤＮＡを同定することができ、従って異常 を診断することもできるが、増幅が実際にどの程度起こっているのかは正確には 分からないので、検体中に存在する目的ＤＮＡの量に関して定量的な情報を得る ことは困難である。ＤＮＡの一方の末端を固定化しもう一方の末端を標識すると 、ＰＣＨの各サイクルの後もしくは合間に、増幅されたＤＮＡからの信号を読み 取ることが可能になり、それによって各段階の増幅度についてのデーターを得る ことができる。最初の１もしくは２サイクル後は信号が微弱で同定できないこと もあるかもしれないが、各ＰＣＲサイクルにおける信号をプロットして初期段階 まで外挿すれば目的ＤＮＡの初期の量を得ることができる。かかる方法において は媒質から固定化ＤＮＡを取り出す必要があるが、その間に信号を読み取って、 その後再び導入すればよい。固定化用プライマーは、全てのＰＣＲ操作が担体上 で行われるように最初から担体に結合させておくのが好ましい。この目的に特に 好適な担体を与えるものとして磁性ビーズがある。標識は、固定化された標識量 を迅速に読み取ることができるように放射性核種が有利である。上述の通り、標 識結合用の汎用ハンドルを用いることによって汎用放射性標識を用いることが可 能になる。

固体担体は、例えばＤＮＡと結合するように活性化されたポリスチレン製（アル マ−（Ａｌｍｅｒ、　Ｋ、）の博士論文、王立工業大学（Ｒｏｙａｌ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、スウェーデン国ストックホルム （１９８８））の微量滴定ウェルもしくは計量棒（例えばプラスチック片）など の形態も取り得る。例えばアガロース、セルロース、アルギン酸、テフロン又は ポリスチレンなどでできた粒子、繊維並びにキャピラリーが特に好適である。

本発明のＰＣＲ操作は、従来のＰＣＲ緩衝液系中で行なう。

外側プライマ一対を用いて第１段階の増幅を行なった後に、第２段階のＰＣＲ用 の新たなプライマー（対）と共にさらにＰＣＲ緩衝液を添加して、増幅生成物及 び残存プライマー分子を希釈するのが有利である。一般に、希釈率は好適には大 きい、例えば約１００：ｌというような、２ｏ：１から２００の範囲内にある。

なお、例えば１：１のように低い希釈率でも有効ではあるが選択性が低くなる。

ＰＣＲ緩衝液は通常６．８乃至７．２のｐＨ範囲にあり、トリス／塩酸（Ｔ＋目 ／ＨＣＪ）が適した緩衝液の一つである。鎖分離は好ましくは９０乃至９５℃の 範囲の温度で行ない、プライマーのアニーリングは４５乃至５５℃で、ＤＮＡ合 成は６５乃至７５℃で行なうのが好ましい。

特に好適には、固体担体は磁性粒子を含んでなる。好ましい磁性粒子はダイナル 社（Ｄｙｎａｌ　ＡＳ、ノルウェー、オス口）製の超常磁性ビーズである。第２ プライマ一対の一方を磁性ビーズに固定化し得るが、この粒子は第２段階のＰＣ Ｒ増幅時に既にプライマーに結合していても或いはその後で添加してビオチニル 化増幅目的ＤＮＡと反応させてもよい。

磁性粒子を用いた場合の幾つかの利点は極めて顕著である。磁性粒子を、目的核 酸を含んだ混合物（例えば細胞抽出液）に加えると、攪拌した後に容器の片側に 磁気的に引き寄せることができる。しかる後に液体を不必要な成分と共に取り除 くことができ、ＲＮＡの結合した磁性粒子を洗浄用溶液中に再分散させることが できる。洗浄段階を間断なく何度も繰り返すことができる。目的核酸を得る全過 程を１５分未満で行なうことができる。

さらに有利な点は簡便さにあり、粒子を時々磁気的に集合させて、粒子上の物質 又は上清中の物質のいずれかに結合した標識をアッセイすることによって、ハイ ブリダイゼーションもしくは磁性粒子を用いて行なういかなろ過程をも連続的に モニターできる。

粒子の分離に磁気的な凝集を用いる方法は、核酸やタンパク質を分断してしまう 可能性のある剪断力を発生するような遠心分離などの従来の分離法よりは格段に 穏やかな方法である。

好ましい粒子は単分散型でしかも超常磁性のものであり、かかる両特性は粒子の 関与する反応の反応速度に大きく貢献する。種々の反応において、粒子に担持さ れたプローブが溶液中に遊離状態で存在する場合と実質上同じ速さで反応するこ とは本発明の驚くべき特徴である。

従って、例えば、細胞溶解物からのｍＲＮ＾の全単離過程が、アフィニティーカ ラムを用いると２時間もかかるのに対して、磁性ビーズを用いると約１５分以内 で達成できる。

はぼ同じ大きさの粒子からなる単分散粒子を用いると、反応速度及びその他のパ ラメーターが著しく均一になる。

超常磁性粒子（常磁性を維持するのに必要とされるドメインサイズよりも小さい 強磁性体並粒子を含む粒子である）を用いると、反応の間の粒子の磁気的凝集も しくは集合を避けることができるので、この場合も均一かつ迅速な反応速度が確 保できる。従って、かかる粒子は磁場を与えることによって表面上に均一な速さ で容易に集合させることができ、また後段での処理のために容易に再分散させる ことができる（例えば物理的攪拌によって）。

このような挙動の均−性並びに反応の迅速性は自動化に特に適しており、工業的 生産及び／又は反復過程に必要とされる数多くの核酸操作に不可欠な要件である 。最も重要なことは、反応及び分離が適当な機械で完全かつ確実に行なえること であり、このとき介在する人手は最低限度ですむ。

本発明で用いる磁性粒子として好ましいものは、欧州特許第８３９０１４０６． ５号（シンテフ（Ｓｉ＋ｕｅり）の記載に従って製造した単分散型超常磁性ビー ズである。かかるビーズにおいては、鉄が非常に均一に分布していて磁場に対し て非常に均一な応答をするが、かかる性質は、すべてのビーズが同じ速さで移動 するために、再現性のある手順、特に自動化された手順を設計する上で重要であ る。

さらに、ある量の鉄を再現性をもって個々の粒子に組み込むことができるので、 この量を粒子の比重が後述の範囲内に収まるような比較的低いレベルに調節する ことができる。これより幾分均一性の劣る製品の場合、小さい粒子が余りに少量 の鉄しか含んでいないため磁石を当ててもブラウン力に抗することができなかっ たり、或いは大きな粒子がその比重によって不本意にも沈降してしまうかのいず れかであった。若干の自動化された系においては、溶液通過時に反応領域内に粒 子をとどめておくために磁場を用いており、このような系で用いる磁性粒子には 均一な磁気的特性と流動的特性が不可欠である。

本明細書中で用いる「単分散」という用語は、直径の標準偏差が５％未満である ような粒度分布を包含した意味で用いる。

比重１．１乃至１．８のビーズの使用が好ましいが、最も好ましいものは比重１ ．２乃至１．５のものである。本発明テ用いる単分散型ビーズの比重は、上述の 通り、特に均一で、均一かつ予測可能な速度論的性質が得られる。

好適には、上記単分散型粒子は、直径１ミクロン以上、好ましくは２ミクロン以 上であって、好ましくは１０ミクロン以下、最も好ましくは６ミクロン以下（例 えば３ミクロン）の球状ビーズである。粒子が小さいほどゆっくりと沈降するの で、沈降時間が反応時間よりも長（なる場合もあり、この場合物理的撹拌を必要 とせずに済む。

しかし、格段に直径の小さい微細粒子を含んだ平均直径０．１乃至Ｉ、５ミクロ ンのビーズは磁化に対する応答に信頼性の欠ける挙動が見られる。

上記粒子へのプローブの結合は直接的な化学結合だけでなく、ストレプトアビジ ン／ビオチン複合体などによる親和性結合であってもよい。

プローブとの結合用に、磁性粒子は水酸基、カルボキシル基、アルデビド基又は アミノ基などの官能基を保有していてもよい。これらの官能基は、一般に、かか る官能基のいずれかを保有するポリマーの表面コーティングを与えるような処理 を未被覆単分散型超常磁性ビーズに施すことによって与えることができ、例えば 、水酸基を与えるにはポリグリコールとポリウレタン、又はセルロース誘導体で 、カルボキシル基を与えるにはアクリル酸もしくはメタクリル酸の重合体又は共 重合体で、アミノ基を与えるにはアミノアルキル化ポリマーで処理する。

かかる表面の被覆導入法は米国特許第４６５４２６７号明細書。

に記載されている。

本発明で用いる好ましい被覆粒子は、米国特許第４３３６１７３号、同第４４５ ９３７８号及び同第４６５４２６７号明細書に記載されたビーズの修飾によって 調製し得る。例えばスチレン−ジビニルベンゼンでできた直径３．１５μｍのマ クロ網状多孔質ポリマー粒子を１（ＮＯ３で処理すると細孔表面に−ＮＯ２基が 導入される。次に、この粒子をＦｅ”の水溶液に分散させる。Ｆｅ”が−ＮＯ２ 基によって酸化されて、細孔内部で不溶性のオキシ−ヒドロキシ化合物が沈殿す る。

