BRPI0713086A2

BRPI0713086A2 - diagnóstico e tratamento de cáncer usando anticorpo anti-desmogleìna-3

Info

Publication number: BRPI0713086A2
Application number: BRPI0713086-4A
Authority: BR
Inventors: Hiroyuki Aburatani; Shunpei Ishikawa; Hirotaka Ito; Kiyotaka Nakano; Shigeto Kawai
Original assignee: Forerunner Pharma Res Co Ltd; Univ Tokyo
Priority date: 2006-08-14
Filing date: 2007-08-14
Publication date: 2012-10-09
Also published as: JP2016185981A; US20170152314A1; EP3111955A1; AU2007285217B2; EP2548576B1; EP2050466B1; EP3111955B1; US10696743B2; JP5972325B2; WO2008020586A1; JP5317697B2; JPWO2008020586A1; US20100092457A1; JP6162864B2; EP2050466A1; CA2658050A1; AU2007285217A1; JP2015003912A; EP2050466A4; JP2013189433A

Abstract

DIAGNóSTICO E TRATAMENTO DE CáNCER USANDO ANTICORPO ANTI-DESMOGLEìNA-3. A presente invenção refere-se a métodos que envolvem detecção de uma proteína DSG3 para o diagnóstico de câncer. Em câncer de pulmão, descobriu-se que a expressão de DSG3 estava intensificada em uma frequência muito alta a nível de gene e a nível de proteína. Os métodos da presente invenção podem ser realizados usando um anticorpo que reconhece uma proteína DSG3. Composições farmacêuticas, inibidores de crescimento celular e agentes anticâncer contendo um anticorpo de ligação à DSG3 como um ingrediente ativo são também descritos. Métodos de indução de dano celular em células expressando DSG3 e métodos de supressão de proliferação de células expressando DSG3 através de contato das células expressando DSG3 com anticorpos que se ligam à DSG3 são também descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DIAGNÓSTI- CO E TRATAMENTO DE CÂNCER USANDO ANTICORPO ANTI- DESMOGLEÍNA-3".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a métodos para diagnóstico e trata- mento de câncer, inibidores de proliferação celular e agentes anticâncer. Técnica Antecedentes

A desmogleína 3 (aqui depois referida como DSG3) foi primeiro identificada como uma glicoproteína tendo um peso molecular de 130 kDa através de imunoprecipitação de extratos de queratinócito com um autoanti- corpo obtido do soro de pacientes afetados por pemphigus vulgaris (aqui depois referido como PV), o qual é uma doença autoimune de formação de bolhas da pele e mucosa e foi denominado o antígeno ao PV (aqui depois referido como PVA) (Documento de Não-Patente 1 e J. Clin. Invest, 74, 313- .320, 1984). Então, moléculas de anticorpo que reagem com a proteína de .130 kDa mencionada acima foram isoladas do soro de pacientes com PV através de purificação por afinidade. Em seguida, uma biblioteca de expres- são foi construída usando RNA poli(A) isolado de queratinócitos humanos e foi selecionado usando os anticorpos isolados e um cDNA que codifica PVA foi isolado. Baseado em análise da seqüência de nucleotídeo do cDNA iso- lado, descobriu-se que a molécula de PVA é altamente homóloga às se- qüências de um grupo de moléculas pertencendo à superfamília do gene de caderina, o qual codifica fatores de adesão intercelular (Documento de Não- Patente 2).

Moléculas de caderina são expressas em uma ampla variedade de tecidos e elas estão envolvidas em adesão celular in vivo. Dentro do gru- po da caderina, um grupo de moléculas é expresso em desmossomas, os quais são sítios de adesão entre as células sobre a membrana celular e são denominadas caderinas desmossômicas ou desmogleínas. Queratinócitos, os quais são usados para isolamento e clonagem da molécula de DSG3 (um membro da família de desmogleína), são células que ocupam uma grande porção da epiderme. Eles são hermeticamente aderidos às células adjacen- tes via os desmossomas e a molécula de DSG3 é considerada como estan- do envolvida nessa adesão. Acredita-se que autoanticorpos anti-DSG3 pre- sentes no soro de pacientes com PV causam lesões do PV através de liga- ção à molécula de DSG3 e inibição da adesão celular mediada pela molécu- Ia de DSG3.

Conforme descrito acima, lesões em PV são induzidas pelos au- toanticorpos anti-DSG3 policlonais presentes no soro de pacientes com PV. Anticorpos anti-DSG3 monoclonais que têm a capacidade de induzir à le- sões similares ao PV quando de transplante de hibridomas em camundon- gos também foram isolados (Documento de Não-Patente 3) e foi mostrado que eles têm uma atividade de dissociação celular que inibe a adesão celu- lar de queratinócitos no tubo de ensaio também (Documento de Não-Patente .4). Conforme descrito acima, a atividade de dissociação celular de anticor- pos anti-DSG3 observada no tubo de ensaio foi sugerida como sendo a ati- vidade que induz à lesões em PV in vivo.

Conforme descrito acima, sabe-se que a proteína DSG3 tem uma função importante na adesão de queratinócito e que anticorpos anti- DSG3 estão envolvidos no desenvolvimento de lesões em PV. Contudo, o envolvimento da proteína DSG3 em outras doenças ou outras funções de anticorpos anti-DSG3 que não a atividade de dissociação celular não foi es- clarecido. Em particular, a relação da molécula de DSG3 com o desenvolvi- mento de câncer, especialmente câncer de pulmão e proliferação, invasão, metástase ou transformação de células de câncer de pulmão em mamíferos, em particular seres humanos, não foi esclarecida. Dos vários tipos de cânceres, o câncer de pulmão tem a maior taxa de mortalidade em homens e mulheres. A taxa de mortalidade do cân- cer de pulmão no Japão vem aumentando após 1950; como um resultado, o número de mortes por câncer de pulmão em 1998 foi de 50.871 indivíduos, o que era aproximadamente 18% de todas as mortes por tumor maligno e, a- pós 1993, o número de mortes excedeu aquele do câncer de estômago e é classificado como um número um entre tumores malignos para homens (He- alth and Welfare Statistics Association, Kokumin eisei no doko/kousei no shihyou (Trends of national health/indicators of welfare), 47, 52-53, 2000). Além disso, em uma escala global, aproximadamente 3.000.000 pessoas por ano estão morrendo de câncer de pulmão. Tipos histológicos básicos de câncer de pulmão incluem adenocarcinoma, carcinoma de células escamo- sas, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células grandes e carcinoma de células pequenas. Uma vez que os quatro primeiros não mostram gran- des diferenças no prognóstico ou estratégia terapêutica, eles são coletiva- mente referidos como câncer de pulmão de células não-pequenas.

O número de casos de câncer de pulmão de células não- pequenas som a 80% a 85% do número total de casos de câncer de pulmão. Exemplos das características do câncer de pulmão de células não-pequenas são progressão lenta comparado com cânceres de células pequenas e res- posta insuficiente à quimioterapia e terapia de radiação. Portanto, quando o tumor é localizado, ressecção cirúrgica é a escolha número um, mas os re- sultados do tratamento são muito pobres comparado com outros carcino- mas, tal como câncer de estômago, no mesmo estágio da doença através da classificação TNM. Embora tentativas recentes tenham sido feitas para me- lhorar os resultados através de tratamento multimodal, métodos terapêuticos eficazes que levam a uma remissão completa não foram estabelecidos. Em câncer de pulmão de células não-pequenas, terapia cirúrgica é considerada até o estágio llla, enquanto que em estágios subsequentes da doença clíni- ca, cirurgia raramente é aplicada e quimioterapia e terapia de radiação são as principais terapias. SCC (antígeno relacionado ao carcinoma de células escamosas), Cyfra (fragmento de citoqueratina 19), CEA (antígeno carcino- embriônico) e SLX (antígeno x-i de sialila de Lewis) são selecionados como marcadores para sorodiagnóstico e eles são usados separadamente ou em combinação, mas a taxa positiva para cânceres em estágio precoce ainda é baixa e o desenvolvimento de marcadores diagnósticos que assegurarão diagnóstico em estágio precoce de câncer de pulmão de células não- pequenas através de sorodiagnóstico é necessário (Shuyo maka no yomika- ta no jissai; haigan (Practical method for reading tumor markers; Iung câncer) Rinsho to Kenkyu (Clinic and Research) 78, 35-40, 2001). Tumores de câncer de pulmão de células pequenas constituem aproximadamente 15% a 20% de todos os cânceres de pulmão no Japão e sua velocidade de proliferação é rápida comparado com outros cânceres de pulmão, mas eles são altamente sensíveis aos agentes anticâncer e terapia de radiação e têm características clínicas significativamente diferentes da- quelas do adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e similares. Para câncer de células pequenas, terapia cirúr- gica é considerada apenas no estágio Ia (o diâmetro do tumor é de 20 mm ou menos e nenhuma invasão ou metástase para nódulos linfáticos e órgãos vizinhos é mostrada) e quimioterapia e terapia de radiação são basicamente os principais métodos terapêuticos empregados. Como marcadores diagnós- ticos, NSE (enolase neurônio-específica) e proGRP (peptídeo de liberação de pró-gastrina) são usados como marcadores de tumor, com especificidade relativamente alta por câncer de células pequenas e suas taxas positivas são reportadas como sendo de aproximadamente 60% e 70%, respectiva- mente.

Embora não existam exemplos de aplicação na prática clínica para cânceres de pulmão, a taxa de resposta terapêutica em câncer de ma- ma, Iinfoma e similares está aumentando, porque terapia objetivada usando anticorpos monoclonais contra antígenos de tumor câncer-específicos exi- bem um modo de ação diferente da terapia convencional, a qual usa agentes quimioterapêuticos. Em terapia objetivada que usa os produtos farmacêuti- cos de anticorpo acima mencionados, quando os anticorpos são funcionais e eficazes, suas atividades incluem: citotoxicidade célula-mediada anticorpo- dependente (ADCC) via células efetuadoras; atividade de citotoxicidade complemento-dependente (CDC) via complementos; e atividade citotóxica como um resultado de construção de moléculas conjugadas com agentes quimioterapêuticos, peptídeos tóxicos ou substâncias químicas radioativas. Atividades adicionais além daquelas mencionadas acima incluem, por e- xemplo, atividade agonística na qual o anticorpo em si catalisa um efeito a- gonístico sobre a molécula antigênica; e atividade de neutralização que blo- queia sinais para ativação, proliferação celular ou similar. De forma a aplicar terapia de objetivação molecular que usa anticorpos exibindo atividades tais como aquelas mencionadas acima no tratamento de câncer de pulmão, a qual tem baixa taxa positiva de diagnóstico, baixa taxa de cura da doença e ainda tem espaço para remissão completa, a identificação de moléculas tu- mor-específicas expressas em células de câncer de pulmão e a produção de anticorpos que exibem atividade desejável através de objetivação de tais moléculas são fortemente necessários.

Informação de literatura da técnica anterior referente à presente invenção é a seguinte:

[Documento de Patente 1] WO 99/57149.

[Documento de Patente 2] WO 02/86443.

[Documento de Patente 3] WO 03/20769.

[Documento de Não-Patente 1] J. Clin. Invest. 70, 281-288, 1982.

[Documento de Não-Patente 2] Cell 67, 869-877, 1991.

[Documento de Não-Patente 3] J. Immunology 170, 2170-2178, 2003.

[Documento de Não-Patente 4] J. Invest. Dermatol., 124, 939-946,

.2005.

Descrição da Invenção

Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção

Um objetivo da presente invenção é proporcionar anticorpos an- ti-DSG3 e usos dos mesmos. Mais especificamente, um objetivo da presente invenção é proporcionar novos métodos para diagnóstico e tratamento de câncer usando anticorpos anti-DSG3, novos inibidores de proliferação celu- lar e agentes anticâncer compreendendo anticorpos anti-DSG3 e novos anti- corpos anti-DSG3. Meios para Resolver os Problemas

Os presentes inventores descobriram que DSG3 é altamente expressa em células cancerígenas, tais como células de câncer de pulmão. Além disso, quando atividade de citotoxicidade complemento-dependente (CDC) e atividade de citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) de anticorpos anti-DSG3 foram medidas, descobriu-se que os anticorpos anti- DSG3 têm atividade de CDC e atividade de ADCC em células expressando DSG3. Além disso, a partir das descobertas acima mencionadas, os presen- tes inventores descobriram que os anticorpos anti-DSG3 são eficazes para o diagnóstico, prevenção e tratamento de cânceres nos quais a expressão de DSG3 está elevada, incluindo câncer de pulmão e, desse modo, completa-

ram a presente invenção.

A presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo de ligação à proteína DSG3 como um ingredi- ente ativo. A presente invenção também proporciona inibidores de prolifera- ção celular compreendendo um anticorpo de ligação à proteína DSG3 como um ingrediente ativo. A presente invenção ainda proporciona agentes anti- câncer compreendendo um anticorpo de ligação à proteína DSG3 como um ingrediente ativo. De preferência, o anticorpo de ligação à proteína DSG3 tem atividade citotóxica. De preferência, o câncer é câncer de pulmão. Mais preferivelmente, o câncer é câncer de pulmão de células não-pequenas. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona métodos para indução de dano celular de células que expressam a proteína DSG3 através de contato de células expressando DSG3 com um anticorpo de liga- ção à proteína DSG3. A presente invenção também proporciona métodos para supressão de proliferação de células que expressam uma proteína DSG3 através de contato de células que expressam a proteína DSG3 com um anticorpo de ligação à proteína DSG3. O anticorpo de ligação à proteína DSG3, de preferência, tem atividade citotóxica. Células que expressam uma proteína DSG3 são, de preferência, células cancerígenas.

Além disso, em outra modalidade, a presente invenção propor- ciona anticorpos que se ligam a uma proteína DSG3 e têm atividade citotóxi- ca em células que expressam a proteína DSG3. De preferência, a atividade citotóxica é atividade de ADCC. De preferência, a atividade citotóxica é ativi- dade de CDC. A presente invenção também proporciona anticorpos aos quais um agente quimioterapêutico de baixo peso molecular ou um peptídeo tóxico está ligado ou anticorpos tendo atividade citotóxica aos quais um a- gente quimioterapêutico ou um peptídeo tóxico está ligado.

A presente invenção ainda proporciona anticorpos que se ligam a uma proteína DSG3 e têm atividade citotóxica, mas não atividade de dis- sociação celular em células expressando a proteína DSG3.

Em outra modalidade, a presente invenção proporciona usos da proteína DSG3 como um marcador diagnóstico de câncer.

Além disso, em outra modalidade, a presente invenção propor- ciona métodos para diagnóstico de câncer os quais compreendem detecção de uma proteína DSG3 usando um anticorpo que se liga à proteína DSG3. Nos métodos da presente invenção, de preferência, a região extracelular da proteína DSG3 é detectada. De preferência, os métodos da presente inven- ção são realizados usando um anticorpo que reconhece a proteína DSG3. De preferência, os métodos da presente invenção detectam a proteína DSG3 no sangue, soro ou plasma ou proteína DSG3 isolada de células.

Em outra modalidade, a presente invenção proporciona métodos para o diagnóstico de câncer o qual compreende as etapas de: (a) coleta de uma amostra de um indivíduo; e

(b) uso de um anticorpo de ligação à proteína DSG3 para detec- tar a proteína DSG3 contida na amostra coletada.

