JPH04501956A

JPH04501956A - Ｒｎａ及びｄｎａの検出並びに定量法

Info

Publication number: JPH04501956A
Application number: JP2501002A
Authority: JP
Inventors: ホーンズ、エリック; コースネス、ラース
Original assignee: ダイナル・エイ・エス
Priority date: 1988-11-21
Filing date: 1989-11-21
Publication date: 1992-04-09
Also published as: AU4759690A; WO1990006042A2; GB8827160D0; WO1990006042A3; ATE93896T1; DE68908900T2; AU634993B2; CA2003501A1; DE68908900D1; EP0444120A1; EP0444120B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＲＮＡ及びＤＮＡの検出並びに定量法本発明は、ＲＮＡ及びＤＮＡの検出並びに定量法とその測定装置に関する。

ＤＮＡ及びＲＮＡは溶剤及び／又は支持体反応を用いる多数の従来技術によって検出及び／又は測定し得る。一般には特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を試料から単離するが、これは電気泳動あるいはニトロセルロース製メンブランフィルタ−などの支持体上への拡散によって行ない、次いで目的核酸とだけ選択的にハイブリダイズする標識プローブを支持体に加える。プローブに共通する型は、目的ＤＮＡ又はｉｌＮ＾のある配列と相補的な一本鎖（ｇ　ｓ）　ＤＮＡＤである。

こうして形成したハイブリッド分子は、使用する標識の性質に依存して様々な技法により検出し得る。かかるハイブリダイゼーション系の一例としては、米国特許第４、３５８．５３５号明細書に記載されたファルコウ（Ｆ＊Ｉｋｏｖ）他の方法がある。

プローブを標識する一つの方法にね３２，１４Ｃ１３Ｈなどの放射性原子を例えばＲｉｇｂｎ７他の一ツクトランスレーション法（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１１３．２３７（１９７７）などで組み込む方法がある。こうして標識されたヌクレオチドはプローブのＤＮＡの中に形成されたギャップに組み込まれる。その他の標識もニックトランスレーションで導入できる。例えばビオチン化ヌクレオチドを組み込んで酵素などのアビジン結合標識と結合できるようにする方法である。ＤＮＡさらに抗体と反応するような抗原基を用いても標識できる。

核酸（例えばＤＮＡ又はｍＲＮ＾）を測定又は定量するには、は、試料中に存在する全ての核酸物質あるいは特定の遺伝子から転写されたもののいずれかをいわゆるドツトプロット分析技術で決定する。この技術においては、例えば　Ｐ又は３５Ｓで標識された適当なプローブを、希釈率の異なる試料核酸ドツトと共に希釈率を色々に変えた対照核酸ドツトの乗ったメンプランとフィルター上でハイブリダイゼーションさせる。オートラジオグラフィー後に、試料のドツトの濃さを視覚的又はデンシトメーターで対照ドツトと比較することによって、核酸濃度を概算できる。

核酸は従来のドツトブロッティング法では測定できないほど微量しか存在しない場合が往々にしであるが、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法で効果的に増幅し得る。ＤＮＡの場合、未増幅のｄｓＤＮＳを変性し、プライマーをコード鎖及び非コード鎖の双方にアニーリングする。

ポリメラーゼによるプライマーの伸長反応で各々の鎖の全ＤＮＡ配列が複製されるように、プライマーはＤＮＡの５′末端配列に対応するのが好ましい。しかし、意図するアッセイが標識プローブとＤＮＡの中央配列のみとのハイブリダイゼーションしか必要としない場合は、転写によってプローブのハイブリダイゼーション部位を含んだ、より短いＤＮＡ配列のコピーが生ずるように、プライマーはその部分のいずれか一方の側の部位とハイブリダイズすればよいであろう。このようにして形成された二本鎖ＤＮＡは温度を上昇させた後急冷することによって変性させる。過剰のプライマー分子が存在しており、新らたに形成されたコード鎖と非コード鎖にアニーリングする。

ポリメラーゼを用いる伸長反応によって、さらに二本鎖ＤＮＡをつくる。温度変化サイクルは何回も繰り返すことができ、それによって大量のＤＮＡコピーをつくる。好ましくは、使用するポリメラーゼは上記サイクル中のもっとも高い温度にも耐え得るもの（通常はＴａｑポリメラーゼ）で、さもなければ加熱段階前に毎回核酸からポリメラーゼを分離するかあるいは冷却段階後に毎回ポリメラーゼを補充することが必要となる。これらのいずれを選択しても費用がかかり、技術がいたずらに複雑さを増すだけである。

ＰＣＲ法の使用によって進歩したとはいえ、洗浄段階（例えば未結合標識プローブを除去するための）の間も目的ＤＮＡが固定化されているように、目的１）ＮＡの標識プローブへのハイブリダイゼーション段階の間に目的ＤＮＡを支持体の固定化する必要がある。通常、固定化は通常は非特異的で（特にニトロセルロースフィルターを使用の場合）、プローブが非特異的に支持体に固定化されるためにバックグラウンドの標識が見られることが多々ある。。

例えば米国特許第４６７２０４０号（＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社）及び欧州特許第２６５２４４号（Ａｍｏｃｏ、　Ｃｏｒｐ、社）に見られるように、磁性粒子をＤＮＡプローブの担体として使用することが提案されている。

従前の方法に存在する問題を克服するようなＲＮＡ又はＤＮＡの検出及び／又は定量法を供する必要がある。かかる必要性を満足するのが本発明の目的である。

従って、本発明は検体試料中の目的ＲＮＡ又はＤＮＡの検出及び／又は定量法にして、ａ）該１１ＮＡ又はＤｌｉＡに結合することのできる一本鎖ＤＮＡプローブの５ ′側と結合した磁性粒子を検体と接触させる段階、ｂ）　標識ヌクレオチド存在下で逆転写酵素又はポリメラーゼの水溶液に該磁性粒子を接触させ、プローブをプライマーとして用いることによって該ＲＮＡ又はＤＮＡが鋳型として機能すべく検体中に存在していれば標識された相補的な一本鎖ＤＮＡが生ずるようにし、該磁性粒子を表面上に磁気的に集合させ、該溶液を除去する段階、Ｃ）　該標識の有無を検出及び／又は該標識量の定量する段階、を含む方法を供する。

標識されたプローブではなくて標準的な標識ヌクレオチドを用いて標識化反応を起こすという点に本発明の一つの利点があり、この場合のプローブは、目的核酸を選別し、未結合標識からの目的核酸の分離を容易ならしめるために目的核酸を固定化し、かつプライマーとして働く、という３つの機能を持っている。このことは放射性標識を用いる場合特に有利である。予備段階としてプローブを標識する必要がなく、それによって放射性崩壊による標識活性の減少を招くような遅れを省くことができるからである。さらに有利な点は、ビーズ上のプライマーに重合させた放射性標識をシンチレーションカウンターで直接分析することができるので、オートラジオグラフ暴露に要する時間を短縮化できることである。この方法は以前の核酸測定技術と比べ、簡便さと迅速さによって特徴付けられる。