加熱すると、鉄は磁性鉄酸化物の微細粒子として上記多孔質粒子全体に存在する ようになる。ＮＯ２基はＦｅ”との反応で還元されてＮＯ２基となる。

細孔を満たし、かつ表面に所望の官能基を導入するために、種々のモノマーを細 孔内部及び表面で重合させる。

好ましい種類の粒子においては、表面は−（Ｃｆ１２ＣＨｚＯ１ｓ−ｔ。

結合を介してポリマー主鎖に連結した一〇Ｈ基を保有する。

その他の好ましいビーズにおいてはメタクリル酸の重合によって得られる一ＣＯ ＯＨ基を保有する。

従って、例えばビーズに最初からＮＯ２基が存在していれば、それを米国特許第 ４６５４２６７号明細書の記載に従ってジエポキシドと反応させ、続いてメタク リル酸と反応させると末端ビニル基が得られる。メタクリル酸との溶液共重合に よって、後述のＲ４５２ビーズのような末端カルボキシル基を有するポリマーコ ーティングが得られる。

同様に、上述のジエポキシドとの反応生成物をジアミンと反応させることによっ てＲ２４０、Ｒ４４２及びＲ４６９ビーズでみられるようなアミノ基が導入する ことができ、アミノグリセロールのようなヒドロキシルアミンとの反応によって Ｒ４５０及びＬ２５５ビーズでみられるような水酸基が導入される。

ダイナル社（ノルウェー、オス口）から入手可能なダイナビーズ（Ｄ７ｎａｂｅ ａｄｓ）　Ｍ４５Ｇ　（直径４．５ミクロン）は単量体エポキシドでコートされ ており、エポキシ基と水酸基の混合体を生ずる。しかし、水と接触させるとエポ キシ基は水酸基に変化する。

ダイナビーズＭ２８０　（直径２．８ミクロン）は水酸基を有するポリスチレン ビーズであるが、水酸基はｐ−トルエンスルホニルクロライドとの反応でトシル オキシ基へ変化させである。

本発明者らは、上記のような官能基を有するコーティングを使用すると、ＤＮＡ 及び／又はＲＮＡの非特異的結合が極めて少なく、特にカルボキシル化ビーズを 使用した場合に顕著であることを発見した。

プライマーはカルボキシル基を介して磁性粒子に結合させることができ、まずＤ ＮＡの５′末端にアミノ基を与えておけば、カルボジイミドカップリング剤を使 用することによって上記カルボキシル基とのアミド結合を生じさせることができ る。ＤＮＡの５′末端での結合は、５゛−アミノＤＮＡと反応するようにＣＮＢ ＋で活性化した水酸基保有磁性粒子を用いても達成できる。

プライマー０８人の３′側の結合は化学合成によっても達成できる。前述の通り 、単分散粒子は非常に均一な特性を有するので、ジーン・アセンブラ−（Ｇｅｎ ｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ。

ファルマシア社（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ　ＡＳ）製）のような自動合成装置中での 合成に特に適した一定の反応速度を与える。磁性粒子は最初に水酸基又は保護さ れた水酸基を与えておく必要がある。ダイナル社製のダイナビーズＭ２８０はこ の目的に十分に適合している。しかし、必要であれば、カルボキシル基のような その他の表面官能基を、水酸基保有リンカ−１或いは３′−結合ヌクレオチドと の結合に用いることができる。

５′末端での結合は、５′−アミノ−オリゴヌクレオチドをトシル活性化磁性粒 子にカップリングさせることによって達成できる。後者はダイナビーズＭ２８０ 　（ダイナル社製）のような水酸化磁性粒子をトシル化することによって調製し 得る。トシル基の置換によって磁性ビーズに直接結合した５′アミノ基が残る。

プローブは単にｍＲＮ＾の単離に用いられるだけであるが、プローブの３′末端 を磁性粒子に結合させてもよい。かかる結合は、ＤＮＡの３゛−リン酸基と該粒 子のアミノ基との間のホスホルアミデート結合によって都合よく行なうことがで きる。

ビオチンで標識されたヌクレオチドは市販されているので、ＤＮＡフラグメント の３′末端をＤＮＡポリメラーゼで容易にラベルすることができる。これらは、 例えば水酸基を介して磁性粒子に結合したアビジンや又はストレプトアビジンに 簡便に結合させ得る。立体的障害を最小限に抑えるために、１個以上のε−アミ ノカプロン酸部分のようなスペーサーアームによってビオチン標識をヌクレオチ ドに結合させてもよい。例えば、二本鎖プラスミドを制限酵素部位で切断して末 端をビオチン化ヌクレオチドで埋めると、各々の鎖の３′末端にビオチンを与え ることができる。該線状化プラスミドを次に別の制限酵素で切断すれば、二本鎖 ＤＮＡの一部分が切り取られてストレプトアビジン被覆ビーズに結合し得る。ビ オチン化されていない鎖を除去すれば、ビーズに結合したビオチン結合オリゴヌ クレオチドが残る。

一般に、ビーズの官能化とその後段のプローブの結合は、好適には個々の磁性粒 子カ月０３〜１０６のプローブ（１〜ｌＯＱｐｍｏｌ／■）を保有するようにす る。磁性粒子が均一な粒度を有していれば、プローブが該粒子と反応する際のプ ローブ密度の均一性を担保する上で有利である。プローブの密度の均一性は、か かるプローブを用いる様々なプロセスにおいて全てのプローブが実質的に同じ挙 動を取るようにするのに重要である。

粒子表面の極めて近傍（例えば７塩基以内の場所）で酵素活性がみられることは 、単分散型超常磁性粒子の特筆すべき特徴の一つである。ビーズがカルボキシル 化ダイナビーズである場合、ビーズの微細表面は極めて不規則で非常に大きな表 面積を与えるので、ビーズ表面付近でのハイブリダイゼーション及び酵素活性に 対する立体障害が低下する。その一方で、かかるカルボキシル化ビーズへの非特 異的結合は増加しない。

本発明は、本発明を実施するためのキットをも包含する。かかるキットは通常少 なくとも以下の構成部分＝（８）微量滴定用ウェルもしくはかかるウェルが整列 したもの、計量棒又はビーズ、より好ましくは磁性ビーズなどの固体担体にして 、（ｉ）増幅された目的ＤＮＡに結合させるための手段、■プライマーに結合さ せるための手段又は（ト）プライマー、を保有する担体、（ｂ）　（ｉ）増幅さ れた目的ＤＮＡに結合させるための手段、■プライマーに結合させるための手段 又は０プライマー、を保有する標識、 （Ｃ）外側プライマ一対及びＤＮＡハンドルを有する１種以上の内側プライマー 、ただしこれらは上記の（ａ）の担体又は（ｂ）の標識と結合していない、（ｄ ）好ましくは熱安定性であるポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、 （ｅ）　ＰＣＲ反応用の緩衝液、及び （【）固定化ＤＮＡを保有する担体を洗浄するための洗浄用緩衝液 を含んでなる。

酵素標識を使用する場合、上記キットは好適には酵素の基質及び検出系の他の成 分を含む。

担体が計量棒である場合、何種類かの異なる目的ＤＮＡ分子と相互作用し得る複 数のゾーンをかかる計量棒に与えて、幾つかの病態の同時診断を実施できるよう にすることもできる。従って、かかるゾーンは目的とする　Ｄ　Ｎ　Ａにそれぞ れ特異的なプライマーを保有する。

本発明を以下の実施例及び図面によって説明するが、これらは本発明を限定する ものではない。

図１は、例１で使用したオリゴヌクレオチドＲＩＴＩからＲＩＴ７までを示した ものである。

図２は、例２で使用した追加オリゴヌクレオチドＲＩ７８からＲ１Ｔｌ１までを 示したものである。

図３は、例１（ａ）での、目的ＤＮＡの配列中へのビオチン及び標識の導入を図 解したものである。

図４は、例１（ａ）の結果を示したもので、ＰＣＲサイクルに対して相対的標識 活性をプロットしたものである。

図５は、例１　（ｂ）での、目的ＤＮＡの配列中へのビオチン及び標識の導入を 図解したものである。

図６は、例１（ｂ）の結果を示したもので、ＰＣＲサイクルに対して相対的標識 活性をプロットしたものである。

図７は、例１（Ｃ）での、目的ＤＮＡの配列中へのビオチン及び標識の導入を図 解したものである。

図８は、例１（Ｃ）の結果を示したもので、ＰＣＲサイクルに対して相対的標識 活性をプロットしたものである。

図９は、例２の結果を示したもので、ＰＣＲサイクルに対して相対的標識活性を プロットしたものである。

図１０は、ＤＮＡフラグメントの精製並びに検出におけるＤＮＡ結合性融合タン パク質の使用を図解したものである。

図１１は、１ａｃＩ遺伝子への変異導入を図解したものである。

図１２は、例３（ｂ）のｌａｃオペレーター配列を有するＤＮＡフラグメントの 固定化及び溶離によって得られた試料の５Ｏ５−ＰＡＧＥゲルを示したものであ る。

図１３は、例３においてスタフィロコッカス・オーレウス　（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ 　）に対して使用した幾つかのオリゴヌクレオチドを示したものである。図２の ＲＩＴＩＩと同様に、ハンドルプライマーＲＩＴ１２はｌａｃオペレーター配列 を含んでおり、ＲＩ７６はビオチン５′末端を有している。

図１４は、ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ及びスタフィロコッカスのタンパク質＾遺 伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを用いてスタフィロコッカス拳オーレウ スの検出を行なった例３（Ｃ）の結果を示したものである。

図１５は、ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ及びストレプトコッカスのタンパク質Ｇ遺 伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを用いてストレプトコッカス６１４８の 検出を行なった例３（Ｃ）の結果を示したものである。

