ES2614939T3 - Anticuerpos monoclonales - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a un epítopo de γ377-395 del dominio γC de fibrina o fibrinógeno, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. nº 2), QMSNLAS (SEQ. ID. nº 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. nº 4) y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias GYTFTSYWIH (SEQ. ID. nº 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. nº 7), y SDPTGC (SEQ. ID. nº 8), en donde el anticuerpo tiene capacidad para inhibir el enlace Mac-1 a fibrina o fibrinógeno, y en donde el anticuerpo suprime los síntomas clínicos de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en el momento de la recaída.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Anticuerpos monoclonales Campo

Esta invencion se refiere en general a la generacion de anticuerpos monoclonales y, en particular, a anticuerpos monoclonales que reconocen el dominio de fibrina yC, y a los anticuerpos monoclonales para empleo como agentes terapeuticos.

Introduccion

Se produce esclerosis multiple cuando el sistema inmunitario ataca el cerebro y la medula espinal, danando la mielina que afsla y protege las fibras nerviosas. Las celulas del cerebro conocidas como microgUa participan en este ataque y se activan cuando se rompe la barrera hematoencefalica (BHE), revestimiento de las celulas que deben proteger el cerebro de intrusos. A medida que se rompe la BHE, una protema de la sangre llamada fibrinogeno se filtra en el cerebro. Ademas de su funcion conocida en la coagulacion de la sangre, el fibrinogeno activa los microgliocitos y por lo tanto aumenta la respuesta inflamatoria en modelos animales de esclerosis multiple. Ademas, se ha determinado que el fibrinogeno interviene en la patogenia de determinados tipos de cancer, artritis reumatoide y otras enfermedades y patologfas en las que se produce dano tustico por donde "fuga" el fibrinogeno. Vease, p. ej., Akassoglou et al., 2002, Neuron, 33:861-875; Akassoglou et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:6.6986.703; Adams et al., 2007, J. Exp. Med., 35:2428-34. Ademas se ha determinado que el receptor espedfico, Mac-1, que utiliza fibrinogeno para mediar estos efectos no interviene en las propiedades beneficiosas de coagulacion de fibrinogeno. Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de los inhibidores espedficos de la union fibrinogeno/Mac-1 se han desarrollado.

Adams et al. (The Journal of Experimental Medicine, vol. 204, n° 3, 19 de marzo de 2007, pags. 571-582) describen el peptido y3 "395 derivado de fibrina que inhibe la activacion de la microglia y suprime la paralisis recurrente en enfermedades autoinmunitarias del sistema nervioso central.

Ryu et al. (Journal of Cellular and Molecular Medicine, vol. 13, n° 9A, septiembre de 2009, pags. 2911-2925) describen la funcion de la rotura de la barrera hematoencefalica y la infiltracion de fibrinogeno en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Segun Ryu et al., Un anticuerpo anti-Mac-1 dirigido contra antfgenos CD11b bloquea la activacion de la microglia, por lo que confiere significativa neuroproteccion.

Ryu et al. (Journal of Thrombosis and Haemostasis, vol. 7, supl. 1, julio de 2009, pags. 151-154) se refiere a la transduccion de la senal de fibrinogeno en el sistema nervioso y especialmente que el direccionamiento farmacologico de las interacciones de fibrinogeno con sus receptores del sistema nervioso podna proporcionar nuevas estrategias para la intervencion terapeutica en enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. Ryu et al. describen ademas que el fibrinogeno reconoce CD11b por la secuencia y377-395 del terminal C, que es un epttopo de union cnptica de la molecula de fibrinogeno expuesta solamente despues de su polimerizacion a fibrina o su inmovilizacion en un sustrato.

El documento US 2009/0221507 A1 describe la funcion inhibidora del peptido y377-395 en la activacion de la microglia y su utilizacion para el tratamiento de trastornos degenerativos del sistema nervioso. Ademas se mencionan anticuerpos anti- y .

Altieri et al. (The Journal of Biological Chemistry, vol. 268, n° 3, 25 de enero de 1993, pags. 1847-1853) describen anticuerpos antifibrinogeno dirigidos contra la region 95-264 de la cadena y.

Por lo tanto, lo que se necesita son inhibidores espedficos de la union fibrinogeno/Mac-1 que reduzcan los efectos proinflamatorios de fibrinogeno en el cerebro y en otra parte en un sujeto, mientras que al mismo tiempo retengan los efectos beneficiosos del fibrinogeno en la coagulacion de la sangre.

Compendio

La presente invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une a un epttopo de y377-395 de la fibrina o al dominio yC del fibrinogeno, en donde dicho anticuerpo comprende, individualmente, una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad con las secuencias que incluyen RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de complementariedad que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias de GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); en donde el anticuerpo tiene una capacidad para inhibir la union de Mac-1 a la fibrina o fibrinogeno, y en donde el anticuerpo suprime los smtomas clmicos de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en el momento de la recafda. En determinados aspectos de la invencion, las exposiciones de anticuerpos mayor del 20% de inhibicion de adhesion de la microglia al dominio yC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de la fibrina o del fibrinogeno. En otro aspecto, el anticuerpo presenta mas del 50% de inhibicion de la union de Mac- 1 al dominio yC de la fibrina o el fibrinogeno.

En diversas realizaciones, el anticuerpo se une a un epftopo de y377’395 del dominio yC de fibrina o fibrinogeno. Ademas se describe un anticuerpo que se puede unir a un epftopo de y190’202 del dominio yC de fibrina o fibrinogeno. Dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales, y, en diversos aspectos anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos.

En diversos aspectos de la invencion, el anticuerpo comprende una cadena ligera con tres regiones determinates de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que incluye RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QmSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4). En diversos aspectos, el anticuerpo comprende una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que incluye GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7), y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8). En determinados casos, el anticuerpo comprende una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que incluye RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que incluye GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7), y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8).

En diversos aspectos, los anticuerpos anteriores comprenden una secuencia de SEQ. ID. n° 1 de aminoacidos de la cadena ligera variable. En diversos aspectos, los anticuerpos anteriormente comprenden una secuencia de SEQ. ID. n° 5 de aminoacidos variable de la cadena pesada. En aun otro aspecto, los anticuerpos anteriormente comprenden tanto una secuencia de SEQ. ID. n° 1 de aminoacidos variable de la cadena ligera y una secuencia de aminoacidos variable de la cadena pesada de la SEQ. ID. n° 5.

En aun otro aspecto de la presente invencion, los anticuerpos anteriores comprenden, cada uno, una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tienen al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias como por ejemplo RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias como por ejemplo GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6),

LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7), y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); y en donde los dominios de la complementariedad de la cadena ligera y dominios de la complementariedad de la cadena pesada conservan la capacidad de union de Mac-1.

En aun otro aspecto de la presente invencion, los anticuerpos anteriores comprenden, cada uno, una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias como por ejemplo RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de complementariedad que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias como por ejemplo GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6),

LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7), y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); y en donde los dominios de

complementariedad de la cadena ligera y los dominios de complementariedad de la cadena pesada conservan capacidad de union de Mac-1.

En aun otro aspecto de la presente invencion, los anticuerpos anteriores comprenden, cada uno, una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tienen al menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias como por ejemplo RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias como por ejemplo GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6),

LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7), y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); y en donde los dominios de la complementariedad de la cadena ligera y los dominios de la complementariedad de la cadena pesada conservan capacidad de union de Mac-1.

Tambien se proporciona el anticuerpo de la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de una patologfa relacionada con el enlace de Mac-1 a la fibrina o el enlace de Mac-1 al fibrinogeno, en donde dicha patologfa se selecciona del grupo que consiste en esclerosis multiple, cicatrizacion de heridas, isquemia pulmonar, lesion de la medula espinal, la enfermedad de Alzheimer, derrame cerebral, artritis reumatoide y cancer, preferiblemente en seres humanos.

Tambien se proporciona una composicion farmaceutica que comprende los anticuerpos anteriores y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En otro aspecto, se proporciona un equipo que comprende los anticuerpos anteriores e instrucciones para usar el equipo para detectar fibrina en una muestra. Ademas se describe un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un epftopo de y377’395 de fibrina, CKKTTMKIIPFNRLTIG

(SEQ. ID. n° 18), o uno de sus derivados biologicamente activos. Ademas se describe una celula que comprende el vector.

Ademas se describe un metodo para generar un anticuerpo que se une inmunoespedficamente a un epftopo de y377"395 de fibrina, o a uno de sus derivados biologicamente activo, comprendiendo el metodo: administrar a un sujeto 5 una primera dosis de la celula descrita anteriormente, en donde la primera dosis es suficiente para generar una respuesta inmunitaria en dicho sujeto. El metodo puede comprender ademas la etapa de administrar a dicho sujeto una segunda dosis de dicha celula, en donde dicha segunda dosis es suficiente para generar una respuesta inmunitaria en dicho sujeto. El anticuerpo producido inhibe la union fibrina/Mac-1 en dicho sujeto.

Ademas se describe un metodo para la identificacion sistematica de un ligando que se une un receptor Mac-1 y 10 modula la actividad del receptor Mac-1, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar el anticuerpo de la reivindicacion 1; (b) poner en contacto un epftopo de y37 "395 de fibrina, CKKTtMKiIpFnRLTIG (SEQ. ID. n° 18), o uno de sus derivados biologicamente activo, y formar un complejo anticuerpo/polipeptido; (c) poner en contacto el complejo anticuerpo/polipeptido con una composicion que comprende un compuesto experimental; y (d) determinar si el compuesto experimental se une al anticuerpo monoclonal; por lo cual, la union del compuesto experimental indica 15 que dicho compuesto experimental es un ligando que modula la actividad del receptor Mac-1.

Estas y otras caractensticas, aspectos y ventajas de las presentes ensenanzas se entenderan mejor con referencia a la siguiente descripcion, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.

Dibujos

Figura 1. Union de anticuerpo monoclonal evaluada por mediciones de absorbancia a 595 nm en comparacion con 20 anticuerpo bloqueador contra Mac-1 (M1/70) disponible en el mercado.

Figura 2.Resultados de ELISA que miden la union del anticuerpo monoclonal al fibrinogeno.

Figura 3. El anticuerpo monoclonal 5B8 contra el epftopo de y377-395 de fibrina modificado presenta aumento de eficacia en la inhibicion de la fagocitosis.

Figura 4. Experimentos in vivo de administracion de anticuerpos anti-fibrina en PLP EAE despues de la primera 25 incidencia de smtomas clrnicos relacionados con anticuerpos (A) 4E11 y (B) 5B8. El anticuerpo monoclonal 5B8 presenta supresion en el momento de recafda.

Descripcion detallada

Abreviaturas y Definiciones

A menos que se defina de otra manera, los terminos cientfficos y tecnicos empleados en relacion con la presente

30 invencion tendran los significados que los expertos en la tecnica entienden normalmente. Ademas, a menos que el

contexto lo requiera de otra manera, los terminos en singular incluiran los plurales y los terminos en plural incluiran el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y las tecnicas de, cultivo celular e hfstico, biologfa molecular, y qrnmica de protemas y oligonucleotidos o polinucleotidos e hibridacion descritas en la presente memoria son bien conocidas y normalmente utilizadas en la tecnica. Se utilizan tecnicas habituales para ADN

35 recombinado, smtesis de oligonucleotidos, cultivo hfstico y transformacion celular. Las reacciones enzimaticas y

tecnicas de purificacion se llevan a cabo utilizando equipos disponibles en el mercado segun las especificaciones del fabricante o como se realizan normalmente en la tecnica o como se describen en la presente memoria.

La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular (incluidas tecnicas biotecnologicas), microbiologfa, biologfa celular, bioqmmica e inmunologfa, 40 que estan dentro de la experiencia de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J .E Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue 45 Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths y D. G Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F .M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley 50 and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (p. ej. Sepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott 55 Company, 1993).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Las nomenclatures utilizadas en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de produccion de anticuerpos, produccion de hibridomas, qmmica analftica, qmmica organica de smtesis y qmmica medicinal y farmaceutica descritas en la presente memoria son las bien conocidos y normalmente utilizadas en la tecnica. Se usan tecnicas convencionales para smtesis qmmicas, analisis qmmicos, preparacion farmaceutica, formulacion, y suministro, y tratamiento de los pacientes.