本明細書中で用いる「標識（ｌｘｂｅｌ）　Ｊという用語は、放射性元来、蛍光、発色団などの直接的な標識だけでなく、特異的結合対の低分子量リガンドがヌクレオチドに結合することによって標識に対する付着物として機能するような間接的標識をも包含する。かかる間接的標識並びに特異的結合対の例としては、ビオチン（これはアビジン又はストレプトアビジンによって親和性結合させることができる）並びにハプテン（これは抗体又はその結合性フラグメントによって親和的に結合させることがでる）が挙げられる。より大きな結合パートナ−自体は標識しなくてもよいが、酵素、ラテックスビーズ、蛍光、発色団のようなそれに結合し得る標識を有している。

遺伝子全体又はその大部分を標識しようとすれば高価になるのは明らかである。

従って、相補的一本鎖ＤＮ人の鎖長を限定するのが本発明の好ましい様態である。この態様は、例えば合成される標識ｃＤＮＡの鎖長を制限するために標識重合の際に若干のジデオキシヌクレオチドを添加することによって達成し得る。

目的核酸の配列が既知の場合、合成がある既知の点で停止するように１個もしくはそれ以上の標識ヌクレオチドを除外することによって限定したｃＤＮＡ鎖を合成することが可能である。このような場合、それによって検出するに十分な結合標識を生じるものであれば１個の標識ヌクレオチドを使用することも可能である。

さらに、ジデオキシヌクレオチドのその他のヌクレオチドに対する比がｃＤＮＡ鎖の平均長を制御しており、従ってまた目的核酸側々の分子にハイブリダイスする標識塩基の平均個数をも制御する。個々の目的分子上の標識の正確な数もしくは平均の数が分っている場合、１個の標識からのシグナルで全シグナルを割って、これに上記の既知の標識数を掛ければ目的とする核酸の分子が数が直接概算できる。。

既知の個々の標識を導入する別の方法として、既知の個々の個数の塩基で５′末端から間隔を置いた目的核酸の配列にハイブリダイスするようにプローブを設計する方法がある。標識ヌクレオチドとポリメラーゼとの反応によって、こうして正確に知られた個数の標識塩基か組み込まれる。

鎖長を制限するさらに別の方法においては、ｍＲＮＡのアッセイを行う場合、ポリＡ「テール」に結合し、プライマーとして機能するに十分な長さをもつがポリＡ「テール」よりは短いポリｄＴプローブを与える。ハイブリダイゼーション後に、ポリメラーゼとチミジンを加え、少なくともいくつかのチミジンが標識され、プライマーの終端からｍＲＮＡの最初の非アデニル残基まで伸びた相補的標識ポリ　Ｔ　ｃＮＤＡが生じる。ポリーｄＴプローブ及びポリＡ「テール」の長さが分っていて、生ずるｃＤＮＡの平均の長さを統計的に決定できれば、この定性的な方法を定量的なものとすることができる。個々のｃＤＮＡからのシグナルは標識チミジン対非標識チミジンの比に基づいて容易に決定することができる。

本発明の方法は、段階（ａ）と段階（ｂ）の間に目的とする核酸のＰＣＲ増幅段階を含んででもよい。該核酸がｍＲＮＡの場合、ｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴプローブを保有する磁性粒子に結合させ、逆転写酵素と反応させてｃＤＮＡを生じさせることができる。次に非コード鎖を、ポリメラーゼを用いて合成する。次いで生成したｄｓＤＮＡを変性させて、コード鎖及び非コード鎖を磁性粒子に結合した特異的ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせることができる（これらのプローブは適当なポリメラーゼを用るＰＣＲ増幅のプライマーとし、て機能する）。生成したｃＤＮＡにそのままハイブリダイズするように２種類の特異的ＤＮＡプローブ／プライマーを別々に保有する磁性粒子が過剰に存在する場合、ＰＣＲ温度サイクルを適用することができ、適度に増幅されるまで繰り返すことができる。ＰＣＲ増幅の最終段階は、標識反応用の一本鎖ＤＮＡをつくるための変性である。

本発明の方法、用途としては特に以下のものが挙げられる。

１　特異的プローブの結合した磁性粒子を用いる特定ＤＮＡ配列の検出及び／又は定量法、例としては、体液や汚染された食物中に含まれる特定のウィルス又は細菌の存在の検出。あるいは人間の診断法におけるゲノムの遺伝子型の検出（任意にはＰＣＲ又はその他の増幅法を用いる）。

２　オリゴ−ｄＴプローブの結合した磁性粒子を用いた全細胞のｍＲＮＡの定量。例えば微量の精製の場合。

３　特異的なプローブに磁性粒子を用いる特定ｍＲＮＡ配列の検出及び定量。例としては、遺伝子発現の研究、特に遺伝子の活性のレベル（例えばガンの診断における発ガン遺伝子の転写レベル）、並びに細胞中のゲノムに組み込まれたあるいは細胞内で独立して存在するＨＩＶのようなウィルスの検出。

４　さらに磁性粒子を有する目的ｍＲＮＡ又はＤＮＡの単離。

これは、同一の磁性プローブ（及び、ポリメラーゼ、又は逆転写酵素）を用いて標識ヌクレオチドを一定の単離された核酸に組み込んで標識ヌクレオチドが単離された目的ＤＮＡ又はＲＮＡを直接測定できるようにすることによって直接アッセイできる。

磁性粒子の使用よる幾つかの利点はきわたって顕著である。磁性粒子は、目的核酸を含んだ混合液（例えば細胞抽出液）に加えて攪拌し、次いで容器の一方の側に磁気的に引き寄せることができる。液体を不必要な成分と共に取り除くことができ、ＲＮＡの結合した磁性粒子を洗浄用溶液中に再分散することができる。洗浄段階は間断なく、幾度も繰り返すことができる。目的核酸を得る全過程を１５分未満で行うことができる。

さらに有利な点は簡便さにあり、時折粒子を磁気的に集合させて粒子上の物質或いは上清中の物質のいずれかに結合した標識をアッセイすることによって、ハイブリダイゼーション或いは、磁性粒子を用いて行ういかなる過程をも簡単かつ連続的に観察できる。