図１６は、例４でプラスモジウムΦファルシパルム（Ｐユｔａｌｃｉｐａ＋＋＋ ｍ　）のＰ１１５５遺伝子の検出に使用したオリゴヌクレオチドプライマーをフ ァバローロ（Ｆａｖａｌｏ＋ｏ）他（１８）の記載したアニーリング部位と共に 示したものである。

図１７は、例４のプラスモジウム・ファルシパルムの検出結果を示したものであ る。顕微鏡観察により決定したｌ検体当りの寄生虫数を示す。活性は１分間当り の４５０ｎｍにおける色変化によって決定した。

図１８は、固定化増幅核酸の比色検出とそれに続く直接固相配列決定に関するＤ ＩＡＮＡ法のおおまかな概念を図解したものである。

検出には、ｌａｃ　ｌ−１ａｃＸ融合タンパク質を使用し、固体担体として磁性 ビーズを用いた。

図１９は、目的とするクラミジア・トラコマティス（！ｌ。

ｔ＋ｘｃｈｏｍａｊｉｓ）のＣｔＰ遺伝子の配列、並びに検出用プライマー（Ｒ ＩＴ２３−２６）と配列決定用プライマー（ＲＩＴ４３）の配列を示したもので ある。臨床検体（図２２）のゲノムを配列決定することによって決定した変異を 示す。番号は、Ｃ１ａｒｋ他（２０）の記載したヌクレオチドを引用した。プラ イマーＲＩＴ２４とＲＩ７２６の配列が図示した配列と相補的であることに留意 されたい。ＲＩ７４３は、第２段階の増幅で導入したｌａｃオペレーター配列（ ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡ−５’　）とハイブリダイズする 。

図２０は、増幅フラグメントがビーズに結合すること並びに内側及び外側フラグ メントの大きさを明らかにしたアガロースゲルを示したものである。レーン１と レーン２は第２段階の増幅によって得られたものであり、レーン３とレーン４は 外側フラグメントから得られたものである。レーン１とレーン３は結合させてい ないものであり、レーン２とレーン４はビーズ結合後の上清である。

マーカーはＰｇｆｌで消化したλ　ＤＮＡである。各フラグメントの長さが予想 された大きさくそれぞれ２６７塩基対と４２１塩基対）であることに留意された い。

図２１は、臨床クラミジア検体についてＤＩＡＮＡアッセイを行なった結果を示 したものである。一般的な細胞培養法（３５）で行なった臨床アッセイの結果は （＋／−）で示しである。ＤＩＡＮＡの活性は「材料及び方法」の項に記載した ように定義される。検体８は、培養クラミジア・トラコマティスの陽性対照検体 であり、検体９はＰＣＲ反応に対する陰性対照検体（このチューブには鋳型ＤＮ Ａを加えていない）である。

図２２は、陽性クラミジア検体の一つ（図２１１番１号）のＤＮＡ配列を決定し た結果を示したものである。この配列決定は、汎用蛍光標識プライマーＲＩ７４ ３を用いて図１８に示した方法で行なうた。解析は、ＡＬＦ自動自動レーザー蛍 光シークエンサブァルマシア社、スウェーデン）を該製造業者の説明書通りに用 いて行なった。

を宿主菌として用いた。使用したプラスミドベクターは、　ｐｓｌ、！（３）　 、ｐＥＭＢＬ９　（４）　、ＩＩＤＭｌ、１（５）　、ｐＮＳＥＱｌ　（６）　 、ｐＥｚ２Ｔ３０８　（７）　、及びｐＳＫ３１０４　（８）　テある。

Ｍ１３ＫＯ？　（９）を変異導入時のへルバーファージとして使用した。実施例 においてスタフィロコッカス・オーレウス　（Ｓｔａｐｈ７１ｏｃｏｃｃｕｓ　 ａｕｒｅｕｓ）’３Ａｌ１３　（１０）　、ストレプトコッカス　（Ｓｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ）　Ｇ１４Ｂ　（ＩＩ）及びバチルス・サチリス　（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓＮ６ｇ　（１２）を使用した。

これらの菌体は、３７℃で一晩ＴＩＩＡＢ、プレート（ディフコ社（［１ｉｆｃ ｏ、米国）製）上で単一コロニーとして増殖させた。

クラミジア・トラコマティス　（Ｃ，ｔｒａｃｈｏｍａ’ｓ）バイオパール（ｂ ｉｏｖａ＋）Ｌ２株は、イエヴレ　（Ｇａｖｌｅ）病院（スウェーデン）のナル ペ（Ｇｎａｒｐｅ、　Ｈ）氏から提供されたものである。臨床検体は男性の尿道 から綿棒で得たもので（力ロリンス力（Ｋａ＋ｏｌｉｎｓｋａ）病院、スウェー デン国ストックホルム）、４℃のＰＣＲ緩衝液（後述のｒＰＣＲ増幅」の項を参 照）中に保存したものである。患者血液から得たプラスモジウム・ファルシパル ム　（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒ＋＋ｍ　）寄生体は、ツォルク（ｚｏｌｇ）他の記 載（１３）に従って調製し、顕微鏡観察はギムザ血液塗沫染色法（１４）に従っ て行なった。菌株及びプラスミドは、王立工業大学（スウェーデン国ストックホ ルム）の生化学材に寄託されてスタフィロコッカスのタンパク質Ａ遺伝子又はス トレプトコッカスのタンパク質Ｇ遺伝子（図１１図２又は図１３参照）と相補的 な１２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（ＲＩＴＩ　−ＲＩＴＩ２）は、自 動ＤＮＡ合成機（ジーン・アセンブラ−、ファルマシア社製）を製造業者の説明 書通りに使用して、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｌｅ）法 で合成した。上記プライマーの中の２種類（ＲＩＴＩ及びＲＩＴＥ）は５′末端 にアミノ基を加えて合成し、該アミノ基は製造業者（ファルマシア社）の説明書 通り後段でビオチン誘導体（１５）を導入するために用いた。ＲＩＴ２、ＲＩＴ ７、ＲＩＴＩＩ及びＲＩＴＩ２は、「モレキュラー・クローニングニア・ラボラ トリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａしａｂｏｒａ ｔｏｒ７　ＭａｎｕａｌｌＪ　（１６）に記載されている通り、丁４ポリヌクレ オチドキナーゼ（ファルマシア社製）を使用して、［７−”Ｐ］　−ＡＴＰ　（ 米国のデュポン（ＤｕＰｏｎｔ１社製）で標識した。

クラミジア・トラコマテイス（２０）に相補的な４種類のオリゴヌクレオチドプ ライマー（ＲＩＴ２３〜ＲＩＴ２６）、プラスモジウム・ファルシパルム（２１ ）に相補的な４種類のプライマー（ＲＩＴ３３〜ＲＩＴ３６）　、及び汎用配列 決定用プライマー（ＲＩ７４３）は、上述の通り合成した。２種類のプライマー （ＲＩＴ２５とＲＩＴ４３）は、５′末端にアミノ基を加えて合成し、該アミノ 基は製造業者の説明書通り後段でビオチン（クローンチック（Ｃ：ｏｎｅｔｅｃ ｈ）社製）及び蛍光基（ファルマシア社製）を導入するために用いた。

ＲＩＴ２５と１ＩＩＴ４３はファルマシア社製のＦＰＬＣｐｅｐＲＰＣ５１５カ ラムを使用して精製した。

制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びフレノウ　ＤＮＡポリメラーゼは、供給元（ ファルマシア社、二ニー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）社及びべ一リンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ＋ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社）の推奨条件下で使用した。ＤＮＡの取扱いは、文献（ １６）に記載されている通りに行なった。

タンパク質及び酵素のアッセイ 細胞抽出液は超音波処理（１８）によって得た。融合タンパク質ｌｘｃ　Ｉ　− ＳＰＡは、ＩｇＧファースト、フロー、セファロース（Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　５ ｅｐｈａｒｏｓｅ、７　フルマシア社製）を用いて製造業者の推奨条件下でＩｇ Ｇアフィニティークロマトグラフィによって精製し、０．３Ｍ酢酸（ｐＨ３，３ ）で溶離した。フラクションを回収して凍結乾燥した後、３．５％スタッキング ゲルと１３％分離ゲルを使用した５ｔ）Ｓ−ＰＡＧＥ分析をレメリ（Ｌａｅｍｅ ｌｌｉ）　（ｉ９）の方法に従って行なった。

ゲルはクーマシーブルーで染色した。

機能的１ａｃ！遺伝子を含有する組換え体は、文献に記載された通り（ＩＳ）　 、Ｘ−ｇａｌ　（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト シド）プレート上に植えてアッセイした。β−ガラクトシダーゼは、０ＮＰＧ　 （ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）を供給元の推奨通りに用いた比 色法でアッセイした。アルカリホスファターゼは、０、１ＭグリシンとＩＱＩＭ 　ＭｇＣｌ２からなる緩衝液（ｐＨ１０，４）中の１５．２ｍＭのｐ−ニトロフ ェニルリン酸（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）を基質として用いて、３７℃でアッ セイした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合物はベーリンガー 参マンハイム社から得た。

