KR101793221B1 - 모노클로널 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피브린 또는 피브리노겐 YC 도메인에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 다양한 태양에서, 항체는 피브린 또는 피브리노겐 yC 도메인에 대한 미세아교세포 부착을 억제하고/하거나, 피브린 또는 피브리노겐 yC 도메인에 대한 Mac-1 결합을 억제하고/하거나, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 임상적 징후를 억제한다. 다양한 항체의 사용 방법, 약제학적 조성물, 키트, 벡터, 벡터를 포함하는 세포 및 항체 생성 방법이 제공된다.

Description

모노클로널 항체{MONOCLONAL ANTIBODIES}

관련 출원에 관한 상호 참조

본 출원은 미국 가출원 제61/248,014호(출원일: 2009년 10월 2일)로부터의 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.

연방정부 지원 연구 또는 개발에 관한 언급

본 발명은 부분적으로 국립 후생 연구소 보조금 NS052189 하에 연방정부 지원으로 이루어졌다. 연방 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

전자 제출된 물질의 참고 포함

본 명세서의 일부인 서열 목록에는 본 발명의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 미국 특허상표청 페이턴트인(PatentIn) 버전 3.5 소프트웨어에 의해 생성된 제목 "RUC110WO_ST25"의 문서에 제공되는 서열이 포함된다. 서열 목록의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

분야

본 발명은 일반적으로 모노클로널 항체의 생성, 특히 피브린 γC 도메인을 인식하는 모노클로널 항체 및 치료제로서 모노클로널 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

다발성 경화증은 면역계가 뇌와 척수를 공격하는 경우 발생하여, 신경 섬유를 절연시키고, 보호하는 미엘린 수초를 손상시킨다. 미세아교세포로 알려져 있는 뇌 세포는 이러한 공격에 참여하며, 침입자로부터 뇌를 보호하여야 하는 세포의 내층(lining)인 혈액 뇌 장벽(BBB)이 무너지는 경우 활성화된다. BBB가 무너짐에 따라, 피브리노겐으로 지칭되는 혈액 단백질이 뇌 내로 누출된다. 피브리노겐은 혈액 응고에서의 그의 알려져 있는 역할 외에, 미세아교 세포를 활성화시켜, 다발성 경화증의 동물 모델에서 염증 반응을 증가시킨다. 또한, 피브리노겐이 "누출"되는 조직 손상이 발생하는 특정 암, 류마티스 관절염 및 기타 질환 및 병상(pathology)의 발병에 관여하는 것으로 결정되었다. 예컨대 문헌 [Akassoglou et al., 2002, Neuron, 33:861-875; Akassoglou et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:6698-6703; Adams et al., 2007, J. Exp. Med., 35:2428-34]을 참조한다. 또한, 피브리노겐이 이들 효과를 매개하기 위해 사용하는 특정 수용체인 Mac-1이 피브리노겐의 유익한 응고 특성에 관여하지 않는 것으로 판명되었다. 그러나, 지금까지 피브리노겐/Mac-1 결합의 특이적인 억제제가 개발되지 않았다.

따라서, 대상체의 뇌 및 다른 곳에서 피브리노겐의 전염증성 효과를 감소시킴과 동시에 혈액 응고에서 피브리노겐의 유익한 효과를 유지시키는 피브리노겐/Mac-1 결합의 특이적 억제제가 필요하다.

본 발명은 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 본 발명의 특정 태양에서, 항체는 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인에 대한 미세아교 부착의 20% 초과의 억제를 나타낸다. 다른 태양에서, 항체는 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인에 대한 Mac-1 결합의 50% 초과의 억제를 나타낸다. 또 다른 태양에서, 항체는 재발 시에 실험적 자가면역 뇌척수염(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)의 임상적 징후(symptom)를 억제한다.

다양한 실시형태에서, 항체는 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인의 γ^377-395 에피토프에 결합한다. 본 발명의 항체는 대안적으로 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인의 γ^190-202 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 모노클로널 항체이며, 다양한 태양에서, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.

본 발명의 다양한 태양에서, 항체는 RSSKSLLHSSGITYLS(서열 번호 2), QMSNLAS(서열 번호 3) 및 AQNLELPLT(서열 번호 4)를 비롯한 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄를 포함한다. 다양한 태양에서, 항체는 GYTFTSYWIH(서열 번호 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG(서열 번호 7) 및 SDPTGC(서열 번호 8)를 비롯한 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 예에서, 항체는 RSSKSLLHSSGITYLS(서열 번호 2), QMSNLAS(서열 번호 3) 및 AQNLELPLT(서열 번호 4)를 비롯한 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄, 및 GYTFTSYWIH(서열 번호 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG(서열 번호 7) 및 SDPTGC(서열 번호 8)를 비롯한 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄를 포함한다.

다양한 태양에서, 상기 항체는 서열 번호 1의 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 태양에서, 상기 항체는 서열 번호 5의 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 상기 항체는 서열 번호 1의 경쇄 가변 아미노산 서열 및 서열 번호 5의 중쇄 가변 아미노산 서열 둘 모두를 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 항체는 개별적으로 RSSKSLLHSSGITYLS(서열 번호 2), QMSNLAS(서열 번호 3) 및 AQNLELPLT(서열 번호 4)를 비롯한 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄, 및 GYTFTSYWIH(서열 번호 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG(서열 번호 7) 및 SDPTGC(서열 번호 8)를 비롯한 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄를 포함하며; 여기서, 경쇄 상보성 도메인 및 중쇄 상보성 도메인은 Mac-1 결합 능력을 보유한다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 항체는 개별적으로 RSSKSLLHSSGITYLS(서열 번호 2), QMSNLAS(서열 번호 3) 및 AQNLELPLT(서열 번호 4)를 비롯한 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄, 및 GYTFTSYWIH(서열 번호 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG(서열 번호 7) 및 SDPTGC(서열 번호 8)를 비롯한 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄를 포함하며; 여기서, 경쇄 상보성 도메인 및 중쇄 상보성 도메인은 Mac-1 결합 능력을 보유한다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 항체는 개별적으로 RSSKSLLHSSGITYLS(서열 번호 2), QMSNLAS(서열 번호 3) 및 AQNLELPLT(서열 번호 4)를 비롯한 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄, 및 GYTFTSYWIH(서열 번호 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG(서열 번호 7) 및 SDPTGC(서열 번호 8)를 비롯한 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄를 포함하며; 여기서, 경쇄 상보성 도메인 및 중쇄 상보성 도메인은 Mac-1 결합 능력을 보유한다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 항체는 개별적으로 RSSKSLLHSSGITYLS(서열 번호 2), QMSNLAS(서열 번호 3) 및 AQNLELPLT(서열 번호 4)를 비롯한 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄, 및 GYTFTSYWIH(서열 번호 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG(서열 번호 7) 및 SDPTGC(서열 번호 8)를 비롯한 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄를 포함하며; 여기서, 경쇄 상보성 도메인 및 중쇄 상보성 도메인은 Mac-1 결합 능력을 보유한다.

또한, 피브린에 대한 Mac-1 결합 또는 피브리노겐과의 Mac-1 결합과 관련된 병상의 징후를 경감시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 특허청구범위 제1항의 항체를 이러한 경감이 필요한 대상체에게, 대상체에서 병상의 징후를 경감시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 다양한 태양에서, 대상체는 인간이다. 다양한 태양에서, 병상은 다발성 골수종, 척수 손상, 알츠하이머병, 뇌졸중, 류마티스 관절염 및 암을 포함한다.

또한, 상기 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 다른 태양에서, 상기 항체를 포함하는 키트가 제공된다. 또 다른 태양에서, 피브린 γ^377-395 에피토프, CKKTTMKIIPFNRLTIG(서열 번호 18) 또는 그의 생물학적 활성 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다. 다른 태양에서, 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 피브린 γ^377-395 에피토프 또는 그의 생물학적 활성 유도체에 면역특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 제1 용량의 특허청구범위 제23항의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 제1 용량은 상기 대상체에서 면역 반응을 생성하는데 충분하다. 다양한 태양에서, 상기 방법은 제2 용량의 상기 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 제2 용량은 상기 대상체에서 면역 반응을 생성하는데 충분하다. 다양한 태양에서, 생성된 항체는 상기 대상체 내에서 피브린/Mac-1 결합을 억제한다.

다른 태양에서, Mac-1 수용체에 결합하고, Mac-1 수용체 활성을 조절하는 리간드에 대한 스크리닝 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 특허청구범위 제1항의 항체를 제공하는 단계; (b) 피브린 γ^377-395 에피토프 CKKTTMKIIPFNRLTIG(서열 번호 18) 또는 그의 생물학적 활성 유도체를 접촉시키고, 항체/폴리펩티드 복합체를 형성하는 단계; (c) 상기 항체/폴리펩티드 복합체를 후보 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (d) 후보 화합물이 모노클로널 항체에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서, 후보 화합물의 결합은 상기 후보 화합물이 Mac-1 수용체 활성을 조절하는 리간드임을 나타낸다.

본 발명의 이들 특징 및 다른 특징, 태양 및 이점은 하기의 설명, 실시예 및 첨부된 특허청구범위를 참조하여 더욱 잘 이해될 것이다.

당업자는 후술하는 도면이 단지 예시의 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 도면은 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하고자 하지 않는다.
도 1은 Mac-1에 대한 구매가능한 블로킹(blocking) 항체(M1/70)와 비교한, 595nm에서의 흡광도 측정으로 평가 시의 모노클로널 항체 결합을 도시한 도면;
도 2는 피브리노겐에 대한 모노클로널 항체 결합을 측정하는 ELISA의 결과를 도시한 도면;
도 3은 변형된 피브린 γ^377-395 에피토프에 대한 모노클로널 항체 5B8은 식세포작용(phagocytosis)을 억제하는 데에 있어 증가된 효능을 나타낸 것을 도시한 도면;
도 4는, 항체 (a) 4E11 및 (b) 5B8과 관련된 임상적 징후의 처음의 발병 후에 PLP EAE에서의 항-피브린 항체 투여의 생체 내 실험으로서, 모노클로널 항체 5B8이 재발 시에 억제를 나타내는 것을 도시한 도면.

약어 및 정의

달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련되어 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에서 다르게 요구하지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이며, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학물질 및 혼성화와 관련되어 사용된 명명법 및 그의 기법는 해당 분야에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기법은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 세포 형질전환에 사용된다. 제조처의 설명서에 따라, 또는 해당 분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같이, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 구매가능한 키트를 사용하여 효소 반응 및 정제 기법을 수행한다.