粒子の分離に磁気的な凝集を用いる方法は、核酸やタンパク質を分断する剪断力を生ずる遠心などの従来の分離技術よりはずっとおだやかな方法である。さらに、磁性粒子を溶液から容易に分離でき、かつ異なる溶液中で再分散できるので自動化、特に自動化された合成法及び測定法に有用である。

上述の通り、プローブはＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ部分であってもよい。このようなものとしては、ｍＲＮＡに普遍的に存在するポリＡ「テール」とハイブリダイズするようなオリゴ−ｄＴ　、並びに目的ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の中の特定の配列とハイブリダイズするような特異的ＤＮＡを含んだプローブが挙げられる。個々のプローブは、オリゴ−ｄＴもしくは特異的なりＮＡ配列であるような直接結合した一本鎖ＤＮＡから成るものでもよいし、あるいは二本鎖ＤＮＡのうちの一本を介して磁性粒子に結合したものでもよい。

本発明の方法を、細胞溶解物からの全ｍＲＮＡ分子の検出及び／又は定量に適用する場合、プローブは好適にはオリゴ−ｄＴ　、即ち比較的短い鎖長（例えば２０乃至２００塩基）のジオキシチミジンユニットである。かかる鎖はデオキシチミジンユニット（例えば２０〜２００塩基）の酵素による重合によって容易にかつ安価に調製し得る。

オリゴ−ｄＴプローブは共有結合によってビーズに直接結合し得る。必要に応じてプローブ及びハイブリダイズしたＤＮＡ又はｍＲＮＡをおだやかな酵素反応によって溶液中に遊離させることができるように、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）特異的部位を含んだリンカ−配列を介してプローブをビーズに結合させると有利な場合もある。従来の検出及び定量法においては、特に自動化した場合、酵素を用いた操作は同一の緩衝液中で行われるので個々の反応にとっては最適なものとはならない。しかし、本発明に従って、磁性粒子を用いると、緩衝液などを変えることができるので、ｃＤＮＡの生成を最適化できる。さらに、５ｓｃＤＮＡの合成の場合、ヌクレオチド試薬のｍＲＮＡに対する比は、過剰な試薬によるその後の段階の汚染を避けるために、はぼ化学量論的に保つのが一般的である。本発明においては磁性粒子を使用することから洗浄が簡便かつ迅速であり、過剰な試薬を使用することが可能でそれに伴って効率が必然的に増加する。

不必要な核酸の非特異的なハイブリダイズを防ぎ、かつハイブリダイゼーション用の溶液の残留成分粒子を完全に取り除くために、最初の磁気的分離の後で少なくとも一度は磁性粒子を洗浄するのが望ましい。ランダムな部分的相同性によって結合した核酸を取り除くために、洗浄は、温度を上げるかあるいはハイブリダイゼーションに用いたものよりも低い塩濃度（例えば０．５Ｍ塩化ナトリウムもしくは回当の溶液）を用いることによって、厳しい条件下で行う。

条件の厳しさくＳｔｒｉｎｇｅｎｃ７）は一般にプローブの長さ及びＧ：Ｃ含量に従って概算される。プローブオリゴヌクレオチドと目的核酸との間の相同性が正確でない場合は、洗浄はより緩やかな条件で行うべきである。一般に、洗浄は、二本鎖の融解温度（Ｔｍ）より１２℃低い温度で行つるべきである。ＴｒＲのおよその値は以下の関係式に従って簡便に概算し得る（Ｍｉｎｉａｌｉｓ、　Ｔ他、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　ａ　１ａｂｏｒｘｌｏＢ　ｍａｎｕａｌ　３８８−３８９頁より抜粋）。

（ｉ）　Ｔｍ＝　６９．３＋　ｏ、　４１　（Ｇ＋　Ｃ）％−６５０／ＬＬはヌクレオチドの中のプローブの平均長さである（ｂ）ミスマツチの塩基対の数が１％増加するごとに二本鎖ＤＮ＾のＴゆは１℃ 減少するＵ、及びＵ！は２つの溶液のイオン強度である。

小さなオリゴヌクレオチドに対しては、融解温度は以下のように摂氏温度で概算される。

Ｔｍ＝２　Ｘ　（Ａ＋　Ｔ残基の数）−）−４Ｘ　（Ｇ＋Ｃ残基の数）ハイブリダイゼーション反応は、１Ｍ塩化ナトリウム溶液又は公知の同等の溶液中で達成し得る（Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄ　Ｈ７ｂｒｉｄｉｓｘｊｉｏｎ参照、Ｂ　Ｄ　Ｈａｍｅｘ及びＳ　Ｊ　Ｈｉｑｑｉｎｓ著、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ社１９８５年発行）。本発明の一つの具体的態様においては、プローブがオリゴ−ｄＴであって、従って細胞抽出液中のすべてのｍＲＮＡは、あらゆるネイティブな真核生物ｍＲＮ八分子分子在するポリＡテールへのハイブリダイゼーションによって単離される。この具体的態様の利点は、特に、オリゴ−ｄＴ　ＤＮＡプローブがその５′末端を介してビーズに結合することによって、プローブが、本発明に従って標識された塩基を組み込むための逆転写反応に対するプライマーとして機能するだけでなく、（同一の磁性プローブを用いることによって）　５ｓｃＤＮＡを合成するための逆転写反応に対するプライマーとしても機能し得るようになる点である。かかる合成は、本願と同日付で出願の、英国特許出願第８８２７１５８．０．号に基づく優先権主張を伴う出願明細書にさらに詳細に記載されている。

目的の核酸は、本発明の方法を行うに先立って、予備処理段階を必要とする場合がある。例えば、目的核酸が二本鎖１）ＮＡであれば一本鎖Ｉ）ＮＡを得るために最初の融解処理段階とその後の急冷処理段階が必要となる（融解温度Ｔ、は前述の通りである。）。ｍＲＮＡのプールから特定のｍＲＮＡをアッセイすることを望むならばＤＮＡよりもＲＮＡの法が安定性が低いので、目的とする核酸を特異的プローブで選択するに先立って、まずプール内のすべてのｍＲＮＡについてｃＤＮＡを合成することが好ましい。目的とする核酸の量が比較的少ない場合は、間隔を置いた２つの特異的配列が分っていれば、当然、ＰＣＲ法で目的とする核酸を増幅することが望ましい。

本発明の方法においては、最初のｍＲＮＡ分離段階は明らかにずっと簡単である。特定のｍＲＮＡを単離するために特異的プローブを用いるので、先行技術のｍＲＮＡの大きさによる分画及び同定段階を必要とせず、従って長時間にわたる操作とそれに起因するｍＲＮＡの劣化を避けることができるからである。

