CN105524918A - 一种高通量提取园艺植物叶片基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子生物学领域，具体提供一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法。该方法简单快捷，无需液氮研磨，制备通量高，耗费时间短，DNA得率和纯度比较高；并且，本发明在裂解液中用高浓度的氯化锂替代了氯化钠，使得到的DNA基本不含RNA污染。本发明得到的DNA可用于园艺植物群体遗传学、系统进化、分子标记、和常规PCR等实验，适用于普通生物实验室研究，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法。
背景技术
足量的高品质DNA是展开植物分子生物学研究的基础，但是，目前，园艺植物细胞中常含有大量的色素、多糖、酚类等次生代谢产物，特别是多糖在DNA提取过程中的共沉淀，使提取的DNA呈胶状难以溶解，纯度显著下降。
常规使用的CTAB法、SDS法、尿素提取法和高盐低pH法在提取园艺植物DNA时或耗时长、操作复杂，或提取效果差，易降解，或提取成本非常昂贵，具体为：
常规的CTAB法需要用液氮研磨材料，提取过程中需要使用酚/氯仿抽提2-3轮，且需要低温长时间离心，耗时长，操作繁琐，提取通量低，每人每天只能提取5-10份，耗时长，并且效率非常低下。
使用常规CTAB法及其它方法提取的基因组DNA中一般都有大量的RNA污染，需要加入RNA酶消化去除RNA。
现有技术中通常所采用的高通量制备DNA的方法，或需要使用组织研磨仪在96孔板或普通EP管中进行高通量研磨，设备昂贵（5-10万元/台），常规实验室无法使用，或直接将材料在稀碱溶液中煮沸裂解，效果不稳定易降解。
并且，目前市场上的商业试剂盒在提取植物DNA时一般都需要液氮研磨材料，其质量和效果因生产批次不同而不稳定，且价格比较昂贵，难以进行高通量提取。
一些改进的CTAB法、SDS法、酶解法虽能进行高通量制备，但提取的DNA纯度不高，且一般需要组织研磨仪等特殊设备，难以满足常规实验室的要求。
发明内容
针对于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种经济、快速、去糖效果良好、高通量的园艺植物叶片基因组DNA提取方法，该方法采用改良的提取液和制备工艺，能够从少量植物叶片提取高质量的DNA，具有巨大的应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
提供一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤：
（1）取10-30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200-300ul研磨液，10-15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加1ml所述研磨液，涡旋混匀；
（2）在8000rpm，室温离心1分钟，去除离心所得上清液，向沉淀中加入500-700ul65℃预热的裂解液和10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，60-65℃保温10-15分钟；
（3）待步骤（2）中的混合液冷却至室温后，加入与步骤（2）中的裂解液等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟；
（4）取300-400ul上清，转入另一离心管中，加入1/4所述上清体积的5M氯化钠，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10-15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀；
（5）向步骤（4）中得到的沉淀加入400ulTE，用移液器吹打，溶解，再加入1/10所述TE体积的3M醋酸钠，pH5.2，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10-15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀。
（6）将步骤（5）所得沉淀用70-75%乙醇洗涤后，室温下风干6-10分钟，加入50ulTE溶液，得到基因组DNA。
所述步骤（1）、（2）和（3）替代为：
（1）取10-30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200-300ul裂解液，10-15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加300-400ul裂解液和10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，60-65℃保温10-15分钟；
（2）待步骤（1）中的混合液冷却至室温后，加入与步骤（2）中的第一次和第二次加入的裂解液体积之和等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟。
所述步骤（5）、（6）替代为：
（5）将步骤（4）所得沉淀用70-75%乙醇洗涤后，室温下风干6-10分钟，加入50ulTE溶液，得到基因组DNA。
步骤（1）中，所述石英砂和维生素C的质量比为1：1.