Tal como se utiliza segun la presente descripcion, los siguientes terminos, a menos que se indique de otra manera, se entendera que tienen los siguientes significados:

Anticuerpo: Como se emplea en la presente memoria, el termino "anticuerpo" se refiere a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moleculas que contienen un punto de union al antfgeno que une inmunologicamente a un antigeno. Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, hubridos, dAb (anticuerpo de dominio), monocatenario, fragmentos Fab, Fab y F(ab')2, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), y una biblioteca de expresion de Fab. La unidad estructural basica del anticuerpo se sabe que comprende un tetramero. Cada tetramero esta compuesto por dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porcion amino-terminal de cada cadena incluye una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables del reconocimiento del antigeno. La porcion carboxi-terminal de cada cadena define una region constante responsable principalmente de la funcion efectora. En general, las moleculas de anticuerpos obtenidos de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren unas de otras por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molecula. Determinadas clases tambien tienen subclases tales como IgG-i, IgG2 y otras. Ademas, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.

Anticuerpo Monoclonal: La expresion "anticuerpo monoclonal" (MAb) o "composicion de anticuerpo monoclonal", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una poblacion de anticuerpos que contienen solo una especie que consiste en un producto genico de la cadena ligera unico y un producto de gen de la cadena pesada unico. En particular, las regiones determinantes de la complementariedad (RDC) del anticuerpo monoclonal son identicas en todas las moleculas de la poblacion. Los MAb contienen un punto de union al antfgeno capaz de unirse inmunologicamente a un epftopo determinado del antfgeno caracterizado por una afinidad de union unica para el.

Punto de union al antfgeno/Parte de union: La expresion "punto de union al antfgeno" o "parte de union" se refiere a la parte de la molecula de anticuerpo que participa en la union al antfgeno. El punto de union de antfgeno esta formado por restos de aminoacidos de las regiones variables ("V") del terminal N de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos muy divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", se interponen entre los tramos flanqueantes mas conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por lo tanto, el termino "FR" se refiere a secuencias de aminoacidos que se encuentran de forma natural entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molecula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada estan dispuestas entre si en un espacio tridimensional para formar una superficie de union al antfgeno. La superficie de union a antfgeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antfgeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "RDC". La asignacion de aminoacidos a cada dominio es segun las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989). Las directrices para la identificacion de las RDC estan disponible en
http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid.

Epftopo: Como se emplea en la presente memoria, el termino "epftopo" incluye cualquier determinante proteico de un antfgeno capaz de unirse espedficamente a un anticuerpo o un receptor de linfocitos T. Los determinantes epitopicos consisten habitualmente en agrupaciones superficiales qmmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos o cadenas laterales de azucares y normalmente tienen caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, asf como caractensticas de carga espedficas. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos contra peptidos N-terminales o C-terminales de un polipeptido. Un anticuerpo se dice que se une espedficamente a un antigeno cuando la constante de disociacion es <1 jM, preferiblemente <100 nM y mas preferiblemente <10 nM. Derivados biologicamente activos del epftopo de y3 7"395, CKKTTMKIIPFNRLTIG (SEQ. ID. n° 18) pueden determinarse segun lo dispuesto por los expertos en la tecnica. Vease, p. ej., Ugarova et al. Identification of a novel recognition sequence for integrin aMp2 within the Y-chain of fibrinogen. J Biol Chem. 1998;273:22519- 22527; Ugarova et al. Recognition of fibrinogen by leukocyte integrins. Ann. N. Y. Acad Sci. 2001; 936:368-385 .

Enlace inmunologico: En la presente memoria, las expresiones "enlace inmunologico" y "propiedades del enlace inmunologico" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molecula de inmunoglobulina y un antfgeno para el que la inmunoglobulina es espedfica. La fuerza, o afinidad, de las interacciones del enlace inmunologico se pueden expresar en terminos de una constante de disociacion (Kd) de la interaccion, en la que una Kd mas pequena representa una mayor afinidad. Las propiedades del enlace inmunologico de polipeptidos seleccionados pueden cuantificarse utilizando metodos bien conocidos en la tecnica. Uno de dichos metodos implica la medicion de las velocidades de formacion y disociacion del complejo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

punto de union al antigeno/antigeno, en donde esas velocidades dependen de las concentraciones de los companeros del complejo, la afinidad de la interaccion y parametros geometricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. As^ tanto la "constante de velocidad de asociacion" (Ka) como la "constante de velocidad de disociacion" (kd) pueden determinarse mediante el calculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociacion y disociacion. (Vease Nature 361:186-87 (1993)). La relacion de Kd / Ka permite la anulacion de todos los parametros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociacion Kd. (Vease, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473). Un anticuerpo de la presente invencion se dice que se une espedficamente al epftopo de y377'395 del fibrinogeno cuando la constante de asociacion (Kd) es <1 pm, preferiblemente <100 nM, mas preferiblemente <10 nM, y aun mas preferiblemente <100 pM a aproximadamente 1 pM, medido por analisis tales como analisis de union de radioligando o analisis similares conocidos por los expertos en la tecnica.

Fibrina y fibrinogeno: Como se emplea en la presente memoria, los terminos "fibrina" y "fibrinogeno" se emplean indistintamente y se refieren a un polipeptido, fragmento, o analogo que conserva capacidad de union a Mac-1. El fibrinogeno es un precursor soluble en fibrina y ambos conservan el dominio yC, y por lo tanto los epftopos de la presente invencion.

Polinucleotido aislado: La expresion "polinucleotido aislado" como se emplea en la presente memoria, significa un polinucleotido de origen genomico, ADNc, o sintetico o alguna de sus combinaciones, que en virtud de su origen el "polinucleotido aislado" (1) no esta asociado con todo o una porcion de un polinucleotido en donde el "polinucleotido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esta operativamente unido a un polinucleotido al que no esta unido en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia mas grande.

Protema aislada: La expresion "protema aislada" referido en la presente memoria significa una protema de ADNc, ARN recombinado o de origen sintetico o alguna de sus combinaciones, que en virtud de su origen o fuente de derivacion, la "protema aislada" (1) no esta asociada con protemas que se encuentran en la naturaleza, (2) esta exenta de otras protemas del mismo origen, (3) se expresa por una celula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza.

Polipeptido: El termino "polipeptido" se emplea en la presente memoria para referirse a protemas naturales, fragmentos de protemas y fragmentos o analogos de una secuencia polipeptfdica. Los fragmentos y analogos de protemas naturales se consideran especies del genero polipeptido. Ejemplos de polipeptidos segun la presente invencion incluyen la molecula de inmunoglobulina de la cadena ligera representada como SEQ. ID. n° 1 y la molecula de inmunoglobulina de cadena pesada representada como SEQ. ID. n° 5, asf como las RDC representadas como SEQ ID n° 2, n° 3, n° 4, n° 6, n° 7 y n°8, las moleculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moleculas de inmunoglobulina de la cadena pesada con moleculas de inmunoglobulina de la cadena ligera, tales como moleculas de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa, y viceversa, asf como uno de sus fragmentos y analogos.

De origen natural: La expresion "de origen natural" empleada en la presente memoria y aplicada a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipeptido o secuencia polinucleotfdica que esta presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio o si no es de origen natural.

Operativamente unido: La expresion "operativamente unido" tal como se emplea en la presente memoria se refiere a las posiciones de componentes asf descritos estan en una relacion que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresion de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Secuencia de control: La expresion "secuencia de control", como se emplea en la presente memoria se refiere a secuencias de polinucleotidos que son necesarias para efectuar la expresion y el procesamiento de secuencias codificantes a las que estan ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo anfitrion. En procariotas, dichas secuencias de control comprenden generalmente activador, punto de union ribosomico, y secuencia de terminacion de la transcripcion. En eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen activadores y secuencia de terminacion de la transcripcion. La expresion "secuencias de control" pretende incluir, como mmimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresion y tratamiento, y tambien puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias principales y secuencias companeras de fusion.

Polinucleotido: Como se emplea en esta memoria, el termino "polinucleotido" significa un compuesto polimerico de nucleotidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido. El termino incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

Oligonucleotido: Como se emplea en esta memoria, el termino oligonucleotido incluye nucleotidos de origen natural, y modificados unidos entre sf por enlaces oligonucleotfdicos de origen natural, y artificial. Los oligonucleotidos son un subconjunto polinucleotfdico que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

los oligonucleotidos son de 10 a 60 bases de longitud y mas preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleotidos son por lo general monocatenarios, p. ej., para sondas, aunque los oligonucleotidos pueden ser bicatenarios, p. ej., para su uso en la construccion de un mutante genico. Los oligonucleotidos de la invencion son oligonucleotidos transcritos o complementarios.

Nucleotidos de origen natural: Como se emplea en la presente memoria, la expresion "nucleotidos de origen natural" incluye desoxirribonucleotidos y ribonucleotidos. La expresion "nucleotidos modificados" mencionada en la presente memoria incluye nucleotidos con grupos de azucar modificados o sustituidos y similares. La expresion "enlaces oligonucleotidicos" mencionada en la presente memoria incluye enlaces oligonucleotfdicos tales como fosforotioato, fosforoselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y similares. Vease p. ej., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pags. 87-108 (F. Eckstein, Ed, Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente de Estados Unidosn° 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleotido puede incluir un marcador para su deteccion sistematica, si se desea.

Se hibridan selectivamente: Como se emplea en esta memoria, la expresion "se hibridan selectivamente" significa que se unen de forma detectable y espedfica. Los polinucleotidos, oligonucleotidos y uno de sus fragmentos descritos en la presente memoria se hibridan selectivamente a cadenas de acido nucleico en condiciones de hibridacion y lavado que minimizan cantidades apreciables de union detectable a acidos nucleicos inespedficos. Pueden utilizarse condiciones de alta severidad para conseguir condiciones de hibridacion selectivas como se conoce en la tecnica y estan expuestas en la presente memoria. Generalmente, la homologfa de secuencia de acido nucleico entre los polinucleotidos, oligonucleotidos y fragmentos descritos en la presente memoria y una secuencia de acido nucleico de interes sera de al menos 80%, y mas generalmente con preferencia creciente homologa de al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%. Dos secuencias de aminoacidos son homologas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homologfa significa que 85% de los aminoacidos son identicos cuando las dos secuencias se alinean para una maxima correspondencia. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que estan emparejadas) en longitudes de hueco con maxima correspondencia de 5 o menos, prefiriendose mas con 2 o menos. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de protemas (o secuencias de polipeptidos derivadas de ellas de al menos 30 aminoacidos de longitud) son homologas, tal como este termino se emplea en la presente memoria, si tienen una puntuacion de alineacion de mas de 5 (en unidades de desviacion estandar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutacion y una penalizacion por hueco de 6 o mayor. Vease Dayhoff, M. O, en Atlas of Protein Sequence and Structure, pags. 101-110 (volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el suplemento 2 a este volumen, pags. 1-10. Las dos secuencias o partes de ellas son mas preferiblemente homologas si sus aminoacidos son mayores o iguales a 50% identicos cuando se alinean de manera optima utilizando el programa ALIGN. La expresion "corresponde a" se emplea en la presente memoria en el sentido de que una secuencia de polinucleotidos es homologa (es decir, es identica, relacionada no estrictamente evolutiva) a toda o una parte de una secuencia de polinucleotidos de referencia, o que una secuencia de polipeptidos es identica a una secuencia de polipeptidos de referencia. En contraposicion, la expresion "complementario a" se emplea en la presente memoria en el sentido de que la secuencia complementaria es homologa a toda o una parte de una secuencia de polinucleotidos de referencia. Para ilustracion, la secuencia de nucleotidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Las siguientes expresiones se emplean para describir las relaciones de secuencia entre dos o mas secuencias de polinucleotidos o de aminoacidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparacion", "identidad de secuencia", "% de identidad de secuencia" e "identidad sustancial".