従来のｍＲＮＡの単離及び精製法においては連続した酵素反応による操作が同一容器内で行われるので、各段階において副生成物をエタノールで沈殿させ、かつ各段階において酵素をフェノール抽出によって取り除く。このため、個々の反応に対する条件を最適化にすることは困難であった。本発明の方法においては、上清がらの磁性粒子の分離が容易なため、各段階で最適の緩衝液を使用することができる。

連続的なｃＤＮＡの合成を意図する場合に用いるためのプローブとして特に有用なプローブの形は、３′末端が重複しかつ、５′末端付近の領域とハイブリダイズした残りの５′末端の領域が目的核酸とハイブリダイズする付着末端として残るような配列のＤＮＡである。アミノ基のような官能基が付着末端から離れた位置に存在する場合には、ループを例えばカルボキシル基を介して磁性粒子に共有結合させてもよい。或いは、ビオチン基をループに結合させ、それによってプローブをストレプトアビジンでコートされた粒子に結合させることもできる。付着末端に対応した末端領域を有するＤＮＡは、従って、ＤＮＡを共有結合させる必要があれば、ループの近傍部分に結合させることが可能である。ＲＥ部位は、その後のＤＮＡの分離用プローブの重複領域に導入することができる。

磁性粒子にカップリングした特異的ＤＮＡプローブを用いると、該プローブにハイブリダイズする共通の配列を有するｍＲＮＡ分子群の検出及び定量に特に有用である。

従って、例えば重鎮と軽鎖の不変領域から得たＤＮＡプローブを用いて、関連する細胞抽出液から免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡをアッセイし得る。

遺伝病の研究においては遺伝子の保存された配列に対応するプローブを用いれば一連の修飾遺伝子に対応するｍＲＮＡのアッセイが可能であり、また上述の方法を用いれば遺伝子の対応するＤＮＡの合成することが可能である。

プローブオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置、例えば＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ＠ｙＮｅｍ　Ｉｎｃ、社から市販のもの（８５０−１１カリフオルニア州、フォスターシティ、リンカーンセンター）を用いて調製し得る。

粒子は特に単分散型及び／又は起磁性であることが望ましい。これらの特性は共に粒子の関与する反応速度に大きく貢献する。反応において粒子に担持されたプローブが溶液中に自由に存在する場合と実質上同じ速さで反応をすることは本発明の驚くべき特性である。従って、前述の通り、例えばｍＲＮＡの全単離過程がアフィニティーカラムを用いると２時間もかかるのに対して、約１５分以内で達成できる。単分散粒子（即ち実質的に同じ大きさの粒子）を用いると、反応速度及びその他のパラメーターが著しく均一となる。超常磁性粒子（即ち常磁性を維持するのに必要とされるドメインサイズよりも小さい強磁性材料の豆粒子を含む粒子）を用いると、反応の間の粒子の凝集もしくは集合を避けることがるので、この場合も均一かつ迅速な反応速度が確保できる。粒子は磁場を与えることによって容易に表面上に集合させることができ、段階の処理については物理的な攪拌などによって容易に再分散させることができる。

本発明で用いる磁性粒子として好ましいものは、欧州特許第８３９０１４Ｎ、　５号（Ｓｉｌｅｆ）の記載に従ッテ製造した単分散型で超常磁性のビーズであるその開示内容は参照によって本願明細書中に組み込まれる。これらのビーズにおいては、鉄が非常に均一に分布しており、磁場に対して非常に均一な応答をするが、この性質は、すべてのビーズが同じ速さで移動するために、再現性のある手順、特に自動化された手順を設計する上で重要である。さらに、ある量の鉄を再現性をもって個々の粒子に組み込むことができるので、この量を粒子の比重が後記の範囲内に収まるような比較的低いレベルに調節することができる。従前は、玉均−な製品もしくは小さな粒子は、磁石を当ててもブラウン力に抗することができないほど少量の鉄しか含んでいないか、あるいは物質の比重によって大きい方の粒子が不本意にも沈降するかのいずれかであった。いくつかの自動化された系では、溶液通過時に、反応領域内に粒子を止めておくために磁場を用いているが、このような系で用いる磁性粒子には均一な磁気的特性並びに流動学的特性が欠かせない。

本発明で用いる「単分散」という用語は直径の標準偏差が５％未満であるような粒度分布を意味する。

１．１乃至１．８の範囲の比重、最適には１．２乃至１．５の範囲の比重のビーズの使用が好ましい。本発明で用いる単分散型ビーズにおいては、比重が著しく均一であり、均一かつ予測可能な速度論的特性が得られる。

好適には、単分散型粒子は、直径１ミクロン以上、好ましくは２ミクロン以上であって、好ましくは直径１０ミクロン以下、最も好ましくは６ミクロン以下、（例えば約３ミクロン）の球状ビーズである。粒子が小さいほどゆっくりと沈降するので、沈降時間の方が反応時間よりも長くなる場合もあり、従って物理的攪拌を必要とせずにすむ。しかし、先行技術で用いるような、はるかに小さい直径の微細粒子を含む平均直径０．１〜１．５ミクロンの粒子は磁化に対する応答挙動に信頼性がない。

粒子へのプローブの結合は直接的な化学結合だけでなく、ストレプトアビジン／ビオチン複合体などによるアフィニティー結合であってもよい。

プローブの結合用に、磁性粒子は水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基又はアミノ基のような官能基を有していてもよい。この官能基は、一般に、非被覆単分散型超磁性ビーズを処理することによって導入することができ、これらの官能基の一つを保有する重合体の表面コーティングを与える。例えば、水酸基を与えるにはポリグリコールと共にポリウレタン、又はセルロース誘導体で、カルボキシル基を与えるにはアクリル酸又はメタクリル酸の重合体又は共重合体で、アミノ基を与えるにはアミノアルキル化ポリマーで処理する。米国特許第４６５４２６７号に、かかる表面コーティングの導入法が記載されている。

本発明で用いるのに好ましい被覆粒子は、米国特許第４３３６１７３号、同第４４５９３７８号、及び同第４６５４２６７号に記載されたビーズ修飾法によって調製し得る。それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる。例えば、スチレン−ジビニルベンゼンから製造される直径３、Ｉ５ｐｍのマクロ網状多孔質ポリマー粒子をＨＮＯｓで処理して細孔表面に−ＮＯ２基を導入する。次に粒子をＦｅ２＋の水溶液中で分散する。Ｆｅ２＋は−ＮＯ２基によって酸化されて、細孔の内部で不溶性の鉄オキシーヒドロキシ化合物の沈殿を引きおこす。