ＰＣＲ増幅 インビトロ増幅はテクネ・プログラマブル・トリブロックＰＨＣ−１（Ｔｅｃｈ ｎｅ　Ｐ＋ｏｇａ＋ｍａｂｌｅ　Ｄｒｉ−ｂｌｏｃｋ　Ｐ）ＩＣ−１゜テクネ（ Ｔｅｃｈｎｅｊ社、英国）上で行なった。汎用ＰＣＲ溶液は、パラフィン油層下 に、６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ８，８）、１６、６ｍＭ　（ＮＨ４） 　２ＳＯ４，６，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭβ−メルカプトエタノール及び １７０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含有する溶液中に溶解したプライマー各１ｍＭ及び ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ各２００＋＋Ｍであった。ＴＢ ＡＢプレートから単一コロニーを滅菌パスツールピペットで採取し、ＰＣＲ溶液 １ｈｊ　（Ｎａｖａｌでｐｉ（１０に調整）の入った０、５μＩ微量遠心チユー ブ（ケミラ（Ｋｅｍｉｌａ）社製、スウェーデン）に加えた。このチューブを温 度ブロックに移して９５℃で５分間加熱して菌体を溶解した後、室温に冷却した 。次いで、この溶液に、６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐ）ｌ　７）、１６．６ ｍＭ　（ＮＨ４）　２ＳＯ４，６、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭβ−メルカプ トエタノール、１７０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ及び１ユニツトのＴａｑＩＤＮＡポリ メラーゼ（ストラータジーン（Ｈ＋ａｔａＨｎｅ）社、米国）を含有する溶液を 等量添加してｐＨを８．８に調整した。以下のプログラムからなる温度サイクル を開始した。即ち、９２℃で１分間の鋳型の変性、５０℃で２分間のプライマー のアニーリング及び７２℃で１分間のプライマーの伸長である。サイクルを５回 繰返すごとに、５μｌの溶液を磁性ビーズ結合用の新しいチューブに移した。

磁性ビーズへの結合 共有結合したストレプトアビジンを含む磁性ビーズはダイナル社（ノルウェー、 オス口）から得た。ＰＣＲ法を用いてインビトロ増幅した後の溶液５μｍを、１ ５８μｇの磁性ビーズと共にｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（ｐＨ７，５）及び ｌ　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡＩＱ１＋１を含む溶液に添加した。この溶液を室温で３０ ｎ間インキュベートし、次いで３５ｐｌの５ＭＮａＣ７，続いてＩｌｌ　ｍＭＴ ＋１ｓ−ＨＣＪ、ＩｍＭ　ＥＤＴ＾（ｐＨ７，５１で繰り返し洗浄し、て未結合 ＤＮＡを除去した。この手順を行なう間、ネオジム−鉄−ホウ素常磁性磁石（ダ イナル社）を使用してチューブ中にビーズを保持した。最後の洗浄前に、ビーズ を新しいチューブに移して、放射性標識のバックグラウンド結合を取り除いた。

放射性標識の検出 磁性ビーズを含むチューブをシンチレーション用バイアルに移して、放射線をシ ンチレーション・アナライザー（Ｓｃｉｎｔｉｌｌｊｔｉｏｎ　Ａｎａ１７ｚｅ ｒ、Ｔｒｉ−ｃａｒ　１５００、パラカード社（Ｐａｃｋｉｔｄｌ製）で検出し た。

オリゴヌクレオチドＲ１ＴｌとＲＩＴ２　（図１）を使用して、図３に図解した 実験を行なった。ＲＩＴＩは５′末端がビオチン化されており、ＲＩＴ２は５′ 末端が１２ｐでラベルされている。スタフィロコッカス由来のタンパク質Ａ遺伝 子に対して特異的な上記プライマーを使用して、種々の細菌の菌体を用いた３組 の実験を行なった。まずタンパク質Ａ遺伝子を有するスタフィロコッカス・オウ レウスの菌体、並びにこの遺伝子を欠いた２種類の対照菌体、即ちバチルス・サ チリスとストレプトコッカスである。ＰＣＲ及びその後の磁性ビーズへの固定化 を３５サイクル行なった結果を図４に示す。図に示されている通り、ＰＣＲ反応 の間に標識の取り込みが増大した。しかしながら、対照試料（バチルス・サチル ス及びストレプトコッカスＧ１４８）に対しての高いバックグラウンドも得られ た。

この例は、インビトロで増幅したＤＮＡフラグメントに標識を導入するのにＰＣ Ｒをプライマ一対と共に使用できることを示している。しかしながら、ＤＮＡ又 は他の染色体ＤＮＡがランダムに伸長してしまうために、特異性はほとんどもし くは全く得られない。

本発明に従って特定ＤＮＡ配列の増幅を行なった。二重ポリメラーゼチェーシリ アクション（Ｄ−ＰＣＲ）と名付けた概念を図５に図解する。検出すべき菌体の 配列に特異的なプライマ一対を、インビトロ増幅の第１段階に使用する。温度サ イクルを適当な回数（例えば５乃至３０サイクル）繰返した後、試料を例えば１ ：１で稀釈して、新しいプライマ一対を添加する。これらのプライマーは第１段 階で増幅されたＤＮＡフラグメントの内側の部分に対して相補的である。第２プ ライマ一対は、その５′末端に親相性ハンドル（ビオチンなど）もしくは標識（ 同位体など）のいずれかを有している。ＰＣＲサイクルを追加して行なった後、 増幅物を固体担体に結合させて標識を検出する。この概念の裏にある根本原理は 、第１段階のＰＣＲ反応の間に、第２段階のＰＣＲ反応のための特異的鋳型が多 量に得られるということである。こうすると、例１（ａ）でみられるような、ビ オチンと標識を含有するＤＮＡフラグメントの非特異的増幅が低下する。

この概念がスタフィロコッカス・オーレウスの特異的検出に適用できるか否かを 検討するために、オリゴヌクレオチドＲＩ７３とＲＩ７４　（図１参照）を用い て第１段階のＰＣＲ反応を行なった。ただし、低濃度のプライマーを用い（各プ ライマー０．２ｍＭずつ）、温度サイクルを２５回しか行なわなかった。２５サ イクルの後、ヌクレオチドを含有する緩衝溶液で混合物を１：１に稀釈し、さら にｌユニットのＴａｑポリメラーゼを、１ｍＭのオリゴヌクレオチドＲＩＴＩ及 びＲＩＴ２　（５’末端にそれぞれビオチンと３２ｐを有する）と共に添加した 。種々の回数でサイクルを行なった後、５μＩのＰＣＲ混合物を取り出して、ス トレプトアビジン担持磁性ビーズに結合させた。

種々のサイクルにおいて標識ビーズを検出した結果を図６に示す。対照菌体（バ チルス・サチルスとストレプトコッカスＧ１４８）に対するバックグラウンドと しての標識量は低く、一方、特異的菌体（スタフィロコッカス・オーレウス）に 対する標識量は高かった。

この例は、高レベルの標識をＰＣＲ増幅物に導入できること、並びに本明細書中 に記載した固相技術を用いて検出できることを示している。嵌込（ｎｅｒｔｅｄ ）プライマーを使用することによって、バックグラウンドの標識量を減少させる ことができる。

汎用プライマ一対を用いて、固体担体と標識とをインビトロ増幅物に導入する新 しい手法を図７に示す。１（ｂ）に記載した二重ＰＣＲ法を用いて、ＤＮＡ領域 の特定部分の配列を増幅する。第２プライマ一対は、各々の５′末端に、分析す べきＤＮＡとは相補的でないある特定のハンドル配列を含んでいる。このように して、第２段階のＰＣＲで増幅された物質は２種類の異なるハンドル配列がその 末端領域に導入される（図７参照）。それぞれビオチン又は標識を含む汎用プラ イマ一対を用いる第３段階のＰＣＲをその後で行なう。そうすると、増幅物はビ オチン化されかつ標識される。固体担体に結合させた後、結合標識量を検出する 。

この概念を検討するために、スタフィロコッカス・材−レウス、バチルス・サチ ルス及びストレプトコッカスＧ１４８の菌体をそれぞれ別個に用い、図１に示し たオリゴヌクレオチドを用いてインビトロ増幅を行なった。

１（ｂ）に記載した通り、第１段階のＰＣＲにＲＩＴ３とＲＩＴ４を使用した。

２５サイクル後、混合物をヌクレオチド含有緩衝溶液でｌ：ｌに稀釈し、さらに １ユニツトのＴａｑポリメラーゼを、１ｍＭのオリゴヌクレオチドＲＩＴＩ、Ｒ ＩＴ２、ＲＩＴ６（５′末端にビオチンを有する）及びＲＩＴ２　（５’末端に ３２Ｐを有する）と共に添加した。種々の回数でサイクルを行なった後、５μｌ のＰＣＲ混合物を取り出して、上述した通りストレプトアビジン含有磁性ビーズ に結合させた。

異なるサイクルにおいて標識ビーズを検出した結果を図８に示す。対照菌体（バ チルス・サチルスとストレプトコッカスＧＩ４８）に対するバックグラウンド標 識量は比較的低く、一方１５サイクル後の特異的菌体（スタフィロコッカス・オ ーレウス）に対する標識量は高かった。

この例は、汎用ビオチン及び標識プライマーを用いることによって、高レベルの 標識を特異的にＰＣＲ増幅物に導入できることを示している。上記プライマーは 検出したＤＮＡと相同なものではないが、バックグラウンドを低レベルに抑える ことができた。