본 발명의 실시는 다르게 지정되지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이며, 이는 본 분야의 기술 내에 있다. 이러한 기법은 예컨대 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al ., 1989) Cold Spring Harbor Press]; 문헌 [Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984)]; 문헌 [Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J .E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; 문헌 [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; 문헌 [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; 문헌 [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; 문헌 [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌 [Handbook of Experimental Immunology (D .M . Weir and CC. Blackwell, eds.)]; 문헌 [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (F .M. Ausubel et al., eds., 1987)]; 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; 문헌 [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌 [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; 문헌 [Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997)]; 문헌 [Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌 [Antibodies: apractical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌 [Monoclonal antibodies: apractical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌 [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌 [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 문헌 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]과 같은 문헌에 완전히 설명되어 있다.

본 명세서에 기재된 항체 생성, 하이브리도마(hybridoma) 생성, 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의료 및 약제 화학과 관련되어 사용되는 명명법, 및 그의 실험실 절차 및 기법은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 통상적으로 사용된다. 표준 기법은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형 및 전달 및 환자의 치료를 위해 사용된다.

본 명세서에 따라 사용되는 바와 같이, 하기의 용어는 달리 지정되지 않는 한, 하기의 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:

항체: 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 면역학적으로 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 말한다. 항체는 폴리클로널, 모노클로널, 키메라(chimeric), dAb(도메인 항체), 단쇄, F_ab, F_ab' 및 F_{( ab' )2} 단편, 단쇄 Fv 단편(scFv) 및 F_ab 발현 라이브러리를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 기본 항체 구조 단위는 테트라머(tetramer)를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 테트라머는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어지며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식의 주원인이 되는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 이펙터(effector) 기능의 주 원인이 되는 불변 영역을 정한다. 일반적으로, 인간으로부터 수득된 항체 분자는 부류 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 임의의 것에 관한 것이며, 이는 분자 내에 존재하는 중쇄의 성질이 서로 상이하다. 특정 부류는 또한 하위부류, 예컨대 IgG₁, IgG₂ 등을 갖는다. 추가로, 인간에서 경쇄는 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다.

모노클로널 항체: 본 명세서에서 사용되는 용어 "모노클로널 항체"(MAb) 또는 "모노클로널 항체 조성물"은 독특한 경쇄 유전자 생성물 및 독특한 중쇄 유전자 생성물로 이루어진 오직 하나의 종을 함유하는 항체의 집단을 지칭한다. 특히, 모노클로널 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 상기 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 항원에 대한 독특한 결합 친화성을 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프에 면역학적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.

항원 결합 부위/결합 부분: 용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도로 상이한 스트레치(stretch)는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로 알려져 있는 더욱 보존된 프랭킹(flanking) 스트레치 사이에 개재된다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 내의 과가변 영역 사이 및 그 근처에서 천연적으로 관찰되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자 내에서, 경쇄의 3개의 과가변 영역 및 중쇄의 3개의 과가변 영역은 항원-결합 표면을 형성하기 위해 3차원적 공간에서 서로에 대해 배치된다. 항원-결합 표면은 결합 항원의 3차원적 표면에 상보적이며, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 과가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))] 또는 문헌 [Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다. CDR의 확인에 대한 지침은 http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid에서 입수할 수 있다.

에피토프: 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 임의의 단백질 결정인자(determinant)를 포함한다. 에피토프 결정인자는 보통 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 이루어지며, 보통 특이적인 3차원적 구조 특징뿐 아니라, 비전하(specific charge) 특징을 갖는다. 예를 들어, 항체는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 펩티드에 대해 유도될 수 있다. 항체는 해리 상수가 1 μΜ 이하; 바람직하게는 100 nM 이하이며, 가장 바람직하게는 10 nM 이하인 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 일컬어진다. γ^377-395 에피토프 CKKTTMKIIPFNRLTIG(서열 번호 18)의 생물학적 활성 유도체는 당업자에 의해 제공되는 바와 같이 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ugarova et al. Identification of a novel recognition sequence for integrin α_Mβ₂ within the γ-chain of fibrinogen. J Biol Chem. 1998;273:22519-22527]; 문헌 [Ugarova et al. Recognition of fibrinogen by leukocyte integrins. Ann N Y Acad Sci. 2001;936:368-385]을 참조한다.

면역학적 결합: 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 특성"은 면역글로불린과 이 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에 발생하는 비공유 상호작용의 유형을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 세기 또는 친화성은 상호작용의 해리 상수(K_d)에 관하여 표현될 수 있으며, 여기서, 더 작은 K_d는 더 큰 친화성을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 해당 업계에 알려져 있는 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 이러한 하나의 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리 속도를 측정하는 것을 수반하며, 여기서, 이러한 속도는 양 방향의 속도에 동등하게 영향을 미치는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성 및 기하학적 파라미터에 좌우된다. 따라서, "온(on) 속도 상수"(K_on) 및 "오프(off) 속도 상수"(K_off)는 농도, 및 회합 및 해리의 실제 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다(문헌 [Nature 361:186-87 (1993)] 참조). K_off/K_on의 비는 친화성과 연관되지 않는 모든 파라미터(parameter)의 소거를 가능하게 하며, 해리 상수 K_d와 같다(일반적으로 문헌 [Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 발명의 항체는 방사성리간드 결합 검정법 또는 당업자에게 알려져 있는 유사 검정법과 같은 검정법으로 측정시, 평형 결합 상수(K_d)가 1 μΜ 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하, 가장 바람직하게는 100 pM 이하 내지 약 1 pM인 경우, 피브리노겐 γ^377-395 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 일컫는다.

피브린 및 피브리노겐: 본 명세서에서 사용되는 용어 "피브린" 및 "피브리노겐"은 상호교환적으로 사용되며, Mac-1 결합 능력을 보유하는 폴리펩티드, 단편 또는 유사체를 지칭한다. 피브리노겐은 피브린에 대한 용해성 전구체이며, 둘 모두는 γC 도메인을 보유하며, 이에 따라 본 발명의 에피토프를 보유한다.

단리된 폴리뉴클레오티드: 본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 일부 조합을 의미할 것이며, 그의 기원으로 인해, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부와 관련되지 않거나, (2) 천연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 부분으로서 천연에서 발생하지 않는다.

단리된 단백질: 본 명세서에서 언급된 용어 "단리된 단백질"은 cDNA, 재조합 RNA, 또는 합성 기원의 단백질 또는 이들의 일부 조합을 의미하며, 그의 기원 또는 유래 공급원으로 인해, "단리된 단백질"은 (1) 천연에서 관찰되는 단백질과 관련되지 않거나, (2) 동일한 공급원으로부터의 다른 단백질이 없거나, (3) 상이한 종으로부터 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 천연에서 발생하지 않는다.

폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드"는 본 명세서에서 천연 단백질, 단백질 단편 및 폴리펩티드 서열의 단편 또는 유사체를 지칭하는데 사용된다. 천연 단백질 단편 및 유사체는 고려되는 종의 폴리펩티드 속이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 예는 서열 번호 1로 나타낸 경쇄 면역글로불린 분자 및 서열 번호 5로 나타낸 중쇄 면역글로불린 분자뿐 아니라, 서열 번호 2, 3, 4, 6, 7 및 8로 제시된 CDR, 중쇄 면역글로불린 분자와 경쇄 면역글로불린 분자, 예컨대 카파 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합물에 의해 형성된 항체 분자 및 그 반대의 경우뿐 아니라 그의 단편 및 유사체를 포함한다.

천연-발생: 본 명세서에서 사용되는 용어 "천연-발생"은 대상에 적용되는 경우, 대상이 천연에서 발견될 수 있는 점을 말한다. 예를 들어, 천연에서 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체(바이러스 포함) 내에 존재하며, 실험실 또는 다른 곳에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연-발생이다.

작동가능하게 연결된: 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 구성요소의 위치가 그들의 의도된 방식으로 구성요소가 기능하도록 하는 관계에 있음을 말한다. 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 암호화 서열의 발현이 조절 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이션된다.

조절 서열: 본 명세서에서 사용되는 용어 "조절 서열"은 이들이 라이게이션되는 암호화 서열의 발현 및 프로세싱(processing)에 영향을 미치는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 상이하다. 원핵세포에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함한다. 진핵세포에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소한 그의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 구성성분을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 그의 존재가 유익한 추가의 구성성분, 예컨대 리더(leader) 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드: 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 적어도 10개 염기 길이의 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 뉴클레오티드의 어느 하나의 유형의 변형된 형태의 폴리머 화합물을 의미한다. 상기 용어는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.

올리고뉴클레오티드: 본 명세서에서 사용되는 용어 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 및 비-천연 발생 올리고뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연 발생 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 이하 길이의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트(subset)이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 60개의 염기 길이이며, 가장 바람직하게는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40개의 염기 길이이다. 올리고뉴클레오티드가 예컨대 유전자 돌연변이체의 작제에서의 사용을 위해 이중 가닥일 수 있지만, 올리고뉴클레오티드는 통상 예컨대 프로브를 위해 단일 가닥이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나이다.

천연 발생 뉴클레오티드: 본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형된 또는 치환된 당기(sugar group) 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "올리고뉴클레오티드 연결"은 포스포로티오에이트, 포스포로셀레로에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 연결을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)]; 문헌 [Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)], 문헌 [Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)], 문헌 [Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991)]; 문헌 [Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))]; 미국 특허 5,151,510 (Stec et al.); 문헌 [Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)]을 참조한다. 올리고뉴클레오티드는 필요에 따라 검출용 표지를 포함할 수 있다.

선택적으로 혼성화하다: 본 명세서에서 사용되는 용어 "선택적으로 혼성화하다"는 검출가능하게 특이적으로 결합함을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 그의 단편은 비특이적 핵산에 대한 검출가능한 결합의 평가가능한 양을 최소화하는 혼성화 및 세척 조건 하에서 핵산 가닥에 선택적으로 혼성화한다. 고 엄격성 조건은 당업계에 공지되고 본 명세서에서 논의된 바와 같이 선택적 혼성화 조건을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 및 단편과 관심있는 핵산 서열 사이의 핵산 서열 상동성은 적어도 80%이고, 보다 일반적으로 적어도 85%, 90%, 95%, 99%, 및 100%의 증가하는 상동성이 바람직하다. 2개의 아미노산 서열은 그 서열 사이에 부분적인 또는 완전한 동일성이 존재할 경우 상동성이다. 예를 들어, 85% 상동성은 2개의 서열이 최대로 매치되도록 정렬될 때 85%의 아미노산이 동일함을 의미한다. 갭(gap)(매치되는 2개의 서열 중의 어느 하나 내의)이 매치를 최대화할 때 허용되고, 갭 길이는 5 이하가 바람직하고, 2 이하가 보다 바람직하다. 별법으로, 그리고 바람직하게는, 2개의 단백질 서열(또는 그들로부터 유도되는, 적어도 30개 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열)이, 돌연변이 데이터 매트릭스 및 6 이상의 갭 페널티(gap penalty)를 사용하는 프로그램 ALIGN을 이용하여 5 초과의 정렬 스코어(표준 편차 단위에서)를 가질 경우, 이들 서열은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 상동성이다. 문헌 [Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10]을 참조한다. 2개의 서열 또는 그의 일부는 보다 바람직하게는 ALIGN 프로그램을 사용하여 최적으로 정렬될 때 그의 아미노산이 50% 이상 동일한 경우에 상동성이다. 용어 "에 대응하다"는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 상동성(즉, 동일하지만, 엄격하게 진화상 관련되지 않음)이거나, 또는 폴리펩티드 서열이 참조 폴리펩티드 서열에 동일함을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 이와 대조적으로, 용어 "에 상보성인"은 상보성 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 상동성임을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 참조 서열 "TATAC"에 대응하고, 참조 서열 "GTATA"에 상보성이다.

둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 서열 관계를 설명하기 위해 다음 용어가 사용된다: "참조 서열", "비교창", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율", 및 "실질적인 동일성".

참조 서열: "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 사용되는 정해진 서열이고, 참조 서열은 예를 들어 전장 cDNA 또는 서열 목록에 제시된 유전자 서열의 세그먼트(segment)로서 보다 큰 서열의 서브세트일 수 있거나 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 참조 서열의 길이는 적어도 18개의 뉴클레오티드 또는 6개의 아미노산, 종종 적어도 24개의 뉴클레오티드 또는 8개의 아미노산, 및 종종 적어도 48개의 뉴클레오티드 또는 16개의 아미노산이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 각각 (1) 2개의 분자 간의 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일부)을 포함할 수 있고, (2) 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 상이한 서열을 추가로 포함할 수 있기 때문에, 2개 (이상)의 분자 사이의 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인 및 비교하기 위해 "비교창"에서 2개의 분자의 서열을 비교함으로써 수행된다.

비교창: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비교창"은 적어도 18개의 연속적인 뉴클레오티드 위치 또는 6개의 아미노산의 개념적 세그먼트를 의미하고, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 적어도 18개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 6개의 아미노산 서열의 참조 서열에 대해 비교하고, 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는)에 비해 20% 이하의 부가, 결실, 치환 등(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 문헌 [Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법에 의해, 상기 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리스(Wisconsin Genetics Software Package Release) 7.0 (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 사이언스 디스트릭트 575), 진웍스(Geneworks), 또는 맥벡터(MacVector) 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 검사에 의해 수행할 수 있고, 다양한 방법에 의해 생성된 최적 정렬(즉, 비교창에서 최고 백분율의 상동성을 생성시킴)을 선택한다.

서열 동일성: 용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 비교창에서 동일하다(즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 잔기 대 잔기를 기초로 하여)는 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교창에서 비교하고, 매치되는 위치의 수를 얻기 위해 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 서열 둘 모두에서 존재하는 위치의 수를 결정하고, 매치되는 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 얻음으로써 계산된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적인 동일성"은 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특징을 나타내고, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산은 적어도 18개의 뉴클레오티드(6개의 아미노산) 위치의 비교창, 종종 적어도 24-48개의 뉴클레오티드(8-16개의 아미노산) 위치의 비교창에서 참조 서열에 비해 적어도 85%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95%의 서열 동일성, 보다 대체로 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 서열 동일성 백분율은 전체적으로 참조 서열의 20% 이하의 결실 또는 부가를 포함할 수 있는 서열에 참조 서열을 비교창에서 비교함으로써 계산된다. 참조 서열은 보다 큰 서열의 서브세트일 수 있다.

아미노산: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 통상적인 용례를 따른다. 문헌 [Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991))]을 참조한다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들어 α-,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산도 본 발명의 폴리펩티드에 대한 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 다음을 포함한다: 4 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트라이메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, α-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-하이드록시프롤린). 본 명세서에서 사용되는 폴리펩티드 표시에서, 표준 용례 및 규약에 따라 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른쪽 방향은 카복시-말단 방향이다. 유사하게, 달리 특정되지 않으면, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 언급된다. 신생 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가 방향은 전사 방향으로 언급되고, RNA와 동일한 서열을 갖는, RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "업스트림(upstream) 서열"로 언급되고, RNA와 동일한 서열을 갖는, RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "다운스트림(downstream) 서열"로 언급된다.

실질적인 동일성: 폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "실질적인 동일성"은 예를 들어 디폴트 갭 가중치를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때 2개의 펩티드 서열이 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환가능성을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌 발린, 글루탐산-아스파르트산, 및 아스파라긴-글루타민이다.

본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 변이는, 이 아미노산 서열의 변이가 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99%를 유지할 경우 본 발명에 포함되는 것으로 고려된다. 그 사이의 특정 백분율은 예를 들어, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 서열 동일성을 포함할 것이다. 특히, 보존적 아미노산 교체가 고려된다. 보존적 교체는 그의 측쇄에서 관련되는 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 것이다. 유전자에 의해 암호화되는 아미노산은 일반적으로 다음 패밀리로 분류된다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이고; (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이고; (3) 비-극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, (4) 비하전 극성 아미노산은 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린, 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 아미노산의 다른 패밀리는 (i) 지방족-하이드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신을 포함한다. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의 분리된 교체, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 분리된 교체, 트레오닌의 세린으로의 분리된 교체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 교체는 특히 교체가 프레임워크 부위 내의 아미노산을 수반하지 않을 경우에, 생성되는 분자의 결합 또는 특성에 큰 영향을 주지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 생성시키는지의 여부는 폴리펩티드 유도체의 비활성을 검정함으로써 쉽게 결정할 수 있다. 검정은 본 명세서에 상세하게 설명되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카복시-말단은 기능적 도메인의 경계 부근에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공공 또는 사유 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 구조 및/또는 기능이 공지된 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 입체형태 도메인을 확인하기 위해 컴퓨터에 의한 비교 방법을 사용한다. 공지의 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법이 알려져 있다(Bowie et al. Science 253:164 (1991)). 따라서, 상기 예는 당업자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 규정하기 위해 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 입체형태를 인식할 수 있음을 입증한다.

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위해 결합 친화성을 변경하고, (4) 결합 친화성을 변경하고, (4) 상기 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경하는 것이다. 유사체는 천연 발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인(mutein)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)이 천연 발생 서열에서(바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변경시키지 않아야 한다(예를 들어, 교체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나, 또는 모 서열을 특징짓는 다른 종류의 2차 구조를 붕괴시키는 경향이 없어야 한다). 당업계에서 인식되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; 문헌 [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 문헌 및 문헌 [Thornton et at. Nature 354:105 (1991)])에 기재되어 있다.

폴리펩티드 단편: 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카복시-말단 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열이 예를 들어 전장 cDNA 서열로부터 추정된 천연 발생 서열 내의 대응하는 위치에 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편의 길이는 일반적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 14개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산, 대체로 적어도 50개의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70개의 아미노산이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유사체"는 추정되는 아미노산 서열의 일부에 대한 실질적인 동일성을 갖고 적합한 결합 조건 하에서 피브린 γ^377-395 에피토프, CKKTTMKIIPFNRLTIG(서열 번호 18) 또는 그의 생물학적 활성 유도체에 대해 특이적으로 결합하는 적어도 5개 아미노산의 세그먼트로 이루어지는 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연 발생 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 일반적으로 적어도 5개의 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산 길이이거나 또는 그보다 길고, 종종 전장 천연 발생 폴리펩티드만큼 길 수 있다.

펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 제약 산업에서 통상적으로 사용된다. 이들 종류의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체(mimetic)" 또는 "펩티드모방체(peptidomimetic)"로 언급된다. 문헌 [Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)], 문헌 [Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)]; 및 문헌 [Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)]을 참조한다. 상기 화합물은 종종 컴퓨터에 의한 분자 모델링을 사용하여 개발된다. 치료상 유용한 펩티드에 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동등한 치료 또는 예방 효과를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 패러다임(paradigm) 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예를 들어 인간 항체에 구조적으로 유사하지만, 당업계에 공지된 방법에 의해 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH₂-, CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO-로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결에 의해 임의로 교체된 하나 이상의 펩티드 연결을 갖는다. 컨센서스(consensus) 서열의 하나 이상의 아미노산의 동일한 종류의 D-아미노산으로의 체계적인 치환(예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)을 사용하여 보다 안정적인 펩티드를 생성시킬 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 속박(constrained) 펩티드는 당업계에 공지된 방법(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992))에 의해; 예를 들어 펩티드를 고리화하는 분자내 다이설피드 가교를 형성할 수 있는 내부의 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다.

작용제(agent): 본 명세서에 사용되는 용어 "작용제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타낸다.

표지: 본 명세서에서 사용되는 용어 "표지" 또는 "표지된"은 방사성 표지된 아미노산의 혼입 또는 마킹된 아비딘(예를 들어, 광학 또는 열량측정법에 의해 검출될 수 있는 효소 활성 또는 형광 마커를 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티(moiety)의 폴리펩티드에 대한 부착에 의한 검출가능한 마커의 혼입을 의미한다. 특정 상황에서, 표지 또는 마커는 치료적인 것일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제, p-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 실시형태에서, 표지는 잠재적인 입체 방해를 감소시키기 위해서 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)에 의해 부착된다.

약제 또는 약물: 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여될 때 요구되는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 다른 화학 용어는 문헌 [The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 예시된 바와 같이 당업계의 통상적인 용법에 따라 사용된다.

실질적으로 순수한: 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한"은 대상 종이 존재하는 우세한 종임을 의미하고(즉, 몰 기준으로, 임의의 다른 개별적인 종보다 조성물에 풍부함), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준)를 구성하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 초과, 보다 바람직하게는 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 구성할 것이다. 가장 바람직하게는, 대상 종은 본질적인 균질성으로 정제되고(오염물질 종을 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출할 수 없음), 여기서 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 구성된다.

환자: 본 명세서에서 사용되는 용어 환자는 인간 및 수의학 대상체를 포함한다.