加熱した後、磁性鉄酸化物の鉄は微細粒子として該多孔質粒子の全体に存在する。ＮＯ２基はＦｅ””との反応によってＮＯ２基に還元される。

細孔を満たしかつ表面に所望の官能基を導入するため、細孔内及び表面で様々な単量体を重合させる。好ましい種類の粒子の場合、表面は−（Ｃ８２ＣＨ２０）　８−１０結合を介して重合体の主鎖に結合した一ＯＨ基を保有する。その他の好ましいビーズは、メタクリル酸の重合によって得られる一ＣＯＯＨ基を保有する。

例えば、ビーズに初めＮＯ２基が存在していれば、米国特許第４６５４２６７号に記載されているように、それをジエボキシドと反応させ、続いてメタクリル酸と反応させることによって、末端にビニル基が生じる。メタクリル酸との溶液共重合によって、後述のＲ４５２ビーズのような末端にカルボキシル基を有するポリマーコーティングが得られる。同様に、Ｒ２４０、Ｒ４４２、及びＲ４６９ビーズで見られるように、アミノ基は前述のジエポキシドとの反応生成物をジアミンと反応させることによって導入することができ、一方アミノグリセロールのような水酸化アミンとの反応によってＭ４５０及びＲ２５５ビーズに見られるような水酸基を導入することができる。

ＤＨｎａ１社（ノルウェー、オス口）から入手可能なダイナビーズ（Ｄ７ｎｘｂ！ｘｄ＋）　Ｍ　４５０　（直径４．５＋＋ｍ）はエポキシド単量体でコートしたもので、エポキシ基及び水酸基の混合体となっている。しかし、水と接触させることによってエポキシ基は水酸基に変化する。

ダイナビーズ　ＷＨＯ（直径２．８μｍ）は水酸基を有するポリスチレンビーズであり、Ｐ−トルエンスルホニルクロライドとの反応によって水酸基をトシルオキシ基に変化させたものである。

上記のような官能基を有するコーティング剤を用いると、非特異的なりＮＡ及びＲＮＡの結合が極めて少なく、特にカルボキシル化されたビーズで顕著であることを本発明者らは発見した。

前述のように、プローブ及びＲＥリンカ−は好ましくはカルボキシル基を介して磁性粒子に結合させる。即ち、まずＤＮＡの５゛−末端にアミノ基が付与すると、アミノ基はカルボジイミドカップリング剤を用いて、カルボキシル基とアミド結合を形成する。ＤＮＡの５′−側の結合は、５′−アミノＤＮＡと反応するようにＣＮＢｒで活性化した水酸化磁性粒子を用いても達成可能である。

オリゴヌクレオチドＤＮＡの３′−側の結合は化学的合成によっても達成可能である。この場合も、単分散型粒子の極めて均一な性質によって、Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｐｂｘｒａ＋ｘｃｉａ社）のような自動合成装置中での合成に特に適した均一な反応速度がもたらされる。磁性粒子には、水酸基又は保護された水酸基を最初に与えてお（必要がある。Ｄｙｎａ１社のダイナビーズＭ２８０はこの目的によく適合しＣいる。ただし、必要ならば、カルボキシル基のようなその他の表面官能基を、水酸基−保有リンカ−又は３゛−結合ヌクレオチドの結合に用いることもできる。

５゛−結合は、５′−アミノオリゴヌクレオチドとトシル活性化磁性粒子とのカップリングによって行い得る。トシル活性化磁性粒子はＤＹ＋＋ａ１社のダイナビーズＭ２８０のような水酸化磁性粒子のトシル化によって得られる。

トシル基の置換によって直接、磁性粒子に直接結合した５゛−アミノ基が残る。

ビオチンで標識されたヌクレオチドが市販されているので、ＤＮＡ断片の３′− 未満はＤＮＡポリメラーゼを用いて標識することができ、これを磁性粒子に結合したアビジン又はストレプトアビジンに簡便に（例えば水酸基を介して）結合させ得る。立体障害を最小限に抑えるため、ビオチン標識を、−個もしくはそれ以上のε−アミノカプロン酸誘導体のようなスペーサーアームによって、ヌクレオチドに結合してもよい。

一般的に、ビーズの官能化並びにその後のプローブの結合は、個々の磁性粒子が１０３〜１０６のプローブ（１〜３ＱＯｐｏｏｌ／ｍｇ　）を保有するようにするのが好適である。

磁性粒子の粒度が均一であると、プローブが粒子と反応する際、均一なプローブの密度を確保するのに有利である。プローブの密度が均一であると、それらのプローブを用いる様々な過程において全てのプローブが実質上同じ挙動を確実に示すようにするのに重要である。

粒子表面の極めて近傍（例えば７塩基以内）で酸素活性が見られることは、磁性粒子の特筆すべき特徴である。

従って、後述するようにリンカ−配列中にＲＥ部分が存在しかつ続いてプローブをプライマーとして用いる場合、５ｓｃＤＮ＾及びｄ＋ｃＤＮＡを［ｌＮ＾ポリメラーゼによってＲＥ部位を通ってビーズ表面に向かう方向に合成することができ、従って適当なエンドヌクレアーゼによって容易に切断することが可能である。カルボキシル化ビーズの場合、ビーズの表面の微細構造は極めて不均一であるので非常に大きな表面積を有しており、ビーズの表面付近でのハイブリッド形成及び酵素活性に対する立体障害を軽減させ得る。一方、かかるカルボキシル化ビーズへの非特異的な結合は増加しない。

本発明のさらにもう一つの態様において本発明者らは目的とするＲＮＡ及びＤＮＡの検出及び／又は定量用のキットにして、（ａ）一本鎖ＤＮＡプローブが５′−側で結合した磁性粒子、及び以下に示すものの一つもしくはそれ以上を含んでなるキットを供する。

（ｂ）逆転写酵素（ｅ）適当な緩衝液以下の例は説明のみを目的として挙げものである。

ｆｉカルボキシル化ビーズのプローブの結合に用いた反応は以下の通りである。

プローブの５′末端へのアミノ基の導入をＣｈｕ他の一段階反応法（Ｃｈｕ、Ｂ、Ｃ，Ｆ、及び０＋ｇｅｌ、　Ｌ、　Ｅ、　（＋９８５）　ＤＮＡ第４巻３２７ −３３１頁）によって行った結果、アルキルリンカ−の末端第一アミノ基の核性は塩基のアミノ官能基よりも増大した。従って、ビーズ上のカルボキシル基はこれらのアルキルリンカ−の第一アミノ基と優先的に反応するものと考えられる。

Ｒ４５２カルボキシルビーズ１■当り、５’−ＮＨ２修飾プローブＩ００＋＋ｇを含む０．１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐ）１７．０１と０．ＩＭＥＤＣの溶液６００　ｐｉを加えた。穏やかに撹拌しながら反応混合物を室温で２０時間インキュベートした。