ストレプトコッカスのタンパク質＾遺伝子（図１）又はスタフィロコッカスのタ ンパク質Ｇ遺伝子（図２）のいずれかに特異的なオリゴヌクレオチドを使用して 、ハンドル法を用いる特定ＤＮＡのＤ−ＰＣＲ検出をさらに試験した。スタフィ ロコッカス・オーレウスＳ＾１１３、バチルス・サチルス１６８又はストレプト コッカス６１４８のいずれかの菌体を二組のオリゴヌクレオチドで分析した。

第２段階のＰＣＲがＲＩＴ５、ＲＩＴ６　（ビオチンを有する）とＲＩ７２　（ ”　Ｐで末端標識）の３種類のオリゴヌクレオチドしか含んでいなかったことを 除いては、例１に記載した通り、スタフィロコッカス遺伝子の検出を行なった。

ストレプトコッカス遺伝子の検出は、第１段階のＰＣＲ（２５サイクル）に対し てはプライマーＲＩＴ８及びＲＩＴ９を使用し、第２段階のＰＣＲに対してはＲ ＩＴＩＯ１ＲＩＴ６　（ビオチンを有する）とＲＩＴｌｌ　（３２Ｐで末端標識 ）を使用して、上記手順と同じ手順で行なった。第２段階のＰＣＲを１５サイク ルで終えて、増幅物を例１記載のストレプトアビジン被覆磁性粒子に結合させた 。

検定結果を図９に示す。スタフィロコッカス・オー−ウス特異性オリゴヌクレオ チド（黒塗りの棒）とストレプトコッカス特異性オリゴヌクレオチド（斜線棒） との２組のオリゴヌクレオチドを使用しても、それぞれの対照菌体に対しては比 較的低いバックグラウンド標識が得られる。２組のプライマーに対して、特異的 菌体を分析するとかなりの量の標識がインビトロ増幅物に導入されている。この 例は、上記概念が、どちらの検定にも同一の汎用ビオチン化ハンドルプライマー を用いて、２種類の異なる細菌の検出に使用できることを示している。

例３ この例は、図１０に図解した通り、ＤＮＡフラグメントの精製並びにＰＣＲ増幅 フラグメントの検出にＤＮＡ結合性りンパク質を使用することに関する。

（ａｊ　ＤＮＡ結合性融合タンパク質の構築と解析ＤＮＡ結合性リプレッサー分 子をコードするスタフィロコッカスタンパク質Ａ　（ＳＰ＾）遺伝子と大腸菌１ ａｃＩ遺伝子を含んでなる融合遺伝子を構築した。ｔａｃｔ遺伝子の端の終止コ ドンにインビトロで変異を導入することができるように（こうして解読枠をつく る）、該遺伝子をまずｐＥＭＢＬ９にクローン化した。ドナープラスミドｐｓ＋ 、１をＰｓｔＩとＢａｍＨＩとで消化して、１０８０塩基対の１ａｃＩ遺伝子を 含む１３６１塩基対のフラグメントを得た。このフラグメントを単離して、ｐＥ ＭＢＬ９のｍｐ９リンカ−中の同じ部位間に挿入した。

形質転換後、大腸菌ＪＭＩ０３をアンピリジン、Ｘ−ｇａ　ｌ及びＩＰＴＧから なるプレート上に植え、白色コロニーを単離した。一本鎖ＤＩ＾を感染させしか も１１フアージ由来の複製起点を保有するｐＥＭＢＬ系ベクターでパッケージン グするためにパッケージング欠失ヘルパーフエージ旧３に０７を使用して、上記 コロニーの一つから得たプラスミドＤＮＡでＩＭＩ０３を形質転換して、一本鎖 プラスミドＤＮＡ　ｐＥＭＢＬ／ｌａｃ　Ｉを得た。合成オリゴヌクレオチド（ ５’　−ＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧ−３’ 　）を使用して、上記一本鎖鋳型上での不適性プライマー伸長反応を行なった。

プライマー伸長反応に関する条件は、カーター（Ｃａｒｔｅｌ）の記載した条件 （１７）と基本的に同一であった。伸長反応で得たＤＮＡを使用して大腸菌ＩＭ Ｉ０３を形質転換した。変異プラスミドｐＥＭＢＬ／ｌａｃ　ｒ　５ＴＯＰは、 アンピシリン、Ｘ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含む寒天プレート上の青色コロニーで 選択した。

図１１にこのインビトロ変異導入法を図解した。星印で示すヌクレオチドは変異 導入時に欠失するものである。

ＥｃｏＲＶとＸｍａで、プラスミドｐＥＭＢＬ／ｌａｃ　Ｉ　５ＴＯＰから終止 コドンをもたない変異１ａｃＩ遺伝子の３′末端を切り出して２９１塩基対のフ ラグメントを得た。単離したフラグメントを、同じ制限酵素で消化しておいたｐ ＤＭｌ、　１に連結した。ｐＤＭｌ、　１プラスミドは３つの主要構成要素、即 ち、ｌａｃリプレッサーを過剰に生産する１ａｃＩｑ遺伝子、カナマイシン耐性 を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、及び９１５Ａレプリコ ンからなる。得られた構築プラスミドｐＤＭ１．　Ｉ　５ＴＯＰは変異＋ＩＣＩ をコードしている。ｐＮｓＥＱＩベクターから、タンパク質Ａの一部分をコード するフラグメントをＢａｍＨｌで切り出して単離した。このフラグメントを、プ ラスミドｐＤＭ１．　Ｉ　５ＴＯＰプラスミド中のＩＩｃ　Ｉ遺伝子の３′末端 にあるユニークなりａｍＨ１部位に挿入した。この新規プラスミドｐＲＩＴ３４ は１９２６塩基対のｌ　ａ　ｃ　ｌ−３ＰＡ融合遺伝子をコードする。

プラスミドｐＲＩＴ３４を保有する大腸菌８８１０１株を、酵母エキス（７ｇ／ ｌ　）とカナマイシン（５０ｍｇ／Ｊ）を添加したトリプシン消化大豆ブロスＮ Ｏｇ／Ｊ）　（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社、米国）を含むバッフル付きエーレン マイヤーフラスコ中で一晩増殖させた。超音波処理した菌体から、マトリックス 結合１ｇＧ上でのアフィニティークロマトグラフィーによって、分子量７０．６ ｋＤＡ　（アミノ酸配列から推定）の融合タンパク質を精製した。アフィニティ ー法で精製したタンパク質を溶離して凍結乾燥した後、５Ｏ３−ＰＡＧＥで分析 した。産生水準は培養液１１当り約２０■であった。アフィニティー法で精製し たタンパク質のほぼ９０％が完全な長さを有していた。

この例は、組換え宿主中でｌａｃ　ｌ−３ＰＡ融合タンパク質を生産できること 、並びに該融合タンパク質をＩｇＧが共有結合した固体担体上で固定化及び精製 できることを示プラスミドｐＥ２２Ｔ３０８　ＤＮＡをＨｇｉ＾■及びＮｏｔＩ で消化して、８５塩基対、４９７塩基対、６７６塩基対、１１６１塩基対及び１ １８３塩基対の異なる長さのフラグメントを得た。６７６塩基対のフラグメント がｌａｅオペレーター配列を含んでいた。消化したＤＮＡを濃度１４０ｎｇ＃ｊ に稀釈した後３等分した。ｐＲＩ７３４を保有するＨＢＩＯＩ溶解物をＩｇＧ− セファロースと室温で１時間混合した。該溶解物中に存在する１ａｃＩ−３ＰＡ 融合タンパク質はその　ＳＰ八へ分を通してＩｇＧ−セフ７０−ス上に固定化さ れた。Ｏ，ＩＭ　Ｔｒｉｍ、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１及び０．１％ＢＳ＾から成 る洗浄用緩衝液（ｐ）１７．４１で十分に洗浄して過剰の融合タンパク質を除去 した後、１００μｌの固定化ｌａｃ　ｌ−３ＰＡ融合タンパク質をプラスミドｐ Ｅｚｚ７３０８の消化ＤＮＡ　Ｉｏｎμｌと室温で混合した。上清を分析したと ころ、６７６塩基対のフラグメントがゲルに選択的に結合した（図１２、レーン ３）。

繰り返し洗浄した後、１ｍＭのＩＰＴＧと共に室温で４５分間インキュベートし たところ、上記フラグメントが溶離した（図１２、レーン４）。図１２（レーン ｌ及びレーン２）に示すように、溶解物を含まないＩｇＧ−セファロース（レー ンｌ）又はｐＤＭｌ、　Ｉ保有ＨＢＩＱＩの溶解物と混合したＩｇＧ−セファロ ース（レーン２）を使用した陰性対照試料では、カラムへのＤＮＡの特異的結合 はほとんどもしくは全く起こらなかった。レーンＭはマーカーＤＮＡを示す。

このことは、タンパク質Ａ−１ｇＧ複合体を介して固体担体に固定化した後も、 上記融合タンパク質のＤＮＡ結合性部分が機能性を有していることを示している 。これは、図１０に概略を図解した手順で、フラグメントをカラムに固定化し、 ＩＰＴＧ溶液で溶離できることを示している。