모노클로널 항체

본 발명은 피브리노겐-Mac-1 결합을 억제하는 모노클로널 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 피브린 및 피브리노겐 γC 도메인의 γ^377-395 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체를 제공한다. 본 발명은 또한, 피브린 및 피브리노겐 γC 도메인의 γ^190-202 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 혈액 응고에서의 그의 유익한 효과에 영향을 미치지 않고, 신경계에서 피브린의 손상 효과를 차단한다. 이들 모노클로널 항체는 MS 플라크(plaque) 및 특정 암의 형성을 차단할 수 있다. 본 발명의 예시적인 항체는 예를 들어, 5B8 항체(^γ377-395 에피토프를 표적화)를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 예를 들어, 1E3 항체(γ^190-202 에피토프)를 포함한다. 5B8 항체와 관련된 다양한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 및 이러한 서열의 용도가 본 명세서에 제공된다. 이들 서열은 5B8 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 1), 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열(CDR-L1, 서열 번호 2; CDR-L2, 서열 번호 3; 및 CDR-L3, 서열 번호 4), 중쇄 아미노산 서열(서열 번호 5), 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열(CDR-H1, 서열 번호 6; CDR-H2, 서열 번호 7; 및 CDR-H3, 서열 번호 8), 경쇄 뉴클레오티드 서열(서열 번호 9), 중쇄 뉴클레오티드 서열(서열 번호 10), 3개의 경쇄 CDR의 뉴클레오티드 서열(CDR-L1, 서열 번호 11; CDR-L2, 서열 번호 12; 및 CDR-L3, 서열 번호 13), 및 3개의 중쇄 CDR의 뉴클레오티드 서열(CDR-H1, 서열 번호 14; CDR-H2, 서열 번호 15; 및 CDR-H3, 서열 번호 16)을 포함한다.

본 발명의 모노클로널 항체는 시험관 내 및 생체 내에서 식세포작용을 억제하는 능력을 가지며, 시험관 내 및 생체 내에서 사이토카인 분비 및 대식 세포 활성화, 시험관 내 및 생체 내에서 미세아교세포 활성화, 시험관 내 및 생체 내에서 염증성 탈수초 및 다발성 경화증의 동물 모델, 즉, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 임상적 징후를 차단한다. 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 PCT 공개 WO 2007/038407호를 참조한다. 또한, 당업자는 본 발명의 모노클로널 항체가 암에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 예컨대, 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 PCT 공개 WO 2007/024817호를 참조한다. 또한, 이러한 모노클로널 항체는 류마티스 관절염, 척수 손상, 알츠하이머병 및 뇌졸중을 비롯한 손상된 조직으로부터의 피브리노겐 누출을 수반하는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Flick et al., J. Clin. Investigation, 2007, 117, 11:3224-3235]; 문헌 [Akassoglou et al., 2002, Neuron, 33:861-875]; 문헌 [Akassoglou et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:6698-6703]; 문헌 [Adams et al., 2007, J. Exp. Med., 35:2428-34]을 참조한다. 본 발명의 모노클로널 항체가 뇌 및 대상체 내의 다른 곳에서 피브리노겐의 전염증성 영향을 감소시킬 수 있음과 동시에, 혈액 응고에 영향을 미치는 화합물과 달리, 혈액 응고에서의 피브리노겐의 유익한 효과를 유지할 수 있음을 주목해야 한다.

또한, 본 명세서에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본 발명에 포함된다. 당업자는 과도한 실험 없이 모노클로널 항체가 피브린 γC 도메인의 γ^377-395 에피토프 또는 γ^190-202 에피토프에 본 발명의 모노클로널 항체가 결합하는 것을 방해하는지를 확인함으로써, 모노클로널 항체가 본 발명의 모노클로널 항체와 동일한 특이성을 갖는지를 결정할 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 모노클로널 항체에 의한 결합의 감소로 나타낸 바와 같이, 시험하고 있는 모노클로널 항체가 본 발명의 모노클로널 항체와 경쟁한다면, 2개의 모노클로널 항체가 동일하거나 밀접히 관련된 에피토프에 결합할 가능성이 있다. 본 발명의 모노클로널 항체의 스크리닝은 전장 피브리노겐 폴리펩티드 상의 Mac-1 수용체를 통하여 미세아교세포 부착을 차단하는 능력을 측정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 스크리닝의 예가 본 명세서에 제공된다.

당업계에 알려져 있는 다양한 절차가 피브리노겐-Mac-1 결합에 대해, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 상동체 또는 오쏘로그(ortholog)에 대해 유도된 폴리클로널 또는 모노클로널 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다(예컨대, 상기 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual] 참조).

항체는 주로 면역 혈청의 IgG 분획을 제공하는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화성 크로마토그래피와 같은 잘 알려져 있는 기법에 의해 정제된다. 후속하여 또는 별법으로, 발견된 면역글로불린의 표적인 특정 항원 또는 그의 에피토프를 면역친화성 크로마토그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제하기 위해 컬럼 상에 고정시킬 수 있다.

본 발명의 항체(예를 들어, 5B8 및 1E3)는 모노클로널 항체이다. 피브리노겐/Mac-1 결합을 억제하는 모노클로널 항체는 예를 들어, 펩티드 항원으로 면역화된 동물로부터 수득된 클론(clone)에 의해 생성된다. 면역화된 동물로부터의 B 세포를 골수종 세포와 융합함으로써, 세포주를 생성한다. 항체를 시험관 내에서 배지로부터, 또는 마우스 내의 복수액(ascite)의 생성 중 어느 하나로부터 정제한다. 또한, 항체를 생성하는 방법은 하기의 실시예 섹션에 제공된다.

모노클로널 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 것들을 사용하여 제조한다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 기타 적절한 숙주 동물을 전형적으로 면역제로 면역화시켜, 면역제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다.

면역제는 전형적으로 단백질 항원, 그의 단편 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 원한다면 말초 혈액 림프구를 사용하거나, 비-인간 포유류 공급원을 원한다면, 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 그 다음, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 불멸화된 세포주는 통상 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함(HAT 배지)할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.

바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 높은 수준의 발현을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 감수성인 세포주이다. 더욱 바람직한 불멸화된 세포주는 뮤린 골수종 세포주이며, 이는 예컨대 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) 및 미국 버지니아주 매너서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능하다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 모노클로널 항체 생성에 대하여 기재된 바 있다(문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)] 참조).

이어서, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를, 항원에 대해 유도된 모노클로널 항체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로널 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정법, 예컨대 방사성면역검정법(RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 검정법(ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로널 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]; 문헌 [Patrono, C. and Peskar, B.A. (eds) Radioimmunoassay in Basic and Clinical Pharmacology. Heidelberg, Springer-Verlag, 1987]; 문헌 [Dwenger, A. Radioimmunoassay: An Overview. J Clin Biochem 22:883, 1984]의 스캣쳐드(Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다. *또한, 모노클로널 항체의 치료적 적용에 있어서, 표적 항원에 대해 고도의 특이성 및 높은 결합 친화성을 갖는 항체를 확인하는 것이 중요하다.

필요한 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론을 제한적인 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103] 참조). 이러한 목적을 위한 적합한 배양 배지로는, 예를 들어 둘베코 개질 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지가 포함된다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 포유동물의 복수액으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비되는 모노클로널 항체는 배양 배지 또는 복수액으로부터 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 단리 또는 정제될 수 있다.

모노클로널 항체는 또한, 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 모노클로널 항체를 암호화하는 DNA는, 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용) 용이하게 단리 및 서열 분석할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 9 및 10은 본 발명의 5B8 모노클로널 항체에 대한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능한다. DNA는 단리되면, 발현 벡터 내에 도입될 수 있고, 이어서 이는 숙주 세포, 예컨대 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포로 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서의 모노클로널 항체 합성을 달성한다. DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열로 치환하거나(미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)] 참조), 면역글로불린 암호화 서열 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 일부에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환될 수 있거나, 본 발명의 항체의 한 항원 조합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.

완전 인간 항체는, CDR을 비롯한 경쇄 및 중쇄의 전체 서열이 인간 유전자로부터 유래된 항체 분자이다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"로 지칭된다. 모노클로널 항체는 트리오마(trioma) 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(문헌 [Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72] 참조); 및 모노클로널 항체를 생성하기 위한 EBV 하이브리도마 기술(문헌 [Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조)을 이용함으로써 제조될 수 있다. 모노클로널 항체가 사용될 수 있으며, 이는 인간 하이브리도마를 사용하거나(문헌 [Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030] 참조) 시험관 내에서 인간 B 세포를 엡스테인 바(Epstein Barr) 바이러스로 형질전환시킴으로써(문헌 [Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조) 생성될 수 있다.

또한, 인간 항체는 추가적인 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 생성될 수 있다(문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)] 참조). 이와 유사하게, 인간 면역글로불린 유전자 자리를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내에 도입함으로써 인간 항체가 제조될 수 있다. 접종시에 인간 항체 생성이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 측면에서, 인간에서 나타나는 것과 밀접하게 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)]; 문헌 [Lonberg et al ., Nature 368 856-859 (1994)]; 문헌 [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)]; 문헌 [Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)]; 문헌 [Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; 및 문헌 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)]에 기재되어 있다.

또한, 항원 접종에 반응하는 동물의 내인성 항체가 아닌, 완전 인간 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 비-인간 동물을 사용하여 인간 항체를 생성할 수 있다. 비-인간 숙주의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 내인성 유전자를 무능화시키고, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 활성 유전자 자리를 숙주의 게놈 내에 삽입한다. 예를 들어, 서열 번호 11 내지 16은 모노클로널 항체 5B8의 3개의 경쇄 및 3개의 중쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 예를 들어, 필수적인 인간 DNA 세그먼트를 함유하는 효모 인공 염색체를 이용하여 인간 유전자를 도입시킨다. 이후, 보다 적은 수의 완전 상보성의 변형들을 함유하는 중간 트랜스제닉 동물들을 교차교배시킴으로써, 필요한 모든 변형을 제공하는 동물이 자손으로 얻어진다. 이러한 비-인간 동물의 일 예는 암젠(Amgen)(Thousand Oaks, CA)에 의해 제공되는 경우 제노마우스(Xenomouse)^®로 지칭되는 마우스이다. 이 동물은 완전 인간 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성한다. 항체는 동물로부터 관심 면역원에 의한 면역화 후에, 예를 들어 폴리클로널 항체의 생성물로서 얻어지거나, 또는 별법으로, 동물로부터 유래된 불멸화 B 세포, 예컨대 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 얻어질 수 있다. 또한, 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 암호화하는 유전자를 회수 및 발현시켜 항체를 직접 수득할 수 있거나, 또는 추가로 변형시켜 항체의 유사체, 예를 들어 단일 쇄 Fv(scFv) 분자를 수득할 수 있다.