Na presente invenção, qualquer substância pode ser usada co- mo a amostra mencionada acima, na medida em que ela possa ser coletada do indivíduo. Soro coletado de um indivíduo é usado em uma modalidade e uma amostra de biópsia coletada de um indivíduo é usada em outra modali- dade. Nos métodos de diagnóstico, o câncer pode ser qualquer câncer, na medida em que as células cancerígenas do indivíduo expressem uma prote- ína DSG3, mas é, de preferência, câncer de pulmão e, mais preferivelmente, câncer de pulmão de células não-pequenas. Na presente invenção, a etapa de coleta de uma amostra de um indivíduo também pode ser expressa como a etapa de fornecimento de uma amostra coletada de um indivíduo.

Além disso, em outra modalidade, a presente invenção propor- ciona métodos para diagnóstico de câncer nos quais o anticorpo de ligação à proteína DSG3 é rotulado com um nuclídeo selecionado de qualquer um de .11C1 13N, 150, 18F, 45Ti, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr e 1241.

Além disso, em outra m modalidade, a presente invenção pro- porciona métodos para diagnóstico de câncer nos quais a expressão de um gene que codifica a proteína DSG3 é detectada.

Além disso, em outra modalidade, a presente invenção propor- ciona agentes diagnósticos e kits a serem usados nos métodos de diagnósti- co da presente invenção.

Assim, o presente pedido proporciona o seguinte:

[1] uma composição farmacêutica compreendendo, como um ingrediente ativo, um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3;

[2] um inibidor de crescimento celular compreendendo, como um ingrediente ativo, um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3;

[3] um agente anticâncer compreendendo, como um ingrediente ativo, um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3;

[4] o agente anticâncer de [3] em que o anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 é um anticorpo que tem atividade citotóxica;

[5] o agente anticâncer de acordo com [3] ou [4] em que o anti- corpo que se liga a uma proteína DSG3 é um anticorpo descrito em qualquer um de (1) a (47) abaixo:

(1) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 como CDR1, a seqüência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 4 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como CDR3;

(2) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 como CH;

(3) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH;

(4) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 12 como CDR1, a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 14 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 como CDR3;

(5) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 como CL;

(6) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL;

(7) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L

de (4);

(8) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L

de (5);

(9) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L

de (6);

(10) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 24 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 26 como CDR3;

(11) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH;

(12) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH;

(13) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 32 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 34 como CDR3;

(14) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL;

(15) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL;

(16) um anticorpo compreendendo a cadeia H (10) e a cadeia L de (13);

(17) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

L de (14);

(18) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

Lde (15);

(19) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia

Lde (13);

(20) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia Lde (14);

(21) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia

Lde (15);

(22) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia

L de (4);

(23) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

L de (5);

(24) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

L de (6);

(25) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 como CDR2 e a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 como CDR3;

(26) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH;

(27) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH;

(28) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 87 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 89 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 como CDR3;

(29) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL;

(30) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL;

(31) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

L de (28);

(32) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

L de (29);

(33) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

L de (30);

(34) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (28);

(35) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia

L de (29);

(36) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia

L de (30);

(37) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia

L de (28);

(38) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

L de (29);

(39) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

L de (30);

(40) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

L de (4);

(41) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

L de (5);

(42) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

L de (6);

(43) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

Lde (13);

(44) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

Lde (14);

(45) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

Lde (15);

(46) um anticorpo compreendendo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções de aminoácido no anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (45), o qual tem atividade equivalente ao anticorpo de qualquer um de (1) a (45); e

(47) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo de proteína DSG3 que o anticorpo de qualquer um de (1) a (45);

[6] o agente anticâncer de acordo com qualquer um de [3] a [5] em que o câncer é câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou câncer uterino; [7] o agente anticâncer de acordo com [6] em que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não-pequenas;

[8] um método de indução de dano celular em células expres- sando DSG3 através de contato de células que expressam uma proteína DSG3 com um anticorpo que se liga à proteína DSG3;

[9] um método de supressão do crescimento de células expres- sando DSG3 através de contato de células que expressam uma proteína DSG3 com um anticorpo que se liga à proteína DSG3;

[10] o método de acordo com [8] ou [9] em que o anticorpo que se liga à proteína DSG3 tem atividade citotóxica;

[11] o método de acordo com qualquer um de [8] a [10] em que o anticorpo que se liga à proteína DSG3 é um anticorpo de qualquer um de (1) a (47) abaixo:

(1) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 como CDR1, a seqüência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 4 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como CDR3;

(7) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L

de (4);

(8) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (5);

(9) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (6);

(10) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 24 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 26 como CDR3;

(13) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 32 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de

SEQIDNO: 34 como CDR3;

(16) um anticorpo compreendendo a cadeia H (10) e a cadeia L

de (13);

(17) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

L de (14);

(18) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

L de (15);

(19) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia

Lde (13);

(20) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia

L de (14);

(21) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia

Lde (15);

(22) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia L de (4);

(23) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

L de (5);

(24) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

L de (6);

(28) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 87 como CDR1, a seqüência de a -

minoácido de SEQ ID NO: 89 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 como CDR3;

(31) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

L de (28);

(32) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

L de (29);

(33) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

L de (30);

(34) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia

L de (28);

(35) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia

L de (29);

(36) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (30);

(37) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia

L de (28);

(38) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

L de (29);

(39) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

L de (30);

(40) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

L de (4);

(41) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

L de (5);

(42) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

L de (6);

43) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

L de (13);

(44) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

Lde (14);

(45) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

Lde (15);

[12] o método de acordo com qualquer um de [8] a [11] em que as células que expressam uma proteína DSG3 são células cancerígenas;

[13] um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 e tem ativi- dade citotóxica contra células que expressam uma proteína DSG3;

[14] o anticorpo de acordo com [13] em que a atividade citotóxica é atividade de ADCC;

[15] o anticorpo de acordo com [13] em que a atividade citotóxica é atividade de CDC;

[16] o anticorpo de acordo com qualquer um de [13] a [15] em que um agente quimioterapêutico de baixo peso molecular ou um peptídeo tóxico está ligado ao anticorpo;

[17] um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 em que o agente quimioterapêutico de baixo peso molecular ou um peptídeo tóxico está ligado ao anticorpo;

[18] o anticorpo de acordo com qualquer um de [13] a [17] em que o anticorpo é um anticorpo de qualquer um de (1) a (47) abaixo: (1) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 como CDR1, a seqüência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 4 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como CDR3;

(2)um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 como CH;

(3)um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH;

(4)um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 12 como CDR1, a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 14 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 como CDR3;

(5)um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 como CL;

(6)um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a

cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL;

(7)um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L

de (4);

(8)um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L

de (5);

(9) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L

de (6);

(13) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 como CDR1, a seqüência de a-

0 minoácido de SEQ ID NO: 32 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 34 como CDR3;

(16) um anticorpo compreendendo a cadeia H (10) e a cadeia L

de (13);

(17) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

Lde (14);

(18) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

Lde (15);

(19) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia

Lde (13);

(20) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia

L de (14);

(21) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia

L de (15);

(22) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia

L de (4);

(23) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia

L de (5);

(24) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (6);

(25) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 como CDR2 e a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 como CDR3;

(29)um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL;

(31) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (28);

(32) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

L de (29);

(33) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

L de (30);

(34) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia

L de (28);

(35) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia

L de (29);

(36) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia

L de (30);

(37) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia

L de (28);

(38) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (29);

(39) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia

L de (30);

(40) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

L de (4);

(41) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

L de (5);

(42) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

L de (6);

43) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia

L de (13);

(44) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia

Lde (14);

(45) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia

L de (15);

[19] uso de uma proteína DSG3 como um marcador diagnóstico de câncer;

[20] um método de diagnóstico de câncer compreendendo de- tecção de uma proteína DSG3 usando um anticorpo que se liga à proteína DSG3;

[21] um método de diagnóstico de câncer compreendendo as etapas de:

(a) coleta de uma amostra do indivíduo; e (b) detecção de uma proteína DSG3 contida na amostra coleta- da usando um anticorpo que se liga à proteína DSG3;

[22] o método de diagnóstico de acordo com [20] ou [21] em que o anticorpo que se liga à proteína DSG3 é um anticorpo rotulado com um nuclídeo que emite positron;

[23] o método de diagnóstico de acordo com [22] em que o nu- clídeo que emite positron é um nuclídeo selecionado de qualquer um de .11C, 13N, 150, 18F, 45Ti, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr e 1241;

[24] um método de diagnóstico de câncer compreendendo de- tecção de expressão de um gene que codifica uma proteína DSG3;

[25] o método de diagnóstico de acordo com qualquer um de [20] a [24] em que o câncer é câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofa- geal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou câncer uterino;

[26] o método de diagnóstico de acordo com [25] em que o cân- cer de pulmão é câncer de pulmão de células não-pequenas;

[27] um agente diagnóstico a ser usado para o método diagnós- tico de acordo com qualquer um de [20] a [26];

[28] um kit a ser usado para o método diagnóstico de acordo com qualquer um de [20] a [26];

[29] uso de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 na produção de um inibidor do crescimento celular;

[30] uso de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 na produção de um agente anticâncer;

[31] um método de supressão de crescimento celular compreen- dendo a etapa de administração, a um indivíduo, de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3; e

[32] Um método de prevenção ou tratamento de câncer compre- endendo a etapa de administração, a um indivíduo, de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3. Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 representa o resultado de análise de expressão de gene de DSG3 em tecidos normais e tecidos cancerígenos usando Gene- Chip U133.

A figura 2 representa o resultado de análise de expressão de DSG3 em linhagens de células cancerígenas usando GeneChip U133.

A figura 3 mostra fotografias de coloração imuno-histológica na qual expressão da proteína DSG3 em carcinoma de células escamosas de pulmão é visualizada através de imunocoloração. Elevação de expressão da proteína DSG3 é mostrada em todas as cinco amostras clínicas.

A figura 4 representa o resultado de análise citométrica de fluxo a qual mostra a ligação de todos os anticorpos monoclonais anti-DSG3 DF120, DF122, DF148, DF151, DF153, DF168, DF331, DF364 e DF366 a uma linhagem de células CHO que expressa constitutivamente DSG3 de comprimento total.

A figura 5 representa a atividade de CDC de anticorpos mono- clonais anti-DSG3 DF120, DF122, DF148, DF151, DF153, DF168 e DF331 em uma linhagem de células CHO que expressa constitutivamente DSG3 de comprimento total.

A figura 6 representa a atividade de CDC do anticorpo monoclo- nal anti-DSG3 DF151 na linhagem de célula de carcinoma epidermóide hu- mano A431 e na linhagem de célula DSG3-A549, a qual é uma linhagem de célula de carcinoma de pulmão humano que expressa constitutivamente DSG3.

A figura 7 representa a atividade de ADCC de anticorpos mono- clonais anti-DSG3 DF151, DF364 e DF366 na célula de célula DSG3-A5, a qual é uma linhagem de célula de carcinoma de pulmão humano que ex- pressa constitutivamente DSG3. A figura 7A representa o resultado de análi- se usando células efetuadoras derivadas de medula óssea e a figura 7B mostra o resultado de análise usando células efetuadoras derivadas de baço de camundongo.

A figura 8 representa a atividade de CDC de anticorpos quiméri- cos de camundongo-humano anti-DSG3 DF151c, DF364c e DF366c na célu- la de célula DSG3-Ba/F3, a qual é uma linhagem de célula Ba/F3 que ex- pressa constitutivamente DSG3.

A figura 9 representa a atividade de ADCC de anticorpos quimé- ricos de camundongo-humano anti-DSG3 DF364c e DF366c e anticorpos quiméricos de camundongo-humano anti-DSG3 com baixo teor de fucose YB-DF364c e YB-DF366c na linhagem de célula DSG3-Ba/F3, a qual é uma linhagem de célula Ba/F3 que expressa constitutivamente DSG3.

A figura 10 representa a atividade de ADCC de anticorpos anti- DSG3 DF366m (anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo), DF366m com baixo teor de fucose (anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo com baixo teor de fucose), DF366c (anticorpo quimérico de camundongo- humano) e YB-DF366c (anticorpo quimérico de camundongo-humano com baixo teor de fucose) na linhagem de célula DSG3-Ba/F3, a qual é uma Ii- nhagem de célula Ba/F3 que expressa constitutivamente DSG3. Células de baço de camundongo que tinham interleucina-2 adicionada foram usadas como células efetuadoras.

A figura 11 representa a atividade de ADCC de anticorpos anti- DSG3 DF366m (anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo), DF366m com baixo teor de fucose (anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo com baixo teor de fucose), DF366c (anticorpo quimérico de camundongo- humano) e YB-DF366c (anticorpo quimérico de camundongo-humano com baixo teor de fucose) na linhagem de célula DSG3-Ba/F2, a qual é uma li- nhagem de célula Ba/F3 que expressa constitutivamente DSG3. Células de baço de camundongo cultivadas durante quatro dias na presença de inter- leucina-2 foram usadas como células efetuadoras.

A figura 12 representa a atividade antitumor de anticorpos anti- DSG3 DF366m (anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo) e DF366m com baixo teor de fucose (anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo com baixo teor de fucose).

Melhor Modo para Realização da Invenção

DSG3 (Desmogleína 3) é uma proteína de receptor de orienta- ção de axônio e sua seqüência de aminoácido e sua seqüência de gene co- dificação são descritas no Acesso ao GenBank Número NP_001935 (SEQ ID NO: 40) e NM_001944 (SEQ ID NO: 39), respectivamente. Na presente invenção, a proteína DSG3 refere-se à proteína de comprimento total e fragmentos da mesma. "Fragmentos" refere-se a polipeptídeos compreen- dendo qualquer região da proteína DSG3 e podem não ter a função da pro- teína DSG3 que ocorre naturalmente. Sem estar limitado ao mesmo, um e- xemplo dos fragmentos é um fragmento compreendendo a região extracelu- Iar da proteína DSG3. As posições 1 a 616 na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 40 correspondem à região extracelular da proteína DSG3. As posição 617 a 641 na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 40 corres- pondem à região transmembrana.

Na presente invenção, descobriu-se que expressão de DSG3 estava elevada, em uma freqüência muito alta, em tecidos de câncer de pulmão a nível de gene e proteína. Além disso, análises de amostras clínicas e linhagens de células cancerígenas de outros tipos de câncer mostrou que a expressão estava elevada não apenas em câncer de pulmão, mas também em câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pan- creático, câncer de pele e câncer uterino. Além disso, foi mostrado que diag- nóstico imuno-histológico é possível usando anticorpos monoclonais especí- ficos para a proteína DSG3. Em outras palavras, a proteína DSG3 é útil co- mo um marcador diagnóstico para câncer. Detecção de expressão do gene de DSG3

Métodos da presente invenção compreendem detecção de ex- pressão do gene de DSG3. Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, a expressão da proteína DSG3 é detectada.

Na presente invenção, detecção inclui detecções quantitativas e qualitativas. Exemplos de detecção qualitativa incluem simples medição da presença ou ausência da proteína DSG3, medição para ver se a proteína DSG3 está ou não presente acima de uma determinada quantidade e medi- ção que compara a quantidade da proteína DSG3 com aquela de outras a- mostras (por exemplo, uma amostra de controle). Por outro lado, exemplos de detecção quantitativa incluem medição da concentração de proteína DSG3 e medição da quantidade da proteína DSG3.