所述研磨液的配方组成为：
200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮，pH8.0；
所述裂解液的配方组成为：体积比为1:1的A液和B液；
所述A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0；
所述B液的配方为：8M氯化锂；
所述TE配方为：
10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸和1mM乙二胺四乙酸二钠。
所述电动研磨仪由小型电钻和设置于所述电钻上的金属研磨棒组成。
所述植物叶片为植物新鲜叶片或室温干燥保存的叶片；所述植物为草莓、桃、梨、柑橘、李子、甘蓝或南瓜。
本发明的方法具有以下有益效果：
1）简单快速，高通量；本方法无需液氮研磨，提取过程中仅需要用氯仿进行1轮抽提，室温短时间离心，耗时短，配合简单组装的电动研磨仪便可以实现高通量提取，每人每天能提取80-120份，提取效率得到大大提高。
2）无RNA污染；本方法提取的基因组DNA几乎不含RNA，纯度高。
3）成本低，效果稳定，常规实验室即可使用；本方法在高通量制备时，只需将常规的电钻和金属研磨棒组合成电动研磨仪，在1.5毫升离心管中仅需10秒即可将材料研磨至匀浆状，研磨完一个样品后，只需用灭菌蒸馏水冲洗干净即可用于下一组材料的研磨，样品少时也可以用研钵进行研磨，效果稳定，重复性好，成本低，使用方便。
4）本发明的方法操作简单快捷，无需液氮研磨，制备通量高，耗费时间短，DNA得率和纯度比较高；并且在裂解液中使用高浓度的氯化锂替代了氯化钠，使得到的DNA基本不含RNA污染，纯度高，本发明得到的DNA可用于园艺植物群体遗传学、系统进化、分子标记、和常规PCR等实验，适用于普通生物实验室研究。
附图说明
图1为本发明实施例1-8提取的不同植物叶片基因组DNA的凝胶电泳图。
图2为以本发明实施例1-8提取的不同植物叶片基因组DNA为模板进行扩增的ISSR凝胶电泳图。
图3为以限制性内切酶ECORI酶切消化本发明实施例1-8提取的不同植物叶片基因组DNA的示意图。
图4为以本发明实施例1-8提取的不同植物叶片基因组DNA为模板扩增叶绿体rbcl基因的PCR凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
（1）取20mg新鲜的草莓叶片置于1.5ml离心管中，再向离心管中加入200ul研磨液，以及10mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪将上述混合物研磨至匀浆状，补加1ml研磨液，涡旋混匀；其中，石英砂和维生素C的加入量均为5mg；电动研磨仪由常规的小型电钻和设置于电钻上的金属研磨棒组成，成本低，组装简单，使用方便；
（2）将步骤（1）得到的研磨液在8000rpm，室温下，离心1分钟，去除离心所得上清液，向沉淀中加入600ul65℃预热的裂解液以及10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，65℃保温10分钟，期间颠倒混匀1-2次；
（3）将步骤（2）得到的混合液冷却至室温后，加入600ul氯仿，剧烈震荡30秒，室温放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟；
（4）取400ul上清转入另一个离心管中，加入100ul的5M氯化钠，颠倒混匀，加入1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保留沉淀。
（5）在步骤（4）的沉淀中加入400ulTE，用移液器吹打加速溶解，再加入40ul3M的醋酸钠，pH5.2，颠倒混匀，加入800ul无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保留沉淀；
（6）将步骤（5）所得沉淀用75%乙醇洗涤后，室温风干10分钟，加入50ulTE溶解，得到基因组DNA，-20℃保存。
上述方法中，研磨液的配方组成为：200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮（pH8.0）；
裂解液的配方组成为：体积比为1:1的A液和B液；其中，
A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000（pH8.0）；
B液的配方为：8M氯化锂。
TE的配方组成为：10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸和1mM乙二胺四乙酸二钠。
实施例2
采用的植物为梨叶片，提取步骤同实施例1，得到梨叶片基因组DNA。
实施例3
（1）取20mg新鲜的桃叶片置于1.5ml离心管中，再向离心管中加入300ul65℃预热的裂解液，以及10mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪将上述混合物研磨至匀浆状，再加入400ul裂解液和10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，65℃保温10分钟，期间颠倒混匀1-2次；
（2）将步骤（1）得到的混合液冷却至室温后，加入700ul氯仿，剧烈震荡30秒，室温放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟；
（3）取400ul上清转入另一个离心管中，加入100ul的5M氯化钠，颠倒混匀，加入1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保留沉淀；
（4）在步骤（3）的沉淀中加入400ulTE，用移液器吹打加速溶解，再加入40ul3M的醋酸钠，pH5.2，颠倒混匀，加入800ul无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保留沉淀；
（5）将步骤（4）所得沉淀用75%乙醇洗涤后，室温风干8分钟，加入50ulTE溶解，得到基因组DNA，-20℃保存。
上述方法中，裂解液的配方组成为：体积比为1:1的A液和B液；其中，
A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0；
B液的配方为：8M氯化锂。
研磨液的配方组成为：200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮，pH8.0；
TE的配方组成为：10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸和1mM乙二胺四乙酸二钠。
实施例4
采用的植物为月季叶片，提取步骤同实施例3，得到月季叶片基因组DNA。
实施例5
（1）取20mg新鲜的甘蓝叶片置于1.5ml离心管中，再向离心管中加入200ul65℃预热的裂解液，以及15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪将上述混合物研磨至匀浆状，再加入500ul裂解液和10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，65℃保温10分钟，期间颠倒混匀1-2次；
（2）将步骤（1）得到的混合液冷却至室温后，加入700ul氯仿，剧烈震荡30秒，室温放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟；
（3）取400ul上清转入另一个离心管中，加入100ul的5M氯化钠，颠倒混匀，加入1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保留沉淀；
（4）将步骤（3）所得沉淀用75%乙醇洗涤后，室温风干8分钟，加入50ulTE溶解，得到基因组DNA，-20℃保存。
上述方法中，裂解液的配方组成为：体积比为1:1的A液和B液；其中，