（ｃ）　ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントの検出ＰＣＲ法を用いることによって、 僅か１個の鋳型ＤＮＡから複数の目的ＤＮＡのコピーを生じさせることが可能に なった。本発明者らは、上記の通り、スタフィロコッカス・オーレウス及びスト レプトコッカスＧ１４８のゲノムの特定ＤＮＡとハイブリダイズし得るオリゴヌ クレオチドを設計し、バチルス・サチルスなどを対照としてそれらの種特異性を 示した。２組の嵌込プライマーを使用する二重ＰＣＲ法は、上述の通り、非特異 的ＤＮＡフラグメントの増幅を減少させるのに使用できる。以下に、フランキン グプライマーを用いた２５サイクルの第１段階増幅と、それに続く固定化及び検 出用嵌込ハンドルプライマーを用いた１５サイクルの増幅について説明する。ハ ンドルプライマーは、５′末端にビオチンを有するＲＩ７６、及びｌａｃオペレ ーター配列を有するＲＩＴＩＩとＲＩＴ１２であった。用いたこれらのプライマ ーを図２及び図１３に示す。ＰＣＩＩ増幅は例２と同様に行なった。

使用手順を図１０Ｂに図解する。ｌａｅ　ｌ−３ＰＡ融合タンパク質のＩｇＧ− セファロースへの固定化を、洗浄用緩衝液が０、１Ｍ　Ｔｈ１ｓ、０．１５Ｍ　 ＮａＣｊ、　０．１％ツイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ　２０）、ＩｍＭ　ＭｇＣｌ ２及び０．　ＩｍＭ　１ｎｃ１２からなっていたことを除いては例３（ｂ）と同 様に行なった。上記固定化融合タンパク質を担持したＩｇＧ−セファロース１０ ０μノを、増幅ＰＣＲ混合物（洗浄用緩衝液で５００μ！まで稀釈）　２０ｒｒ ｌと室温で６０分間混合した。増幅ＤＮＡは、ハンドルのｌａｃオペレーター配 列とｌａｃ　Ｉ　−３ＰＡ融合タンパク質の１ａｃＩ部分との相互作用によって 上記セファロースに結合する。次いで、セファロースビーズを１．５ｍｆｆ１の 洗浄用緩衝液で３回洗浄した。結合増幅ＤＮＡの検出は上記混合物に１００μｍ のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体を添加し、３０分間静置 することによって行なった。図１［ＩＢに示スように、ストレプトアビジン−ア ルカリホスファターゼは５′ビオチンを介して増幅ＤＮＡに結合する。１．５ｍ ｌの緩衝液で３回洗浄して過剰の結合体を除去した。次に５００μＩのアルカリ 性緩衝液を添加し、温度を３７℃に調節し、次いで５００μｌの基質を添加した 。酵素反応を４０μ！の０．５ＭＮａＯＨで停止し、活性を分光光度計を用いて （４０５ｎｍにおける１秒当りの吸光度変化で）測定した。

図１４及び図１５は、スタフィロコッカス・オーレウスに対する特異的オリゴヌ クレオチド（図１４）又はストレプトコッカスＧ１４８に対する特異的オリゴヌ クレオチド（図１５）を使用した結果を示している。どちらのオリゴヌクレオチ ドに対しても、バックグラウンドレベルを遥かに越える大きな吸光度変化が得ら れた。このことは、固定化された融合タンパク質が１ａＣオペレーター含有ＤＮ Ａフラグメントの回収に使用できること、結合したＤＮＡ分子を簡単な呈色反応 によって検出できること、並びに同じ固定化融合タンパク質の呈色反応を異なる 増幅ＤＮＡフラグメントの検出に使用できることを示し７ている。

例４ この例は、臨床上極めて重要な感染体についても検出できることを示しており、 ＤＩＡＮＡ法を用いて臨床血液検体中のプラスモジウム・ファルシパルムＤＮＡ の存在を決定した。

図１６に示す５種類のオリゴヌクレオチドを使用して、図１０に図解した２段階 ＰＣＲ法を行なった。プラスモジウム・ファルシパルム特異性プライマーはＰ＋ １５５／ＲＥＳ＾遺伝子中のエクソン■の５′末端にハイブリダイズする（２１ ）。

この遺伝子は寄生体抗原をコードしており、未来のマラリアワクチン候補と考え られている（２２．２３）。Ｐ＋１５５／ＲＥＳ＾遺伝子は、これまで僅か２株 の寄生体においてしか特徴付けられていない（２１）。この遺伝子の５′領域を 選択したのは、僅かに変化しているかもしれないが種々の株の間で比較的保存さ れていると考えられているからでる。上記特徴付けのなされた２株において、第 １プライマ一対は４２８塩基対のフラグメントを生じ、第２プライマ一対は３９ ８塩基対のフラグメントを生ずる。

アフリカのガンビアの患者から得た１４検体について、例３と同様に二段階ＰＣ Ｒ増幅法を行なった。得られた物質を１ａｃＩ含有セフアロース（例３）で捕捉 し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体で検出した。この検定 結果を図１７に示す。ここで、検定感度を調べるために寄生度の低い患者からの 検体をも含んでいたことに留意されたい。顕微鏡下で陽性であった検体は、検体 を僅か１μｌしか用いなかったＤＩＡＮＡ法においてもすべて陽性であった。１ ０寄生体ゲノムが、バックグラウンドよりもかなり大きくはっきりと識別できる 信号によって、再現性をもって検出できた。

例５ この例では、陽性検体の直接的な固相配列決定ができるように設計したポリメラ ーゼチェーシリアクション（ＰＣＲ）法で増幅した特定ゲノムＤＮＡフラグメン トの高速比色検出系を説明する。増幅物は、ビオチン−ストレプトアビジン系を 用いて磁性ビーズに固定化する。ｌａｃオペレーター配列は、嵌込プライマー法 の第２段階において増幅物に導入される。この２１塩基対の配列を大腸菌ｌａｃ リプレッサーとβ−ガラクトシダーゼとからなる融合タンパク質と共に汎用比色 検出に使用する。その後、陽性試料をアルカリ処理すると、直接的なゲノム配列 決定に適した一本鎖鋳型ＤＮＡを得ることができる。固定化された増幅核酸を検 出するこの方法ＣＤＩＡＮＡ）は、自動化又は半自動化された臨床検査に十分に 適合している。本方法が臨床検体中のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮ Ａの検出並びに配列決定に利用できることを以下に示す。

（ａ）基本概念 磁性ビーズを固相として用いた特異的インビトロ増幅物の検出及び配列決定法を 図１８に示す。第１段階は、目的ＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドによ る標準的ＰＣＲである。多くのサイクル、即ち２５〜３５サイクルを行なって、 第２ＰＣＲ段階で使用することのできる多数の鋳型分子を得る。目的ＤＮＡを含 まない検体に対しては、上述の通り、無作為ＤＮＡの非特異的増幅が起こるであ ろう。第１１’ＣＲ段階で得られた物質を稀釈した後、内側プライマーと共に第 ２ＰＣＲ段階に使用する。この内側プライマーは、箪１段階で増幅されたＤＮＡ フラグメント内の配列に対して特異的である。該プライマーの一つはビオチン化 されており、もう一方は２１個のヌクレオチドからなるｌａｃオペレーター「ハ ンドル」を含んでいる。従って、きちんと増幅すると、該フラグメント中にビオ チンとｌａｃオペレーターの導入された特異的ＤＮＡを生じる。

第２段階のＰＣＲ反応は第１段階よりも少ない１５サイクルで行なう。従って、 非特異的ＤＮＡを含む試料に対しては、ビオチンとｆａｔオペレーターとを含む フラグメントは極めて低い収量でしか得られない（図１８）。

しかる後、ビオチン化された物質を、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相 互作用を利用して、ストレプトアビジンとカップリングした磁性ビーズに捕捉す る。

こうして、ビオチン化されていないフラグメントを容易に取り除くことができる 。１ＩＣリプレツサー（ｌａｃＩ）とβ−ガラクトシダーゼ（Ｉａｃｚ）とから なる組換え融合タンパク質をビーズに加え、β−ガラクトシダーゼ酵素に対して 特異的な発色性基質を添加することによって、結合した酵素結合体を検出する。

この比色法で陽性と認められた検体は、直接アルカリで処理して、結合した融合 タンパク質を除去し、かつビーズに固定化された二本鎖ＤＮＡを融解させること ができる。ビオチン−ストレプトアビジン複合体はこの処理に耐えるので、かか る一段階溶離法を用いると、配列決定に適した一本鎖鋳型が得られる。従って、 別の鋳型を調製しなくても、固相ＤＮＡ配列決定用のプロトコル（２４）を続け ることができる。最終的にはホルムアミドを用いて伸長物質をビーズから溶離さ せ、配列決定用のゲルに上層する。この固相法は、沈殿、遠心分離、脱塩を必要 とせず、再現性をもって配列情報を得ることのできるような汚染のない鋳型（２ ４）を与える。

（ｂ）合成プライマーの設計 クラミジア・トラコマティスは、真核細胞宿主内での個性寄生生活環によって特 徴付けられるグラム陰性細菌である。臨床学的、生物学的かつ分子論的な特徴に 基づいて、ヒトから単離されたクラミジア・トラコマティスは、２種類の生物学 的変異株（バイオパル（ｂｉｏマｊｒ））と１５種類の血清型変異株（セロパル （ｓｅ＋ｏｖａｒ））に分類される（２５．２６）。血清型変異株Ｌｌ、　Ｌ２ 及びＬ３は、リンパ系組織に関わる比較的侵襲性の高いクラミジア性疾病に関連 しており、臨床上重要である（２７）。

クラミジア・トラコマティスの血清型変異株Ｌ１及びＬ２から若干の遺伝子が単 離され、特徴付けられている。その中には血清型変異株Ｌｌ　（２ｇ）及びＬ２ 　（２９）由来の外膜主要タンパク質（ｍａｉｏｒ　ｏｌｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎ ｅ　ｐｔｏｔｅｉｎ、　ＭＯＭＰと略す）並びに血清型変異株Ｌｌ由来の外膜シ スティン富有タンパク質（＋＋ｌｅｒ　ｍｅｍｂｒｓｎｅ　ｃ７ｓｊｅｉｎｅ　 ｔｉｃｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ。