Amostras de teste não estão particularmente limitadas, na medi- da em que elas sejam amostras que possam conter proteína DSG3 e são, de preferência, amostras coletadas do corpo de organismos tais como ma- míferos e, mais preferivelmente, amostras coletadas de seres humanos. E- xemplos específicos das amostras de teste incluem sangue, fluido interstici- al, plasma, fluido extravascular, fluido cérebro-espinhal, fluido sinovial, fluido pleural, soro, fluido linfático, saliva e urina, mas as amostras de teste são, de preferência, sangue, soro ou plasma. Amostras de teste da presente inven- ção também incluem amostras obtidas de amostras de teste, tais como solu- ções de cultura de célula e espécimes de tecidos ou células imobilizadas coletados do corpo de um organismo.

Os cânceres que são diagnosticados não estão particularmente limitados e podem ser qualquer câncer, mas exemplos específicos incluem câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele e câncer uterino. Câncer de pulmão é preferível e câncer de pulmão de células não-pequenas é particularmente preferível.

Na presente invenção, quando uma proteína DSG3 é detectada em uma amostra de teste e, se a amostra de teste é julgada como tendo uma quantidade da proteína DSG3 maior do que um controle negativo ou um indivíduo saudável, pode ser determinado que o indivíduo tem câncer ou tem um risco de ser afetado com câncer no futuro. Indivíduos, na presente invenção, podem ser espécies animais que trazem geneticamente uma proteína DSG3 e muitos mamíferos não- humanos, tais como macacos, gado, ovelha, camundongos, cães, gatos e hamsters são conhecidos como tais espécies animais. Indivíduos que são adequadamente usados são, em particular, seres humanos, mas não estão limitados aos mesmos.

Modalidades preferidas dos métodos diagnósticos da presente invenção incluem métodos diagnósticos que compreendem detecção de uma proteína DSG3 sobre uma seção de tecido ou células imobilizadas obtida de um paciente afetado com o câncer antes mencionado. Além disso, outras modalidades da presente invenção incluem métodos diagnósticos compre- endendo detecção de proteína DSG3 liberada de células no sangue. Em par- ticular, a presente invenção é, de preferência, um método diagnóstico que detecta um fragmento compreendendo o domínio extracelular da proteína

DSG3 presente no sangue.

Métodos para detecção de uma proteína DSG3 contida em uma amostra de teste não estão particularmente limitados, mas um método imu- nológico que usa um anticorpo anti-DSG3 para detecção é preferido. O mé- todo imunológico inclui, por exemplo, radioimunoensaio (RIA), imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaio por fluorescência (FIA), imunoensaio por Iu- minescência (LIA), imunoprecipitação (IP), imunoensaio turbidimétrico (TIA), Western blotting (WB), coloração imuno-histoquímica (IHC) e imunodifusão radial única (SRID) e é, de preferência, um imunoensaio enzimático, em par- ticular ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA), por exemplo, ELISA em sanduíche como uma modalidade do mesmo. Os métodos imunológicos acima mencionados, tal como ELISA, podem ser realizados através de mé- todos conhecidos por aqueles versados na técnica. O método a seguir é, por exemplo, um método de detecção co- mum que usa um anticorpo anti-DSG3. Após (mobilização de um anticorpo anti-DSG3 a um suporte, o suporte é bloqueado com albumina de soro bovi- no (BSA), gelatina, albumina ou similar para evitar ligação não-específica de proteínas ao suporte. Em seguida, uma amostra de teste é adicionada ao suporte para incubação e as proteínas DSG3 são deixadas se ligar ao anti- corpo anti-DSG3 ligado ao suporte. Subseqüentemente, através de lavagem do complexo formado entre as proteínas DSG3 e o anticorpo anti-DSG3 li- gado ao suporte com uma solução de lavagem, outras proteínas DSG3 que não aquelas ligadas ao anticorpo anti-DSG3 sobre o suporte que se ligaram não especificamente ao suporte são removidas. Exemplos de métodos de detecção que usam um anticorpo anti-DSG3 incluem métodos para detecção de uma proteína DSG3 em uma amostra de teste através de detecção quali- tativa ou quantitativa da proteína DSG3 ligada ao anticorpo anti-DSG3 sobre o suporte e vários exemplos específicos descritos abaixo. Na presente invenção, um suporte usado para imobilizar um an- ticorpo anti-DSG3 é, por exemplo, polissacarídeos insolúveis, tais como aga- rose e celulose, resinas sintéticas, tais como resina de silício, resina de poli- estireno, resina de poliacrilamida, resina de náilon e resina de policarbonato e suportes insolúveis, tal como vidro. Tal suporte é usado na forma de glóbu- los ou lâminas. No caso de glóbulos, uma coluna ou similar cheia de glóbu- los pode ser usada. No caso de uma lâmina, uma lâmina com múltiplas cavi- dades (lâmina com múltiplas cavidades com 96 cavidades ou similar) ou uma lasca biossensora podem ser usadas. Para ligação entre um anticorpo anti-DSG3 e um suporte, um anticorpo anti-DSG3 pode ser ligado a um su- porte através de métodos geralmente usados, tais como ligação química ou adsorção física. Suportes comercialmente disponíveis podem ser usados adequadamente.

A ligação entre um anticorpo anti-DSG3 e uma proteína DSG3 é geralmente realizada em um tampão. Por exemplo, tampão de fosfato, tam- pão de Tris, tampão de ácido cítrico, tampão de borato, tampão de carbona- to ou similar é usado como o tampão. Além disso, incubação pode, adequa- damente, ser realizada usando condições que já são comumente conheci- das, tal como incubação em uma temperatura entre 4°C e a temperatura ambiente durante uma hora a 24 horas. Na medida em que a ligação entre a proteína DSG3 e anticorpo anti-DSG3 não seja interrompida, qualquer coisa pode ser usada para lavagem após incubação e, por exemplo, um tampão contendo um tensoativo, tal como Tween 20 ou similar, pode ser adequada- mente usado.

No método de detecção de proteína DSG3 da presente inven- ção, uma amostra de controle pode ser preparada adequadamente, além da amostra de teste na qual o teor de proteína DSG3 será detectado. A amostra de controle inclui, por exemplo, uma amostra de controle negativa não con- tendo proteína DSG3 e uma amostra de controle positivo contendo a proteí- na DSG3. Nesse caso, comparando os resultados obtidos de uma amostra de controle negativo não contendo proteína DSG3 com os resultados obtidos de uma amostra de controle positivo contendo a proteína DSG3, a presença ou ausência da proteína DSG3 na amostra de teste pode ser confirmada. Além disso, após preparo de uma série de amostras de controle com altera- ções graduais na concentração e obtenção de resultados de detecção para cada amostra de controle como um valor numérico, a proteína DSG3 contida em uma amostra de teste pode ser quantitativamente detectada de acordo com uma curva padrão produzida baseado nos valores da concentração de proteína DSG3 e seus valores medidos correspondentes.

Em uma modalidade preferida, um exemplo de detecção da pro- teína DSG3 ligada a um suporte via um anticorpo anti-DSG3 é um método que usa um anticorpo anti-DSG3 rotulado com uma substância de rotulação. Por exemplo, a proteína DSG3 pode ser detectada através de contato de uma amostra de teste com o anticorpo anti-DSG3 imobilizado sobre um su- porte, lavagem da mesma e, então, uso de um anticorpo rotulado que reco- nhece especificamente a proteína DSG3 ligada ao anticorpo anti-DSG3.

Anticorpos anti-DSG3 podem ser rotulados através de métodos geralmente conhecidos. Uma substância de rotulação conhecida por aqueles versados na técnica, tais como corantes fluorescentes, enzimas, co- enzimas, substâncias quimioluminescentes e substâncias radioativas, pode ser usada como a substância de rotulação e exemplos específicos incluem radioisótopos (32P, 14C, 1251, 3H, 1311 e similares), fluoresceína, rodamina, cloreto de dansila, umbeliferona, luciferase, peroxidase, fosfatase alcalina, β- galactosidase, β-glicosidade, peroxidase de armorácia, glicoamilase, Iisozi- ma, oxidase de sacarídeo, microperoxidase e biotina. Quando usando bioti- na como uma substância de rotulação, a adição de anticorpos biotina- rotulados é, de preferência, seguida pela adição de avidina ligada a uma en- zima, tal como fosfatase alcalina. Para a ligação de substância de rotulação com um anticorpo anti-DSG3, métodos conhecidos, tais como o método com glutaraldeído, o método com maleimida, o método com dissulfeto de piridila ou o método com ácido periódico, pode ser usado.

Especificamente, um anticorpo anti-DSG3 é imobilizado sobre um suporte através da adição de uma solução contendo o anticorpo anti- DSG3 ao suporte, tal como uma lâmina. Após a lâmina ser lavada, ela é blo- queada, por exemplo, com albumina de soro bovino (BSA), gelatina, albumi- na ou similar para evitar ligação de proteína não-específica. Após a lâmina ser lavada novamente, incubação é realizada através da adição de uma a- mostra de teste à lâmina. Após incubação, a lâmina é lavada e o anticorpo anti-DSG3 rotulado é adicionado. Após incubação apropriada, a lâmina é lavada e, então, o anticorpo anti-DSG3 rotulado que permanece sobre a lâ- mina pode ser detectado. Detecção pode ser realizada através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e, por exemplo, quando de de- tecção de um anticorpo anti-DSG3 rotulado com uma substância radioativa, o anticorpo anti-DSG3 rotulado pode ser detectado através de cintilação de líquido ou um método RIA. Quando de detecção de um anticorpo anti-DSG3 enzima-rotulado, adição de substrato ao anticorpo anti-DSG3 rotulado pode ser seguida por detecção da alteração enzimática do substrato, tal como de- senvolvimento de cor, usando um espectrofotômetro. Exemplos específicos de um substrato incluem sal de diamônio de ácido 2,2-azinobis(3- etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), 1,2-fenilenodiamina (orto- fenilenodiamina) e 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Quando o substrato é uma substância que emite fluorescência, alteração enzimática do substrato pode ser detectada usando um espectrofluorômetro.

Na presente invenção, uma modalidade particularmente preferi- da do método para detecção da proteína DSG3 é, por exemplo, um método que usa um anticorpo anti-DSG3 biotina-rotulado e avidina. Especificamente, a adição de uma solução contendo um anticorpo anti-DSG3 a um suporte, tal como uma lâmina, permite imobilização do anticorpo anti-DSG3 à lâmina. Após a lâmina ser lavada, ela é bloqueada, por exemplo, com BSA, para evitar a ligação de proteína não-específica. A lâmina é lavada novamente e, então, uma amostra de teste é adicionada à lâmina. Após incubação, a lâmi- na é lavada e um anticorpo anti-DSG3 biotina-rotulado é adicionado à lâmi- na. Após incubação adequada, a lâmina é lavada e avidina ligada a uma en- zima, tal como fosfatase alcalina ou peroxidase, é adicionada à lâmina. Após incubação, a lâmina é lavada e a proteína DSG3 pode ser detectada após a adição de um substrato para a enzima avidina-conjugada, usando a altera- ção enzimática do substrato ou similar como um indicador.

Na presente invenção, outra modalidade do método para detec- ção da proteína DSG3 inclui um método que usa um ou mais tipos de anti- corpos primários que reconhecem especificamente a proteína DSG3 e um ou mais tipos de anticorpos secundários que reconhecem especificamente os anticorpos primários.

Por exemplo, após imobilização de um anticorpo anti-DSG3 a um suporte, tal como uma lâmina, a lâmina é bloqueada com albumina de soro bovino (BSA), gelatina, albumina ou similar para prevenir ligação não- específica de proteínas ao suporte. Então, após a adição de uma amostra de teste à lâmina, ela é incubada para permitir que a proteína DSG3 se ligue ao anticorpo anti-DSG3 ligado à lâmina. Após o que, a lâmina é lavada com uma solução de lavagem, de modo que as proteínas DSG3 ligadas ao supor- te através de ligação não-específica e não através de ligação específica ao anticorpo anti-DSG3, sejam removidas da lâmina. Um tipo de anticorpo anti- DSG3 diferente do anticorpo ligado ao suporte se liga à proteína DSG3 e, então, um anticorpo secundário que pode se ligar apenas ao anticorpo anti- DSG3 que se liga à proteína DSG3, mas não ao suporte, é levado a reagir com os complexos de proteína DSG3/anticorpo anti-DSG3. Um exemplo é um método que detecta a proteína DSG3 em uma amostra de teste através de detecção qualitativa ou quantitativa do anticorpo secundário que se liga como um resultado da operação mencionada acima. Nesse caso, o anticor- po secundário pode ser mais adequadamente rotulado com uma substância de rotulação.

Na presente invenção, outra modalidade dos métodos para de- tecção da proteína DSG3 é, por exemplo, um método de detecção que usa reação de agregação. Nesse método, a proteína DSG3 pode ser detectada usando um veículo sobre o qual um anticorpo anti-DSG3 é adsorvido. Qual- quer veículo pode ser usado para adsorção do anticorpo, na medida em que ele seja insolúvel e estável e não cause reações não-específicas. Por exem- plo, partículas de látex, bentonita, colodion, caulim ou eritrócitos de ovelha imobilizados podem ser usados, mas o uso de partículas de látex é preferi- do. Partículas de látex que podem ser usadas são, por exemplo, partículas de látex de poliestireno, partículas de látex de copolímero de estireno- butadieno ou partículas de látex de polivinil tolueno, mas o uso de partículas de látex de poliestireno é preferido. Partículas sensibilizadas são misturadas com uma amostra e essas são agitadas durante um determinado período de tempo. Uma vez que o grau de agregação de partícula se torna maior à me- dida que a concentração de proteína DSG3 na amostra aumenta, a proteína DSG3 pode ser detectada avaliando o grau de agregação a olho nu. Além disso, a proteína DSG3 também pode ser detectada através de medição do aumento na turbidez causado por agregação usando um espectrofotômetro ou similar.

Na presente invenção, outra modalidade dos métodos para de- tecção da proteína DSG3 inclui, por exemplo, um método que usa um bios- sensor utilizando o fenômeno de ressonância de plasmônio em superfície. O uso de um biossensor utilizando o fenômeno de ressonância de plasmônio em superfície permite observação em tempo real de interações proteína- proteína, uma vez que a ressonância de plasmônio em superfície sinalizada sem a necessidade de rotulação da proteína. Por exemplo, usando um bios- sensor, tal como BIAcore (Biacore), a ligação entre a proteína DSG3 e um anticorpo anti-DSG3 pode ser detectada. Especificamente, uma amostra de teste é contatada com uma lasca sensora sobre a qual um anticorpo anti- DSG3 está imobilizado e a proteína DSG3 que se liga ao anticorpo anti- DSG3 pode ser detectada como uma alteração nos sinais de ressonância.

Anticorpos antí-DSG3 podem ser rotulados através de métodos gerais usando, além dos rótulos mencionados acima, nuclídeos que emitem positron, tais como 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr e 1241 (Acta. Oncol. 32, 825-830, 1993). Usando PET (exploração por tomografia de e- missão de positron), o qual é um instrumento para obtenção não invasiva de dados sobre o comportamento in vivo de fármacos, após administração de um anticorpo anti-DSG3 rotulado com o nuclídeo que emite positron mencio- nado acima a seres humanos ou animais, a radiação emitida pelo nuclídeo radioativo é medida do lado de fora do corpo e, então, convertida em uma imagem quantitativa através de métodos de tomografia computadorizados. Usando PET conforme descrito acima, moléculas antigênicas que são alta- mente expressas em um câncer em particular podem ser detectadas sem coletar amostras dos pacientes. Além dos nuclídeos mencionados acima, anticorpos anti-DSG3 podem ser radio-rotulados com Rl de vida curta usan- do nuclídeos que emitem positron, tais como 11C, 13N, 150, 18F e 45Ti.