Secuencia de referencia: Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para una comparacion de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de un ADNc completo o una secuencia genica de longitud dada en una lista de secuencias o puede comprender una ADNc completo o una secuencia genica. En general, una secuencia de referencia es de al menos 18 nucleotidos o 6 aminoacidos de longitud, frecuentemente al menos de 24 nucleotidos u 8 aminoacidos de longitud, y a menudo de al menos 48 nucleotidos o 16 aminoacidos de longitud. Puesto que dos secuencias de polinucleotidos o aminoacidos pueden comprender cada una (1) una secuencia (es decir, una parte de la secuencia completa de polinucleotidos o de aminoacidos) que es similar entre las dos moleculas, y (2) puede comprender ademas una secuencia que es divergente entre los dos secuencias de polinucleotidos o aminoacidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o mas) moleculas se realizan generalmente comparando secuencias de las dos moleculas sobre un "intervalo de comparacion" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.

Intervalo de comparacion: Un "intervalo de comparacion", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleotidos contiguos o 6 aminoacidos en donde una secuencia de polinucleotido o una secuencia de aminoacidos pueden compararse con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleotidos contiguos o 6 secuencias de aminoacidos y en donde la parte de la secuencia polinucleotfdica en el intervalo de comparacion puede comprender adiciones, supresiones, sustituciones y similares (es decir,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

huecos) de 20% o menos en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para alineacion optima de las dos secuencias. La alineacion optima de secuencias para alinear un intervalo de comparacion puede realizarse por el algoritmo de homolog^a local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion de homologfa de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la busqueda del metodo de similitud de Pearson y Lipman

Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85:2444 (1988), mediante aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks o MacVector software packages), o mediante inspeccion, y se selecciona la mejor alineacion (es decir, lo que resulta en el % mas alto de homologfa sobre la ventana de comparacion) generada por los diversos metodos.

Identidad de secuencia: La expresion "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleotidos o de aminoacidos son identicas (es decir, nucleotido a nucleotido o resto a resto) sobre el intervalo de comparacion. La expresion "% de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera optima sobre el intervalo de comparacion, determinando el numero de posiciones en las que la base de acido nucleico identica (p. ej., A, T, C, G, U o I) o resto se produce en ambas secuencias para obtener el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes por el numero total de posiciones en el intervalo de comparacion (es decir, el tamano del intervalo), y multiplicando el resultado por 100 para dar el % de de identidad de secuencia. Las expresiones "identidad sustancial" tal como se emplea en la presente memoria indica una caractenstica de una secuencia de polinucleotidos o aminoacidos, en donde el polinucleotido o aminoacido comprende una secuencia que tiene al menos 85% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95% de identidad de secuencia, mas habitualmente al menos una identidad de secuencia del 99%, en comparacion con una secuencia de referencia sobre un intervalo de comparacion de al menos 18 posiciones de nucleotidos (6 aminoacidos), frecuentemente sobre un intervalo de al menos 24-48 posiciones de nucleotidos (8-16 aminoacidos), en donde el % de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones que totalizan 20% o menos de la secuencia de referencia sobre el intervalo de comparacion. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor.

Aminoacidos: Como se emplea en esta memoria, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vease Inmunology-A Synthesis (2a edicion, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Los estereoisomeros (p. ej., D-aminoacidos) de los veinte aminoacidos convencionales, aminoacidos artificiales tales como aminoacidos a,a-disustituidos, N-alquil aminoacidos, acido lactico y otros aminoacidos no convencionales tambien pueden ser componentes adecuados para polipeptidos de la presente invencion. Ejemplos de aminoacidos no convencionales comprenden: 4 hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N- trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N- metilarginina, y otros aminoacidos y iminoacidos similares (p. ej., 4-hidroxiprolina). En la anotacion de polipeptidos empleada en la presente memoria, la direccion hacia la izquierda es la direccion amino terminal y la direccion hacia la derecha es la direccion carboxi-terminal, segun el uso y convencion ordinario. Del mismo modo, a menos que se especifique de otra manera, el extremo de la izquierda de secuencias de polinucleotidos monocatenarias es el extremo 5' en la direccion de la izquierda de las secuencias bicatenarias de polinucleotidos se designa direccion 5'. La direccion de adicion de 5 'a 3' de los transcritos de ARN nacientes se denomina regiones de secuencias en la direccion de transcripcion de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son el extremo 5' al 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas arriba", regiones de secuencia en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que son del extremo 3' al 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas abajo".

Identidad sustancial: Aplicado a polipeptidos, el termino "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptfdicas, cuando se alinean de manera optima, como por ejemplo mediante los programas GAP o BESTFIT usando cargas de huecos por defecto, comparten al menos 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia, mas preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia, y lo mas preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son identicas difieren en las sustituciones moderadas de aminoacidos. Las sustituciones moderadas de aminoacidos se refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales de alifatico-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cistema y metionina. Los grupos de sustitucion moderada de aminoacidos preferidos son: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, acido glutamico-acido aspartico y asparagina- glutamina.

Como se expone en la presente memoria, las variaciones en las secuencias de aminoacidos de anticuerpos o moleculas de inmunoglobulina se contemplan como englobados por la presente invencion, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoacidos mantengan al menos el 90%, 95%, y mas preferiblemente 99%. determinados porcentajes en el medio se incluyen, por ejemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

98% y 99% de identidad de secuencia. En particular, se contemplan sustituciones moderadas de aminoacidos. Las sustituciones moderadas son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos que estan relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoacidos geneticamente codificados se dividen generalmente en familias: (1) aminoacidos acidos son aspartato, glutamato; (2) aminoacidos basicos son la lisina, arginina, histidina; (3) aminoacidos apolares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano, y (4) aminoacidos polares sin carga son glicina, asparagina, glutamina, cistema, serina, treonina, tirosina. Los aminoacidos hidrofilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoacidos hidrofobos incluyen alanina, cistema, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina y valina. Otras familias de aminoacidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi- alifatica; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifatica; y (iv) fenilalanina, triptofano y tirosina, que son la familia aromatica. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitucion aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitucion similar de un aminoacido por un aminoacido estructuralmente relacionado no tendra un efecto importante sobre el enlace o las propiedades de la molecula resultante, especialmente si la sustitucion no implica un aminoacido en un punto del marco. Si un cambio de aminoacido da lugar a un peptido funcional se puede determinar facilmente analizando la actividad espedfica del derivado polipeptfdico. Los analisis se describen en detalle en la presente memoria. Cualquier experto en la tecnica puede preparar facilmente fragmentos o analogos de anticuerpos o moleculas de inmunoglobulina. Los terminales amino y carboxi preferidos de fragmentos o analogos se producen cerca de los lfmites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparacion de los datos de secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos con bases de datos de secuencias publicas o privadas. Preferiblemente, se usan metodos de comparacion informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de configuracion de protema predichos que se producen en otras protemas de estructura y/o funcion conocida. Se conocen metodos de identificacion de secuencias de protemas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la tecnica pueden reconocer motivos de secuencia y configuraciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales segun la invencion.

Sustituciones de aminoacidos preferidas son las que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidacion, (3) alteran la afinidad de union para formar complejos de protemas, (4) alteran las afinidades de union, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales de dichos analogos. Los analogos pueden incluir diversas mutemas de una secuencia distinta de la secuencia peptfdica de origen natural. Por ejemplo, sustituciones de uno solo o varios aminoacidos (preferiblemente sustituciones moderadas de aminoacidos) pueden realizarse en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la porcion del polipeptido fuera del dominio(s) que forman contactos intermoleculares. Una sustitucion moderada de aminoacidos no debena cambiar sustancialmente las caractensticas estructurales de la secuencia original (p. ej., un aminoacido de sustitucion no debena tender a romper una helice que se produce en la secuencia original, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia original). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipeptidos reconocidas por la tecnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds, Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).

Fragmento de polipeptido: Como se emplea en esta memoria, el termino "fragmento de polipeptido" se refiere a un polipeptido que tiene un terminal amino y/o supresion del terminal carboxi, pero donde la secuencia de aminoacidos restante es identica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc completa. Los fragmentos normalmente son de al menos 5, 6, 8 o 10 aminoacidos de longitud, preferiblemente al menos 14 aminoacidos de longitud, mas preferiblemente al menos 20 aminoacidos de longitud, generalmente al menos 50 aminoacidos de longitud, e incluso mas preferiblemente al menos 70 aminoacidos de longitud. El termino "analogo" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a polipeptidos que se componen de un segmento de al menos 5 aminoacidos que tiene una identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoacidos deducida y que tiene union espedfica a un epftopo de y377"395 de fibrina, CKKTTMKIIPFNRLTIG (SEQ. ID. n° 18), o uno de sus derivados biologicamente activo en condiciones de union adecuadas. Por lo general, los analogos polipeptfdicos comprenden una sustitucion (o adicion o eliminacion) moderada de aminoacidos con respecto a la secuencia de origen natural. Los analogos, por lo general, son de al menos 5 aminoacidos de longitud, preferiblemente de al menos 10 aminoacidos de longitud o mas, y a menudo pueden ser tan largos como un polipeptido de origen natural completo.

Los analogos peptfdicos se utilizan frecuentemente en la industria farmaceutica como farmacos no peptfdicos con propiedades analogas a las del peptido plantilla. Estos tipos de compuesto no peptfdico se denominan "mimeticos peptfdicos" o "peptidomimeticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber y Freidinger TINS pag. 392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Dichos compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelado molecular informatizado. Los peptidos mimeticos que son estructuralmente similares a peptidos terapeuticamente utiles pueden usarse para producir un efecto terapeutico o profilactico equivalente. En general, los peptidomimeticos son estructuralmente similares a un polipeptido paradigmatico (es decir, un polipeptido que tiene una propiedad bioqmmica o actividad farmacologica), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o mas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

enlaces peptidicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: -CH2NH-, - CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -C0CH2-, CH(OH)CH2- y -CH2SO-, por metodos bien conocidos en la tecnica. La sustitucion sistematica de uno o mas aminoacidos de una secuencia de consenso por un D-aminoacido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede utilizarse para generar peptidos mas estables. Ademas, pueden generarse peptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variacion de la secuencia consenso sustancialmente identica por metodos conocidos en la tecnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, anadiendo restos internos de cistema capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el peptido.

Agente: Como se emplea en esta memoria, el termino "agente" se refiere a un compuesto qmmico, una mezcla de compuestos qmmicos, una macromolecula biologica o un extracto hecho de materiales biologicos.

Marcador: Como se emplea en esta memoria, los terminos "marcador" o "marcado" se refiere a la incorporacion de un marcador detectable, p. ej., por incorporacion de un aminoacido radiomarcado o acoplamiento a un polipeptido de restos biotinilo que pueden ser detectados por avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimatica que puede detectarse por metodos opticos o colorimetricos). En determinadas situaciones, la etiqueta o marcador tambien puede ser terapeutico. En la tecnica se conocen y pueden utilizarse varios metodos de marcaje de polipeptidos y glucoprotemas. Los ejemplos de marcadores para polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisotopos o radionuclidos (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p. ej., FlTc, rodamina, fosforos de lantanidos), marcadores enzimaticos (p. ej., peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, epftopos polipeptfdicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., secuencias de pares cremallera de leucina, puntos de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metal, etiquetas de epftopo). En algunas realizaciones, los marcadores estan unidos por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento esterico.

Agente farmaceutico o farmaco: Como se emplea en esta memoria, las expresiones "agente farmaceutico" o "farmaco" se refieren a un compuesto qmmico o composicion capaz de producir un efecto terapeutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.

Se utilizan otros terminos qmmicos en la presente memoria segun el uso convencional en la tecnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Sustancialmente puro: Como se emplea en esta memoria, la expresion "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es mas abundante que cualquier otra especie en la composicion), y preferiblemente una fraccion sustancialmente purificada es una composicion en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composicion sustancialmente pura comprendera mas de aproximadamente el 80% de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion, mas preferiblemente mas de aproximadamente 85%, 90%, 95% y 99%. Lo mas preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composicion por metodos convencionales de deteccion sistematica) en donde la composicion consiste esencialmente en una unica especie macromolecular.