내인성 면역글로불린 중쇄의 발현이 결여된 비-인간 숙주, 예를 들어, 마우스를 생성하는 방법의 일 예는 미국 특허 제5,939,598호에 개시되어 있다. 이는, 배아 줄기 세포의 하나 이상의 내인성 중쇄 유전자 자리로부터 J 세그먼트 유전자를 결실시켜 유전자 자리의 재배열을 방지하고 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자 자리의 전사체의 형성을 방지하고(여기서, 결실은 선별 마커를 암호화하는 유전자를 함유하는 표적화 벡터에 의해 수행됨); 선별 마커를 암호화하는 유전자를 함유하는 체세포 및 생식세포를 갖는 트랜스제닉 마우스를 배아 줄기 세포로부터 생성하는 것을 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다.

관심 항체, 예컨대 인간 항체를 생성하기 위한 한 방법은 미국 특허 제5,916,771호에 개시되어 있다. 이 방법은 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열 번호 10)을 함유하는 발현 벡터를 배양 상태의 한 포유동물 숙주 세포 내에 도입하고, 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열 번호 9)을 함유하는 발현 벡터를 다른 포유동물 숙주 세포 내에 도입하고, 두 세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 형성하는 것을 포함한다. 하이브리드 세포는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 항체를 발현한다.

항체는 앞서 기재된 단쇄 항체를 암호화하는 DNA 세그먼트를 함유하는 벡터에 의해 발현될 수 있다.

이러한 항체에는 벡터, 리포좀, 네이키드(naked) DNA, 애쥬번트(adjuvant)-보조 DNA, 유전자 건(gun), 카테터가 포함될 수 있다. 바람직한 벡터로는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 컨쥬게이트가 포함된다. 레트로바이러스 벡터로는 몰로니(moloney) 뮤린 백별병 바이러스가 포함된다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터로는 폭스(pox) 벡터, 예컨대 오르토폭스 또는 조류폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 I 바이러스(HSV) 벡터(문헌 [Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995)]; 문헌 [Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)]; 문헌 [Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)]; 문헌 [Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)] 참조), 아데노바이러스 벡터 (문헌 [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993)]; 문헌 [Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993)]; 문헌 [Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)] 참조) 및 아데노-연관 바이러스 벡터 (문헌 [Kaplitt, M. G.. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)] 참조)가 포함된다.

폭스 바이러스 벡터는 유전자를 세포질 내에 도입시킨다. 조류폭스 바이러스 벡터는 단지 핵산의 짧은 기간 발현을 일으킨다. 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터는 핵산을 신경계 세포 내에 도입시키는 데 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(약 4개월)의 경우보다 짧은 기간의 발현(약 2개월)을 일으키며, 이는 차례로 HSV 벡터 보다 더 짧다. 선택된 특정 벡터는 표적 세포 및 치료할 병태(condition)에 따라 달라질 것이다. 도입은 표준 기술, 예를 들어 감염, 형질감염, 형질도입 또는 형질전환에 의한 것일 수 있다. 유전자 전달 방식의 예에는, 예를 들어 네이키드 DNA, CaPO₄ 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포펙션(lipofection), 세포 마이크로주사 및 바이러스 벡터가 포함된다.

벡터는 임의의 원하는 표적 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 입체정위(stereotaxic) 주사는 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, HSV)를 원하는 위치로 지시하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 미니펌프 주입 시스템, 예컨대 싱크로메드(SynchroMed) 주입 시스템(Medtronic, Minneapolis, MN)을 이용한 뇌실내(icv) 주입에 의해 입자가 전달될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 방법으로는 카테터, 정맥내, 비경구, 복강내 및 피하 주사, 및 경구 또는 기타 공지된 투여 경로가 포함된다.

이들 벡터는 다양한 방식으로 사용될 수 있는 다량의 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 피브리노겐의 존재 및 피브리노겐/Mac-1 결합을 검출하기 위해 항체를 사용할 수 있다.

본 발명의 항원 단백질에 특이적인 단쇄 항체의 생성을 위해 기술을 적합화시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, 단백질 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대한 원하는 특이성을 갖는 모노클로널 F_ab 단편의 신속하고 효과적인 확인이 가능하도록 F_ab 발현 라이브러리를 구축하기 위해 방법을 적합화시킬 수 있다(예를 들어, 문헌 [Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281] 참조). 단백질 항원에 대한 이디오형(idiotype)을 함유하는 항체 단편은 (i) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성된 F_(ab')2 단편; (ii) F_{( ab' )2} 단편의 다이설피드 가교를 환원시킴으로써 생성된 F_ab 단편; (iii) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 생성된 F_ab 단편; 및 (iv) F_v 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 본 발명은 또한, F_v, F_ab, F_ab' 및 F_(ab')2 항-피브린 γ^190-202 및 γ^377-395 단편, 단쇄 항-γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 항체, 이중특이적 항-γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 항체 및 이종컨쥬게이트 항-γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 항체를 포함한다.

이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 에피토프에 대한 것이다. 제2 결합 표적은 임의의 다른 항원이며, 바람직하게는 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다.

원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 트랜스펙션시킨다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예컨대, F_{( ab' )2} 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 가수분해적으로 절단하여 F_{( ab' )2} 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 다이티올 착화제, 비소화나트륨의 존재 하에 환원시켜, 인접한 다이티올을 안정화시키고 분자간 다이설피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 F_ab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 F_ab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 F_ab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 F_ab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

또한, F_ab' 단편은 이. 콜라이(E. coli)로부터 직접 회수될 수 있으며, 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F_{( ab' )2} 분자의 생산을 기재한다.

재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. 이러한 방법은 항체 호모다이머(homodimer)의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv(sFv) 다이머를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].

본 발명은 또한 세포독성제, 예를 들어 독소(예를 들어, 암 세포를 표적화하는 화학치료제, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성컨쥬게이트)에 컨쥬게이트된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 화학치료제의 예에는 알킬화제, 니트로소우레아, 항대사물질, 안트라사이클린 및 관련 약물, 토포아이소머라제(Topoisomerase) 억제제, 유사분열 억제제, 코르티코스테로이드 호르몬 및 다른 화학요법 약물이 포함된다.

효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피셜스(sapaonaria officials) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종이 방사성컨쥬게이트된 항체의 생성을 위해 이용가능하다. 그의 예는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다.

항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 이작용성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2작용성 유도체(예컨대 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-다이아소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 컨쥬게이트시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다.

당업자는, 매우 다양한 가능한 모이어티가 본 발명의 생성된 항체에 커플링될 수 있음을 알 것이다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 ["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)] 참조).

커플링은, 항체 및 다른 모이어티가 각각의 활성을 유지하는 한, 2개의 분자를 결합시키는 임의의 화학 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 결합에는 수많은 화학 메커니즘, 예를 들어 공유 결합, 친화성 결합, 삽입(intercalation), 배위 결합 및 착물화가 포함될 수 있다. 그러나, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 존재하는 측쇄들의 직접 축합에 의해, 또는 외부 가교 분자들의 도입에 의해 달성될 수 있다. 수많은 2가 또는 다가 결합제는 단백질 분자, 예컨대 본 발명의 항체를 다른 분자와 커플링시키는 데 유용하다. 예를 들어, 대표적인 커플링제에는 티오에스테르, 카보다이이미드, 숙신이미드 에스테르, 다이아이소시아네이트, 글루타르알데히드, 다이아조벤젠 및 헥사메틸렌 다이아민과 같은 유기 화합물이 포함될 수 있다. 상기 목록은 당업계에 공지된 다양한 커플링제 부류의 전부라기보다는, 보다 통상적인 커플링제를 예시하고자 한다(문헌 [Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)]; 문헌 [Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982)]; 및 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참조).

링커는 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)의 이용이 기재된 문헌 [Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)] 참조). 또한, 올리고펩티드 링커를 통해 항체에 커플링된 할로겐화 아세틸 하이드라지드 유도체의 용도가 기재되어 있는 미국 특허 제5,030,719호를 참조한다. 예시적인 링커에는 (i) EDC (1-에틸-3-(3-다이메틸아미노-프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드; (ii) SMPT (4-숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-다이티오)-톨루엔(피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chem. Co.), Cat. (21558G)); (iii) SPDP (숙신이미딜-6[3-(2-피리딜다이티오)프로피온아미도]헥사노에이트(피어스 케미컬 컴퍼니, Cat ＃21651G); (iv) 설포-LC-SPDP(설포숙신이미딜-6[3-(2-피리딜다이티오)-프로피안아미드]헥사노에이트(피어스 케미컬 컴퍼니, Cat. ＃2165-G); 및 (v) EDC에 컨쥬게이트된 설포-NHS(N-하이드록시설포-숙신이미드: 피어스 케미컬 컴퍼니, Cat. ＃24510)가 포함된다.

상술된 링커는 다양한 속성을 갖는 구성성분을 포함하며, 이에 따라 다양한 물리화학적 특성을 갖는 컨쥬게이트가 생성된다. 예를 들어, 알킬 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르는 방향족 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르보다 더 안정적이다. NHS-에스테르 함유 링커는 설포-NHS 에스테르보다 덜 가용성이다. 또한, 링커 SMPT는 입체적으로 방해된 다이설파이드 결합을 함유하며, 안정성이 증가된 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 다이설파이드 연결은 일반적으로 다른 연결보다 덜 안정적인데, 이는 다이설파이드 연결이 시험관 내에서 절단되어 이용가능한 컨쥬게이트를 보다 적게 생성하기 때문이다. 설포-NHS는 특히 카보다이이미드 커플링의 안정성을 향상시킬 수 있다. 카보다이이미드 커플링(예컨대 EDC)이 설포-NHS와 함께 사용되는 경우, 카보다이이미드 커플링 반응 단독의 경우보다 가수분해에 더 내성인 에스테르를 형성한다.

본 명세서에 개시된 항체는 또한 면역리포좀으로서 제형화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호에 기재된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 개선된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다. 본 발명의 항체의 F_ab' 단편은 다이설피드-상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 컨쥬게이트될 수 있다.