No momento, o uso de um cyclotron médico para a produção de nuclídeos de vida curta usando os nuclídeos mencionados acima, técnicas para a produção de compostos Rl de vida curta-rotulados e similares estão atualmente sob pesquisa e desenvolvimento e anticorpos anti-DSG3 podem ser rotulados usando tais técnicas. Administrando um anticorpo anti-DSG3 aos pacientes após rotulação do mesmo com os nuclídeos que emitem posi- tron acima mencionados, o anticorpo anti-DSG3 rotulado que reconhece a proteína DSG3 presente no corpo vivo se acumula em focos primários e fo- cos metastáticos de acordo com a especificidade do anticorpo anti-DSG3 em cada local do tecido patológico. Portanto, a presença de focos primários e focos metastáticos pode ser diagnosticada através de detecção de sua ra- dioatividade. Para uso em tal finalidade diagnostica, valores de atividade de emissão de 25-4000 keV de partículas gama ou positrons podem ser usados apropriadamente. Além disso, efeitos terapêuticos podem ser esperados a- través de seleção de um nuclídeo adequado e administração do mesmo em grandes quantidades. Nesse caso, a emissão de 70-700 keV de partículas gama ou positrons pode ser adequadamente usada.

Em outra modalidade dos métodos da presente invenção, a ex- pressão de mRNA de DSG3 é detectada. Na presente invenção, detecção inclui detecções quantitativas e qualitativas. Exemplos de detecção qualitati- va incluem simples medição da presença ou ausência de mRNA de DSG3, medição para ver se o mRNA de DSG3 está ou não presente acima de uma determinada quantidade e medição que compara a quantidade de mRNA de DSG3 com aquela de outras amostras (por exemplo, uma amostra de con- trole). Por outro lado, detecção quantitativa inclui, por exemplo, medição da concentração de mRNA de DSG3 e medição da quantidade de mRNA de DSG3.

Amostras de teste não estão particularmente limitadas, na medi- da em que elas sejam amostras que possam conter mRNA de DSG3 e são, de preferência, amostras coletadas do corpo de organismos tais como ma- míferos e, mais preferivelmente, amostras coletadas de seres humanos. E- xemplos específicos das amostras de teste incluem sangue, fluido interstici- al, plasma, fluido extravascular, fluido cérebro-espinhal, fluido sinovial, fluido pleural, soro, fluido linfático, saliva e urina, mas as amostras de teste são, de preferência, sangue, soro ou plasma. Amostras de teste da presente inven- ção também incluem amostras obtidas de amostras de teste, tais como solu- ções de cultura de célula e espécimes de tecidos ou células imobilizadas coletados do corpo de um organismo.

Indivíduos, na presente invenção, podem ser espécies animais que trazem geneticamente uma proteína DSG3 e muitos mamíferos não- humanos, tais como macacos, gado, ovelha, camundongos, cães, gatos e hamsters são conhecidos como tais espécies animais. Indivíduos que são adequadamente usados são, em particular, seres humanos, mas não estão limitados aos mesmos.

Modalidades específicas dos métodos diagnósticos da presente invenção são descritas abaixo, mas os métodos da presente invenção não estão limitados a esses métodos. Primeiro, uma amostra é preparada de um indivíduo. Em seguida, mRNAs de DSG3 incluídos na amostra são detecta- dos. Na presente invenção, também é aceitável detectar cDNAs sintetizados a partir de mRNAs. Na presente invenção, quando o mRNA de DSG3 ou cDNA que codifica DSG3 é detectado em uma amostra de teste, se uma maior quantidade de mRNA de DSG3 ou cDNA que codifica DSG3 é detec- tada na amostra de teste do que em um controle negativo ou um indivíduo saudável, pode ser determinado que o indivíduo tem câncer ou tem um alto risco de ser afetado por câncer no futuro. Exemplos de tais métodos incluem métodos conhecidos por a- queles versados na técnica, tais como o método de Northern blotting, o mé- todo de RT-PCR e o método de arranjo de DNA.

Os métodos de detecção da presente invenção descritos acima podem ser automatizados usando vários dispositivos de testagem automáti- cos e grandes quantidades de amostra podem ser examinadas de uma vez.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar agentes ou kits diagnósticos para detecção da proteína DSG3 em uma amostra de teste para diagnóstico de câncer. Os agentes ou kits diagnósticos contêm pelo menos um anticorpo anti-DSG3. Quando os agentes ou kits diagnósti- cos são baseados em um método EIA, tal como o método ELISA, um veículo para imobilização do anticorpo pode ser incluído ou um veículo pode ser li- gado ao anticorpo antecipadamente. Se os agentes ou kits diagnósticos são baseados em um método de agregação que usa um veículo, tal como látex, eles podem incluir um veículo anticorpo-adsorvido.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar agentes ou kits diagnósticos para detecção de mRNA de DSG3 ou cDNA que codifica DSG3 em uma amostra de teste para diagnóstico de câncer. Os agentes ou kits diagnósticos contêm pelo menos um DNA que codifica DSG3 (um DNA consistindo na seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 39) ou um oligonu- cleotídeo compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos que são complemen- tares à sua fita complementar.

Aqui, o termo "fita complementar" refere-se à outra fita com rela- ção a uma das fitas de um ácido nucleico fita dupla consistindo em pares de base de A:T (U no caso de RNA) e G:C. Além disso, "complementar" refere- se não apenas a casos de seqüências completamente complementares den- tro de uma região de pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, mas tam- bém a casos de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais pre- ferivelmente 90% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95% de homo- Iogia ou mais em uma seqüência de nucleotídeo. A homologia pode ser de- terminada usando um algoritmo descrito aqui.

Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser usados como sondas ou primers para detecção ou amplificação de DNA que codifica DSG3 e sondas ou primers para detecção da expressão desses DNAs. Além disso, os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser usados na for- ma de um substrato de arranjo de DNA.

Quando tais oligonucleotídeos são usados como primers, seus comprimentos são, normalmente, de 15 bp a 100 bp e, de preferência, 17 bp a 30 bp. Os primers não estão particularmente limitados, na medida em que pelo menos uma porção do DNA que codifica DSG3 ou uma fita complemen- tar do mesmo possa ser amplificada. Além disso, quando eles são usados como primers, suas regiões na extremidade 3' podem ser feitas para serem complementares e seqüências de reconhecimento de enzima de restrição ou tags podem ser adicionadas às suas extremidades 5'.

Quando usando esses oligonucleotídeos como sondas, as son- das não estão particularmente limitadas, na medida em que elas se hibridi- zem especificamente a pelo menos uma porção do DNA que codifica DSG3 ou a uma fita complementar do mesmo. As sondas podem ser oligonucleotí- deos sintéticos e têm, normalmente, 15 bp ou mais.

Quando os oligonucleotídeos da presente invenção são usados como sondas, é preferível usar aqueles rotulados. Exemplos de métodos de rotulação incluem métodos de rotulação que usam quínase de polinucleotí- deo T4 para fosforilar as extremidades 5' de oligonucleotídeos com 32P e métodos que incorporam um nucleotídeo de substrato rotulado com um isó- topo, tal como 32P, um corante fluorescente, biotina ou similar, usando uma DNA polimerase, tal como enzima Klenow e um oligonucleotídeo de hexâ- mero aleatório ou um primer (métodos de iniciação aleatória e assim por di- ante).

Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser produzi- dos usando, por exemplo, um sintetizador de oligonucleotídeo comercial- mente disponível. As sondas podem ser produzidas como fragmentos de DNA fita dupla obtidos através de tratamento com enzima de restrição ou similar.

Nos agentes ou kits diagnósticos mencionados acima, água es- terilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, tensoativos, lipídios, solu- bilizantes, tampões, estabilizantes de proteína (BSA, gelatina ou similar), conservantes, soluções de bloqueio, solução de reação, solução de término de reação, reagentes para tratamento de amostras e similares podem ser combinados conforme necessário, além dos oligonucleotídeos de anticorpos,

os quais são os ingredientes ativos.

Os métodos diagnósticos da presente invenção podem ser reali- zados in vitro e in vivo, mas são, de preferência, realizados in vitro.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, um exem- pio dos métodos para diagnóstico de câncer é um método compreendendo

as etapas a seguir de:

(a) fornecimento de uma amostra coletada de um indivíduo; e

(b) detecção de proteínas DSG3 contidas na amostra de (a). Além disso, em uma modalidade preferida da presente invenção,

um exemplo dos métodos para diagnóstico de câncer é um método compre- endendo as etapas a seguir de:

(a) fornecimento de uma amostra coletada de um indivíduo; e

(b) detecção de genes de DSG3 contidos na amostra de (a).

Produção de anticorpos anti-DSG3 Os anticorpos anti-DSG3 usados na presente invenção podem ser derivados de qualquer origem e podem ser de qualquer tipo (monoclonal ou policlonal) e em qualquer forma, na medida em que eles se liguem espe- cificamente a uma proteína DSG3. Especificamente, anticorpos conhecidos, tais como anticorpos de animais (por exemplo, anticorpos de camundongo, anticorpos de rato e anticorpos de camelo), anticorpos humanos, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, podem ser usados. Os anticorpos podem ser anticorpos policlonais e são, de preferência, anticorpos monoclo- nais.

Anticorpos anti-DSG3 a serem usados na presente invenção po- dem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando técni- cas conhecidas. Em particular, anticorpos monoclonais derivados de um mamífero são preferíveis como o anticorpo anti-DSG3 a ser usado na pre- sente invenção. Exemplos de anticorpos monoclonais derivados de um ma- mífero incluem anticorpos produzidos através de hibridoma e anticorpos pro- duzidos por um hospedeiro transformado, através de técnicas de engenharia genética, com um vetor de expressão contendo um gene de anticorpo.

Um hibridoma que produz anticorpo monoclonal pode ser prepa- rado essencialmente usando técnicas conhecidas como segue. Especifica- mente, imunização é realizada usando a proteína DSG3 como um antígeno de sensibilização de acordo com um método de imunização geral para obter imunócitos os quais são, então, fundidos à células precursoras conhecidas através de um método geral de fusão celular. Então, o hibridoma que produz um anticorpo anti-DSG3 pode ser selecionado através de triagem de células que produzem anticorpo monoclonal usando um método geral de triagem.

Especificamente, anticorpos monoclonais são preparados como segue. Primeiro, o gene de DSG3 tendo a seqüência de nucleotídeo descrita no Acesso ao GenBank No. NM_001944 (SEQ ID NO: 39) é expresso e a proteína DSG3 é obtida e usada como o antígeno de sensibilização para obtenção do anticorpo. Especificamente, a seqüência genética que codifica DSG3 é inserida em um vetor de expressão conhecido e é usada para trans- formar uma célula hospedeira apropriada. Então, a proteína DSG3 humana de interesse pode ser purificada através de um método conhecido da célula hospedeira ou seu sobrenadante de cultura. Alternativamente, uma proteína DSG3 que ocorre naturalmente purificada pode ser usada da mesma manei- ra.

A proteína DSG3 purificada pode ser usada como um antígeno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptídeo parcial de DSG3 pode também ser usado como o antígeno de sensibilização. Nesse caso, o peptídeo parcial pode ser obtido a partir da seqüência de aminoácido de DSG3 humana através de síntese química; ele também pode ser obtido através de incorporação de uma parte do gene de DSG3 em um vetor de expressão e expressão do mesmo, alternativamente, o peptídeo parcial pode ser obtido através de degradação da proteína DSG3 com uma protease e não existem limitações sobre a região ou tamanho dos peptídeos parciais de DSG3 usados.

O mamífero a ser imunizado com o antígeno de sensibilização não está particularmente limitado mas é, de preferência, selecionado Ievan- do-se em conta a compatibilidade com células precursoras a serem usadas para fusão celular. Por exemplo, roedores, tais como camundongos, ratos e hamsters, coelhos ou macacos são usados em geral.

Os animais descritos acima podem ser imunizados com um antí- geno de sensibilização de acordo com um método conhecido. Por exemplo, como um método geral, imunização pode ser realizada através de injeção O em um mamífero, intraperitoneal ou subcutaneamente, de um antígeno de sensibilização. Especificamente, o antígeno de sensibilização é diluído em uma diluição apropriada com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica ou similar; misturado com um adjuvante padrão, tal como adjuvante completo de Freund, conforme desejado; emulsificado; e, então, administrado a mamíferos várias vezes a cada quatro a 21 dias. Além disso, um veículo apropriado pode ser usado quando o antígeno de sensibi- lização é usado para imunização. Particularmente, quando um peptídeo par- cial com um pequeno peso molecular é usado como um antígeno de sensibi- lização, o peptídeo de antígeno de sensibilização é, desejavelmente, ligado a uma proteína veículo, tal como albumina ou hemocianina do caramujo Me- gathura Crenulata e, então, usado para imunização.

Mamíferos são imunizados conforme descrito e, quando um au- mento na quantidade de anticorpo desejado no soro é confirmado, imunóci- tos são coletados dos mamíferos e submetidos à fusão celular. Um imunóci- to particularmente preferido é um esplenócito.

Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com o imunócito acima mencionado. Uma variedade de linha- gens de célula conhecidas pode ser adequadamente usada como a célula de mieloma e exemplos incluem: P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) .123, 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immu- nology (1978) 81, 1-7); NS-1 (Kohler. G. e Milstein1 C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519); MPC-11 (Margulies. D.H. e outros, Cell (1976) 8, 405- .415); SP2/0 (Shulman, Μ. e outros, Nature (1978) 276, 269-270); FO (de St. Groth, S. F. e outros, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21); S194 (Trow- bridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323); e R210 (Galfre, G. e outros, Nature (1979) 277, 131-133).

Fusão celular dos imunócitos acima mencionados com células de mieloma é essencialmente realizada de acordo com um método conheci- do, por exemplo, o método de Kohler e Milstein e outros (Kohler. G. e Milste- in, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mais especificamente, a fusão celular acima mencionada pode ser realizada em um meio de cultura nutricional padrão na presença, por e- xemplo, de um acelerador de fusão celular. Um acelerador de fusão celular é, por exemplo, polietileno glicol (PEG), Sendai vírus (HVJ) ou similar. Se desejado, um agente auxiliar, tal como sulfóxido de dimetila, pode ser adi- cionado para intensificar adicionalmente a eficiência de fusão. A proporção de imunócitos para células de mieloma usada pode ser estabelecida em qualquer critério. Por exemplo, o número de imunócitos é, de preferência, ajustado para um a dez vezes aquele das células de mie- loma. Como um meio a ser usado para a fusão celular mencionada acima, por exemplo, meio RMP11640 e meio MEM, os quais são apropriados para o crescimento da linhagem de célula de mieloma mencionada acima ou outros meios padrões que são usados para esse tipo de cultura de célula podem ser usados. Além disso, uma solução de suplemento de soro, tal como soro fetal de bezerro (FCS) pode ser, adequadamente, adicionada e usada em combinação.