Paciente: Como se emplea en esta memoria, el termino paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.

Anticuerpos monoclonales

La presente invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une a un epftopo de y377‘395 del dominio yC de fibrina o fibrinogeno, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias de RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias de GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8), en donde el anticuerpo tiene una capacidad para inhibir la union de Mac-1 a la fibrina o fibrinogeno, y en donde el anticuerpo suprime los smtomas clrnicos de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en el momento de la recafda. Se describen ademas anticuerpos que se unen al epftopo de y190‘ 202 del dominio yC de la fibrina y el fibrinogeno. Dichos anticuerpos bloquean los efectos daninos de la fibrina en el sistema nervioso sin afectar sus efectos beneficiosos en la coagulacion de la sangre. Estos anticuerpos monoclonales pueden bloquear la formacion de placas de EM y determinados canceres. Anticuerpos ejemplares de la invencion incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 5B8 (dirigiendo el epftopo de y377-395). Ademas se describe el anticuerpo 1E3 (dirigiendo el epftopo de y190-202). Varias secuencias de polinucleotidos y polipeptidos relacionadas con el anticuerpo 5B8, y empleos de dichas secuencias se proporcionan en la presente memoria. Estas secuencias incluyen la secuencia de aminoacidos 5B8 de la cadena ligera (SEQ. ID. n° 1), tres secuencias de aminoacidos de la RDC de la cadena ligera (RDC-L1, SEQ. ID. n° 2; RDC-L2, sEq. ID. n° 3 y RDC-L3, SEQ. ID. n° 4), secuencia de aminoacidos de la cadena pesada (SEQ. ID. n° 5), tres secuencias de aminoacidos de la RDC de la cadena pesada

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(RDC-H1, SEQ. ID. n° 6; RDC-H2, SEQ. ID. n° 7 y RDC-H3, SEQ. ID. n° 8), secuencia de nucleotidos de la cadena ligera (SEQ. ID. n° 9), secuencia de nucleotidos de la cadena pesada (SEQ. ID. n° 10), secuencias de nucleotidos de las tres RDC de la cadena ligera (RDC-L1, SEQ. ID. n° 11; RDC-L2, SEQ. ID. n° 12 y RDC-L3, SEQ. ID. n° 13), y secuencias de nucleotidos de las tres RDC de la cadena pesada (RDC-H1, SEQ. ID. n° 14; RDC-H2, SEQ. ID. n° 15 y RDC-H3, SEQ. ID. n° 16).

Los anticuerpos monoclonales de la invencion tienen capacidad para inhibir la fagocitosis in vitro e in vivo, bloquean la liberacion de citocinas y la activacion de macrofagos in vitro e in vivo, la activacion de microglia in vitro e in vivo, la desmielinizacion inflamatoria in vitro e in vivo y los smtomas clmicos en la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), un modelo animal de esclerosis multiple. Vease, p. ej., publicacion PCT WO 2007/038407. Los expertos en la tecnica tambien reconoceran que los anticuerpos monoclonales de la presente invencion tambien pueden afectar el cancer. Vease, e. g., publicacion PCT WO 2007/024817. Ademas, estos anticuerpos monoclonales podffan utilizarse en el tratamiento de enfermedades que implican fugas de fibrinogeno en los tejidos danados, incluida la artritis reumatoide, la lesion de la medula espinal, la enfermedad de Alzheimer y el accidente cerebrovascular. Vease, p. ej., Flick et al., J. Clin. Investigation, 2007, 117, 11:3224-3235; Akassoglou et al., 2002, Neuron, 33:861-875; Akassoglou et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:6698-6703; Adams et al., 2007, J. Exp. Med., 35:2428-34 . Debe tenerse en cuenta que los anticuerpos monoclonales de la presente invencion reducen los efectos proinflamatorios de fibrinogeno en el cerebro y otras partes en un sujeto, mientras que al mismo tiempo conservan los efectos beneficiosos del fibrinogeno en la coagulacion de la sangre, a diferencia de los compuestos que afectan a la coagulacion de la sangre.

Ademas se describen anticuerpos que se unen a los mismos epftopos que los anticuerpos descritos en la presente memoria. Los expertos en la tecnica reconoceran que es posible determinar, sin experimentacion indebida, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal de la invencion determinando si el

1 1 377 395 1 190 202

primero impide que el ultimo se una al epftopo de y o al epftopo de y del dominio yC de la fibrina. Si el anticuerpo monoclonal que se esta probando compite con el anticuerpo monoclonal de la invencion, como se de muestra por una disminucion en la union por el anticuerpo monoclonal de la invencion, entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo, o a un epftopo estrechamente relacionado. La deteccion sistematica de anticuerpos monoclonales de la invencion puede llevarse a cabo midiendo la capacidad de bloquear la adhesion de la microglia mediante el receptor Mac-1 en el polipeptido completo de fibrinogeno. En la presente memoria se proporcionan ejemplos de dicha deteccion sistematica.

Diversos procedimientos conocidos en la tecnica pueden utilizarse para la produccion de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra el enlace fibrinogeno-Mac-1, o contra derivados, fragmentos, analogos, homologos u ortologos de los mismos. (Vease, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, anteriormente).

Los anticuerpos se purifican por tecnicas bien conocidas, tales como cromatograffa de afinidad utilizando protema A o protema G, que proporcionan principalmente la fraccion IgG del antisuero. Posterior, o alternativamente, el anffgeno espedfico que es la diana de la inmunoglobulina buscada, o uno de sus epftopos, se puede inmovilizar en una columna para purificar el antianticuerpo espedfico por cromatograffa de inmunoafinidad.

Los anticuerpos de la invencion (p. ej., 5B8) son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales que inhiben la union fibrinogeno/Mac-1 son generados, p. ej., por los clones obtenidos de animales que han sido inmunizados con un anffgeno pepffdico. Las estirpes celulares se producen fusionando linfocitos B del animal inmunizado con celulas de mieloma. Los anticuerpos se purifican, ya sea in vitro en los medios de produccion de ascitis en ratones. Los metodos de produccion de anticuerpos tambien se proporcionan en la seccion de Ejemplos a continuacion.

Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un raton, hamster u otro animal anfitrion apropiado, por lo general se inmuniza con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran espedficamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante incluira por lo general el anffgeno proteico, uno de sus fragmentos o una de sus protemas de fusion. En general, se utilizan linfocitos de la sangre periferica si se desean celulas de origen humano, o se usan celulas de bazo o celulas de ganglios linfaticos si se desean celulas de origen de mamferos no humanos. Los linfocitos se fusionan a continuacion con una estirpe celular inmortalizada usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pags. 59-103). Las estirpes celulares inmortalizadas son normalmente celulas de mairftfero transformadas, especialmente celulas de mieloma de roedor, bovino y de origen humano. Por lo general, se emplean estirpes celulares de mieloma de rata o raton. Las celulas de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluira por lo general

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

hipoxantina, aminopterina y timidina ( "medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de celulas carentes de hgprt.

Las estirpes celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan la expresion de alto nivel estable de anticuerpos por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las estirpes celulares inmortalizadas mas preferidas son las estirpes de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., y la American Type Culture Collection, Manassas, Va. Se han descrito tambien estirpes celulares de mieloma humano y de celulas de heteromieloma de raton-humano para la produccion de anticuerpos monoclonales. (Vease Kozbor, J. Immuno.l, 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pags. 51-63)).

En el medio de cultivo en donde se cultivan a continuacion las celulas de hibridoma, puede analizarse la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. Preferiblemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por las celulas de hibridoma se determina por inmunoprecipitacion o por un analisis de union in vitro, tal como radioinmunoanalisis (RIA) o ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). Dichas tecnicas y ensayos son conocidos en la tecnica. La afinidad de union del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, por el analisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980); Patrono, C. y Peskar, B. A. (eds.) Radioimmunoassay: An Overview. J. Clin. Biochem., Heidelberg, Springer- Verlag, 1987; Dwenger, A. Radioimmunoassay: An Overview. J. Clin. Biochem. 22:883, 1984. *Por otra parte, en aplicaciones terapeuticas de anticuerpos monoclonales, es importante identificar anticuerpos que tienen un alto grado de especificidad y una gran afinidad de union por el antfgeno diana.

Una vez identificadas las celulas de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilucion limitativos y cultivarse por procedimientos convencionales. (Vease Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pags. 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, Medio Eagle modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mairnfero.

Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del lfquido ascftico por procedimientos convencionales de purificacion de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, protema A-Sefarosa, cromatograffa en hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, cromatograffa de afinidad.

Tambien pueden prepararse anticuerpos monoclonales por procedimientos de ADN recombinado, tales como los descritos en la patente de EE.UU. n° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion puede aislarse y secuenciarse facilmente utilizando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Por ejemplo, las SEQ. ID. n° 9 y n° 10 proporcionan las secuencias de nucleotidos para el anticuerpo monoclonal 5B8 de la presente invencion. Las celulas de hibridoma descritas en la presente memoria sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresion, que luego se transfectan en celulas anfitrion tales como las celulas de simio COS, las celulas de ovario de hamster chino (CHO), o celulas de mieloma que de otro modo no producen protema inmunoglobulina, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas anfitrion recombinadas. El ADN tambien se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (vease la Patente de EE.UU. n° 4.816.567; Morrison, Nature 368, 81213 (1994)) o uniendose por enlace covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina o parte de la secuencia codificante para un polipeptido distinto de inmunoglobulina. Dicho polipeptido distinto de inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invencion, o puede sustituirse por los dominios variables de un punto de combinacion con el anffgeno de un anticuerpo de la invencion para crear un anticuerpo hffbrido bivalente.

Anticuerpos completamente humanos son moleculas de anticuerpo en donde toda la secuencia tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluidas las RDC, surgen a partir de genes humanos. Dichos anticuerpos se denominan "anticuerpos humanos", o "anticuerpos completamente humanos" en la presente memoria. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar empleando la tecnica de trioma; la tecnica de hibridoma de linfocitos B humanos (vease Kozbor, et al., 1983 Immunol. Today 4: 72); y la tecnica de hibridoma del VEB para producir anticuerpos monoclonales (vease Cole, et al., 1985 en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96). Pueden utilizar y producirse anticuerpos monoclonales usando hibridomas humanos (vease Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) o transformando linfocitos B humanos con el virus de Epstein Barr in vitro (vease Cole, et al., 1985 en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pags. 7796).

Ademas, los anticuerpos humanos tambien pueden producirse empleando tecnicas adicionales, incluidas bibliotecas de presentacion de fagos. (Vease Hoogenboom y Winter, J. Mol Biol., 227:381 (1991)); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)). De manera similar, pueden prepararse anticuerpos humanos introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, p. ej., ratones en los que los genes de inmunoglobulina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

endogenos se han inactivado parcial o completamente. Tras la prueba de provocacion, se observa la produccion de anticuerpos humanos, que se asemeja bastante a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluidos el reordenamiento genico, el montaje, y el repertorio de anticuerpos. Este metodo se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.545.807; n° 5.545.806; n° 5.569.825; n° 5.625.126; n° 5.633.425; n° 5.661.016, y en Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992.); Lonberg y otros, Nature 368 856-859 (1994.); Morrison, Nature 368, 81213 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

Los anticuerpos humanos pueden producirse, ademas, utilizando los animales no humanos transgenicos que se modifican para producir anticuerpos totalmente humanos en lugar de anticuerpos endogenos de animales en respuesta a la provocacion por un antfgeno. En dichos animales, los genes endogenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el anfitrion no humano han sido incapacitados, y los locus activos que codifican inmunoglobulinas de la cadena pesada y ligera humanas se insertan en el genoma del anfitrion. Por ejemplo, las SEQ. ID. n° 11 a n° 16 proporcionan las secuencias de nucleotidos que codifican las tres cadenas ligeras y tres RDC de la cadena pesada de anticuerpo monoclonal 5B8. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, empleando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humanos necesarios. Se obtiene entonces un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas como prole por cruzamiento de animales transgenicos intermedios que contienen menos que el complemento completo de las modificaciones. Un ejemplo de dicho animal no humano es un raton denominado el Xenomouse® producido por Amgen (Thousand Oaks, CA). Este animal produce linfocitos B que segregan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente del animal despues de la inmunizacion con un inmunogeno de interes, como, por ejemplo, un preparado de un anticuerpo policlonal, o alternativamente a partir de linfocitos B inmortalizados extrafdos del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Ademas, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse mas para obtener analogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moleculas monocatenarias Fv (scFv).