피브린 에피토프 γ ^190-202 및 γ ^377-395 에 대한 항체의 용도

본 발명의 모노클로널 항체를 포함하는 본 발명의 치료적 제형은 바람직하게는 혈액 응고에는 영향을 미치지 않고, 피브린-관련 장애(예컨대, 다발성 골수종, 상처 치유, 폐 허혈, 척수 손상, 알츠하이머병, 뇌졸중, 류마티스 관절염 및 암)와 연관된 징후를 치료하거나 경감시키기 위해 사용된다. 본 발명은 또한, 바람직하게는 혈액 응고에는 영향을 미치지 않고, 피브린-관련 장애(예컨대, 다발성 골수종, 상처 치유, 폐 허혈, 척수 손상, 알츠하이머병, 뇌졸중, 류마티스 관절염 및 암)와 연관된 징후를 치료하거나 경감시키는 방법을 제공한다. 치료 요법은 표준 방법을 사용하여, 대상체, 예컨대 피브린-관련 장애(예컨대, 다발성 골수종, 상처 치유, 폐 허혈, 척수 손상, 알츠하이머병, 뇌졸중, 류마티스 관절염 및 암)를 앓고 있는(또는 발병할 위험이 있는) 인간 환자를 확인하는 것에 의해 수행된다. 이들 피브린-관련 장애와 연관된 징후는 예컨대, 염증, 통증 및 감각 인지의 소실을 포함한다. 치료의 효율성은 특정 피브린-관련 장애를 진단하거나 치료하는 임의의 알려져 있는 방법과 함께 결정된다. 피브린-관련 장애의 하나 이상의 징후의 경감은 항체가 임상적 혜택을 부여하는 것을 나타낸다. 항체 제제, 바람직하게는 그의 표적 항원에 대해 높은 특이성 및 높은 친화성을 갖는 항체 제제가 대상체에게 투여되며, 일반적으로 이것이 표적과 결합함으로 인해 효과를 가질 것이다. 항체의 투여는 표적(예컨대, γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 에피토프)의 신호전달 기능을 없애거나, 이를 억제하거나 또는 이를 간섭할 수 있다. 항체의 투여는 표적(예컨대, 피브린)과 표적이 자연상에서 결합하는 내인성 리간드(예컨대, Mac-1)의 결합을 없애거나 이를 억제하거나, 이를 간섭할 수 있다. 예를 들어, 항체는 표적에 결합하고, 피브린/Mac-1 결합을 억제한다.

본 발명에 따른 치료학적 물질(therapeutical entities)의 투여는 개선된 전달, 운반, 내성 등을 제공하기 위해서 제형 내에 혼입되는 적합한 담체, 부형제, 및 기타 물질과 함께 투여될 것으로 이해될 것이다. 여러 가지 적절한 제형은 문헌 [formulary Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995))], 특히 상기 문헌 내의 87장(Blaug, Seymour)에서 찾을 수 있다. 이들 제형은 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예를 들어, 리포펙틴(Lipofectin)™), DNA 컨쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 제형 내의 활성 성분이 제형화에 의해서 불활성화되지 않고, 제형이 생리학적으로 상용성이며 투여의 경로에 대해서 허용되는 한, 전술한 혼합물 중의 어떤 것이라도 본 발명에 따르는 치료 및 치료법에서 적절할 수 있다. 또한, 문헌 [Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)], 문헌 [Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)], 문헌 [Charman W N "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000)], 문헌 [Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)], 및 약제학 화학자에게 잘 알려진 제형, 부형제 및 담체와 관련된 추가의 정보를 위하여 이들에 인용된 문헌을 참조한다.

본 발명의 항체(또한 본 명세서에서 "활성 화합물"로 지칭됨) 및 그의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는 약제학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 투여에 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산성 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 본 명세서에 참조로 포함된 당업계의 표준 참조 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]의 가장 최신판에 기재되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예에는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 5％ 인간 혈청 알부민이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 리포좀 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 용도는 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용된 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 멸균성 희석제, 예컨대 주사용수, 염수액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 투여 바이알(vial) 중에 동봉될 수 있다.

주사가능한 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포르 EL(Cremophor EL)^TM(바스프, 뉴저지주 파르시파니 소재) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균성일 수 있으며, 용이하게 주사가능할 정도로 유동화되어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정적일 수 있으며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산성 매질 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 조성물에 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 일어날 수 있다.

주사가능한 멸균 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 필요한 경우 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 성분과 다른 필요 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분에 더하여 사전 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.

경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 동봉되거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위해서, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되며, 정제, 트로키제(troch) 또는 캡슐제의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척제로서 사용하기 위해 유동성 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 유동성 담체 중의 화합물은 경구 적용되고, 스위싱되고(swished), 뱉어지거나 삼켜진다. 약제학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 하기 성분 중 임의의 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미결정질 셀룰로스, 트래거캔쓰 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제.

흡입에 의한 투여의 경우, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체 또는 연무제를 함유하는 가압 용기 또는 분배기로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달된다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제제 중에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여의 경우 세제(detergent), 담즙염 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 분무 또는 좌제의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 고약, 겔 또는 크림 내로 제형화된다.

화합물은 또한 직장 전달을 위한 좌제(예를 들어 코코아 버터 및 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 기재를 갖는 것) 또는 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.

한 실시형태에서, 활성 화합물은 화합물을 신체로부터의 신속한 제거에 대해 보호하는 담체, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제형으로 제조된다. 생분해성 생체적합성 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 물질은 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈, 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 구입할 수 있다. 또한, 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로널 항체로 감염된 세포에 표적화된 리포좀 포함)이 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

경구 또는 비경구 조성물을 투여 용이성 및 투여 균일성을 위한 단위 투여형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 단위 투여형은 치료될 대상체에 대한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형에 대한 상세설명은, 활성 화합물의 고유 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 상기 활성 화합물의 배합 기술에 고유한 제한에 의해 기술되며 그에 직접적으로 좌우된다.

약제학적 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다.

항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기준으로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)] 참조). 제형은 또한 치료될 특정 증후(indication)에 필요한 1개 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 조성물은 그의 기능을 향상시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학치료제 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 존재한다.

또한, 활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다.

생체내 투여에 사용될 제형은 멸균성일 수 있다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

지속 방출형 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 여기서, 이 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예컨대 루프론 데포트(LUPRON DEPOT)^TM 락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있는 반면, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다.

본 발명의 항체의 치료적 유효량은 일반적으로 치료 목적을 달성하는데 필요한 양에 관한 것이다. 상기 나타낸 바와 같이, 이는 항체와 그의 표적 항원 사이의 결합 상호작용일 수 있으며, 이는 특정 경우에서는 표적의 기능을 간섭한다. 또한, 투여에 필요한 양은 특이적 항원에 대한 항체의 결합 친화성에 좌우될 것이며, 투여된 항체가 투여된 다른 대상체의 자유 부피로부터 고갈되는 비율에도 좌우될 것이다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 치료적 유효 투여량에 대한 통상적인 범위는 비제한적인 예로서, 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 체중 1 kg 당 약 50mg일 수 있다. 통상적인 투여 빈도는 예를 들어 1일에 2회 내지 1주에 1회 범위일 수 있다.

항체 스크리닝 방법

목적하는 특이성을 갖는 항체를 스크리닝하는 방법은 효소-결합 면역흡수 검정법(ELISA) 및 당업계에 공지된 다른 면역학적 매개 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 에피토프에 대해 지시된 항체는 피브린의 국소화 및/또는 정량화와 관련된 업계에 공지된 방법에서 사용될 수 있다. 제공된 실시형태에서, 항체 유도된 항원 결합 도메인을 함유하는 γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 에피토프, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 특이적인 항체가 약리학적으로 활성인 화합물로서 이용된다(이하에서 "치료제"로서 지칭됨).

γ^190-202 및 γ^377-395 피브린 에피토프에 특이적인 항체는 표준 기술, 예컨대 면역친화성, 크로마토그래피 또는 면역침전법에 의해 피브린 폴리펩티드를 단리하는데 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물질에 커플링(즉, 물리적으로 연결)시켜 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예에는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고; 적합한 보결기 복합체의 예에는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예에는 루시페라제, 루시페린 및 애쿠오린이 포함되며; 적합한 방사성 물질의 예에는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H가 포함된다.

본 발명에 따른 항체는 샘플에서 γ^190-202 및/또는 γ^377-395 피브린 에피토프의 존재를 검출하기 위한 작용제로서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 검출가능한 표지를 함유한다. 항체는 폴리클로널이거나, 또는 보다 바람직하게는 모노클로널이다. 무손상 항체 또는 그의 단편(예를 들어, F_ab, scFv 또는 F_{( ab )2})이 사용된다. 프로브 또는 항체와 관련된 용어 "표지된"은, 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링(즉, 물리적으로 연결)시킴에 의한, 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화뿐 아니라, 직접 표지되는 또다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간접적인 표지화의 예에는 형광-표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 형광-표지된 스트렙트아비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴에 의한 DNA 프로브의 말단-표지화가 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체뿐 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "생물학적 샘플"의 용도 내에는 혈액 및 혈액 혈청, 혈액 혈장 또는 림프를 비롯한 혈액의 분획 또는 성분이 포함된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서 생물학적 샘플 내의 분석물인 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물인 mRNA의 검출을 위한 시험관 내 기술은 노던(Northern) 혼성화 및 동소(in situ) 혼성화를 포함한다. 분석물인 단백질의 검출을 위한 시험관 내 기술은 효소-결합 면역흡수 검정법(ELISA), 웨스턴(Western) 블롯, 면역침전법 및 면역형광법을 포함한다. 분석물인 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관 내 기술은 서던(Southern) 혼성화를 포함한다. 면역검정을 수행하기 위한 절차는 예를 들어 문헌 ["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995]; 문헌 ["Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996]; 및 문헌 ["Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기재되어 있다. 또한, 분석물인 단백질의 검출을 위한 생체 내 기술은 대상체 내로 표지된 항-분석물인 단백질 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 대상체에서의 존재 및 위치를 표준 영상화 기술에 의해 검출할 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.

억제제 스크리닝 방법

본 발명은 조절제, 즉, 피브린 및 Mac-1의 결합을 조절하거나 다르게는 간섭하는 후보물질 또는 시험 화합물 또는 작용제(예컨대 펩티드, 펩티드모방체, 소분자 또는 다른 약물), 또는 피브린, Mac-1 및/또는 피브린/Mac-1 복합체의 신호전달 작용을 조절하거나 다르게는 간섭하는 후보 물질 또는 시험 화합물 또는 작용제를 확인하는 방법(본 명세서에서 "스크리닝 검정"이라고도 지칭됨)을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 스크리닝 검정에서 확인된 화합물을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 피브린/Mac-1 복합체의 신호전달 작용 및/또는 피브린 및 Mac-1 간의 상호작용을 조절하는 후보물질 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 검정을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 생물학적 라이브러리; 공간적으로 다룰 수 있는 병렬 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "1-비드 1-화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법을 비롯한 당업계에 공지된 조합 라이브러리 방법에 있어서 수많은 접근법 중 임의의 접근법을 사용하여 수득될 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 제한되지만, 다른 네가지 접근법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용가능하다(예를 들어, 문헌 [Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145] 참조).

본 명세서에 사용된 "소분자"는 분자량이 약 5 kD 미만, 가장 바람직하게는 약 4 kD 미만인 조성물을 지칭함을 의미한다. 소분자는 예를 들어, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 진균, 박테리아 또는 해조류 추출물과 같은 화학적 및/또는 생물학적 혼합물의 라이브러리는 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 임의의 검정에 의해 스크리닝될 수 있다.