ＣＡＰと略す）　（２０）が含まれる。図１８に示す通り、ＣｒＰ遺伝子配列を 目的ＤＮＡとして使用し、クラミジア・トラコマティスをモデル系としてＤ］八 へ＾検査法を行なった。

システィン富有（Ｃｒｌタンパク質はクラミジアの基本小体のエンベロープ（ｅ ｌｅｍｅｎｆａＢ　ｂａ＋Ｉｙ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ）の構造上の完全性（ｉｎｆ ｅｇｒＮ７）を保つのに必要であると示唆されており（３０）、クラミジア・ト ラコマティスのペプチドグリカンが見掛は上存在しないとすると（３１）　Ｃｒ タンパク質は特に重要である。従って、この遺伝子は侵襲性クラミジアにとって 最も必須なものと思われ、臨床検体中のクラミジアＤＮＡを検出するための標的 として使用できる可能性が高い。

クラミジア・トラコマナイス血清型変異株Ｌ２のＣｒＰコード領域の中央部分に 対して特異的な４種類のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。この４種類 のプライマーの配列を図１９に示すが、ＣｒＰ遺伝子中の目的ＤＮＡの位置も同 時に示した。２つの外側プライマーはそれぞれから４２１塩基対とハイブリダイ ズし、内側プライマーは２６７塩基対離れている。内側プライマーの一方（ＲＩ Ｔ２５）にはビオチンが共有結合しており、もう一方の内側プライマー（ＲＩ７ ２６）の５′末端には大腸菌１ａｃオペレ一ター配列（詳細については「材料及 び方法」を参照）に対応する２１塩基対のハンドルが付いている。

ＰＣＲ増幅物の磁性ビーズ上への固定化クラミジアのＣｒＰコード領域を増幅す るように設計したプライマーの有効性を検討するために、クラミジア・トラコマ ディス血清型変異株Ｌ２の培養液を用いて標準的なアガロース検査法を行なった 。菌体をＰＣＲ緩衝液中で直接溶解し、外側プライマー（ＲＩＴ２３及びＲＩＴ ２４、図１９）を用いてＣＡＰ遺伝子を２５サイクル増幅した。得られた物質を １００倍に稀釈した後、内側プライマー（ＲＩＴ２５及びＲＩＴ２６、図１９） を用いて第２ＰＣＲ段階を１５サイクル行なった。用いたＰＣＲ緩衝液は、２０ ｍＭ　ＴＡＰ！ｉ　（ｐＨ９，３）、８ｍＭｈ１ｇｃＪ　２、及び０．２％トリ トンＸ（Ｔ＋白ｏｎ　Ｘ）を含有しティた。

ＰＣＲ緩衝液（１０μｍ）で満たしたＰＣＲチューブに臨床綿棒を入れて該チュ ーブの壁にこすりつけた。続いて、菌体を溶解するためにチューブを９９℃に５ 分間加熱し、しかる後に水中で冷却した。この溶解混合物に、０．２ｍＭ　ｄＮ ＴＰ。

０、２ｍＭの各プライマー及び１．０ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（ベーリン ガー・マンハイム社、スウェーデン）を含有するＰＣＲ緩衝液９０μｌを添加し た。このＰＣＲにおける１回の温度サイクルは、９５℃での鋳型の変性０．５分 間、５８℃でのプライマーのアニーリング１分間、及び７２℃でのプライマーの 伸長１分間であった。

第１段階のＰＣＲで得られた物質と第２段階のＰＣＲで得られた物質をそれぞれ ストレプトアビジン含有磁性ビーズと混合し、その上清をアガロースゲル電気泳 動法によって分析した。

ストレプトアビジンがカップリングした磁性ビーズ、即ちダイナビーズＭ２８０ −ストレプトアビジン（３１）はダイナル社（ノルウェー）から入手した。ネオ ジム−鉄−ホウ素永久磁石（ダイナル社、ノルウェー）を使用して、洗浄工程の 際にビーズを沈降させた。該ビーズ３００μｇを８５μｌのＰＣＲ混合物と混合 して、室温で２０分間インキュベートした。このビーズは、上述の通り、ＴＳＴ 緩衝液で十分に洗浄した。

その結果（図２０）、第１段階のＰＣＲで予想通りの大きさく４２１塩基対）の 特異的バンド（レーン３）が得られたが、これは磁性ビーズとは結合しない（レ ーン４）。

これに対して、第２段階のＰＣＲ（レーンｌ）で得られた大きさの小さい（２６ ７塩基対）物質は磁性ビーズに効率よく捕捉される（レーン２）。達成された固 定化収率は９５％以上で、固体担体上にＤＮＡを捕捉する上でのビオチン、スト レプトアビジン系の有効性を実証している。

（ｃ）　１ａｃＩ−１ａｃ２融合タンパク質の精製ｌａｃ　Ｉと１ａｃ２の融合 遺伝子を有する大腸菌ＸＡｃ／６１４株（３３）は、１ａｃＩリプレツサー活性 とβ−ガラクトシダーゼ活性を同時に有する融合タンパク質をコードする。

この大腸菌株を、酵母エキス（１ｇ／ｊ　）を添加したトリプシン消化大豆ブロ スＨＯｇ／ｊ）　（ディフコ社、米国）を含むバッフル付きエーレンマイヤーフ ラスコ内で３７℃で一晩増殖させた。０．１％ＢＳ人、０．１ｍＭ　１ｎｃ１２ ．０．１ｍＭ　ＭｇＣＪｚ及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノールを添加したＴ ＳＴ緩衝液（０，ＬＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣｊ　（ｐＨ７，５）、０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１，０，１％ツイーン）中で超音波処理して細胞抽出液を得た（３４）。融合 タンパク質は硫安塩析法で精製し、２５％〜４５％飽和の硫安画分を使用した。

次いで、ヘパリン−セファロースカラム（ファルマシア社、スウェーデン）にア フィニティー結合させた。融合タンパク質は、０．２５Ｍ　ＫＣＪ及び１５％グ リセロール緩衝液中で溶離させた。

（ｄ）臨床検体中のクラミジアの比色ＤＩＡＮＡ図１８に図解したＤＩＡＮＡ法 の概念について、ヒト泌尿系由来の幾つかの臨床検体を使用して検討した。同一 検体について、標準的な細胞培養検査法（３５）を並行して行なった。クラミジ ア・トラコマディス血清型変異株Ｌ２の培養液（図２１）をこの検査における陽 性対照検体として使用した。

９検体を例５（ｂ）と同様に増幅し、得られた物質をダイナビーズＭ２８０−ス トレプトアビジン上に固定化した。

ｌａｃリプレッサー酵素結合体（例５　（ｃ）　）からなる組換え融合タンパク 質を加えた。

ＤＮＡの固定化されたビーズを、脱塩した融合タンパク質（１ａｃＩ−ｌａｃ２ ．光学密度＝０．２）　２００ｕｌ及び超音波処理したニシン精液ＤＮＡ　２０ ０μｌと共に、エツペンドルフチューブ内で３０分間混合した。このビーズをＴ ＳＴ緩衝液で洗浄した。基質の０−ニトロフェニル−β−〇−ガラクトシド（Ｏ ＮＩ’Ｇ）を添加し、室温で吸光度変化を測定した。１分間に４０５ｎｍにおけ る吸光度が１単位変化したときの酵素活性を１ユニツトとして定義した。

図２１に示す結果は、ＤＩＡＮ＾検査と従来の細胞培養検査法との間に良好な相 関関係が成り立つことを実証している。陰性検体に対する吸光度は極めて低く、 二段階ＰＣＲ法で得られるバックグラウンドレベルが低いことが確認ＤＩＡＮ＾ 検査（図２１）で得られた陽性検体すべてについて、図１８に図解した固相法を 用いて直接配列決定した。

結合ＤＮＡフラグメントの一方の鎖と酵素結合体とをアルカリで同時に溶離させ 、残る固定化ＤＮＡ鎖をゲノム配列決定用の鋳型として使用した。ｌａｃオペレ ーター配列に対応する蛍光プライマーを使用した。

室温で１０分間、０．１５Ｍ　ＮａＯＨで鎖を融解することによっテＤＮＡの配 列決定を行なった。ビーズを５０μｌのＴＥ緩衝液（０，ＩＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣ ｊ　（ｐＨ７，５）、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。

プライマーをアニールするために、１０ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣＪ　（ｐＨ７，５ ）、ｌ００ｍＭ　ＮａＣｊ、　ｌ０ｍＭ　ＮａＣｊ２及び０．１ｍｇ／ｍＪ　Ｂ ＳＡを含む緩衝液を２ｐｍｏｌのＲＩＴ４３プライマーと共に混合して全量を１ ７μｌとした。アニーリング混合物を６５℃で加熱し、室温に冷却した。しかる 後、この混合物に、１μｌのＭＩＤ溶液（ファルマシア社）と３ユニツトの７７ 　ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア社）を添加して全量を２０μＩとした。上 記溶液４．５μｌに、ファルマシア社製のヌクレオチド混合物（Ａ、　Ｃ，Ｇ及 びＤ　２．５μｊを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。Ｈ２Ｏでビ ーズを洗浄し、３μｌの脱イオン化ホルムアミドと共に８５℃でインキュベート してＤＮＡ鎖を変性させた。生じた一本鎖４ｐｌを、Ａ、　Ｌ、　Ｆ、配列決定 装置（ファルマシア・エルφニー・ビー（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ　ＬＫＢＡＢ）社 、スウェーデン）上の７％ポリアクリルアミドゲルにのせた。