Fusão celular é realizada misturando totalmente quantidades predeterminadas dos imunócitos e células de mieloma mencionados acima no meio mencionado acima, adição e mistura com uma solução de PEG com uma concentração, em geral, de 30 a 60% (peso/v) que tenha sido preaque- cida para aproximadamente 37°C e tem, por exemplo, um peso molecular médio de aproximadamente 1000 a 6000, de modo a formar as células fun- didas desejadas (hibridomas). Subseqüentemente, o agente para fusão celu- lar ou similar, o qual é desfavorável para o crescimento de hibridomas, pode ser removido através da adição sucessiva de um meio apropriado, tal como aqueles listados acima, remoção do sobrenadante através de centrifugação e repetição dessas etapas.

Hibridomas obtidos dessa maneira podem ser selecionados a- través de cultura dos hibridomas em um meio de seleção padrão, tal como meio HAT (um meio contendo aminopterina de hipoxantina e timidina). O meio HAT mencionado acima pode ser usado para continuar a cultura duran- te um período de tempo suficiente para matar as outras células que não o hibridoma de interesse (células não-fundidas) (tipicamente, um período de tempo suficiente é de vários dias a várias semanas). Subseqüentemente, hibridomas que produzem o anticorpo de interesse podem ser selecionados e monoclonados realizando um método de diluição Iimitativa padrão.

Alternativamente, um anticorpo que reconhece DSG3 pode ser preparado usando o método descrito na Publicação de Patente Internacional No. WO 03/104453.

Seleção e monoclonagem de um anticorpo de interesse pode ser adequadamente realizado através de um método de triagem baseado em uma reação de antígeno-anticorpo conhecida. Por exemplo, o antígeno é ligado a um veículo, tal como glóbulos de poliestireno ou similar ou uma lâ- mina de microtitulação com 96 cavidades comercialmente disponível, segui- do por reação com o sobrenadante de cultura dos hibridomas. Após o veícu- lo ser lavado, ele é reagido com um anticorpo secundário enzima-rotulado ou similar para determinar se o anticorpo de interesse que reagem com o antí- geno de sensibilização está ou não contido no sobrenadante de cultura. Hi- bridomas que produzem os anticorpos desejados que têm uma capacidade de ligação ao antígeno podem ser clonados através do método de diluição Iimitativa ou similar. Antígenos usados para imunização, bem como uma pro- teína DSG3 operavelmente similar, podem ser usados adequadamente nes- se caso.

Além do método mencionado acima onde hibridomas são obti- dos através de imunização de animais não-humanos com o antígeno, anti- corpos humanos desejados tendo a atividade de se ligar a uma proteína DSG3 também podem ser obtidos através de sensibilização de linfócitos humanos com a proteína DSG3 in vitro e fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de seres humanos que têm potencial de divisão infinito (vide Publicação de Patente Japonesa Kokoku Publicação No.

(JP-B) H01-59878 (pedido de patente Japonês examinado, aprovado publi- cado para oposição)). Alternativamente, anticorpos humanos desejados também podem ser obtidos de administração de uma proteína DSG3 que serve como um antígeno a um animal transgênico tendo um repertório de gene de anticorpo humano completo para obter células que produzem anti- corpo anti-DSG3, imortalização dessas células e isolamento de anticorpos humanos contra a proteína DSG3 das células imortalizadas (vide Publica- ções de Patente Internacional Nos. WO 94/25585, WO 93/12227, WO .92/03918 e WO 94/02602).

O hibridoma que produz anticorpo monoclonal produzido dessa maneira pode ser passado e cultivado em um meio padrão ou pode ser ar- mazenado durante um longo período em nitrogênio líquido.

Para obter anticorpos monoclonais a partir de hibridoma, um mé- todo para obtenção de anticorpos monoclonais como um sobrenadante de cultura após cultura do hibridoma de acordo com um método padrão, um método para obtenção de anticorpos monoclonais como uma ascite após administração e crescimento do hibridoma em um mamífero compatível ou similar pode ser adequadamente realizado. O primeiro método é adequado para obtenção de anticorpos altamente purificados, enquanto que o último método é adequado para a produção em massa de anticorpos. Na presente invenção, um anticorpo recombinante é produzido a partir de células recombinantes geradas através de técnicas de engenharia genética que envolvem clonagem do gene de anticorpo a partir do hibrido- ma, incorporação do gene em um vetor apropriado e introdução do vetor em um hospedeiro e pode ser usado como um anticorpo monoclonal (vide, por exemplo, Vandamme, A. M. e outros, Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775). Especificamente, o gene pode ser obtido a partir de células de hibridoma que produzem um anticorpo anti-DSG3 através de isolamento de mRNA que codifica a região variável (região V) do anticorpo anti-DSG3. Isto é, RNA total pode ser preparado a partir de células de hibridoma por meio de um método conhecido, tal como o método de ultracentrifugação com guanidina (Chirg- win, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ou o método AGPC (Chomczynski, P. e outros, Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) e, então, o mRNA de interesse pode ser preparado usando um kit de purificação de mRNA (GE Healthcare Bio-Sciences) ou similar. Além disso, mRNA também pode ser diretamente preparado a partir de hibridoma usando o kit de Purifi- cação de mRNA QuickPrep (GE Healthcare Bio-Sciences). cDNA da região V do anticorpo pode ser sintetizado a partir do mRNA obtido usando transcriptase reversa. cDNA pode ser sintetizado u- sando o Kit AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis (SEI- KAGAKU CORPORATION) ou similar. Para sintetizar e amplificar cDNA, por exemplo, o kit 5'-Ampli FINDER RACE (CIontech) e o método de 5-RACE usando PCR (Frohman, M. A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, .8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919- .2932) também pode ser usado favoravelmente e, no processo de tal síntese de cDNA, sítios de enzima de restrição apropriados, os quais serão descritos depois, podem ser introduzidos em ambas as extremidades do cDNA. O fragmento de cDNA de interesse é purificado do produto de PCR obtido e, então, ligado a um DNA de vetor. O vetor recombinante é preparado dessa maneira e introduzido em Escherichia coli ou similar e, a- pós colônias serem selecionadas, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir de E. coli que formou as colônias. Se o vetor recombinan- te tem ou não a seqüência de nucleotídeo de cDNA de interesse pode ser confirmado através de um método conhecido, tal como o método de término de cadeia de dideoxinucleotídeo. Uma vez que o cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-DSG3 de interesse é obtido, esse cDNA é digerido por enzimas que reconhecem os sítios de enzima de restrição inseridos em am- bas as extremidades desse cDNA. O cDNA que codifica a região V do anti- corpo anti-DSG3, o qual foi digerido conforme descrito acima, é incorporado, através de ligação, em um vetor de expressão que contém uma região cons- tante de anticorpo desejada (região C), de modo que o DNA que codifica essa região C pode ser fundida em rede com o cDNA quando digerido com a mesma combinação de enzimas,

Um método preferido para a produção de um anticorpo anti- DSG3 usado na presente invenção é um método que incorpora o gene de anticorpo em um vetor de expressão, de modo que o gene é expresso sob a regulação de uma região de controle de expressão, por exemplo, um intensi- ficador ou um promotor. Em seguida, através de transformação adequada de uma célula hospedeira com esse vetor de expressão, células recombinantes que expressam o DNA que codifica anticorpo anti-DSG3 podem ser obtidas.

Um gene de anticorpo pode ser expresso através de incorpora- ção de um DNA que codifica a cadeia pesada de anticorpo (cadeia H) e um DNA que codifica a cadeia leve de anticorpo (cadeia L) separadamente em vetores de expressão e, então, transformação simultânea de uma célula hospedeira com os vetores; ou através de incorporação de um DNA que co- difica a cadeia Hea cadeia L em um único vetor de expressão e, então, transformação de uma célula hospedeira com o vetor (vide Publicação de Patente Internacional No. WO 94/11523).

Combinações apropriadas de hospedeiros e vetores de expres- são adequados podem ser usadas para isolamento de um gene de anticorpo e introdução do gene em um hospedeiro apropriado para produzi o anticor- po. Quando usando células eucariotas como um hospedeiro, células de ani- mal, células de planta e células fúngicas podem ser usadas. Células de ani- mal conhecidas incluem (1) células de mamífero, tais como células CHO, COS, mieloma, rim de hamster bebê (BHK) e Vero; (2) células de anfíbio, tais como oócitos de Xenopus; e (3) células de inseto, tais como sf9, sf21 e Tn5. Células de planta conhecidas incluem células derivadas do gênero Ni- cotiana, tal como Nicotiana tabacum, a partir das quais caule pode ser culti- vado. Células fúngicas conhecidas incluem levedos, tal como o gênero Sac- charomyces, por exemplo, Saccharomyces eerevisiae e fungos filamentosos, tal como o gênero Aspergilius, por exemplo, AspergiHus niger. Sistemas de produção que utilizam células bacterianas podem ser adequadamente usa- dos quando do uso de células procariotas. Células bacterianas conhecidas incluem E. coli e Bacillus subtilis. Introduzindo vetores de expressão com- preendendo os genes de anticorpo de interesse nessas células através de transformação e, então, cultura das células transformadas in vitro, os anti- corpos desejados podem ser obtidos a partir da cultura de célula transfor- mada.

Além das células hospedeiras acima, animais transgênicos po- dem também ser usados adequadamente para produzir um anticorpo re- combinante. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser inserido em rede em um gene que codifica uma proteína inerentemente produzida em leite, por exemplo, β-caseína de cabra, para construir um gene fundido. Um frag- mento de DNA contendo o gene fundido, o qual tenha sido inserido com o gene de anticorpo, é injetado em um embrião de cabra e, então, esse embri- ão injetado é introduzido em uma cabra fêmea. Anticorpos desejados podem ser obtidos do leite produzido pelo filhote de cabra transgênico da cabra que recebeu o embrião ou prole da mesma. Para aumentar o volume do leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser usados na cabra transgênica, conforme necessário (Ebert, Κ. M. e outros, Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Regiões C de anticorpo derivadas de animal podem ser usadas para as regiões C de um anticorpo recombinante da presente invenção. Por exemplo, Ογ1, CY2a, CY2b, Cy3, Ομ, Cô, Ca1, Ca2 e Ce podem ser usadas para a cadeia H e Ck e CX podem ser usadas para a região C de cadeia L. Além de anticorpos de camundongo, anticorpos de animais tais como ratos, coelhos, cabra, ovelha, camelos e macacos podem ser usados como anti- corpos de animal. Suas seqüências são conhecidas. Além disso, a região C pode ser modificada para melhorar a estabilidade dos anticorpos ou sua produção.

Na presente invenção, anticorpos geneticamente recombinantes que são artificialmente modificados para fins de reduzir a xeno- antigenicidade contra seres humanos ou similar podem ser usados. Exem- plos dos mesmos incluem anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Esses anticorpos modificados podem ser produzidos usando métodos co- nhecidos. Um anticorpo quimérico é um anticorpo compreendendo as regi- ões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo de um mamífero não-humano, tal como um camundongo, e as regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo de um ser humano. O DNA que codifica uma região variável de anticorpo de camundongo é ligado ao DNA que codi- fica uma região constante de anticorpo humano e esse é incorporado em um vetor de expressão para produzir um vetor recombinante expressando o DNA. As células recombinantes que foram transformadas com o vetor são cultivadas e o DNA incorporado é expresso para obter o anticorpo quimérico produzido na cultura.

A região C de anticorpo humano pode ser usada para as regiões C do anticorpo quimérico e anticorpo humanizado e, por exemplo, Cy1, Cy2a, Cy2b, Cy3, Cy4, Ομ, Cô, Ca1, Ca2 e Ce podem ser usadas para a cadeia H e Ck e CX podem ser usadas para a cadeia L. Suas seqüências são conhecidas. Além disso, a região C de anticorpo humano pode ser modi- ficada para melhorar a estabilidade do anticorpo ou sua produção.

Um anticorpo quimérico consiste na região V de um anticorpo derivado de um animal não-humano e uma região C derivada de um anticor- po humano. Por outro lado, um anticorpo humanizado consiste na região de determinação de complementaridade (CDR) de um anticorpo derivado de um animal não-humano e da região de estrutura (FR) e região C derivadas de um anticorpo humano. Uma vez que a antigenicidade de um anticorpo hu- manizado no corpo humano é reduzida, um anticorpo humanizado é útil co- mo um ingrediente ativo para agentes terapêuticos da presente invenção.

Um anticorpo humanizado, o qual é também denominado um anticorpo humano reformatado, é obtido através de transplante, em lugar da CDR de anticorpo humano, da CDR de um anticorpo de animal não-humano tal como um anticorpo de camundongo e técnicas de recombinação genética comuns para tal preparo são conhecidas. Especificamente, uma seqüência de DNA é projetada para ligação de uma CDR de anticorpo de camundongo em rede com uma FR de anticorpo humano e é sintetizada através de PCR usando vários oligonucleotídeos projetados para conter porções de sobrepo- sição em suas extremidades como primers. Um vetor de integração pode ser produzido através de inserção do DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano em um vetor de ex- pressão, de modo que eles se ligarão em rede. Após incorporação desse vetor de integração em um hospedeiro para estabelecer células recombinan- tes, as células recombinantes são cultivadas e o DNA que codifica o anticor- po humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura de célula (vide Pedido de Patente Européia No. EP 239.400 e Pedido de Pa- tente Internacional No. WO 96/02576).

Medindo qualitativa ou quantitativamente e avaliando a atividade do anticorpo humanizado produzido conforme descrito acima de se ligar a antígenos, FRs de anticorpo humano que fariam as CDRs formar um sítio de ligação a antígeno favorável quando ligadas através das CDRs podem ser adequadamente selecionadas. Conforme necessário, aminoácidos em uma FR podem ser substituídos de modo que as CDRs de um anticorpo humano reformatado formem um sítio de ligação a antígeno apropriado. A substitui- ção de aminoácido mencionada acima pode ser introduzida usando, apropri- adamente, o método de PCR usado quando de fusão da CDR de camun- dongo com a FR humana e seqüências de FR mutante tendo as característi- cas desejadas podem ser selecionadas através de medição e avaliação da atividade do anticorpo mutante aminoácido-substituído de se ligar ao antíge- no através do método mencionado acima (Sato, K. e outros, Câncer Res. .1993, 53, 851-856).

Métodos para obtenção de anticorpos humanos também são conhecidos. Por exemplo, anticorpos humanos desejados com atividade de ligação a antígeno podem ser obtidos sintetizando linfócitos humanos com um antígeno desejado ou células expressando um antígeno desejado in vi- tro; e fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma humano, tal como U266 (vide JP-B H01-59878). Alternativamente, um anticorpo humano desejado pode ser obtido usando um antígeno desejado para imunizar um animal transgênico que compreende todo o repertório de genes de anticorpo humano (vide Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 93/12227, WO .92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 e WO 96/33735). Além disso, técnicas para obter anticorpos humanos através de panning de uma biblioteca de anticorpo humano também são conhecidas. Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo com ca- deia simples (scFv) sobre a superfície do fago usando um método de "phage display" e fagos que se ligam ao antígeno podem ser selecionados. Anali- sando os genes de fagos selecionados, as seqüências de DNA que codifi- cam as regiões V de anticorpos humanos que se ligam ao antígeno podem D ser determinadas. Após determinação das seqüências de DNA de scFvs que se ligam ao antígeno, a seqüência da região V é fundida em rede com a se- qüência da região C de anticorpo humano desejada e essa é inserida em um vetor de expressão adequado, tal como aquele descrito acima e o gene que codifica o anticorpo humano pode ser expresso para obter os anticorpos i humanos. Tais métodos são bem-conhecidos e referência pode ser feita aos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 92/01047, WO 92/20791, WO .93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 e WO 95/15388.