Un ejemplo de un metodo de produccion de un anfitrion no humano, ejemplificado como un raton, que carece de expresion de una cadena pesada de inmunoglobulina endogena se describe en la Patente de EE.UU. n° 5.939.598. Puede obtenerse por un metodo, que incluye la eliminacion de los genes del segmento J de al menos un locus de la cadena pesada endogena en una celula madre embrionaria para evitar la reordenacion del locus y para evitar la formacion de un transcrito de un locus reordenado de la cadena pesada de inmunoglobulina, efectuandose la eliminacion por un vector dirigido que contiene un gen que codifica un marcador seleccionable; y produciendo a partir de la celula madre embrionaria un raton transgenico cuyas celulas somaticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable.

Un metodo para la produccion de un anticuerpo de interes, tal como un anticuerpo humano, se da a conocer en la patente de Ee.UU. n° 5.916.771 . Este metodo incluye la introduccion de un vector de expresion que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una cadena pesada (p. ej., SEQ. ID. n° 10) en una celula anfitrion de mairnfero en cultivo, la introduccion de un vector de expresion que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una cadena ligera (p. ej., SEQ. ID. n° 9) en otro celula anfitrion de mai^ero, y la fusion de las dos celulas para formar una celula hnbrida. La celula hnbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.

El anticuerpo puede ser expresado por un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo monocatenario descrito anteriormente.

Estos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, acelerador de genes, y cateteres. Los vectores preferidos incluyen vectores vmcos, protemas de fusion y conjugados qrnmicos. Los vectores retrovmcos incluyen virus de la leucemia murina de Moloney. Se prefieren los vectores vmcos de ADN. Estos vectores incluyen pox vectores, tales como vectores ortopox o de la viruela aviar, vectores de herpesvirus, tales como un vector del virus del herpes simple de tipo I (VHS) (vease Geller, A. I. et al., J. Neurochem., 64:487 (1995); Lim, F., et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems., D. Glover, Ed (Oxford Univ. Press, Oxford Inglaterra) (1995); Geller, A. I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1149 (1990), vectores de adenovirus (vease LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995) y vectores de virus adeno- asociados (vease Kaplitt, M.G. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994).

Los vectores pox vmcos introducen el gen en el citoplasma celular. Vectores de virus de la viruela aviar como dan lugar solamente a una expresion del acido nucleico a corto plazo. Los vectores de adenovirus, los vectores de virus adeno-asociados y los vectores del virus del herpes simple (VHS) se prefieren para introducir el acido nucleico en celulas neuronales. El vector de adenovirus da lugar a una expresion a mas corto plazo (alrededor de 2 meses) que el virus adeno-asociado (alrededor de 4 meses), que a su vez es mas corto que los vectores de VHS. El vector espedfico seleccionado dependera de la celula diana y la enfermedad a tratar. La introduccion puede ser por tecnicas estandar, p. ej., infeccion, transfeccion, transduccion o transformacion. Ejemplos de modos de transferencia

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

genica incluyen p. ej., ADN desnudo, precipitacion con CaPO4, DEAE dextrano, electroporacion, fusion de protoplastos, lipofeccion, microinyeccion de celulas y vectores vmicos.

El vector puede emplearse para dirigir esencialmente cualquier celula diana deseada. Por ejemplo, puede utilizarse inyeccion estereotaxica para dirigir los vectores (p. ej., adenovirus, VHS) a una posicion deseada. Ademas, las partmulas pueden administrarse por infusion intracerebroventricular (icv) usando un sistema de infusion con minibomba, como un SynchroMed Infusion System (Medtronic, Minneapolis, MN). Otros metodos que pueden emplearse incluyen cateteres, inyeccion intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutanea, y las vfas de administracion oral u otras conocidas.

Estos vectores pueden usarse para expresar grandes cantidades de anticuerpos que pueden utilizarse de varias maneras. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de fibrinogeno y el enlace fibrinogeno/Mac-1.

Pueden adaptarse tecnicas para la produccion de anticuerpos monocatenarios espedficos para una protema antigenica descrita en la presente memoria (vease, p. ej., patente de EE.UU. N° 4.946.778). Ademas, pueden adaptarse metodos para la construccion de bibliotecas de expresion de Fab (vease, por ejemplo, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificacion rapida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una protema o uno de sus derivados, fragmentos, analogos u homologos. Los fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos contra un antfgeno proteico se pueden producir por tecnicas conocidas en la tecnica, incluidas, pero no limitadas a: (i) un fragmento F(ab')2 producido por digestion con pepsina de una molecula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado por reduccion de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2i (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molecula de anticuerpo con papama y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv. La invencion tambien incluye fraamentos Fv, Fab, Fab' y y37 -395 anti-fibrina F(ab')2,

anticuerpos y 77-395 anti-fibrina monocatenarios, anticuerpos y3 "395 anti-fibrina biespedficos y anticuerpos y3 7" 395 anti-fibrina heteroconjugados.

Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos que tienen especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de union es para el epftopo de y377-395 de fibrina. La segunda diana de union es cualquier otro antfgeno, y ventajosamente es una protema de la superficie celular o un receptor o subunidad de receptor.

Los metodos para preparar anticuerpos biespedficos son conocidos en la tecnica. Tradicionalmente, la produccion biotecnologica de anticuerpos biespedficos se basa en la coexpresion de pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta se logra generalmente mediante etapas de cromatograffa de afinidad.

Dominios variables de anticuerpos con las especificidades de union deseadas (puntos de combinacion anticuerpo- antfgeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera region constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el punto necesario para la union de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los aDn que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados y se cotransfectan en un organismo anfitrion adecuado. Para mas detalles de la generacion de anticuerpos biespedficos vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Pueden prepararse anticuerpos biespedficos como anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., F(ab')2 de anticuerpos biespedficos). Las tecnicas para generar anticuerpos biespedficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la bibliograffa. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespedficos empleando enlaces qmmicos. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos mtegros se cortan mediante proteolisis para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del arseniuro de sodio agente complejante de ditiol para estabilizar los ditioles adyacentes y evitar la formacion de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab-TNB se reconvierte a continuacion en Fab'-tiol mediante reduccion con

mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab-TNB para formar el anticuerpo biespedfico. Los anticuerpos biespedficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.

Ademas, los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse qmmicamente para formar anticuerpos biespedficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la produccion de una molecula F(ab')2 de anticuerpo biespedfico completamente humanizado.

Se han descrito tambien diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespedficos directamente a partir de cultivos de celulas recombinadas. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespedficos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Este metodo tambien puede utilizarse para la produccion de homodfmeros de anticuerpo. La tecnologfa del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespedficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (Vl) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios Vh y Vl de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formando asf dos puntos de union al antfgeno. Tambien se ha descrito otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespedficos mediante el uso de dfmeros de Fv monocatenarios (sFv). Vease, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespedficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

La invencion tambien se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado contra un agente citotoxico, tal como una toxina (p. ej., un agente quimioterapeutico dirigido selectivamente contra celulas cancerosas, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal o fragmentos de los mismos), o una isotopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos comprenden agentes alquilantes, nitrosoureas, antimetabolitos, antraciclinas y farmacos relacionados, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de la mitosis, hormonas corticosteroides y otros medicamentos de quimioterapia.

Las toxinas enzimaticamente activas y uno de sus fragmentos que pueden utilizarse comprenden la cadena A antidifterica, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A del ricino, cadena A de la abrina, cadena A de la modeccina, alfa-sarcina, protemas de Aleurites fordii, protemas de la diantina, protemas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, enzimas de restriccion, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Para la produccion de anticuerpos radioconjugados estan disponibles una

J oi 0 101 ioi Qpi 1AR1 J ^ 1

variedad de radionuclidos. Los ejemplos incluyen Bi, I, In, Y y Re.

Los conjugados de anticuerpos y de agentes citotoxicos se preparan utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de protemas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehfdos (tales como glutaraldehfdo), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoilo) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)- etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6-diisocianato) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacetico (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugacion de radionucleotidos para el anticuerpo.

Los expertos en la tecnica reconoceran que una gran variedad de posibles restos se puede acoplar a los anticuerpos resultantes de la invencion. (Vease, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds.), Carger Press, Nueva York, (1989)).

El acoplamiento puede realizarse por cualquier reaccion qmmica que una las dos moleculas, siempre que el anticuerpo y el otro resto conserven sus respectivas actividades. Este enlace puede incluir muchos mecanismos qmmicos, por ejemplo, enlace covalente, union por afinidad, intercalado, union y complejacion coordinada. El enlace preferido es, sin embargo, el enlace covalente. El enlace covalente puede conseguirse ya sea por condensacion directa de la cadenas laterales existentes o por la incorporacion de moleculas puente externas. Muchos agentes enlazadores bivalentes o polivalentes son utiles en el acoplamiento de moleculas de protema, tales como los anticuerpos de la presente invencion, a otras moleculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos organicos tales como tioesteres, carbodiimidas, esteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehfdo, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la tecnica, sino mas bien, es ilustrativa de los agentes de acoplamiento mas corrientes. (Vease Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).

Los enlazadores se describen en la bibliograffa. (Vease, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201208 (1984) que describen el uso de MBS (ester de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) Vease tambien, patente de eE.UU. N° 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetil hidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador de oligopeptido. Los ejemplos de enlazadores incluyen: (i) EDC hidrocloruro (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)- tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP hexanoato de (succinimidil-6[3- (2-piridilditio) propionamido] (Pierce Chem Co., Cat. n° 21651G); (iv) sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6[3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat n° 2165-G); y (v) sulfo-NHS(N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem Co., Cat. n° 24510) conjugado con EDC.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen atributos diferentes, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades ffsico-qmmicas. Por ejemplo, los sulfo-NHS esteres de carboxilatos de alquilo son mas estables que los sulfo-NHS esteres de carboxilatos aromaticos. Los enlazadores que contienen NHS-ester son menos solubles que los sulfo-NHS esteres. Ademas, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estericamente impedido y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro son, en general, menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se escinde in vitro, dando como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en concreto, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos carbodiimida. Los acoplamientos de carbodiimida (tales como eDc) cuando se utiliza junto con sulfo-NHS, forman esteres que son mas resistentes a la hidrolisis que la reaccion de acoplamiento de carbodiimida sola.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria tambien pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por metodos conocidos en la tecnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y patentes de EE.UU. n° 4.485.045 y n° 4.544.545. Los liposomas con mayor tiempo de circulacion se describen en la patente de EE.UU. n° 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente utiles por el procedimiento de evaporacion en fase inversa con una composicion lipfdica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina modificada con PEG (PEG- PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de tamano de poro definido para producir liposomas con el diametro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invencion se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante una reaccion de intercambio de disulfuros.