陽性検体すべてについて明瞭な塩基配列が得られたが、検体の一つについて（図 ２１のＮｏ、　Ｉ）得た結果を図２２に示す。

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Ｉｎｏｕ７（Ｃ，及びＵｔｄｅａ、　Ｍ、　Ｓ、（１９８７）Ｊ、　Ｂａｃｌｅ ｒｉｏｌ、第１６９巻３８７９−３８８５頁３０、　Ｂａｖｏｉｌ、Ｐ、　０ｈ ｌｉｎ、＾、及び５ｃｈａｃｈｊｅｒ、１．　（１９８４）Ｉｎｆｅｃｌ　１ｍ ｍｕｎ、第４４巻４７９０−４８５頁３１、Ｈａｒｂｏｕｒ、Ａ、Ｇ、、Ａｍａ ｎｏ、に、１．、Ｈａｃｋｓｔａｄｊ、Ｔ、、Ｐｅ＋＋７゜し、及びＣａ１ｄｖ ｅｌｌ、　Ｈ，Ｄ、（１９８２）１、　Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、第１５１巻４２０ −４２８頁３２、Ｌｅａ、Ｔ、、Ｖａｒｌｄａｌ、Ｆ、、Ｎｕｓｔａｄ、に、、 Ｆｕｎｄｅｒｕｄ、Ｓ、。

ＢｅＢｅ、Ａ、、Ｅｌｌｉｎｇｓｅｎ、Ｔ、、Ｓｃｈｍｉｄ、Ｒ，、５ｔｅｎｕ ａｄ、Ｐ。

及びＵｇｅｌｓｔａｄ、　１．　（１９８８）１、　ｏｆ　Ｍａｔ、Ｒｅｃｏｇ ｎ、第１巻９−１８頁３３、　Ｃｏｕｌｏｎｄｒｅ、Ｃ，及びＭｉｌｌｕ、Ｉ、 Ｈ，（１９７７）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉａｌ第１１７巻５９−７１頁３４、Ｕｈ ｌｅｎ、Ｍ、Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｂ、、Ｇｕｓ＋、Ｂ、、Ｌｉｎｄｂｅ＋ｇ、Ｍ、 。

Ｇａｎｔｅｎｂｅｃｋ、　Ｓ、及びＰｈ１ｌｉｐｓｏｎ、Ｌ、（１９８３）Ｇｅ ｎｅ第２３巻３６９−６８５頁 ３５、　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｔ、及びＷｏｏｄｌａｎｄ、Ｒ，Ｍ、（１９８３）Ｂ 「１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ第３９巻＋８１−１８６頁浄 書′内容に変更ない 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 一ユニコ＝＝＝■＝４ サイクル数 浄書（内容に変更なし） サイクル数 浄書（内容に変更なし） サイクル数 浄書（内容に変更なし） 浄書Ｃ内容に変更なし） Ｉ０１１ １ａｃｌ　末端ｐＥＭＢＩ、／Ｌｔｃ１１２３４Ｍ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容１ζ変更°なし）　。

浄書Ｃ内容に変更なし） ＦＩＧ、　１６ 浄書（内容に変更なし） ＦＩｏ、１８ 特異的目的ＤＮＡ　非特異的ＤＮＡ （ｖｉｉｌ↓試料の溶離と投入 ＜−←０＋　←〔←し　←ＣリＣ 宴ε　ごギ　巧ρ　ビｙ　〉；　ご窃 く―　べ句　リー　←コ　トφ　くコ ←句　Ｑ−Ｉ　ＵΦ　←Φ　０飄　←のＱ＞　０く　←ψ　ＣＪ、Ｊ　１−（Ｊ 　り一浄書（内容に変更なし） ＦＩｏ、　２０ １２３４Ｍ 手続補正書（方力 平成４年　７月１３日 国際出願番号　ＰＣＴ／ＥＰ９０１００４５４平成２年特許願第５０４９０８号 ２　発明の名称 医学的健康状態の固相診断法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　セミュ・バイオテクニク・アーベー４代理人 住　所　東京都千代田区永田町１丁目１１番２８号平成４年　６月１６日溌送日 ） ６　補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面中、特許出願人の代表者の項、委 任状、法人国籍証明書、並びに図面翻訳文の浄書。

７　補正の内容　／〆＝−）＼ 国際調査報告 １１ＣＩＩ＃ｌｌｌｌ１１＠−＾峠−１瞳内−・　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１００４ ５４国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．特定ＤＮＡの同定による医学的健康状態の診断方法にして、検体中のＤＮＡ を、目的ＤＮＡに特異的な第１プライマー対を用いたポリメラーゼ・チェーン・ リアクション（ＰＣＲ）法による第１段回の増幅に付し、このようにして生じた 増幅ＤＮＡを、第２プライマー対を用いたＰＣＲ法によってさらに増幅し（ここ で該第２プライマー対の一方又は両方は、上記第１プライマー対のいずれとも異 なり、目的ＤＮＡの上記第１プライマー対とのハイブリダイゼーション部位間の １カ所以上の配列に特異的なものであって、該第２プライマー対の一つは固体担 体上に固定化されているか或いは後で固体担体に結合させるための手段を与えら れており、かつ第２プライマーのもう一方は標識を保有しているか或いは後で標 識に結合させるための手段を与えられている）、かかる増幅後に上記増幅ＤＮＡ を保有する固体担体を分離して、それに結合した標識を検出する（ここで上記後 で結合させるための手段の一方もしくは両方は、当該プライマーによって保有さ れる遠位ＤＮＡ配列にして目的ＤＮＡとはハイブリダイズしないが固体担体又は 標識のいずれかに結合した結合パートナーに対して選択的親和性を有するような 遠位ＤＮＡ配列を含んでなる）ことを特徴とする方法。
2. ２．請求項１記載の方法において、前記固体担体が磁性粒子を含んでなることを 特徴とする方法。
3. ３．請求項１又は請求項２記載の方法において、前記固体担体が単分散型超常磁 性粒子を含んでなることを特徴とする方法。
4. ４．請求項１記載の方法において、前記固体担体が、微量滴定用ウェル、計量棒 、非磁性粒子、繊維又はキャビラリーであることを特徴とする方法。
5. ５．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法において、前記プライマー 又は増幅ＤＮＡがビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン結合に よって前記固体担体に結合していることを特徴とする方法。
6. ６．請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法において、前記プライマー 又は増幅ＤＮＡが、前記標識を保有するＤＮＡ結合タンパク質と該ＤＮＡとの結 合によって該標識に結合していることを特徴とする方法。
7. ７．請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法において、前記ＤＮＡ結合 タンパク質がｌａｃＩであって、それが結合する前記ＤＮＡがｌａｃオペロンで あることを特徴とする方法。
8. ８．請求項７記載の方法において、前記ＤＮＡ結合タンパク質が、酵素標識と融 合したｌａｃＩタンパク質であることを特徴とする方法。
9. ９．請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法において、前記遠位ＤＮＡ 配列の結合パートナーが、該遠位ＤＮＡ配列と相補的な第３段階ＤＮＡプライマ ーであって、これを１回以上のＰＣＲサイクル後のＰＣＲ反応に添加して、固体 担体又は標識に結合した第３段階プライマーを増幅した目的ＤＮＡに取り込ませ ることを特徴とする方法。
10. １０．請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法において、前記固体担体 上に固定化した二本鎖増幅目的ＤＮＡを一本鎖型に変換して配列決定に付すこと を特徴とする方法。
11. １１．請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法において、前記遠位Ｄ ＮＡ配列がｌａｃオペロンであって増幅した目的ＤＮＡがｌａｃオペロンを３′ 末端で取り込むようなものであり、増幅ＤＮＡの検出を、酵素標識に融合したｌ ａｃＩを添加して、汚染物質を除去した後、該酵素に信号を発生せしめることに よってによって行い、上記検出の後、二本鎖固定化ＤＮＡを値分離に付して生じ た固定化一本鎖ＤＮＡを配列決定に付すことを特徴とする方法。
12. １２．請求項１記載の方法を実施するためのキットにして、少なくとも以下の構 成部分： （ａ）微量滴定用ウェルもしくはかかるウェルが整列したもの、計量棒又はビー ズ、より好ましくは磁性ビーズのような固体担体にして、（ｉ）増幅された目的 ＤＮＡに結合させるための手段、（ｉｉ）プライマーに結合させるための手段又 は（ｉｉｉ）プライマー、を保有する担体、 （ｂ）（ｉ）増幅された目的ＤＮＡに結合させるための手段、（ｉｉ）プライマ ーに結合させるための手段又は（ｉｉｉ）プライマー、を保有する標識、 （ｃ）外側プライマー対及びＤＮＡハンドルを供した１種以上の内側プライマー にして、上記の（ａ）の担体又は（ｂ）の標識に結合していないもの、（ｄ）好 ましくは熱安定性であるポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、 （ｅ）ＰＣＲ反応用の緩衝液、及び （ｆ）固定化ＤＮＡ保有担体を洗浄するための洗浄用緩衝液 を含んでなるキット。