O anticorpo usado na presente invenção não está limitado a an- ticorpos bivalentes representados por IgG, mas inclui anticorpos monovalen- tes e anticorpos multivalentes representados por IgM, na medida em que ele se ligue à proteína DSG3. O anticorpo multivalente da presente invenção inclui um anticorpo multivalente que tem os mesmos sítios de ligação a antí- geno e um anticorpo multivalente que tem sítios de ligação a antígeno parci- al ou completamente diferentes.

O anticorpo usado na presente invenção não está limitado à mo- lécula de anticorpo inteira, mas inclui minicorpos e produtos modificados dos mesmos, na medida em que eles se liguem à proteína DSG3.

Um minicorpo compreende fragmentos de anticorpo carecendo de uma porção de um anticorpo inteiro (por exemplo, IgG inteira) e não está particularmente limitado, na medida em que ele tenha capacidade de ligação a antígeno. Não existem limitações particulares sobre os fragmentos de anti- corpo da presente invenção, na medida em que eles sejam porções de um anticorpo inteiro mas, de preferência, eles contêm uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL). A seqüên- cia de aminoácido de VH ou VL pode ter substituições, deleções, adições e/ou inserções. Além disso, na medida em que ela tenha capacidade de Ii- gação a antígeno, parte da VH e/ou VL pode ser deletada. A região variável pode ser quimerizada ou humanizada. Exemplos específicos dos fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Exemplos específicos de mini- corpos incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv com cadeia simples), diacor- po e sc(Fv)2 ((Fv)2 com cadeia simples). Multímeros desses anticorpos (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e polímeros) também são incluídos nos minicorpos da presente invenção.

Fragmentos de anticorpo podem ser produzidos através de tra- tamento de um anticorpo com uma enzima, tal como papaína ou pepsina. Alternativamente, genes que codificam esses fragmentos de anticorpo po- dem ser construídos, introduzidos em vetores de expressão e expressos em células hospedeiras apropriadas (vide, por exemplo, Co, M. S. e outros, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. e Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. e Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods in Enzymology (1989) .121, 663-669; e Bird, R. E. e outros, TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Um diacorpo refere-se a um fragmento de anticorpo bivalente construído através de fusão de gene (Hollinger P. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161; e similares). Um diacorpo é um dímero composto de duas cadeias polipeptídicas e, em geral, as cadeias polipeptídicas são individualmente ligadas através de um ligante, por exemplo, de cinco resíduos ou similar, o qual é curto o bastante para impedir ligação entre VL e VH na mesma cadeia. VL e VH que são codifica- das pela mesma cadeia polipeptídica têm um ligante curto entre as mesmas e formam um dímero porque elas não contêm um fragmento de região variá- vel de cadeia simples. Portanto, diacorpos têm dois sítios de ligação a antí- geno. scFv pode ser obtido através de ligação da região V de cadeia H e da região V de cadeia L de um anticorpo. Nesse scFv, a região V de ca- deia Hea região V de cadeia L são ligadas via um ligante, de preferência um ligante peptídico (Huston, J. S. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., .1988, 85, 5879-5883). A região V de cadeia Hea região V de cadeia L do scFv podem ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos aqui. O ligante peptídico para ligação das regiões V não está particularmente limita- do mas, por exemplo, qualquer peptídeo com cadeia simples consistindo em .3 a 25 resíduos ou similar ou um ligante peptídico descrito abaixo pode ser usado. Métodos de PCR1 tais como aqueles descritos acima, podem ser u- sados para ligação das regiões V. Um DNA que codifica scFv pode ser am- plificado através de um método de PCR usando, como um template, um DNA inteiro ou um DNA parcial que codifica uma seqüência de aminoácido desejada selecionada de uma seqüência de DNA que codifica a região V de cadeia H ou cadeia L do anticorpo mencionado acima e uma seqüência de DNA que codifica a região V de cadeia L ou cadeia H do anticorpo mencio- nado acima; e usando um par de primer tendo seqüências correspondendo às seqüências das duas extremidades. Em seguida, um DNA compreenden- do a seqüência desejada pode ser obtida realizando uma reação de PCR usando a combinação de um DNA que codifica a porção de ligante peptídico e um par de primer tendo seqüências projetadas de modo que ambas as extremidades do DNA sejam ligadas à cadeia H e cadeia L. Uma vez que o DNA que codifica scFv é construído, vetores de expressão contendo o DNA e células recombinantes transformadas através desses vetores de expres- são podem ser obtidos de acordo com métodos convencionais. Além disso, os scFvs podem ser obtidos através de cultura das células recombinantes resultantes e expressão de DNA que codifica scFv.

sc(Fv)2 é um minicorpo preparado através de ligação de duas VHs e duas VLs com Iigantes ou similar para formar uma cadeia simples (Hudson e outros, J. Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). sc(Fv)2 pode ser produzido, por exemplo, através de união de scFvs com um ligante.

Além disso, anticorpos nos quais duas VHs e duas VLs estão dispostas na ordem de VH1 VL, VH e VL ([VH]-ligante-[VL]-ligante-[VH]- ligante-[VL]), começando a partir do lado N-terminal de um polipeptídeo com cadeia simples são preferidos.

A ordem das duas VHs e das duas VLs não está particularmente limitada à disposição mencionada acima e eles podem ser colocadas em qualquer ordem. Exemplos incluem as disposições a seguir: [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL] [VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH] [VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL] [VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH] [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VH] Qualquer Iigante arbitrário pode ser introduzido através de enge- nharia genética e Iigantes sintéticos (vide, por exemplo, aqueles descritos em Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996) ou similar podem ser usados como Iigantes para ligação das regiões variáveis de anticorpo mas, na pre- sente invenção, Iigantes peptídicos são preferíveis. O comprimento dos Ii- gantes peptídicos não está particularmente limitado e pode ser adequada- mente selecionado por aqueles versados na técnica de acordo com a finali- dade; contudo, o comprimento é geralmente de 1 a 100 aminoácidos, de pre- ferência 3 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente 5 a 30 aminoácidos e, particularmente de preferência, 12 a 18 aminoácidos (por exemplo, 15 ami- noácidos).

Exemplos de Iigantes peptídicos incluem: Ser

Gly-Ser

Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 72) Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 73) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 74) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 75) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 76) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 77) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 78) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 79) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 74))n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 75))n

no qual η é um número inteiro de 1 ou maior. O comprimento e seqüência dos Iigantes peptídicos podem ser selecionados apropriadamente por aque- les versados na técnica de acordo com a finalidade.

Portanto, uma modalidade particularmente preferida de sc(Fv)2 na presente invenção é, por exemplo, o seguinte sc(Fv)2:

[VH]-ligante peptídico (15 aminoácidos)-[VL]-ligante peptídico (15 aminoáci- dos)-[VH]-ligante peptídico (15 aminoácidos)-[VL]

Ligantes químicos sintéticos (agentes de ligação cruzada quími- cos) os quais incluem agentes de reticulação rotineiramente usados para ligar cruzadamente peptídeos são, por exemplo, N-hidróxi succinimida (NHS), suberato de dissuccinimidila (DSS), suberato de bis(sulfo- succinimidila) (BS3), ditiobis(succinimidil propionato) (DSP), ditiobis(sulfo- succinimidil propionato) (DTSSP), etileno glicol bis(succinimidil succinato) (EGS), etileno glicol bis(sulfo-succinimidil succinato) (sulfo-EGS), tartrato de dissuccinimidila (DST), tartrato de di-sulfo-succinimidila (sulfo-DST), bis[2- (succinimidoxicarbonilóxi)etil] sulfona (BSOCOES) e bis[2-(sulfo- succinimidoxicarbonilóxi)etil] sulfona (sulfo-BSOCOES). Esses agentes de ligação cruzada estão comercialmente disponíveis.

Usualmente, três Iigantes são requeridos para ligar quatro regi- ões variáveis de anticorpo. Os Iigantes a serem usados podem ser todos do mesmo tipo ou de tipos diferentes. Na presente invenção, um minicorpo pre- ferido é um diacorpo ou um sc(Fv)2. Tal minicorpo pode ser obtido através de tratamento de um anticorpo com uma enzima, tal como papaína ou pep- sina, para gerar fragmentos de anticorpo ou construindo DNAs que codificam esses fragmentos de anticorpo, introdução dos mesmos em vetores de ex- pressão e, então, em células hospedeiras apropriadas (vide, por exemplo, Co, M. S. e outros, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. e Horwitz, Α. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun1 Α. e Skerra1 Α., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods Enzymol. (1986) 121, .663-669; e Bird, R. E. e Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- .137).

Os anticorpos da presente invenção podem ser exemplificados pelos anticorpos de (1) a (62) abaixo, mas não estão limitados aos mesmos. Os anticorpos de (1) a (62) incluem, por exemplo, anticorpos de comprimen- to total, minicorpos, anticorpos de animal, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos:

(1) um anticorpo que compreende uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 (seqüência da CDR1 de cadeia H do anticorpo DF151) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (seqüência da CDR2 de cadeia H do anticorpo DF151) como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (seqüência da CDR3 de ca- deia H do anticorpo DF151) como CDR3;

(2) um anticorpo que compreende a cadeia H de (1) tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 (seqüência da CH do anticorpo DF151) como CH (região constante de cadeia H);

(3) um anticorpo que compreende a cadeia H de (1) tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (seqüência da CH do anticorpo quimérico de camundongo-humano DF151) como CH;

(4)um anticorpo que compreende uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 (seqüência da CDR1 de cadeia L do anticorpo DF151) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 (seqüência da CDR2 de cadeia L do anticorpo DF151) como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 (seqüência da CDR3 de ca- deia L do anticorpo DF151) como CDR3;

(5)um anticorpo que compreende a cadeia L de (4) tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 (seqüência da CL do anticorpo DF151) como CL (região constante de cadeia L);

(6) um anticorpo que compreende a cadeia L de (4) tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 (seqüência da CL do anticorpo

quimérico de camundongo-humano DF151) como CL;

(7) um anticorpo que compreende a cadeia H de (1) e a cadeia L

de (4);

(8) um anticorpo que compreende a cadeia H de (2) e a cadeia L de (5);

(9) um anticorpo que compreende a cadeia H de (3) e a cadeia L de (6);

(10) um anticorpo que compreende uma cadeia H tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 (seqüência da CDR1 de cadeia H do anticorpo DF364) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 (seqüência da CDR2 de cadeia H do anticorpo DF364) como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 (seqüência da CDR3 de cadeia H do anticorpo DF364) como CDR3; (11) um anticorpo que compreende a cadeia H de (10) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 (seqüência da CH do anticorpo DF364) como CH;

(12) um anticorpo que compreende a cadeia H de (10) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (seqüência da CH do anticorpo quimérico de camundongo-humano DF364) como CH;

(13) um anticorpo que compreende uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 (seqüência da CDR1 de cadeia L do anticorpo DF364) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 (seqüência da CDR2 de cadeia L do anticorpo DF364) como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (seqüência da CDR3 de ca- deia L do anticorpo DF364) como CDR3;

(14) um anticorpo que compreende a cadeia L de (13) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 (seqüência da CL do anticorpo DF364) como CL;

15) um anticorpo que compreende a cadeia L de (13) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 (seqüência da CL do anticorpo quimérico de camundongo-humano DF364) como CL; (16) um anticorpo que compreende a cadeia H de (10) e a ca- deia L de (13);

(17) um anticorpo que compreende a cadeia H de (11) e a ca- deia L de (14);

(18) um anticorpo que compreende a cadeia H de (12) e a ca-

deia L de (15);

(19) um anticorpo que compreende a cadeia H de (1) e a cadeia

Lde (13);

(20) um anticorpo que compreende a cadeia H de (2) e a cadeia

L de (14);

(21) um anticorpo que compreende a cadeia H de (3) e a cadeia

Lde (15);

(22) um anticorpo que compreende a cadeia H de (10) e a ca- deia L de (4);

(23) um anticorpo que compreende a cadeia H de (11) e a ca-

deia L de (5);

(24) um anticorpo que compreende a cadeia H de (12) e a ca- deia L de (6);

(25) um anticorpo que compreende uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 (seqüência da CDR1 de cadeia H do anticorpo DF366) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 (seqüência da CDR2 de cadeia H do anticorpo DF366) como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 (seqüência da CDR3 de cadeia H do anticorpo DF366) como CDR3;

(26) um anticorpo que compreende a cadeia H de (25) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 (seqüência da CH do anticorpo DF366) como CH;

(27) um anticorpo que compreende a cadeia H de (25) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (seqüência da CH do anticorpo quimérico de camundongo-humano DF366) como CH;

(28) um anticorpo que compreende uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 87 (seqüência da CDR1 de cadeia L do anticorpo DF366) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 89 (seqüência da CDR2 de cadeia L do anticorpo DF366) como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 (seqüência da CDR3 de ca- deia L do anticorpo DF366) como CDR3;

(29) um anticorpo que compreende a cadeia L de (28) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 (seqüência da CL do anticorpo DF366) como CL;

(30) um anticorpo que compreende a cadeia L de (28) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 (seqüência da CL do anticorpo quimérico de camundongo-humano DF366) como CL;

(31) um anticorpo que compreende a cadeia H de (25) e a ca- deia L de (28);

(32) um anticorpo que compreende a cadeia H de (26) e a ca- deia L de (29);

(33) um anticorpo que compreende a cadeia H de (27) e a ca- deia L de (30);

(34) um anticorpo que compreende a cadeia H de (1) e a cadeia L de (28);

(35) um anticorpo que compreende a cadeia H de (2) e a cadeia L de (29);

(36) um anticorpo que compreende a cadeia H de (3) e a cadeia L de (30);

(37) um anticorpo que compreende a cadeia H de (10) e a ca- deia L de (28);

(38) um anticorpo que compreende a cadeia H de (11) e a ca- deia L de (29);

(39) um anticorpo que compreende a cadeia H de (12) e a ca- deia L de (30);

(40) um anticorpo que compreende a cadeia H de (25) e a ca-

deia L de (4);

(41) um anticorpo que compreende a cadeia H de (26) e a ca- deia L de (5); (42) um anticorpo que compreende a cadeia H de (27) e a ca- deia L de (6);

(43) um anticorpo que compreende a cadeia H de (25) e a ca- deia L de (13);

(44) um anticorpo que compreende a cadeia H de (26) e a ca- deia L de (14);

(45) um anticorpo que compreende a cadeia H de (27) e a ca- deia L de (15);

(46) um anticorpo que compreende a cadeia H de (1) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 108 (seqüência da CH de um anti- corpo de lgG2a de camundongo) como CH;

(47) um anticorpo que compreende a cadeia L de (4) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (seqüência da CL de um anti- corpo de lgG2a de camundongo) como CL;

(48) um anticorpo que compreende a cadeia H de (10) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 108 (seqüência da CH de um anti- corpo de lgG2a de camundongo) como CH;

(49) um anticorpo que compreende a cadeia L de (13) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (seqüência da CL de um anti- corpo de lgG2a de camundongo) como CL;

(50) um anticorpo que compreende a cadeia H de (25) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 108 (seqüência da CH de um anti- corpo de lgG2a de camundongo) como CH;

(51) um anticorpo que compreende a cadeia L de (28) tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (seqüência da CL de um anti- corpo de lgG2a de camundongo) como CL;

(52) um anticorpo que compreende a cadeia H de (46) e a ca- deia L de (47);

(53) um anticorpo que compreende a cadeia H de (48) e a ca- deia L de (49);

(54) um anticorpo que compreende a cadeia H de (50) e a ca- deia L de (51); (55) um anticorpo que compreende a cadeia H de (46) e a ca- deia L de (49);

(56) um anticorpo que compreende a cadeia H de (48) e a ca- deia L de (51);

(57) um anticorpo que compreende a cadeia H de (50) e a ca- deia L de (47);

(58) um anticorpo que compreende a cadeia H de (46) e a ca- deia L de (51);

(59) um anticorpo que compreende a cadeia H de (48) e a ca- deia L de (47);

(60) um anticorpo que compreende a cadeia H de (50) e a ca- deia L de (49);

(61) um anticorpo tendo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções de aminoácido no anticorpo de qualquer um de (1) a

(60) e tendo uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (60); e

(62) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o epítopo de proteína DSG3 ao qual o anticorpo de qualquer um de (1) a (60) se liga.