분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 당업계에서, 예를 들어 문헌 [DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909]; 문헌 [Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422]; 문헌 [Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678]; 문헌 [Cho, et al., 1993. Science 261: 1303]; 문헌 [Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059]; 문헌 [Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061]; 및 문헌 [Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233]에서 발견할 수 있다.

화합물의 라이브러리는 용액 중에(예를 들어, 문헌 [Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421] 참조), 또는 비드 상에(문헌 [Lam, 1991. Nature 354: 82-84] 참조), 칩 상에(문헌 [Fodor, 1993. Nature 364: 555-556] 참조), 박테리아 상에(미국 특허 제5,223,409호 참조), 포자 상에(미국 특허 제5,233,409호 참조), 플라스미드 상에(문헌 [Cull, et al ., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869] 참조) 또는 파지 상에(문헌 [Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390]; [Devlin, 1990. Science 249: 404-406]; 문헌 [Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382]; 문헌 [Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310]; 및 미국 특허 제5,233,409호 참조) 존재할 수 있다.

일 실시형태에서, 후보 화합물을 항체-항원 복합체에 도입하여, 후보 화합물이 항체-항원 복합체를 파괴하는지의 여부를 결정하며, 여기서 이러한 복합체의 파괴는 후보 화합물이 피브린/Mac-1 복합체의 신호전달 작용 및/또는 피브린과 Mac-1 간의 상호작용을 조절하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 모노클로널 항체는 5B8이고, 항원은 피브리노겐 복합체이다. 별법으로, 모노클로널 항체는 1E3이고, 항원은 피브리노겐이다.

다른 실시형태에서, 적어도 하나의 중화 모노클로널 항체에 노출되는 피브린/Mac-1 복합체가 제공된다. 항체-항원 복합체의 형성이 검출되고, 1종 이상의 후보 화합물이 복합체에 도입된다. 1종 이상의 후보 화합물의 도입 후에 항체-항원 복합체가 파괴된다면, 후보 화합물은 피브린/Mac-1 결합과 관련된 장애를 치료하는데 유용하다.

다른 실시형태에서, 적어도 하나의 중화 모노클로널 항체에 노출되는 본 발명의 용해성 키메라 단백질이 제공된다. 항체-항원 복합체의 형성이 검출되고, 1종 이상의 후보 화합물이 복합체에 도입된다. 1종 이상의 후보 화합물의 도입 후에 항체-항원 복합체가 파괴된다면, 후보 화합물은 피브린/Mac-1 결합과 관련된 장애를 치료하는데 유용하다.

항체-항원 복합체를 간섭하거나 파괴하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어 항원 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분에 대한 시험 화합물의 결합이 복합체 중 표지된 화합물의 검출에 의해 결정될 수 있도록 시험 화합물을 방사성 동위원소 또는 효소 표지와 커플링시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H에 의해, 방사성 방출의 직접적인 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출될 수 있는 방사성 동위원소로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 별법으로, 시험 화합물은 예를 들어 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제, 및 생성물에 대한 적절한 기질의 전환의 결정에 의해 검출될 수 있는 효소 표지에 의해 효소적으로 표지될 수 있다.

일 실시형태에서, 검정은 항체-항원 복합체를 시험 화합물과 접촉시키고, 항원과 상호작용하거나 또는 존재하는 항체-항원 복합체를 파괴하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다. 이 실시형태에서, 항원과 상호작용하고/거나 항체-항원 복합체를 파괴하는 시험 화합물의 능력의 결정은, 항체에 비해 항원 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분에 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다.

다른 실시형태에서, 검정은 항체-항원 복합체를 시험 화합물과 접촉시키고, 항체-항원 복합체를 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다. 항체-항원 복합체를 조절하는 시험 화합물의 능력의 결정은, 예를 들어 시험 화합물의 존재 하에 항체에 결합하거나 항체와 상호작용하는 항원의 능력을 결정함으로써 수행될 수 있다.

당업자는 본 명세서에 개시된 임의의 스크리닝 방법에서 항체가 중화 항체, 예컨대, 모노클로널 항체 5B8 및/또는 1E3일 수 있으며, 이들 각각이 피브린/Mac-1 결합을 조절하거나 다르게는 간섭하는 것을 인식할 것이다.

일 실시형태에서, 항체 또는 항원을 고정시켜 후보 화합물의 하나 또는 모든 후속 도입의 비복합체 형태로부터 복합체 형태의 분리를 촉진할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 적응시키는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물의 존재 및 부재 하에 항체-항원 복합체를 관찰하는 것은 반응물 함유에 적합한 임의의 용기에서 수행될 수 있다. 이러한 용기의 예에는 마이크로타이터(microtiter) 플레이트, 시험관 및 마이크로-원심분리 튜브가 포함된다. 일 실시형태에서, 하나 또는 모든 단백질이 매트릭스에 결합되도록 하는 도메인이 부가된 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, GST-항체 융합 단백질 또는 GST-항원 융합 단백질을 글루타치온 세파로스 비드(시그마 케미칼(Sigma Chemical), 미주리주 세인트 루이스 소재) 또는 글루타치온 유도체화 마이크로타이터 플레이트 상에 흡착시킨 다음, 시험 화합물과 조합하고, 혼합물을 복합체 형성에 도움되는 조건 하에서(예를 들어, 염 및 pH에 대한 생리학적 조건에서) 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후, 비드 또는 마이크로타이터 플레이트 웰을 세척하여 임의의 비결합 성분을 제거하고, 비드의 경우 매트릭스를 고정시키고, 복합체를 직접 또는 간접적으로 결정한다. 별법으로, 복합체를 매트릭스로부터 해리시킬 수 있으며, 항체-항원 복합체 형성의 수준을 표준 기술을 사용하여 결정할 수 있다.

또한, 매트릭스 상에 단백질을 고정시키는 다른 기술이 본 발명의 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체(예를 들어, 5B8 및/또는 1E3) 또는 항원(예를 들어, 피브린)은 비오틴과 스트렙트아비딘의 접합을 이용하여 고정될 수 있다. 비오티닐화 항체 또는 항원 분자는 당업계에 널리 공지된 기술(예를 들어, 비오티닐화 키트, 피어스 케미칼즈(Pierce Chemicals), 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 비오틴-NHS(N-하이드록시-숙신이미드)로부터 제조되고, 스트렙트아비딘-코팅된 96웰 플레이트(피어스 케미칼)의 웰 내에 고정될 수 있다. 별법으로, 관심 항체 또는 항원과 반응성이지만 관심 항체-항원 복합체의 형성을 간섭하지 않는 다른 항체는 플레이트의 웰에 유도체화될 수 있으며, 비결합 항체 또는 항원은 항체 컨쥬게이션에 의해 웰에 포획될 수 있다. GST-고정된 복합체에 대해 상기 기재된 방법에 더하여, 상기 복합체를 검출하는 방법은, 항체 또는 항원과 반응성인 다른 항체를 사용하는 복합체의 면역검출을 포함한다.

본 발명은 추가로 상술된 스크리닝 검정 중 임의의 것에 의해 확인된 신규한 작용제 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

진단 검정

본 발명의 항체는 적절한 검정, 예를 들어 통상적인 유형의 면역검정에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 전장 피브리노겐, 피브린 또는 그의 단편을 고체 상에 고정시키는 샌드위치 검정이 수행될 수 있다. 인큐베이션은 샘플 중의 항체가 고체 상에 고정된 폴리펩티드에 결합하도록 충분한 시간 동안 유지한다. 이러한 제1 인큐베이션 후에, 고체 상을 샘플로부터 분리한다. 고체 상을 세척하여 비결합 물질 및 방해 물질, 예컨대 샘플 중에 또한 존재할 수 있는 비-특이적 단백질을 제거한다. 이후, 고정된 폴리펩티드에 결합된 대상 항체(예를 들어, 모노클로널 항체 5B8 및/또는 1E3)를 함유하는 고체 상은 제2의 표지된 항체 또는 비오틴 또는 아비딘과 같은 커플링제에 결합된 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 이러한 제2 항체는 다른 항-피브린 항체일 수 있다. 항체에 대한 표지는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 방사성핵종, 효소(예를 들어 말레에이트 탈수소효소, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 카탈라제), 플루오르(플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코시아닌, 플루오레스카르민), 비오틴 등이 포함된다. 표지된 항체를 고체와 인큐베이션시키며, 고체 상에 결합된 표지를 측정한다. 이들 및 다른 면역검정은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

생물학적 샘플 중 피브린 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 예시적인 방법은, 시험 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하고 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 표지된 모노클로널 항체와 접촉시켜 생물학적 샘플 중 피브린의 존재를 검출하는 것을 포함한다.

프로브 또는 항체와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링(즉, 물리적으로 연결)시킴에 의한 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화 뿐만 아니라, 직접 표지되는 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간적접인 표지화의 예에는 형광 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙트아비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴에 의한 DNA 프로브의 말단 표지화가 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체 뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 의도된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서 생물학적 샘플 중 피브린을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 피브린의 검출을 위한 시험관 내 기술은 효소-결합 면역흡수 검정법(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전법 및 면역형광법을 포함한다. 또한, 피브린의 검출을 위한 생체 내 기술은 표지된 항-피브린 항체의 대상체 내로의 도입을 포함한다. 예를 들어, 항체는 대상체에서의 존재 및 위치를 표준 영상화 기술에 의해 검출할 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.

일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 시험 대상체로부터의 단백질 분자를 함유한다. 한 바람직한 생물학적 샘플은 대상체로부터 통상적인 수단에 의해 단리된 말초 혈액 백혈구 샘플이다.