（ｂ）　１ＪＨ２修飾プローブを＾ｐｐｌｉｅｄ　［ｌｉｏｓｙｓｆｅｍｇ社製の合成装置とＡｍ１ｎｏｌｉｎｋ　Ｕを用いて合成した。

カップリング反応は以下の通りであった。

Ｒ４５２カルボキシルビーズ１■当り、５’−Ｎ）１２修飾プロ一ブｌＯｊｇを含むＯ，１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ７，０）とＯ，ＩＭＥＤＣの溶液１００　Ｉを加えた。反応混合物をローラーミキサー（Ｃｏｕｌｌｅ＋社製）上で室温で２ＱｆＴｊｒｊ１インキユベートし、次いでＯ，ＩＭ　ＮａＣ１を含むＴＥ緩衝液（×４）中で洗浄した。

ハイブリダイゼーション効率：相補的な２５量体のポリｄＴプローブを用いたハイブリダイゼーション実験を様々な量のプローブが結合したビーズで行った。

ビーズはビーズ１■当り　１〜２５０　ｐｍｏｌのプローブが覆っていた。２５量体のポリｄＡオリゴヌクレオチドの量が増えるに従って、より多量の結合プローブとハイブリダイズした。

２５０　ｐｍｏｌのプローブが結合したビーズには１９３　ｐｍｏｌのプローブがハイブリダイズした。しかし、目的の分子が１００［１塩基対（ｂｐ）の範囲にある時（Ｐ＋ｏｍｅｇｘ　Ｂｉｏｓ７ｓｔｅｍｓ社製の対照ｍＲＮＡ）　、１００　ｐｍｏｌのプローブが結合したビーズとそれより多量のプローブが結合したビーズとの間でハイブリッド形成効率の差はなかった。

Ｇｈｏｓｈ他の方法（Ｇｈｏｓｈ、　Ｓ、Ｓ、及びＭｕｓｓｏ、　Ｇ、Ｆ。

（１９８７）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ＋　Ｒｅｓ、第１５巻５３５３−５３７２頁）によって、プローブをホスフォルアミデート結合を介して３種類の異なるアミノビーズに結合させた。異なるビーズに結合したＤＮＡの量を］、　４ａｇ／■からＩｌ、　３ｕｇ／■まで変化させた。

ポリエチレングリコールリンカ−（８原子）の末端にアミノ基を保有するＲ４６９ビーズは、それより短いリンカ−（３原子）上にアミノ基を保有するＲ２４０ビーズよりも多量のプローブと結合した。Ｒ４４２ビーズの場合のように、リンカ−がそれより長い（２０原子）場合は、ビーズに結合するプローブ量の減少が観察される。これは恐らくリンカ−の二次構造によるもので末端のアミノ基がカップリングできなくなったためであると思われる。

非特異的に結合したＤＮＡの量は、恐らく表面積当りのアミノ基の数によるものと思われるが、ビーズによって異なる（７〜３０％）。最も多量のプローブ（１１μｇ／■）と共有結合したＲ４６９ビーズが、最も少ない非特異的結合を示した。

ホスフォルアミデート結合の酸不安定性を酸加水分解による末端結合度の測定に用いた（Ｃｈｕ、Ｂ、　Ｃ，Ｆ、、　Ｗａｈｌ。

Ｇ、　Ｍ、　及びＯ＋ｇｅ１．Ｌ、Ｅ、　（１９８３）Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、第１１巻６５１３−６５２９頁）。末端結合したプローブの量はビーズによって異なり２０〜６５％と変化したが、この場合もＲ４６９ビーズが好ましいビーズであると思われ、末端結合したプローブは６５％であった。

本発明者らは、ｐＨ６、室温で２４時間の条件に代えて、イミダゾール緩衝液ｐＨ７，５０℃で３時間の条件で反応を行うことにより、Ｒ４６９ビーズに２倍のプローブを結合させることができた。ＥＤＣの濃度を０．１Ｍから０．２Ｍに増加させると、Ｒ４６９ビーズへのプローブ結合量は２０％減少した（データはここには示していない）。

一般的手法６００ｐｍｏｌ　（６＋＋ｇ）のオリゴｄＡ　（３６量体）をｌ　ｍｌの０．１Ｍイミダゾール（ｐＨ７）　、Ｏ，ＩＭ　ＥＤＣ中に溶解し、５■のアミノビーズと混合して５０℃で３時間インキュベートした。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｒｌｅｍ＋社製のＤＮＡ合成装置３８１人と５′末端への第一アミン導入用のＡｍ１ｎｏｌｉｎｋＩＩを用いてオリゴヌクレオチドの５′末端にＮＯ３基を導入した。Ａｍ１ｎｏ　ｌ　ｉ　ｎｋ　ＩＩはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｌｅｍｓ社から入手したものである。合成後、これらのアミノ修飾オリゴヌクレオチドをカップリング実験に直接使用した。

トシル活性化ビーズはＤ７ｎａ１社（オス口）から市販されている。

カップリング法：１０■のトシル活性化ビーズを、５０μｇのＮＨ２修飾オリゴヌクレオチドが溶解した０、５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４１００μｊと混合し、ローラーミキサー上で２０時間３７℃でインキュベートし、次いで０．　ＩＭ　Ｍａｃｅを含むＴＥ緩衝液（×４）中で洗浄した。

ダイナビーズＲ４８８を使用した。このビーズは直径が２．８ミクロンではなく３．１５ミクロンであることを除けばＭ２Ｂ５と同じビーズで、Ｍ２８０ビーズと同様に表面上に第一水酸基を有している。

合成装置（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ　Ｇｅｎｃ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ）を用いて、ＤＮＡの３′末端を表面に結合させる。３．１５ミクロンのビーズに適合させるためにほんの僅かな変更が必要であった。

人ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ＋ｅｍｓ社製の標準小スケールカラムに３１１ミクロンカットのテフロンフィルターを取り付け、ビーズを充填してカラムを装着した。

この担体はジメチルトリチル基（ＤＭＴ＋）を含んでおらず、１サイクル目の第一段階でかかる化学物質が放出されないときにはこの機械は停止してしてしまうので、開始操作に僅か変更を加えた。合成はＤＭＴ　ｒ基が放出されるステップまで標準ＡＢＩ小スケスケールカラムって開始した。次いでＧｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅ＋を手動で停止させ、改良磁性粒子を充填したカラムをＧｅｎｅ　Ａ＋ｓｅｍｂｌｅ＋に取り付けた。

製造業者の勧める標準的な合成プログラムに従って以降の操作を行った。脱保護はＰｈａｒｍ＠ｃｉａ社の勧める通り行った。直接合成法で、オリゴ（ｄＴ）　２５及び以下のに軽鎖遺伝子のＣ領域の配列を合成した。