Um exemplo de VH na "cadeia H tendo a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 2 (seqüência da CDR1 de cadeia H do anticorpo DF151) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (seqüên- cia da CDR2 de cadeia H do anticorpo DF151) como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (seqüência da CDR3 de cadeia H do anti- corpo DF151) como CDR3" mencionada acima de (1) inclui uma VH tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 46 (seqüência de VH do anticorpo DF151).

Um exemplo de VL na "cadeia L tendo a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 12 (seqüência da CDR1 de cadeia L do anticorpo DF151) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 (se- quência da CDR2 de cadeia L do anticorpo DF151) como CDR2 e a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 16 (seqüência da CDR3 de cadeia L do anticorpo DF151) como CDR3" mencionada acima de (4) inclui uma VL ten- do a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 48 (seqüência de VL do anti- corpo DF151).

Um exemplo de VH na "cadeia H tendo a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 22 (seqüência da CDR1 de cadeia H do anticorpo DF364) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 (se- qüência da CDR2 de cadeia H do anticorpo DF364) como CDR2 e a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 (seqüência da CDR3 de cadeia H do anticorpo DF364) como CDR3" mencionada acima de (10) inclui uma VH tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (seqüência de VH do anticorpo DF364).

Um exemplo de VL na "cadeia L tendo a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 30 (seqüência da CDR1 de cadeia L do anticorpo DF364) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 (se- qüência da CDR2 de cadeia L do anticorpo DF364) como CDR2 e a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (seqüência da CDR3 de cadeia L do anticorpo DF364) como CDR3" mencionada acima de (13) inclui uma VL tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (seqüência de VL do anticorpo DF364).

Um exemplo de VH na "cadeia H tendo a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 81 (seqüência da CDR1 de cadeia H do anticorpo DF366) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 (se- qüência da CDR2 de cadeia H do anticorpo DF366) como CDR2 e a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 (seqüência da CDR3 de cadeia H do anticorpo DF366) como CDR3" mencionada acima de (25) inclui uma VH tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 93 (seqüência de VH do anticorpo DF366).

Um exemplo de VL na "cadeia L tendo a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 87 (seqüência da CDR1 de cadeia L do anticorpo DF366) como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 89 (se- quência da CDR2 de cadeia L do anticorpo DF366) como CDR2 e a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 91 (seqüência da CDR3 de cadeia L do anticorpo DF366) como CDR3" mencionada acima de (28) inclui uma VL tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 95 (seqüência de VL do anticorpo DF366).

Uma modalidade preferida do anticorpo mencionado acima de (61) é um anticorpo no qual a CDR não tenha sido modificada. Como um exemplo, uma modalidade preferida de "um anticorpo tendo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções de aminoácido no anticorpo de (1) e tendo uma atividade equivalente àquela do anticorpo de (1)" entre o anticorpo acima mencionado de (61) é "um anticorpo tendo uma atividade equivalente àquela do anticorpo de (1) e tendo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções de aminoácido no anticorpo de (1) e tam- bém compreendendo uma cadeia H tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como CDR3". Modalidades preferidas de outros anticorpos incluídos no anticorpo acima mencionado de (61) podem ser expressas de uma maneira similar.

Métodos de introdução de mutações em polipeptídeos são bem- conhecidos por aqueles versados na técnica como métodos para o preparo de polipeptídeos que são funcionalmente equivalentes a um determinado polipeptídeos. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem preparar um anticorpo funcionalmente equivalente a um anticorpo da presente inven- ção através de introdução de mutações apropriadas no anticorpo usando mutagênese sítio-dirigida (Hashimoto-Gotoh, T. e outros (1995) Gene 152, .271-275; Zoller1 MJ e Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. e outros (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W e Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, .2763-2766) e similares. Mutações de aminoácido também podem ocorrer naturalmente. Dessa forma, os anticorpos da presente invenção também compreendem anticorpos compreendendo seqüências de aminoácido com uma ou mais mutações de aminoácido nas seqüências de aminoácido dos anticorpos da presente invenção e os quais são funcionalmente equivalentes aos anticorpos da presente invenção. O número de aminoácidos que sofrem mutação em tais mutantes é, em geral, considerado como sendo 50 aminoá- cidos ou menos, de preferência 30 aminoácidos ou menos e, mais preferi- velmente, 10 aminoácidos ou menos (por exemplo, 5 aminoácidos ou me- nos).

E desejável que os resíduos de aminoácido sofram mutação em aminoácidos nos quais as propriedades das cadeias laterais de aminoácido sejam conservadas. Exemplos de propriedades da cadeia lateral de aminoá- cido incluem: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoá- cidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S e T), aminoácidos compreen- dendo as seguintes cadeias laterais: cadeias laterais alifáticas (G, A, V, L, I e P); cadeias laterais contendo hidroxila (S, T e Y); cadeias laterais contendo enxofre (C e M); cadeias laterais contendo ácido carboxílico e amida (D, Ν, E e Q); cadeias laterais básicas (R, K e H); ou cadeias laterais contendo anel aromático (H, F, Y e W) (aminoácidos são representados pelos códigos de uma letra entre parênteses).

Polipeptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido modificada, na qual um ou mais resíduos de aminoácido em uma determina- da seqüência de aminoácido são deletados, adicionados e/ou substituídos por outros aminoácidos são conhecidos por reter suas atividades biológicas originais (Mark, D. F. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81, 5662- .5666; Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487- .6500; Wang, A. e outros, Science 224, 1431-1433; DaIbadie-McFarIand, G. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982) 79, 6409-6413).

Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos anti-DSG3 descritos na presente invenção também são proporcionados. Tais anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, através do método a seguir.

Para determinar se um anticorpo de teste pode competir pela ligação ao mesmo epítopo ligado pelos anticorpos anti-DSG3 descritos na invenção do presente pedido, um ensaio de bloqueio cruzado, por exemplo, um ensaio ELISA competitivo, pode ser realizado. Por exemplo, em um en- saio ELISA competitivo, cavidades de uma lâmina de microtitulação revesti- das com proteína DSG3 são pré-incubadas com ou sem um anticorpo de competição candidato e, então, um anticorpo anti-DSG3 biotina-rotulado da presente invenção é adicionado. A quantidade de anticorpo anti-DSG3 rotu- lado ligado à proteína DSG3 nas cavidades pode ser medida usando um conjugado de avidina-peroxidase e um substrato apropriado. O anticorpo pode ser rotulado, por exemplo, com um rótulo radioativo ou rótulo fluores- cente ou algum outro rótulo detectável e mensurável. A quantidade de anti- corpo anti-DSG3 rotulado ligado à proteína DSG3 está indiretamente corre- lacionada com a capacidade de ligação do anticorpo de competição candida- to (anticorpo de teste) que compete pela ligação ao mesmo epítopo. Isto é, quanto maior a afinidade do anticorpo de teste pelo mesmo epítopo, menor a atividade de ligação do anticorpo anti-DSG3 rotulado às cavidades revesti- das com proteína DSG3. Um anticorpo de competição candidato é conside- rado como sendo um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epí- topo ou que compete pela ligação ao mesmo epítopo que um anticorpo anti- DSG3 da presente invenção se o anticorpo de competição candidato pode bloquear a ligação do anticorpo anti-DSG3 em pelo menos 20%, de prefe- rência em pelo menos 20% a 50% e, ainda mais preferivelmente, em pelo menos 50% quando comparado com a atividade de ligação obtida em um experimento de controle realizado na ausência do anticorpo de competição candidato.

Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos anti-DSG3 incluem, por exemplo, o anticorpo acima mencionado de (62), mas não estão limitados ao mesmo.

Conforme descrito acima, os anticorpos acima mencionados de (1) a (62) incluem não apenas anticorpos monovalentes com duas ou mais valências. Anticorpos multivalentes da presente invenção incluem anticorpos multivalentes cujos sítios de ligação a antígeno são todos os mesmos e anti- corpos multivalentes cujos sítios de ligação a antígeno são parcial ou com- pletamente diferentes. Os seguintes anticorpos são exemplos de anticorpos multivalen- tes que têm diferentes sítios de ligação a antígeno, mas os anticorpos da presente invenção não estão limitados aos mesmos: um anticorpo compreendendo pelo menos dois pares de cadeia H e cadeia L (aqui depois referidos como pares de HL) selecionados dos pares de HL de (7), (16), (19), (22), (31), (34), (37), (40) e (43);

um anticorpo compreendendo pelo menos dois pares de HL se- lecionados dos pares de HL de (8), (17), (20), (23), (32), (35), (38), (41) e (44);

um anticorpo compreendendo pelo menos dois pares de HL se- lecionados dos pares de HL de (9), (18), (21), (24), (33), (36), (39), (42) e (45); e

um anticorpo compreendendo pelo menos dois pares de HL se- lecionados dos pares de HL de (52) a (60).

Anticorpos ligados a vários tipos de moléculas, tal como polieti- Ieno glicol (PEG) podem também ser usados com anticorpos modificados. Além disso, agentes quimioterapêuticos, peptídeos tóxicos ou substâncias químicas radioativas podem ser ligadas aos anticorpos. Tais anticorpos mo- dificados (aqui depois referidos como conjugados de anticorpo) podem ser obtidos submetendo os anticorpos obtidos à modificação química. Métodos para modificação de anticorpos já são estabelecidos nesse campo. Além disso, conforme descrito abaixo, tais anticorpos também podem ser obtidos na forma molecular de um anticorpo biespecífico projetado usando técnicas de engenharia genética para reconhecer não apenas proteínas DSG3, mas também agentes quimioterapêuticos, peptídeos tóxicos, compostos químicos radioativos ou similar. Esses anticorpos são incluídos nos "anticorpos" da presente invenção.

Agentes quimioterapêuticos de baixo peso molecular, tais como azaribina, anastrozola, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina-1, busulfan, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clo- rambucila, cisplatina, irinotecan, carboplatina, cladribina, ciclofosfamida, cita- rabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, glucuronida de daunomicina, daunorubicina, dexametasona, dietilstilbestrol, doxorubicina, glucuronida de doxorubicina, epirubicina, etinil estradiol, estramustina, etoposídeo, glucuro- nida de etoposídeo, floxuridina, fludarabina, flutamida, fluorouracila, fluoxi- mesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiuréia, ida- rubicina, ifosfamida, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de me- droxiprogesterona, acetato de megestrol, melphalan, mercaptopurina, meto- trexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenilbutirato, pred- nisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, estreptozocina de semustina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguani- na, tiotepa, teniposídeo, topotecan, mostarda de uracila, vinblastina, vinorel- bina e vincristina podem ser adequadamente usados como agentes quimio- terapêuticos (incluindo pró-fármacos que são convertidos a tais agentes quimioterapêuticos não-enzimática ou enzimaticamente in vivo) que são li- gados aos anticorpos anti-DSG3 para levar à atividade citotóxica. Além dis- so, peptídeos tóxicos, tais como ricina, abrina, ribonuclease, onconase, DNase I, enterotoxina A Estafilocócica, proteína anti-viral de fitolaca ameri- cana, gelonina, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas, L-asparaginase e PEG L-Asparaginase também podem ser adequadamente usados. Em outra modalidade, um ou mais dos agentes quimioterapêuticos de baixo peso molecular podem ser adequadamente u- sados em combinação e um ou mais dos peptídeos tóxicos. Para a ligação entre um anticorpo anti-DSG3 e o agente quimioterapêutico de baixo peso molecular acima mencionado, uma ligação covalente ou ligação não cova- Iente pode ser adequadamente selecionada e métodos para preparo de anti- corpos agente quimioterapêutico-ligados são conhecidos.

Além disso, para a ligação com agentes farmacêuticos proteiná- ceos ou toxinas, técnicas de recombinação de gene podem ser usadas para construir um vetor recombinante no qual um DNA que codifica o peptídeo tóxico acima mencionado e um DNA que codifica um anticorpo anti-DSG3 são fundidos em rede e inseridos em um vetor de expressão. Esse vetor é introduzido em células hospedeiras adequadas e células transformadas são obtidas e cultivadas. Proteínas recombinantes podem ser preparadas atra- vés de expressão do DNA incorporado.

Além disso, o anticorpo usado na presente invenção pode ser um anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico pode ter sítios de ligação a antígeno que reconhecem diferentes epítopos sobre uma molécula de DSG3. alternativamente, um sítio de ligação a antígeno pode reconhecer a DSG3 e o outro sítio de ligação a antígeno pode reconhecer uma substância citotóxica, tal como um agente quimioterapêutico, peptídeo tóxico ou subs- tância química radioativa. Isso permite que a substância citotóxica atue dire- tamente sobre células expressando DSG3, desse modo, danificando especi- ficamente células tumorígenas e suprimindo a proliferação de células tumo- rígenas. Alternativamente, pode-se preparar um anticorpo biespecífico no qual o outro sítio de ligação a antígeno reconhece um antígeno que é similar, mas diferente da DSG3, e especificamente expresso sobre a superfície das células cancerígenas alvo. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de ligação dos pares de HL de dois tipos de anticorpos ou através de fusão de hibridomas que produzem diferentes anticorpos monoclonais para preparar células fundidas que produzem anticorpo biespecífico. Anticorpos biespecíficos também podem ser preparados através de técnicas de enge- nharia genética.

Genes de anticorpo construídos descritos acima podem ser obti- dos através de expressão por meio de métodos conhecidos. No caso de cé- lulas de mamífero, os genes de anticorpo podem ser expressos através de ligação operável de um promotor eficaz comumente usado, o gene de anti- corpo a ser expresso e um sinal poliA sobre seu lado 3' a jusante. Um e- xemplo do promotor/intensificador é o promotor/intensificador imediato pre- coce do citomegalovírus humano.

Exemplos de outros promotores/intensificadores que podem ser usados para expressão de um anticorpo a ser usado na presente invenção incluem promotores/intensificadores virais, polioma vírus, adenovírus ou ví- rus simian 40 (SV40) e promotores/intensificadores derivados de células de mamífero, tal como o fator 1a de alongamento humano (HEF1a).