A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0；
B液的配方为：8M氯化锂。
研磨液的配方组成为：200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮，pH8.0。
实施例6
采用的植物为南瓜叶片，提取步骤同实施例6，得到南瓜叶片基因组DNA。
实施例7
（1）取20mg新鲜的李子叶片置于1.5ml离心管中，再向离心管中加入300ul研磨液，以及10mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪将上述混合物研磨至匀浆状，补加1ml研磨液，涡旋混匀；其中，石英砂和维生素C的加入量均为5mg；
（2）将步骤（1）得到的研磨液在8000rpm，室温下，离心1分钟，去除离心所得上清液，向沉淀中加入700ul65℃预热的裂解液以及10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，65℃保温10分钟，期间颠倒混匀1-2次；
（3）将步骤（2）得到的混合液冷却至室温后，加入700ul氯仿，剧烈震荡30秒，室温放置2分钟；；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟；
（4）取400ul上清转入另一个离心管中，加入100ul的5M氯化钠，颠倒混匀，加入1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保留沉淀；
（5）将步骤（4）所得沉淀用75%乙醇洗涤后，室温风干10分钟，加入50ulTE溶解，得到基因组DNA，-20℃保存。
上述方法中，研磨液的配方组成为：200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮，pH8.0；
裂解液的配方组成为：体积比为1:1的A液和B液；其中，
A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0；
B液的配方为：8M氯化锂。
试验例
1、计算实施例1-8提取的不同植物的叶片基因组DNA的得率和纯度，计算结果，如下表1所示：
从表1可以看出，采用本发明方法提取的DNA无蛋白污染，多糖的污染也比较低，满足大部分实验的要求。
表1不同植物叶片基因组DNA
2、取本发明实施例1-8提取的不同植物的叶片基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶对上述基因组DNA进行电泳检测，如图1所示，结果表明：DNA条带清晰，几乎不含RNA，没有受到DNA的污染。
3、以本发明实施例1-8提取的不同植物的叶片基因组DNA为模板，CW32466（5’-ACACACACACACACACYG-3’）为特异引物进行ISSR凝胶电泳检测，获得目标条带，如图2所示，可以看出，条带比较清晰，可以显著区分不同物种的差异，表明其可以用于分子标记实验。
4、以限制性内切酶ECORI酶切消化本发明实施例1-8提取的不同植物的叶片基因组DNA，获得目标条带，如图3所示，可以看出，消化效果很好，表明其可以用于分子标记实验。
5、以本发明实施例1-8提取的不同植物的叶片基因组DNA为模板，PCR扩增叶绿体rbcl基因，并进行电泳检测，获得目标条带，如图4所示，条带清晰单一，表明其可以用于常规PCR扩增实验。
在上述图1-图4中，M为标准分子量参考；1、草莓；2、梨；3、桃；4、月季；5、甘蓝；6、南瓜；7、李子。
Claims (7)
1.一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）取10-30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200-300ul研磨液，10-15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加1ml所述研磨液，涡旋混匀；
（2）在8000rpm，室温离心1分钟，去除离心所得上清液，向沉淀中加入500-700ul65℃预热的裂解液和10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，60-65℃保温10-15分钟；
（3）待步骤（2）中的混合液冷却至室温后，加入与步骤（2）中的裂解液等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟；
（4）取300-400ul上清，转入另一离心管中，加入1/4所述上清体积的5M氯化钠，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10-15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀；
（5）向步骤（4）中得到的沉淀加入400ulTE，用移液器吹打，溶解，再加入1/10所述TE体积的3M醋酸钠，pH5.2，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10-15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀；
（6）将步骤（5）所得沉淀用70-75%乙醇洗涤后，室温下风干6-10分钟，加入50ulTE溶液，得到基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，所述步骤（1）、（2）和（3）替代为：
（1）取10-30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200-300ul裂解液，10-15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加300-400ul裂解液和10ul2-巯基乙醇，涡旋混匀，60-65℃保温10-15分钟；
（2）待步骤（1）中的混合液冷却至室温后，加入与步骤（2）中的第一次和第二次加入的裂解液体积之和等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟。
3.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，所述步骤（5）、（6）替代为：
（5）将步骤（4）所得沉淀用70-75%乙醇洗涤后，室温下风干6-10分钟，加入50ulTE溶液，得到基因组DNA。
4.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，步骤（1）中，所述石英砂和维生素C的质量比为1：1。
5.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，所述研磨液的配方组成为：
200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮，pH8.0；
所述裂解液的配方组成为：体积比为1:1的A液和B液；
所述A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0；
所述B液的配方为：8M氯化锂；
所述TE配方为：
10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸和1mM乙二胺四乙酸二钠。
6.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，所述电动研磨仪由小型电钻和设置于所述电钻上的金属研磨棒组成。
7.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，所述植物叶片为植物新鲜叶片或室温干燥保存的叶片；所述植物为草莓、桃、梨、柑橘、李子、甘蓝或南瓜。
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