５′−丁ＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧ丁ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡ−３’グイナビ一ズＭ２８０ストレプトアビジン（ＤＹｎａ１社製、オス口）を固相として使用した。このビーズは直径２，８μｍの単分散型超常磁性粒子でス）　Ｌ／プトアヒジンか共有結合している。このビーズは４．３ｒｒｉ／ｇの表面積を有する。

ビオチン結合能ｌｎｍｏｌの１４０−ビオチン（Ａｍｅ＋ｓｈａｍ社製）を含む５ＸＳＳＰＥ　（リン酸及びＥＤ丁Ａを含む標準塩水溶液＋　１ｌｌａｎｉａｌｉ＋社製）１００μＩを０．５■のビーズに加え、ローラーミキサー（Ｃｏｕｌｔｅ＋ｊ上に室温で１５分間装いた。

５ｘＳＳＰＥ中で２度に分けて洗浄した後、１４Ｃ−ビオチンの結合したフラクションをシンチレーションカウンターで測定した。

デオキシオリゴヌクレオチドデオキシオリゴヌクレオチドは＾ｐｐｌｉｅ＋Ｉ　ＢｉｏｓｙＮｅｍｓ社製の３８１Ａ　ＤＮ人合成装置で合成した。試薬はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｌε ｍｓから購入した。５′アミノ修飾デオキシオリゴヌクレオチドはＡｍ１ｎｏｌｉｎｋ　Ｉｆを用いて合成した。

用いた免疫グロブリンに軽鎖プローブは、５’　−ＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡ−３’ビオチンＸＮＨＳエステル（ＣＬ＋ｎｔｅｃ社製、トビオチニルε−カプロン酸Ｎ−コハク酸イミジルエステル）は供給元の勧めに従って使用した。

９０μＩの水中に溶解した０、１μｍｏｌのＮＨ２修飾オリゴ（ｄＴ）　２５に、標識用緩衝液（Ｉ　Ｍ重炭酸／炭酸ナトリウム、ｐ）ｌ　９．０）　１０μｌを加えて混合した。

最後にビオチンＸＮＨＳエステルのジメチルホルムアミド溶液（１００■／ｍ１）２５μＩを加え、室温で一晩インキユベートした。

過剰の標識試薬と緩衝液を５ｅｐｂａｄｅｘ　Ｇ　−５０のスピンカラムで取り除いた。

５′ビオチン−オリゴ（ｄＤ　２５は、クレノーポリメラーゼ、α−［３２Ｐ］　−ｄＴＴＰ、及び鋳型としてのオリゴ（ｄＡ）２５の反応による補充により末端標識された。過剰な標識は５ｅｐｈａｄｅｒ　Ｇ−５０スピンカラムで取り除いた。

オリゴ（ｄＴ）グイナビーズ（Ｔビーズ）の調製６χ５ＳＰＥ　２．５ｍｌ中に溶解したビオチン化オリゴ（ａＴ）　２５２００ｐｇ　（２４ｎｍｏｌ）を、５０ｍｇの予め洗浄したダイナビーズＭ２８０ストレプトアビジンと混合し、ローラーミキサー上で１５分間室温でインキュベートした。

６ＸＳＳＰＥ中で２回洗浄した後、ビーズを４℃の６ＸＴＥ。

０．１％ＳＤＳ中で保存した。

異なるバッチのＴビーズのハイブリダイゼーション能を測定する標準アッセイ法において、エッペンドルフチューブに入れた０、　１■ノビーズを６ＸＳＳＰＬ　Ｏ，１％　ＳＤＳテ１回洗浄した。各段階でビーズを集めるためにマグネット・ラック（ＭＰＣ−Ｅ、Ｄｙｎａ１社製、オス口）を使用した。

洗浄用緩衝液を除去した後、痕跡量（１〜２Ｘ１０５ｃ　ｐｍ）のａ　−［３２ＰＩ　−ｄＡＴＰで標識されたオリゴ（ｄＡ）２．を５０ｐｍｏｌ含むハイブリダイゼーション溶液（６ＸＳＳＰＥ、　０．１％５ＤＳ）を加えた。

穏やかに撹拌した後、ハイブリダイゼーションさせるためチューブを室温で２分間放置した。

ハイブリダイズしたビーズを２ＸＳＳＰＬ　０．１％ＳＯＳで室温で２回洗浄し、オリゴ（ｄＴ）　２５にハイブリダイズしたオリゴ（ｄＡ）　２５の量をシンチレーションカウンターで測定した。

ポリＡ　ｍＲＮＡ　トレーサーの標識３′末端にポリＡ２５テイルをもっ１２００ｂｐの加ＲＮＡ（Ｐ＋ｏｍｅｇｘ社製）ｌａｇを、５Ｘクレノウ緩衝液、１ユニツトのＲＮａｓｉｎ　（Ｐ＋ｏｍｅｇａ社製）及びｌ０ｍＭ　ＤＴＴ中に溶解した２、　５ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＤ　２５と混合する。室温で２分経過した後、１０μＣｉのα−［”Ｐ］　−ｄＡＴＰ、　１ユニツトのクレノーポリメラーゼ（Ａｍｅ＋ｓｈｉｍ社製）及び水を加えて５０μｌとし、１５℃で６０分間インキコベートした。過剰のα−［３２Ｐ］　−ｄＡＴＰをＳｅｐｈａｄｅｗ　Ｇ−５０スピンカラムで除去した。

ポリ（Ａ）結合用緩衝液：０、５Ｍ　ＬｔＣｌ、　ＩＱＩｎＭ　１ｒｉｓ−Ｃ７（９Ｈ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．１％５ＤＳ０洗浄用緩衝液：Ｑ、　１５Ｍ　ＬｉＣｊＳｌｏｍＭ　ｌｌ１ｇ−ＣＩ（ｐＨ７，５）、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．１％　ＳＤＳ溶出用緩衝液：２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％５ＤＳ０精製ｍＲＮＡを用いるその後の段階に応じて最後の洗浄段階並びに溶出用緩衝液からＳＤＳを省いてもよい。

例６溶液中に存在するポリアデニル化ｍＲＮＡの定量アッセイハイブリドーマ細胞系列ＡＢ４のｍＲＮＡが磁性ビーズを用いて単離されているが、その濃度を測定するのに、ＵＶ−分光光度法よりも感度の高い方法が必要とされていた。