Empleo de anticuerpos contra los epttopos de fibrina y190-202 y y377-395

Las formulaciones terapeuticas de la invencion, que incluyen un anticuerpo monoclonal de la invencion, se utilizan para tratar o aliviar un smtoma asociado a un trastorno relacionado con la fibrina (p. ej., la esclerosis multiple, la cicatrizacion de heridas, la isquemia pulmonar, la lesion de la medula espinal, la enfermedad de Alzheimer, el accidente cerebrovascular, la artritis reumatoide y el cancer), preferiblemente sin afectar a la coagulacion de la sangre. La presente invencion tambien proporciona los anticuerpos de la invencion para su uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con la fibrina (p. ej., la esclerosis multiple, la cicatrizacion de heridas, la isquemia pulmonar, la lesion de la medula espinal, la enfermedad de Alzheimer, el accidente cerebrovascular, la artritis reumatoide y el cancer), preferiblemente sin afectar a la coagulacion de la sangre. Un regimen terapeutico se lleva a cabo al identificar un sujeto, p. ej., un paciente humano que padece (o esta en situacion de riesgo de desarrollar) un trastorno relacionado con la fibrina (p. ej., la esclerosis multiple, la cicatrizacion de heridas, la isquemia pulmonar, lesion de la medula espinal, la enfermedad de Alzheimer, el accidente cerebrovascular, la artritis reumatoide y el cancer), utilizando metodos estandar. Los smtomas asociados a estos trastornos relacionados con la fibrina incluyen, por ejemplo, la inflamacion, el dolor y la perdida de percepcion sensorial. La eficacia del tratamiento se determina junto con cualquier metodo conocido para diagnosticar o tratar el trastorno concreto relacionado con la fibrina. El alivio de uno o mas smtomas de trastorno relacionado con la fibrina indica que el anticuerpo confiere una cualidad clmica. Un preparado de anticuerpos, preferiblemente uno que tenga gran especificidad y gran afinidad por su antfgeno diana, se administra al sujeto y, en general tendra un efecto debido a su union con la diana. La administracion del anticuerpo puede abolir, inhibir o interferir con la funcion de senalizacion de la diana (los epftopos

190 202 377 395 11 ' 1 1

Y y Y de fibrina). La administracion del anticuerpo puede abolir, inhibir o interferir con la union de la diana (p. ej., fibrina) con un ligando endogeno (p. ej., Mac-1) a la que se une de forma natural. Por ejemplo, el anticuerpo se une a la diana e inhibe el enlace fibrina/Mac-1.

Se apreciara que la administracion de entidades terapeuticas segun la invencion se administre con vehmulos, excipientes, y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, suministro, tolerancia y similares. Una gran cantidad de formulaciones apropiadas se puede encontrar en el formulario Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)), concretamente el capftulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones comprenden, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, jaleas, ceras, aceites, lfpidos, vesmulas que contienen lfpidos (anionicos o cationicos) (tales como Lipofectina™), conjugados de ADN, pastas de absorcion anhidras, emulsiones aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisolidos y mezclas semisolidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias segun la presente invencion, siempre que el principio activo en la formulacion no este inactivado por la formulacion y la formulacion sea fisiologicamente compatible y tolerable con la via de administracion. Vease tambien Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance" Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Liophilization and development of solid protein pharmaceuticals" Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman W. N. Lipids, lipophilics drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J. Pharm. Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en este para informacion adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehmulos bien conocidos por los qmmicos farmaceuticos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los anticuerpos de la invencion (tambien denominados en la presente memoria "compuestos activos"), y uno de sus derivados, fragmentos, analogos y homologos de los mismos, se pueden incorporar en composiciones farmaceuticas que pueden comprender un vetuculo farmaceuticamente aceptable. Como se emplea en esta memoria, la expresion "vetuculo farmaceuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de absorcion retardantes, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. Los vetuculos adecuados se describen en la edicion mas reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, texto de referencia habitual en el campo. Los ejemplos preferidos de dichos vetuculos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solucion salina, soluciones de Ringer, solucion de dextrosa, y albumina de suero humana al 5%. Pueden usarse tambien liposomas y vetuculos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, su uso se contempla en las composiciones. Los compuestos activos complementarios tambien pueden incorporarse en las composiciones.

Una composicion farmaceutica de la invencion se formula para ser compatible con su via de administracion prevista. Los ejemplos de vfas de administracion incluyen la parenteral, p. ej., intravenosa, intradermica, subcutanea, oral (p. ej., inhalacion), transdermica (es decir, topica), a traves de las mucosas, y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyectables, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiamintetraacetico (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sodico o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clorhudrico o hidroxido de sodio. El preparado parenteral puede estar contenido en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis multiples hechos de vidrio o plastico.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para el preparado improvisado de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para administracion intravenosa, los vetuculos adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composicion puede ser esteril y debe ser fluida de manera que sea facil de inyectar. Puede ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe preservarse contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vetuculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vetuculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los demas ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion son secado al vacfo y liofilizacion que produce un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de una solucion previamente filtrada esteril del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vetuculo comestible. Pueden estar contenidos en capsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para la administracion terapeutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, grageas o capsulas. Las composiciones orales tambien se pueden preparar usando un vetuculo fluido para su uso como colutorio, en donde el compuesto en el vetuculo fluido se aplica por via oral y se agita y se expectora o se traga. Los agentes de union farmaceuticamente compatibles, y/o los materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composicion. Los comprimidos, pfldoras, capsulas, grageas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente disgregador tal como acido algmico, Primogel, o almidon de mafz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un fluidificante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Para la administracion por inhalacion, los compuestos se suministran en forma de un pulverizador de aerosol desde el recipiente o dispensador presurizado que contiene un gas propulsor adecuado, p. ej., un gas tal como dioxido de carbono o un nebulizador.

La administracion general tambien puede ser a traves de la mucosa o por via transdermica. Para la administracion a traves de la mucosa o transdermica, se utilizan en la formulacion penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, para la administracion a traves de la mucosa, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusfdico. La administracion a traves de la mucosa puede conseguirse mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en pomadas, balsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la tecnica.

Los compuestos tambien se pueden preparar en forma de supositorios (p. ej., con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para administracion rectal.

En una realizacion, los compuestos activos se preparan con vefnculos que protejan el compuesto contra la eliminacion rapida del cuerpo, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluidos implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden utilizarse polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de vinil etileno, polianfndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Los metodos para la preparacion de dichas formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales tambien pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomicas (incluidos los liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales contra antfgenos vmcos) tambien pueden utilizarse como vefnculos farmaceuticamente aceptables. Estos se pueden preparar segun metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. n° 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis individuales para facilidad de administracion y uniformidad de dosis. Forma de dosis individual tal como se emplea en esta memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehnculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de dosis individuales de la invencion estan dictadas por y dependen directamente de las caractensticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico concreto a conseguir, y las limitaciones inherentes en la tecnica de la composicion de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las composiciones farmaceuticas pueden estar contenidas en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administracion.

Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor mas pequeno que se une espedficamente al dominio de union de la protema diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de la region variable de un anticuerpo, pueden disenarse moleculas de peptidos que conservan la capacidad de unirse a la secuencia proteica diana. Dichos peptidos pueden sintetizarse qmmicamente y/o producirse por tecnologfa de ADN recombinado. (Vease, p. ej., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889 hasta 7893 (l993)). La formulacion tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion concreta que se este tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de manera adversa entre sf Alternativamente, o ademas, la composicion puede comprender un agente que potencia su funcion, tal como, por ejemplo, un agente citotoxico, citocinas, un agente quimioterapeutico o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moleculas estan presentes adecuadamente en combinacion en cantidades que son eficaces para el proposito previsto.

Los principios activos tambien pueden atraparse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartfculas y nanocapsulas) o en macroemulsiones.

Las formulaciones que deben utilizarse para administracion in vivo pueden ser esteriles. Esto se consigue facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.

Pueden prepararse preparados de liberacion lenta. Los ejemplos adecuados de preparados de liberacion lenta comprenden matrices semipermeables de polfmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, matrices que estan en forma de artfculos moldeados, p. ej., pelfculas o microcapsulas. Ejemplos de matrices de liberacion lenta incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vimlico)), polilactidas (patente de EE.UU. N° 3.773.919), copolfmeros de acido L-glutamico y Y-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolfmeros degradables de acido lactico-acido glicolico tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida) y poli- D-(-)-acido 3-hidroxibutmco. Mientras que polfmeros tales como etileno-acetato de vinilo y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

acido lactico-acido glicolico permiten la liberacion de moleculas durante mas de 100 d^as, determinados hidrogeles liberan protemas durante peffodos mas cortos.

Una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo de la invencion se refiere en general a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapeutico. Como se indico anteriormente, esta puede ser una interaccion de enlace entre el anticuerpo y su anffgeno diana que, en determinados casos, interfiere con el funcionamiento de la diana. La cantidad requerida a administrar, ademas, dependera de la afinidad de union del anticuerpo por su anffgeno espedfico, y tambien dependera de la velocidad a la que se elimina un anticuerpo administrado del volumen libre de otro sujeto al que se administra. Intervalos comunes para la dosificacion terapeuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion pueden ser, a modo de ejemplo no limitativo, desde aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificacion comunes pueden variar, por ejemplo, de dos veces al dfa a una vez a la semana.

Metodos de deteccion sistematica de anticuerpos

Los metodos para la deteccion sistematica de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA) y otras tecnicas inmunologicamente mediadas conocidas en la tecnica.

Los anticuerpos dirigidos contra los epftopos y190-202 y y377-395 de fibrina pueden utilizarse en metodos conocidos en la tecnica relacionados con la localizacion y/o cuantificacion de la fibrina. En una realizacion dada, los anticuerpos espedficos a los epftopos y377-395 de fibrina, o uno de sus derivados, fragmentos, analogos u homologos, que contienen el dominio de union del anffgeno derivado del anticuerpo, se utilizan como compuestos farmacologicamente activos (denominados en lo sucesivo "compuestos terapeuticos").

Un anticuerpo espedfico para los epftopos Y y Y de fibrina puede utilizarse para aislar el polipeptido de fibrina mediante tecnicas estandar, tales como inmunoafinidad, cromatograffa o inmunoprecipitacion. La deteccion sistematica puede facilitarse por acoplamiento (es decir, uniendo ffsicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables comprenden diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas comprenden peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, o

acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prosteticos adecuados comprenden estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados comprenden umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes comprenden

J 1 J J 1 125 131 35 1 3

luciferasa, luciferina, y aequorina, y ejemplos de materiales radiactivos adecuados comprenden I, I, S o H.

Un anticuerpo segun la invencion puede utilizarse como un agente para detectar la presencia de epftopo de y377-395 de fibrina en una muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene un marcador detectable. Los anticuerpos son policlonales, o mas preferiblemente, monoclonales. Se utiliza un anticuerpo intacto, o uno de sus fragmentos (p. ej., Fab, scFv o F(ab)2). El termino "marcado", con respecto a la sonda o al anticuerpo, pretende abarcar el marcaje directo de la sonda o el anticuerpo acoplando (es decir, uniendo ffsicamente) una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, asf como el marcaje indirecto de la sonda o del anticuerpo por reactividad con otro reactivo que esta directamente marcado. Ejemplos de marcaje indirecto incluyen la deteccion sistematica de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y marcaje del extremo de una sonda de ADN con biotina de manera que puede detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. En la expresion "muestra biologica" se pretende incluir tejidos, celulas y ftquidos biologicos aislados de un sujeto, asf como tejidos, celulas y ftquidos presentes dentro de un sujeto. Incluido dentro del empleo de la expresion "muestra biologica", por lo tanto, esta la sangre y una fraccion o componente de la sangre, incluidos suero sangumeo, plasma sangumeo o la linfa. Es decir, el metodo de deteccion sistematica descrito en la presente memoria se puede utilizar para detectar un ARNm, protema o ADN genomico del analito en una muestra biologica in vitro asf como in vivo. Por ejemplo, las tecnicas in vitro para la deteccion sistematica de un ARNm del analito incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las tecnicas in vitro para la deteccion sistematica de un protema del analito incluyen ensayos por inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las tecnicas in vitro para la deteccion sistematica de un ADN genomico del analito incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos para la realizacion de inmunoanalisis se describen, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology', vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, N. J., 1995; "Immunoassay', E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985 . Ademas, las tecnicas in vivo para la deteccion sistematica de una protema del analito incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo proteico anti-analito marcado. El anticuerpo puede marcarse, por ejemplo, con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicacion en un sujeto puede detectarse mediante tecnicas de diagnostico por la imagen ffpicas.

Metodos de deteccion sistematica de inhibidores

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se describen en la presente memoria metodos (tambien denominados en la presente memoria "ensayos de deteccion sistematica") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes experimentales o de ensayo (p. ej., peptidos, peptidomimeticos, moleculas pequenas u otros farmacos) que modulan o si no interfieren con el enlace de la fibrina y Mac-1, o compuestos o agentes experimentales o de ensayo que modulan o si no interfieren con la funcion de senalizacion de la fibrina, Mac-1 y/o el complejo fibrina/Mac-1. Se describen ademas compuestos identificados en los ensayos de deteccion sistematica descritos en la presente memoria.