키트

본 발명은 또한 생물학적 샘플 중 피브린의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플 중 피브린을 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 작용제; 샘플 중 피브린의 양을 측정하기 위한 수단; 및 샘플 중 피브린의 양과 표준물질을 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 화합물 또는 작용제는 적합한 용기에 포장될 수 있다. 키트는 또한 샘플에서 피브린을 검출하기 위한 키트의 사용설명서를 포함할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 기재될 것이며, 이는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

실시예

본 발명의 태양은 하기의 실시예의 견지에서 추가로 이해될 것이며, 이는 본 발명의 범주를 어떠한 방법으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예 1 - 모노클로널 항체의 생성

피브리노겐과 Mac-1의 상호작용에 중요한 것으로 보여지는 피브리노겐의 γ 쇄 상의 정확한 아미노산에 상응하는 펩티드 서열을 합성하였다(펩티드 #1: CGWTVLQKRIDGSL(서열 번호 17) 및 펩티드 #2: CKKTTMKIIPFNRLTIG(서열 번호 18)). 이들 2개의 펩티드를 해당하는 N-말단 시스테인 잔기와 함께 합성하여, 생체 내에서 강력한 항체 반응을 증진시키는 운반체 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 대한 컨쥬게이션을 가능하게 하였다. 두 펩티드 모두를 이들 마우스에서 항체 반응을 생성하는 3마리의 마우스를 면역화시키기 위해 사용하였다. 예비 혈청 스크리닝으로, 이들 펩티드에 대한 강한 항체 역가가 드러났으며, 이후에 이들 2개의 펩티드 서열에 대한 클로널 항체를 생성하는 하이브리도마의 생성을 야기하였다. 480개의 하이브리도마 클론의 초기의 스크리닝을 둘 모두의 펩티드뿐 아니라 운반체 단백질에 대하여 ELISA로 수행하였다. 양성의 클론을 증식시키고, 재시험하여, ELISA에 의해 펩티드 에피토프 반응성을 확인하였다. 이들 초기 스크리닝의 최종 결과는 펩티드 #1 또는 #2 중 어느 하나에 대해 특이적인 46개의 클론을 야기하였다. 이들 ELISA 결과의 심층 분석으로, 추가의 시험을 위한 16개의 표적 후보물질을 확인하였다. 이들 16개의 클론을 전장 피브리노겐 상의 Mac-1 수용체를 통한 미세아교세포 부착을 차단하는 이들의 능력에 대해 스크리닝하였다. 조직 배양 웰을 50 ㎍/mL의 피브리노겐으로 코팅하고, 그 위에 미세아교 세포(200,000개 세포/mL)를 이들 항체 클론의 존재 하에서 플레이팅하였다. 웰을 30분 후에 세척하고, 남아있는 부착 세포를 0.1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다. 염색된 세포를 1% PFA로 고정시키고, 0.5% Triton X-100으로 용해시켰다. 이들 클론 중 5개는 595nm에서의 흡광도 측정에 의해 평가시 피브리노겐에 대한 미세아교세포 부착을 방지하기 위한, Mac-1(M1/70)에 대한 구매가능한 블로킹 항체의 능력과 유사한 유의미한 능력을 보였다(도 1; 흡광도의 이동에 의해 측정시 20% 초과의 억제를 가짐). 본 발명의 항체가 피브리노겐에 대한 미세아교세포 부착을 30%, 40% 또는 50% 초과로 방지할 수 있는 것이 고려된다. 클론 1A5, 1D6 및 1E3은 펩티드 #1 에피토프를 인식하는 한편, 클론 4E11 및 5B8은 펩티드 #2 에피토프를 인식한다. 이들 5개의 클론을 웨스턴 블롯에 의해 피브리노겐을 인식하는 이들의 능력에 대해 추가로 분석하였다. 모든 5개의 항체는 유사한 정도로 피브리노겐의 γ 쇄를 인식하였다. 이들 항체가 용량 의존적 방식으로 피브리노겐을 인식하는지를 시험하기 위하여, ELISA를 전장 코팅된 피브리노겐 상에서 수행하였다(도 2). 모든 5개의 항체는 증가하는 농도의 전장 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 것으로 관찰되었다. 이들 5개의 항체로부터, 단리 및 대규모 정제를 위해 3개(흡광도의 이동으로 측정시, 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인에 대한 Mac-1 결합의 50% 초과의 억제를 갖는 1E3, 4E11 및 5B8)를 선택하였다. 본 발명의 항체가 피브린에 대한 Mac-1 결합을 50%, 60% 또는 70% 초과로 억제할 수 있음이 고려된다. 먼저, 20mg의 모든 3개의 항체를 시험관 내 식세포작용 검정 및 EAE 실험에서의 사용을 위해 정제하였다.

실시예 2 - 피브리노겐의 γ 쇄에 대한 모노클로널 항체는 미세아교세포에 의한 식세포작용을 억제한다.

식세포작용은 활성화된 미세아교세포 및 Mac-1에 의해 매개되는 대식세포의 주기능이다. 식세포작용 검정을 이전에 기재된 바와 같이, 미세아교세포 상에서 수행하였다. 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함되는 문헌 [Adams et al., 2007, J. Exp. Med. 204 :571-582]을 참조한다. 피브린-유래된 γ^377-395 펩티드는 미세아교세포 활성화를 억제하며, 중추신경계 자가면역 반응에서 재발성 마비(relapsing paralysis)를 억제한다. 변형된 피브린 γ^377-395 에피토프에 대한 모노클로널 항체 5B8은 시험관 내에서 식세포작용을 억제하는데 뛰어난 효능을 보여주었다. 생체 내 연구에서 이러한 항체는 γ^377-395 펩티드에 대해 이전에 기재된 바와 같이, MS에 대한 동물 모델에서 예방 및 치료적 투여를 보여준다.

실시예 3 - 모노클로널 항체 5B8은 실험적 자가면역 뇌척수염의 재발-완화형 동물 모델에서의 재발 발생을 억제한다.

생체 내의 미세아교세포 활성화 및 탈수초화의 조절에서 피브린 항체의 효과를 평가하기 위하여, PLP EAE의 발생 후에 마우스에 대한 식세포작용 검정에서 확인된 클론 중 2개를 투여하였다. 항체 5B8 및 4E11을 마우스당 250 ㎍으로 주마다 3회 투여하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 항체 4E11은 EAE의 발생에 실질적인 영향을 갖지 않았다. 대조적으로, 항체 5B8은 재발 시에 임상적 징후의 억제를 보여주었다.

기타 실시형태

상기 기술된 상세한 설명은 본 발명을 실행에 있어 당업자에게 도움을 주기 위해 제공된 것이다. 그러나, 본 명세서에 기술되고 청구된 본 발명은 이러한 실시형태가 본 발명의 여러 양태들의 예시로서 의도된 바, 본 명세서에 기술된 특정 실시형태에 의해 그 범위에 있어 제한되지 않는다. 임의의 균등한 실시형태는 본 발명의 범위 내에 존재하는 것으로 의도된다. 실제로, 본 명세서에 도시되고 기술된 발명에 추가하여 본 발명의 다양한 변형은 본 독창적인 발견의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않는 상기 설명으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 특허청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

인용된 참고문헌

본 명세서에서 참고문헌의 인용은 이러한 것이 본 발명에 대한 이전의 기술이라는 승인으로 간주되어서는 안된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Akassoglou, Katerina <120> Monoclonal Antibodies <130> RUC-110WO <150> US 61/248,014 <151> 2009-10-02 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Thr Phe Asp Ser Pro Tyr Gln Val Arg Arg Met Arg Phe Ser Ala Gln 1 5 10 15 Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro Gly Ser Thr Ala Asp Ile 20 25 30 Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Ile Thr Leu Gly Thr Ser 35 40 45 Ala Ser Met Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly 50 55 60 Ile Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 65 70 75 80 Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 85 90 95 Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg 100 105 110 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu 115 120 125 Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 130 135 140 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ala Cys Thr Lys Gly Glu Phe 145 150 155 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 5 <211> 166 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asn Thr Ala Phe Ala Gly Phe Gly Arg Asn Met Arg Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 Leu Gln Leu Leu Ser Thr Gln Asp Leu Ala Met Gly Trp Ser Cys Ile 20 25 30 Ile Val Leu Leu Val Ser Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln 35 40 45 Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys 50 55 60 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His 65 70 75 80 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile 85 90 95 Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys 100 105 110 Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu 115 120 125 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser 130 135 140 Asp Pro Thr Gly Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Pro 145 150 155 160 Ala Ser Thr Thr Pro Pro 165 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Leu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Ser Asp Pro Thr Gly Cys 1 5 <210> 9 <211> 474 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 acttttgact caccatatca agttcgcaga atgaggttct ctgctcagct tctggggctg 60 cttgtgctct ggatccctgg atccactgca gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc 120 aatccaatca ctcttggaac atcagcttcc atgtcctgca ggtctagtaa gagtctccta 180 catagtagtg gcatcactta tttgtcttgg tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag 240 ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt 300 gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatt agccgagtgg aggctgagga tgtgggtgtt 360 tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag 420 ctgaaacggg ctgatgctgc accaactgta tccgcatgca ccaagggcga attc 474 <210> 10 <211> 499 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 gaacactgcg tttgctggct ttggaagaaa catgagatca ctgttctctc tacagttact 60 gagcacacag gacctcgcca tgggatggag ctgtatcatt gtcctcttgg tatcaacagc 120 tacaggtgtc cactcccagg tccaactgca gcagcctggg gctgagctgg tgaggcctgg 180 gacttcagtg aagttgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcaccagct actggataca 240 ctgggtaaag cagaggcctg gacaaggcct tgagtggatc ggactgattg atccttctga 300 tagttatact aactacaatc aaaagttcag gggcaaggcc acattgactg tagacacatc 360 ctccagcaca gcctacatgc agctcagcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta 420 ctgtgcaagc tccgatccta caggctgctg gggccaaggc accactctca cagtctcccc 480 agctagcaca acaccccca 499 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 aggtctagta agagtctcct acatagtagt ggcatcactt atttgtct 48 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 cagatgtcca accttgcctc a 21 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 gctcaaaatc tagaacttcc gctcacg 27 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 ggctacacct tcaccagcta ctggatacac 30 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 ctgattgatc cttctgatag ttatactaac tacaatcaaa agttcagggg c 51 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 tccgatccta caggctgc 18 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Cys Gly Trp Thr Val Leu Gln Lys Arg Ile Asp Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Cys Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn Arg Leu Thr Ile 1 5 10 15 Gly

Claims (29)

1. 인간의 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인의 γ^377-395 에피토프에 결합하고, 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인에 대한 Mac-1 결합을 억제하는 단리된 항체로서,
   상기 항체 경쇄는 각각 RSSKSLLHSSGITYLS(서열 번호 2), QMSNLAS(서열 번호 3) 및 AQNLELPLT(서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 항체 중쇄는 각각 GYTFTSYWIH(서열 번호 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG(서열 번호 7) 및 SDPTGC(서열 번호 8)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 상기 피브린 또는 피브리노겐 γC 도메인에 대한 Mac-1 결합의 50% 초과의 억제를 나타내는 항체.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 재발 시에 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 임상적 징후를 억제하는 항체.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로널 항체인 항체.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항체인 항체.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 항체.
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 5의 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 항체.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 경쇄 가변 아미노산 서열 및 서열 번호 5의 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 항체.
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19. 대상체에서 피브린에 대한 Mac-1 결합 또는 피브리노겐과의 Mac-1 결합과 관련된 병상(pathology)의 징후를 경감시키는데 사용되기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 병상은 다발성 골수종, 척수 손상, 알츠하이머병, 뇌졸중, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
20. 제19항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 약제학적 조성물.
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