市販のマウスの膵臓（ｃｌｏｎｌｅｃｈ）由来の濃度既知ポリＡのｍＲＮＡを以下の希釈溶液中に懸濁させた。２ユニツトのＲＮａｓｉｎ及び１０　ｍＭ　ＤＤＴを含む５０μｌの５　Ｘ　５ＳＰＨにそれぞれＩＱＯｎｇ　（０，２５ｐｍｏｌ）　、５０ｎｇ　（０，］２ｐｍｏｌ）　、２０ｎｇ　（５０℃ｍｏｌ）及びＩＯｎｇ　（２５１ｍｏｌ）のｍＲＮＡを加えた。（質量とモル数の関係（ｕｇ／ｍａｔ）はポリＡ　ｍＲＮＡの平均の長さを１２００塩基と仮定して計算した。この計算から、分子量は３９６、０００でｌｌ１ｇのｍＲＮＡは２．５ｐｍｏｌに相当すると示唆された。）濃度未知のへＢ４−ｍＲＮへについて同様の４種の希釈を行った。

ＲＥＴと呼ぶ［１）ＩＡプローブを磁性ビーズ（Ｒ５０２）にカップリングした。ビーズ１ｍｇ当り　（ｄＡ）　１□オリゴヌクレオチド８ｐｍｏｌｓのハイブリダイゼーション容量が得られた。

８種類の混合液それぞれに０．５ｍｇのＲＥＴビーズを加え、ｍＲＮＡを磁性プローブと室温で１０分間ハイブリダイズさせた。以前の実験結果から、このようにｍＲＮＡに対するモル比で大過剰のプローブが存在すると、（この場合２０：１以上）この段階で９０％を越すｍＲＮＡがハイブリダイズすることが知られている。

ビーズを回収（凝集）し、室温にて、２００　ｐｇの２×５ＳＰＥで一回洗浄した。

８本のチューブ、及びｍＲＮＡのない０．５ｍｇのＲＥＴビーズだけの対照試料の各々に、予め混合しておいた反応溶液を５０ｐｌづつ加えた。

この５０ｒｒｌの混合液はフレノウ緩衝液（５（ｌ　ｍＭ　ＮａＣｌ、　２Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｔｔ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５）１　ｍＭ　ＥＤＴＡ１ユニツトクレノウ酵素１００ｍｏｌ非放射性ｄＴＴＰを含む。

ビーズの沈降を避けるためにチューブをローラーマシン上で６０分間１５℃でインキュベートした。インキュベーションの後、ビーズを２００　ｐｌの０．２　Ｍ　ＮａＯＨ，０，５Ｍ　Ｍａｃｅで２回洗浄し、５０ｔｔｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　ｌｌ１ｇ−ＨＣ（（ｐＨ７，４）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）に再懸濁した。

ビーズに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターで測定した。

その結果（第１図に示す）、添加した標準ｍＲＮＡと取り込まれたｄＴＴＰの間にはっきりとした直線関係が認められた。試料のうち２つは今回選択した標準希釈率の範囲内に存在し、それぞれを用いて、第１図の標準曲線から実際のＡＢ４　ｍＲＮＡの濃度を決定した。

対照試料については、鋳型が存在しないことから予想される通り、ｄＴＴＰの取り込みは全く認められなかった。

例７例６と同様の実験であるが、この場合は、ビオチン化されたオリゴｄＴ２ｓの結合したダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン１００μｇをＩｏｏｎｇ　、５０ｎｇ、２０ｎｇ及びｌ（ｌｎｇのＰ＋ｏｍｅｇａ社製対照ｍＲＮＡ　（３０塩基のポリＡテールを有する〜１，２ＫｂカナマイシンｍＲＮＡ）とハイブリダイズさせ、２Ｘ　５ＳＰＥで２度洗浄した後に、逆転写酵素及び（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰを用いて、標準一本鎖ｃＤＮ＾の合成（Ｐｒｏｍｅｇａｐｒｏｔｏｃｏｌ）を行った。さらに０．２　Ｍ　ＮｌＯＨで２度洗浄した後に、５ｈＪのＴＥ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐｔ＋７．５、ｌＯｍＭＥＤＴＡ　）に再懸濁させた。ビーズに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターで測定したところ、例６と同様の結果が得られた。

４、ｆｆ１ｏＬ　−１ＬＮＡ国際調査報告国際調査報告ＥＰ　８９０１４１６

Claims

【特許請求の範囲】１　検体試料中の目的ＲＮＡ又はＤＮＡの検出及び／又は定量法にして、ａ）該ＲＮＡ又はＤＮＡに結合することのできる一本鎖ＤＮＡプローブの５′側と結合した磁性粒子を検体と接触させる段階、ｂ）標識ヌクレオチド存在下で該磁性粒子を逆転写酵素又はポリメラーゼの水溶液に接触させ、上記プローブをプライマーとして用いることによって検体中に上記ＲＮＡ又はＤＮＡが存在していれば標識された相補的一本鎖ＤＮＡが生ずるようにし、該磁性粒子を表面上に磁気的に集合させ、かつ上記溶液を除去する段階及び、ｃ）上記標識の有無を検出及び／又は該標識量を定量する段階、を含んでなる方法。２　請求項１記載の方法において、相補的一本鎖ＤＮＡの鎖長が限定されていることを特徴とする方法。３　請求項２記載の方法において、全標識量を目的核酸分子数に相関せしめるべく、鎖合成をある既定の平均長に制限するための既定量のジデオキシヌクレオチドが量段階（ｂ）に存在することを特徴とする方法。４　請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法において、段階（ａ）で使用するプローブがオリゴｄＴであることを特徴とする方法。５　請求項２記載の方法において、全標識量を目的核酸分子数と相関せしめるべく、前記プローブが前記ＤＮＡ又はＲＮＡの鎖終結点からある一定の間隔を置いて該ＤＮＡ又はＲＮＡに結合することを特徴とする方法。６　請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法において、（ａ）段階及び（ｂ）段階の間で該目的ＲＮＡ又はＤＮＡを増幅させるために、５′−側で磁性粒子に結合したプライマーを用いてＰＣＲを行う方法。７　請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法において、段階（ａ）、段階（ｂ）及び段階（ｃ）の各段階の間で洗浄を行うことを特徴とする方法。８　請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法において、前記標識ヌクレオチドが、放射線標識、蛍光発色団、及び特異的結合対の低分子量リガンドからなる群から選択される標識を含んでなることを特徴とする方法。９　試料中の微生物の存在及び／又は存在量を検知する方法にして、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法に従って、微生物のＲＮＡ又はＤＮＡを検出することを特徴とする方法。１０　目的ＲＮＡ又はＤＮＡの検出及び／又は定量用のキットにして、（ａ）一本鎖ＤＮＡプローブが５′−側で結合した磁性粒子、及び以下の一つあるいは複数のもの。（ｂ）逆転写酵素（ｃ））ポリメラーゼ（ｄ）標識ヌクレオチド（ｅ）適当な緩衝液。