Se describen ademas los ensayos para la identificacion sistematica de compuestos experimentales o de ensayo que modulan la funcion de senalizacion del complejo fibrina/Mac-1 y/o la interaccion entre la fibrina y Mac-1. Los compuestos de ensayo descritos en la presente memoria pueden obtenerse empleando cualquiera de los numerosos enfoques en los metodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la tecnica, incluidos: bibliotecas biologicas; bibliotecas en fase de solucion o en fase solida paralelas espacialmente dirigibles; metodos de bibliotecas sinteticas que requieren desconvolucion; el metodo de biblioteca "una perla un compuesto"; y metodos de bibliotecas sinteticas que utilizan seleccion por cromatograffa de afinidad. El enfoque de la biblioteca biologica esta limitado a bibliotecas de peptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos peptfdicos, oligomeros no peptfdicos o de pequenas moleculas. (Vease, p. ej., Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145).

Una "molecula pequena", como se emplea en esta memoria, se entiende que se refiere a una composicion que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y aun mas preferiblemente menos de aproximadamente 4 kD. Las moleculas pequenas pueden ser, p. ej., acidos nucleicos, peptidos, polipeptidos, peptidomimeticos, carbohidratos, lfpidos u otras moleculas organicas o inorganicas. Bibliotecas de mezclas qmmicas y/o biologicas, tales como extractos de hongos, bacterias o algas, se conocen en la tecnica y se pueden detectar con cualquiera de los analisis descritos en la presente memoria.

En la tecnica pueden encontrarse ejemplos de metodos para la smtesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo en: DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678;. Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233 .

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solucion (vease p. ej., Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (vease Lam, 1991. Nature 354: 82-84), en chips (vease Fodor, 1993. Nature 364: 555-556), bacterias (vease la patente de EE.UU. n° 5.223.409), esporas (vease la patente de EE.UU. n° 5.233.409), plasmidos (vease Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 1865-1869) o en fagos (vease Scott y Smith, 1990. Science 249:386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404- 406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:63786382; Felici, 1991. J. Mol Biol. 222: 301-310; y patente de EE.UU. n° 5.233.409).

En la presente memoria se describe que un compuesto experimental se introduce en un complejo anticuerpo- antfgeno y que determina si el compuesto experimental altera el complejo anticuerpo-antfgeno, en donde una ruptura de este complejo indica que el compuesto experimental modula la funcion de senalizacion del complejo fibrina/Mac-1 y/o la interaccion entre la fibrina y Mac-1. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 5B8 y el complejo antigeno-fibrinogeno. Alternativamente, el anticuerpo monoclonal es 1E3 y el antfgeno es el fibrinogeno.

Ademas se describe que se proporciona un complejo fibrina/Mac-1 y se expone al menos un anticuerpo monoclonal neutralizante. Se detecta la formacion de un complejo anticuerpo-antfgeno, y se introducen en el complejo uno o mas compuestos experimentales. Si el complejo anticuerpo-antfgeno se rompe despues de la introduccion de los uno o mas compuestos experimentales, los compuestos experimentales son utiles para tratar trastornos asociados con el enlace fibrina/Mac-1.

Ademas se describe que una protema quimerica soluble descrita en la presente memoria se proporciona y se expone al menos a un anticuerpo monoclonal neutralizante. Se detecta la formacion de un complejo anticuerpo- antfgeno, y uno o mas compuestos experimentales se introducen en el complejo. Si el complejo anticuerpo-antfgeno se rompe despues de la introduccion de uno o mas compuestos experimentales, los compuestos experimentales son utiles para tratar trastornos relacionados con el enlace fibrina/Mac-1.

La determinacion de la capacidad del compuesto de ensayo para interferir con o romper el complejo anticuerpo- antfgeno se puede lleva a cabo, por ejemplo, acoplando del compuesto de ensayo con un radioisotopo o marcador enzimatico de tal forma que la union del compuesto de ensayo con el antfgeno o una de sus partes biologicamente activa puede determinarse detectando el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos de ensayo pueden marcarse con 1251,35S, 14C, o 3H, ya sea directa o indirectamente, y el radioisotopo puede detectarse por recuento directo de radioemision o por recuento de centelleo. Alternativamente, los compuestos de ensayo pueden marcarse enzimaticamente, por ejemplo con, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y el marcador enzimatico detectarse por determinacion de la conversion de un sustrato apropiado en producto.

En la presente memoria se da a conocer que el ensayo comprende poner en contacto un complejo anticuerpo- antfgeno con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

el antigeno o si no alterar el complejo anticuerpo-antigeno existente. En esta descripcion, la determinacion de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con el antigeno y/o alterar el complejo anticuerpo-antigeno comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente al antigeno o a una de sus partes biologicamente activas, en comparacion con el anticuerpo.

Se describe ademas que el ensayo comprende poner en contacto un complejo anticuerpo-antigeno con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular el complejo anticuerpo- antigeno. La determinacion de la capacidad del compuesto de ensayo para modular el complejo antfgeno-anticuerpo se puede realizar, por ejemplo, determinando la capacidad del antigeno para unirse o interactuar con el anticuerpo en presencia del compuesto de ensayo.

Los expertos en la tecnica reconoceran que, en cualquiera de los metodos de deteccion sistematica descritos en la presente memoria, el anticuerpo puede ser un anticuerpo neutralizante, tal como un anticuerpo monoclonal 5B8 y/o 1E3, cada uno de los cuales modula o si no interfiere con el enlace fibrina/Mac-1.

Puede ser deseable inmovilizar el anticuerpo o el antigeno para facilitar la separacion de formas complejadas de las no complejadas de una o ambas despues de la introduccion del compuesto experimental, asf como acomodar la automatizacion del ensayo. La observacion del complejo antigeno-anticuerpo, en presencia y ausencia de un compuesto experimental, puede realizarse en cualquier recipiente adecuado que contenga los reactivos. Ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microvaloracion, tubos de ensayo y tubos de microcentnfugadora. Puede proporcionarse una protema de fusion que anade un dominio que permite a una o ambas de las protemas que se unan a una matriz. Por ejemplo, las protemas de fusion GST-anticuerpo o las protemas de fusion GST-antigeno pueden adsorber en perlas de glutation sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de microvaloracion modificadas con glutation, que luego se combinan con el compuesto de ensayo, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formacion de complejos (p. ej., en condiciones fisiologicas de sal y pH). Despues de la incubacion, las perlas o los pocillos de la placa de microvaloracion se lavan para eliminar cualquier componente no unido, la matriz se inmoviliza en el caso de perlas, el complejo se determina directa o indirectamente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, y el nivel de la formacion de complejos anticuerpo-antigeno se pueden determinar usando tecnicas estandar.

Tambien se pueden utilizar otras tecnicas para inmovilizar protemas sobre matrices en los ensayos de seleccion descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el anticuerpo (p. ej. 5B8 y/o 1E3) o el antfgeno (p. ej. fibrina) pueden inmovilizarse utilizando la conjugacion de biotina y estreptavidina. Moleculas biotiniladas de anticuerpo o antigeno se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando tecnicas bien conocidas en la tecnica (p. ej. , kit de biotinilacion, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o el antfgeno de interes, pero que no interfieren con la formacion del complejo anticuerpo-antfgeno de interes, pueden modificarse en los pocillos de la placa, y el anticuerpo o antfgeno no unido atrapados en los pocillos por conjugacion de anticuerpos. Los metodos para detectar dichos complejos, ademas de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodeteccion de complejos usando dichos otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o antfgeno.

Ademas en la presente memoria se describen nuevos agentes identificados por cualquiera de los ensayos de deteccion sistematica mencionados anteriormente y sus usos para los tratamientos como los descritos en la presente memoria.

Ensayos de diagnostico

Los anticuerpos de la presente invencion pueden detectarse mediante analisis apropiados, p. ej., tipos convencionales de inmunoanalisis, p. ej., puede realizarse un ensayo sandwich en donde el fibrinogeno completo, fibrina o uno de sus fragmentos esta fijado a una fase solida. La incubacion se mantiene durante un penodo de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo en la muestra se una al polipeptido inmovilizado sobre la fase solida. Despues de esta primera incubacion, la fase solida se separa de la muestra. La fase solida se lava para eliminar los materiales no unidos y substancias que interfieren, tales como protemas no espedficas que tambien pueden estar presentes en la muestra. La fase solida que contiene el anticuerpo de interes (p. ej., anticuerpo monoclonal 5B8 y/o 1E3) unido al polipeptido inmovilizado se incuba posteriormente con un segundo, anticuerpo marcado o anticuerpo unido a un agente de acoplamiento tal como biotina o avidina. Este segundo anticuerpo puede ser otro anticuerpo anti-fibrina. Los marcadores de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica e incluyen radionuclidos, enzimas (p. ej. maleato deshidrogenasa, peroxidasa de rabano picante, glucosa oxidasa, catalasa), compuestos fluorescentes (isotiocianato de fluorescema, rodamina, ficocianina, fluorescarmina), biotina y similares. Se incuban con el solido los anticuerpos marcados y se mide el marcador unido a la fase solida. Cualquier experto en la tecnica puede realizar facilmente estos y otros inmunoanalisis.

Un metodo ejemplar para detectar la presencia o ausencia de una protema de fibrina en una muestra biologica implica obtener una muestra biologica de un sujeto de la prueba y poner en contacto la muestra biologica con un

anticuerpo monoclonal marcado segun la invencion de modo que se detecta la presencia de fibrina en la muestra biologica.

Como se emplea en esta memoria, el termino "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el marcaje directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento (es decir, enlazando ffsicamente) una sustancia 5 detectable a la sonda o anticuerpo, asf como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que esta marcado directamente. Ejemplos de marcaje indirecto incluyen la deteccion sistematica de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y marcado en el extremo de una sonda de ADN con biotina de manera que puede detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. La expresion "muestra biologica" se pretende que incluya tejidos, celulas y fluidos biologicos aislados de un sujeto, asf 10 como tejidos, celulas y fluidos presentes en un sujeto. Es decir, el metodo de deteccion sistematica descrito en la presente memoria se pueden usar para detectar fibrina en una muestra biologica in vitro asf como in vivo. Por ejemplo, las tecnicas in vitro para la deteccion sistematica de fibrina incluyen ensayos por inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Ademas, las tecnicas in vivo para la deteccion sistematica de fibrina incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo anti-fibrina marcado. Por 15 ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localizacion en un sujeto puede detectarse mediante tecnicas de diagnostico por la imagen tfpicas.

En la presente memoria se describe que la muestra biologica contiene moleculas de protema del sujeto de ensayo. Una muestra biologica preferida es una muestra de leucocitos de la sangre periferica aislada por medios convencionales de un sujeto.

20 Equipos

La invencion tambien comprende equipos para detectar la presencia de fibrina en una muestra biologica. El equipo comprende un anticuerpo de la invencion e instrucciones para usar el equipo para detectar fibrina en una muestra. Por ejemplo, el equipo puede comprender: un compuesto o agente marcado capaz de detectar fibrina en una muestra biologica; medios para determinar la cantidad de fibrina en la muestra; y medios para comparar la 25 cantidad de fibrina en la muestra con un patron. El compuesto o agente puede envasarse en un recipiente adecuado.

La invencion se describe ademas en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Aspectos de lo dado a conocer en esta memoria se pueden entender mejor a la luz de los siguientes ejemplos, que 30 no deben interpretarse restrictivos del alcance de lo dado a conocer en esta memoria en modo alguno.

Ejemplo 1 -Generacion de anticuerpos monoclonales

Se sintetizaron secuencias peptfdicas correspondientes a los aminoacidos exactos en la cadena y de fibrinogeno que se han demostrado ser cruciales para la interaccion de fibrinogeno con Mac-1 (peptido n° 1: CGWTVLQKRIDGSL (SEQ. ID. n° 17) y peptido n° 2: CKKTTMKIIPFNRLTIG (SEQ. ID. n° 18)). Estos dos peptidos 35 se sintetizaron con los correspondientes restos de cistema del terminal N para permitir la conjugacion a la protema portadora hemocianina de lapa californiana (KLH), que estimula una fuerte respuesta de anticuerpos in vivo. Ambos peptidos se utilizaron para inmunizar a tres ratones que generan una respuesta de anticuerpos en estos ratones. La deteccion sistematica preliminar de suero puso de manifiesto un fuerte valor de anticuerpos contra estos peptidos y condujo a la generacion posterior de hibridomas que producen anticuerpos clonales contra estas dos secuencias 40 peptfdicas. La deteccion sistematica inicial de 480 clones de hibridoma se realizo por ELISA contra ambos peptidos, asf como la protema portadora. Los clones positivos se expandieron y se volvieron a ensayar para confirmar la reactividad del epftopo del peptido por ELISA. Los resultados finales de esta deteccion sistematica inicial dio lugar a 46 clones que eran espedficos para el peptido n° 1 o el n° 2. En un analisis en profundidad de estos resultados del ELISA se identificaron 16 dianas experimentales para un examen mas detenido. En estos 16 clones se identifico su 45 capacidad para bloquear la adhesion microglial mediante el receptor Mac-1 sobre el fibrinogeno completo. Se recubrieron pocillos de cultivo hftstico con 50 pg/ml de fibrinogeno tras lo cual los microgliocitos (200.000 celulas/ml) se colocaron en placas en presencia de estos clones de anticuerpos. Los pocillos se lavaron despues de 30 minutos y las celulas adherentes restantes se tineron con cristal violeta al 0,1%. Las celulas tenidas se fijaron con PFA al 1% y se disolvieron con Triton X-100 al 0,5%. Cinco de estos clones presentaban una capacidad significativa, similar a la 50 de un anticuerpo bloqueante contra Mac-1 (M1/70) disponible en el mercado, para evitar la adhesion microglial al fibrinogeno tal como se evaluo mediante mediciones de absorbancia a 595 nm (Figura 1; que tiene una inhibicion superior al 20% medida por el cambio en la absorbancia). Se contempla que los anticuerpos de la invencion puedan evitar la adhesion microglial al fibrinogeno a valores mayores de 30%, 40% o 50%. Los clones 1A5, 1D6 y 1E3 reconocen el epftopo del peptido n° 1 mientras que los clones 4E11 y 5B8 reconocen el epftopo del peptido n° 55 2. Estos cinco clones se continuo analizando su capacidad para reconocer fibrinogeno por inmunotransferencia. Los

cinco anticuerpos reconocieron la cadena y de fibrinogeno en un grado similar. Para examinar si estos anticuerpos reconodan el fibrinogeno en funcion de la dosis se realizo un ELISA sobre fibrinogeno completo recubierto (Figura 2). Se descubrio que los cinco anticuerpos se unen espedficamente aumentando las concentraciones de fibrinogeno

completo. De estos cinco anticuerpos se seleccionaron tres (1E3, 4E11 y 5B8, que tienen una inhibicion mayor del 50% de Mac-1 de union al dominio yC de fibrina o fibrinogeno cuando se mide mediante el cambio en la absorbancia) para aislamiento y purificacion a gran escala. Se contempla que los anticuerpos de la invencion pueden inhibir la union de Mac-1 a la fibrina en mas del 50%, 60% o 70%. Inicialmente, 20 mg de los tres 5 anticuerpos se purificaron para su empleo en ensayos de fagocitosis in vitro y en experimentos de EAE.

Ejemplo 2 - Los anticuerpos monoclonales contra la cadena y de fibrinogeno inhiben la fagocitosis por microrglia

La fagocitosis es una funcion importante de la microglia y los macrofagos activados con la mediacion de Mac-1. Se llevaron a cabo ensayos de fagocitosis en microglia segun se describio anteriormente. Vease, Adams et al., 2007, J. Exp. Med. 204:571-582, incorporada en la presente memoria por referencia en su totalidad. El peptido y377-395 10 derivado de fibrina inhibe la activacion de la microglia y suprime la paralisis recurrente en la enfermedad autoinmunitaria del sistema nervioso central. El anticuerpo monoclonal 5B8 el contra el epftopo de y377-395 de fibrina modificado presentaba una eficacia superior en la inhibicion de la fagocitosis in vitro. Este anticuerpo en estudios in vivo presenta una administracion profilactica y terapeutica en modelos animales para EM como se ha descrito anteriormente para el peptido y377-3 5

15 Ejemplo 3 - El anticuerpo monoclonal 5B8 suprime la incidencia de recafdas en un modelo animal de recafdas remitente de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental

Para evaluar los efectos de los anticuerpos de fibrina en la regulacion de la activacion de la microglia y la desmielinizacion in vivo, se administraron a ratones dos de los clones identificados en el ensayo de fagocitosis despues del desarrollo de PLP EAE. Se administraron anticuerpos 5B8 y 4E11 tres veces a la semana a razon de 20 250 |jg por raton. Como se muestra en la figura 4, el anticuerpo 4E11 no tuvo un efecto sustancial en el desarrollo de

EAE. Por el contrario, el anticuerpo 5B8 presento una supresion de los smtomas clmicos en el momento de la recafda.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La presente descripcion tambien se refiere a los siguientes puntos:

Punto 1. Un anticuerpo aislado que se une un dominio yC de fibrina o fibrinogeno, en donde el anticuerpo presenta mas del 20% de inhibicion de la adhesion microglial al dominio yC de fibrina o fibrinogeno.

Punto 2. Un anticuerpo aislado que se une al dominio yC de fibrina o fibrinogeno, en donde el anticuerpo presenta mas del 50% de inhibicion de la union de Mac-1 al dominio yC de fibrina o fibrinogeno.

Punto 3. Un anticuerpo aislado que se une al dominio yC de fibrina o fibrinogeno, en donde el anticuerpo suprime los smtomas clmicos de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en el momento de la recafda.

Punto 4. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 3, donde el anticuerpo se une a un epftopo de y377"395 del dominio yC de fibrina o fibrinogeno.

Punto 5. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 3, donde el anticuerpo se une a un epftopo de y190"202 del dominio yC de fibrina o fibrinogeno.

Punto 6. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

Punto 7. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

Punto 8. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.

Punto 9. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera con

tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ ID n° 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4).

Punto 10. El anticuerpo de los puntos 1 a 8, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8).

Punto 11. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ ID n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8).

Punto 12. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 11, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos variable de la cadena ligera de SEQ. ID. n° 1.

Punto 13. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 11, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos variable de la cadena pesada de la SEQ. ID. n° 5.

Punto 14. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 11, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos variable de la cadena ligera de la SEQ. ID. n° 1 y una secuencia de aminoacidos variable de la cadena pesada de la SEQ. ID. n° 5.

Punto 15. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); y en donde los dominios de complementariedad de la cadena ligera y los dominios de complementariedad de la cadena pesada conservan capacidad de union de Mac-1.

Punto 16. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tienen al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionado del grupo que consiste en GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7), y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); y

en donde los dominios de la complementariedad de la cadena ligera y los dominios de la complementariedad de la cadena pesada conservan capacidad de union de Mac-1.

Punto 17. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una cadena ligera con tres regiones determinates de la complementariedad que comprenden una secuencia de 5 aminoacidos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); y 10 en donde los dominios de complementariedad de la cadena ligera y dominios de complementariedad de la cadena pesada conservan capacidad de union de Mac-1.

Punto 18. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una cadena ligera con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tienen al menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionadas del grupo que 15 consiste en RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3), y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una cadena pesada con tres regiones determinantes de la complementariedad que comprenden una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias seleccionado del grupo que consiste en GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8); y en donde los dominios de complementariedad de la cadena ligera y dominios de complementariedad de la cadena 20 pesada conservan capacidad de union de Mac-1.

Punto 19. Un metodo para aliviar un smtoma de una patologfa relacionada con el enlace de Mac-1 a la fibrina o el enlace de Mac-1 al fibrinogeno, comprendiendo el metodo administrar el anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 18 a un sujeto en el que se desea dicho alivio de en una cantidad suficiente para aliviar el smtoma de la patologfa en el sujeto.

25 Punto 20. El procedimiento del punto 19, en donde el sujeto es un humano.

Punto 21. El procedimiento del punto 19, en donde dicha patologfa se selecciona del grupo que consiste en esclerosis multiple, lesion de la medula espinal, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, artritis reumatoide y cancer.

Punto 22. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 18 y un 30 vehmulo farmaceuticamente aceptable.

Punto 23. Un equipo que comprende el anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 18.

Punto 24. Un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un epftopo de y377-395 de fibrina, CKKTTMKIIPFNRLTIG (SEQ. ID. n° 18) o uno de sus derivados biologicamente activos.

Punto 25. Una celula que comprende el vector del punto 24.

35 Punto 26. Un metodo de generacion de un anticuerpo que se une inmunoespedficamente a un epftopo de y377-395 de fibrina, o a uno de sus derivados biologicamente activo, comprendiendo el procedimiento: administrar a un sujeto una primera dosis de la celula del punto 23, en donde la primera dosificacion es suficiente para generar una respuesta inmunitaria en dicho sujeto.

Punto 27. El procedimiento del punto 26, que comprende ademas la etapa de administracion a dicho paciente de 40 una segunda dosis de dicha celula, en donde dicha segunda dosis es suficiente para generar una respuesta inmunitaria en dicho sujeto.

Punto 28. El metodo de cualquiera de los puntos 26 a 27, en donde el anticuerpo producido inhibe el enlace fibrina/Mac-1 en dicho sujeto.

Punto 29. Un procedimiento de deteccion sistematica de un ligando que se une a un receptor Mac-1 y modula la 45 actividad del receptor Mac-1, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar el anticuerpo del punto 1; (b) poner en contacto un epftopo de y37 -395 de fibrina CKKTTMKIIpFnRLtIg (SEQ. ID. n° 18), o uno de sus derivados biologicamente activos, y formar un complejo anticuerpo/polipeptido; (c) poner en contacto el complejo anticuerpo/polipeptido con una composicion que comprende un compuesto experimental; y (d) determinar si el compuesto experimental se une al anticuerpo monoclonal; con lo que, la union del compuesto experimental indica 50 que dicho compuesto experimental es un ligando que modula la actividad del receptor Mac-1.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo aislado que se une a un epftopo de y377'395 del dominio yC de fibrina o fibrinogeno, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con las secuencias GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7), y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8), en donde el anticuerpo tiene capacidad para inhibir el enlace Mac-1 a fibrina o fibrinogeno, y en donde el anticuerpo suprime los smtomas clmicos de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en el momento de la recafda.
2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, donde el anticuerpo inhibe el enlace de Mac-1 al dominio yC de fibrina o fibrinogeno.
3. 3. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo presenta mas del 20% de inhibicion de adhesion de la microglia al dominio yC de fibrina o fibrinogeno.
4. 4. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo presenta mas del 50% de inhibicion del enlace de Mac-1 al dominio yC de fibrina o fibrinogeno.
5. 5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
6. 6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo comprende una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos de RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) o/y una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8).
7. 7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos SEQ. ID. n° 1 variable de la cadena ligera y/o una secuencia de aminoacidos SEQ. ID. n° 5 variable de la cadena pesada.
8. 8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una region variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos RSSKSLLHSSGITYLS (SEQ. ID. n° 2), QMSNLAS (SEQ. ID. n° 3) y AQNLELPLT (SEQ. ID. n° 4) y una region variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos GYTFTSYWIH (SEQ. ID. n° 6), LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ. ID. n° 7) y SDPTGC (SEQ. ID. n° 8).
9. 9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho anticuerpo comprende, en cada caso, una secuencia de aminoacidos SEQ. ID. n° 1 variable de la cadena ligera.
10. 10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su empleo en el tratamiento de una patologfa relacionada con el enlace de Mac-1 a la fibrina o el enlace de Mac-1 al fibrinogeno, en donde dicha patologfa se selecciona del grupo que consiste en esclerosis multiple, cicatrizacion de heridas, isquemia pulmonar, lesion de la medula espinal, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, artritis reumatoide y cancer.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
12. 12. Un equipo que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, e instrucciones para usar el equipo para detectar fibrina en una muestra.