Quando um promotor/intensificador de SV40 é usado, expressão de gene pode ser prontamente obtida através do método de Mulligan e ou- tros (Nature (1979) 277, 108) e, quando um promotor/intensificador de HEFIa é usado, expressão de gene pode ser prontamente obtida através do método de Mizushima e outros (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

No caso de E. coli, um promotor eficaz comumente usado, uma seqüência sinalizadora para secreção de anticorpo e o gene de anticorpo a ser expresso são funcionalmente ligados para expressar o gene. Exemplos de um promotor incluem o promotor IacZ e o promotor araB. Quando o pro- motor IacZ é usado, o gene pode ser expresso através do método de Ward e outros (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) e quan- do o promotor araB é usado, o gene pode ser expresso através do método de Better e outros (Science (1988) 240, 1041-1043). Com relação à seqüência sinalizadora para secreção de anticor- po, a seqüência sinalizadora pelB (Lei, S. P. e outros, J. Bacteriol. (1987) .169, 4379) pode ser usada para produção no periplasma de E. coli. Após o anticorpo produzido no periplasma ser isolado, a estrutura de anticorpo é reduplicada usando um desnaturante de proteína, tal como hidrocloreto de guanidina ou uréia, de modo que o anticorpo tenha a atividade de ligação desejada.

A origem de replicação inserida no vetor de expressão inclui, por exemplo, aquela derivada de SV40, polioma vírus, adenovírus ou papiloma vírus bovino (BPV). De forma a amplificar o número de cópias do gene no sistema de célula hospedeira, o vetor de expressão pode ter, por exemplo, o gene de transferase de aminoglicosídeo (ΑΡΗ), o gene de quínase de timidi- na (TK), o gene de fosforibosil transferase de guanina xantina de E. coli (E- cogpt) ou o gene de reductase de di-hidrofolato (dhfr) inserido como um mar- cador de seleção.

Qualquer sistema de expressão, por exemplo, um sistema de célula eucariota ou um sistema de célula procariota, pode ser usado para produzir anticorpos usados na presente invenção. Exemplos de células eu- cariotas incluem células de animal, tal como um sistema de células de mamí- fero estabelecido, sistema de células de inseto e células de fungos filamen- tosos e células de levedo. Exemplos de células procariotas incluem células bacterianas, tais como células de E. coli. Anticorpos usados na presente in- venção são, de preferência, expressos em células de mamífero, tais como células CHO, COS, de mieloma, BHK, Vero ou HeLa.

Em seguida, a célula hospedeira transformada é, então, cultiva- da in vitro ou in vivo para induzir à produção do anticorpo de interesse. As células hospedeiras são cultivadas de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, DMEM, MEM, RPMI 1640 ou IMDM podem ser usados como o meio de cultura. Uma solução de suplemento de soro, tal como soro fetal de bezerro (FCS) pode também ser usada em combinação.

Anticorpos expressos e produzidos conforme descrito acima po- dem ser purificados usando um método simples conhecido ou uma combina- ção adequada de métodos conhecidos geralmente usados para purificação de proteínas. Anticorpos podem ser separados e purificados, por exemplo, através de seleção e combinação apropriada de colunas de afinidade, tais como coluna de proteína A, coluna cromatográfica, filtração, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise e similares (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Meios conhecidos podem ser usados para medir a atividade de ligação a antígeno dos anticorpos (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Har- low, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por exemplo, um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA), um imunoensaio enzimático (EIA), um radioimunoensaio (RIA) ou um fluoroimunoensaio podem ser usa- dos.

Os anticorpos usados na presente invenção pode ser anticorpos com uma cadeia de açúcar modificada. Sabe-se que a atividade citotóxica de um anticorpo pode ser aumentada através de modificação de sua cadeia de açúcar. Anticorpos tendo cadeias de açúcar modificadas são, por exem- plo, anticorpos com glicosilação modificada (por exemplo, WO 99/54342), anticorpos deficientes em fucose os quais são adicionados às cadeias de açúcar (por exemplo, WO 00/61739 e WO 02/31140), anticorpos tendo uma cadeia de açúcar com GIcNAc de bissecção (por exemplo, WO 02/79255). Os anticorpos usados na presente invenção são, de preferência, anticorpos tendo atividade citotóxica.

Na presente invenção, a atividade citotóxica inclui, por exemplo, citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente (ADCC) e atividade cito- tóxica complemento-dependente (CDC). Na presente invenção, atividade de CDC significa atividade citotóxica causada pelo sistema de complemento. Atividade de ADCC refere-se à atividade de danificação de uma célula alvo quando um anticorpo específico se prende a seu antígeno na superfície celu- lar e uma célula trazendo receptor Fcy (célula imune ou similar) se liga à porção Fc do antígeno via o receptor Fcy, danificando a célula alvo.

Um anticorpo anti-DSG3 pode ser testado para ver se ele tem atividade de ADCC ou atividade de CDC usando métodos conhecidos (por exemplo, Current Protocols in Immunology, Capítulo 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E. Coligan e outros, John Wiley & Sons, Inc., (1993) e similares.

Primeiro, especificamente, células efetuadoras, solução de com- plemento e células alvo são preparados. (1) Preparo de células efetuadoras Baço é removido de um camundongo CBA/N ou similar e células do baço são isoladas em meio RPMI1640 (fabricado pela Invitrogen). Após lavagem no mesmo meio contendo soro fetal bovino a 10% (FBS, fabricado pela HyCIone), a concentração de células é ajustada para 5 χ 106/mL para preparar as células efetuadoras.

(2) Preparo de solução de complemento Complemento de Coelho Bebê (fabricado pela CEDARLANE) é diluído 10 vezes em um meio de cultura (fabricado pela Invitrogen) contendo FBS a 10% para preparar uma solução de complemento. (3) Preparo de células alvo As células alvo podem ser radioativamente rotuladas através de incubação de células expressando a proteína DSG3 (células transformadas com um gene que codifica a proteína DSG3, células de câncer de pulmão, células de câncer de cólon, células de câncer esofageal, células de câncer gástrico, células de câncer pancreático, células de câncer de pele, células de câncer uterino e similares) com 0,2 mCi de cromato de sódio-51Cr (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences) em um meio DMEM contendo FBS a 10% durante uma hora a 37°C. Após rotulação radioativa, as células são lavadas três vezes em meio RPM11640 contendo FBS a 10% e as células alvo po- dem ser preparadas através de ajuste da concentração de células para 2 χ .105AnL.

A atividade de ADCC ou atividade de CDC pode ser medida a- través do método descrito abaixo. No caso de medição da atividade de ADCC, a célula alvo e anticorpo anti-DSG3 (50 μΙ_ cada) são adicionados a uma lâmina com fundo em U com 96 cavidades (fabricada pela Becton Dic- kinson) e reagidos durante 15 minutos sobre gelo. A concentração final do anticorpo é ajustada para 0 ou 10 μg/mL. Após cultura, 100 μΙ_ do sobrena- dante são coletados e a radioatividade é medida com um contador gama (COBRAII AUTO-GAMMA, MODELO D5005, fabricado pela Packard Instru- ment Company). A atividade citotóxica (%) pode ser calculada usando os valores obtidos de acordo com a equação: (A - C) / (B - C) χ 100, em que A representa a radioatividade (cpm) em cada amostra, B representa a radioati- vidade (cpm) em uma amostra onde NP-40 a 1% (fabricado pela Nacalai Tesque) foi adicionado e C representa a radioatividade (cpm) de uma amos- tra contendo as células alvo apenas.

Enquanto isso, no caso de medição de atividade de CDC, 50 μί de célula alvo e 50 μί de um anticorpo anti-DSG3 são adicionados a uma lâmina de fundo redondo com 96 cavidades (fabricado pela Becton Dickin- son) e reagidos durante 15 minutos sobre gelo. Após o que, 100 μί de solu- ção de complemento são adicionados e incubados em uma incubara com dióxido de carbono durante quatro horas. A concentração final do anticorpo é ajustada para 0 ou 3 μg/mL. Após incubação, 100 μί de sobrenadante são coletados e a radioatividade é medida com um contador gama. A atividade citotóxica pode ser calculada da mesma forma que a determinação de ativi- dade de ADCC.

Por outro lado, no caso de medição da atividade citotóxica de um conjugado de anticorpo, 50 μί de célula alvo e 50 μί de um conjugado de anticorpo anti-DSG3 são adicionados a uma lâmina de fundo redondo com 96 cavidades (fabricada pela Becton Dickinson) e reagidos durante 15 minutos sobre gelo. Após o que, isso é incubado em uma incubadora com dióxido de carbono durante uma a quatro horas. A concentração final do an- ticorpo é ajustada para 0 ou 3 μ9/ιτιΙ_. Após cultura, 100 μΙ_ de sobrenadante são coletados e a radioatividade é medida com um contador gama. A ativi- dade citotóxica pode ser calculada da mesma maneira conforme na determi- nação de atividade de ADCC.

Um anticorpo da presente invenção tendo atividade citotóxica é, mais preferivelmente, um anticorpo que não tem atividade de dissociação celular. Um anticorpo que não tem atividade de dissociação celular pode ser adequadamente selecionado e obtido através de medição da atividade de dissociação celular que inibe a adesão celular de queratinócitos mesmo em um tubo de ensaio. O método de medição da atividade de dissociação celu- lar pode ser realizado em um tubo de ensaio, por exemplo, através do méto- do descrito em J. Invest. Dermatol., 124, 939-946, 2005. Além disso, como um método para observação dessa atividade celular in vivo, a atividade pode ser avaliada como a atividade de induzir à lesões em PV, os quais são feno- tipos de atividade de dissociação celular in vivo. A atividade de indução de lesão em PV pode ser avaliada através do método descrito em J. Immuno- Iogy 170, 2170-2178,2003. As células cuja proliferação é suprimida pelo anticorpo anti- DSG3 não estão particularmente limitadas, na medida em que elas expres- sem uma proteína DSG3 mas, de preferência, são células cancerígenas e, mais preferivelmente, células de câncer de pulmão, células de câncer de cólon, células de câncer esofageal, células de câncer gástrico, células de câncer pancreático, células de câncer da pele ou células de câncer uterino. Mais preferivelmente, elas são de câncer de pulmão de células não- pequenas. Portanto, o anticorpo anti-DSG3 pode ser usado para fins de tra- tamento ou prevenção de doenças atribuídas à proliferação celular, por e- xemplo, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou câncer uterino, mais prefe- rivelmente câncer de pulmão de células não-pequenas e, ainda mais preferi- velmente, carcinoma de células escamosas do pulmão, adenocarcinoma, carcinoma adenoescamoso ou carcinoma de células grandes.

A presente invenção também proporciona polinucleotídeos que codificam os anticorpos da presente invenção e polinucleotídeos que se hi- bridizam, sob condições estringentes, a esses polinucleotídeos e codificam anticorpos tendo uma atividade equivalente àquela dos anticorpos da pre- sente invenção. A presente invenção também proporciona vetores contendo esses polinucleotídeos e transformantes (incluindo células transformadas) contendo tais vetores. Os polinucleotídeos da presente invenção são políme- ros compreendendo múltiplos nucleotídeos ou pares de base de ácidos deo- xiribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e não estão particular- mente limitados, na medida em que eles codifiquem os anticorpos da pre- sente invenção. Eles também podem conter nucleotídeos não naturais. Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para expressar anticorpos usando técnicas de engenharia genética. Além disso, eles podem ser usados como sondas na seleção de anticorpos que são funcionalmente equivalentes aos anticorpos da presente invenção. Especificamente, um DNA que se hibridiza, sob condições estringentes, ao polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção e codifica um anticorpo tendo uma atividade equivalente àquela do anticorpo da presente invenção, pode ser obtido através de técnicas tal como hibrídização e a técnica de amplifica- ção de gene (por exemplo, PCR), usando o polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção ou uma porção do mesmo, como uma son- da. Tais DNAs são incluídos nos polinucleotídeos da presente invenção. Mé- todos de hibrídização são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica (Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning 2- ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989). Condições para hibrídização incluem, por exem- plo, aquelas com baixa estringência. Exemplos de condições de baixa es- tringência incluem lavagem pós-hibridização sob condições de 0,1 χ SSC e SDS a 0,1% a 42°C e, de preferência, sob condições de 0,1 χ SSC e SDS a .0,1 % a 50°C. Condições de hibrídização mais preferíveis incluem aquelas de alta estringência. Condições altamente estringentes incluem, por exemplo, condições de 5x SSC e SDS a 0,1% a 65°C. Sob essas condições, quanto maior a temperatura, polinucleotídeos tendo alta homologia serão obtidos eficientemente. Contudo, vários fatores, tais como temperatura e concentra- ção de sal, podem influenciar a estringência de hibridização e aqueles ver- sados na técnica podem, adequadamente, selecionar esses fatores para obter estringências similares.

Um anticorpo que é codificado por um polinucleotídeo obtido a- través dessas técnicas de hibridização e amplificação de gene e o qual é funcionalmente equivalente aos anticorpos da presente invenção, usualmen- te tem alta homologia às seqüências de aminoácido desses anticorpos. Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos que são fun- cionalmente equivalentes a e têm alta homologia de seqüência de aminoáci- do aos anticorpos da presente invenção. O termo "alta homologia" geralmen- te refere-se à identidade de aminoácido de pelo menos 50% ou maior, de preferência 75% ou maior, mais preferivelmente 85% ou maior, ainda mais preferivelmente 95% ou maior. A homologia de polipeptídeo pode ser deter- minada através do algoritmo descrito na literatura (Wilbur, W. J. e Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 726-730). Composições farmacêuticas

Em outro aspecto, a presente invenção se caracteriza por com- posições farmacêuticas compreendendo um anticorpo que se liga a uma pro- teína DSG3 como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção se caracteriza por um inibidor de proliferação celular, em particular um agente anticâncer, compreendendo um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 como um ingrediente ativo. Inibidores de proliferação celular e agentes anti- câncer da presente invenção são, de preferência, administrados a um indiví- duo afetado por câncer ou a um indivíduo que é provável de ser afetado por câncer. Indivíduos, na presente invenção, são espécies de animais que tra- zem geneticamente uma proteína DSG3 e são afetadas por câncer ou pro- váveis de serem afetadas por câncer e incluem, por exemplo, mamíferos, tais como seres humanos, macacos, gado, ovelha, camundongos, cães, ga- tos e hamsters, mas não estão limitadas aos mesmos.

Na presente invenção, um inibidor de proliferação celular com- preendendo, como um ingrediente ativo, um anticorpo que se liga a uma pro- teína DSG3 pode também ser descrito como um método para supressão de proliferação celular o qual compreende a etapa de administração de um anti- corpo que se liga a uma proteína DSG3 a um indivíduo ou como uso de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 na produção de um inibidor de proliferação celular.

Além disso, na presente invenção, um agente anticâncer com- preendendo, como um ingrediente ativo, um anticorpo que se liga a uma pro- teína DSG3 também pode ser descrito como um método para prevenção ou tratamento de câncer o qual compreende a etapa de administração de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 a um indivíduo ou como uso de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 na produção de um agente anticâncer.

Na presente invenção, a frase "compreendendo um anticorpo que se liga à DSG3 como um ingrediente ativo" significa compreendendo um anticorpo anti-DSG3 como a principal substância ativa e não limita o teor percentual do anticorpo anti-DSG3.

O anticorpo incluído na composição farmacêutica da presente invenção (por exemplo, inibidor de proliferação celular e agente anticâncer; o mesmo aqui depois) não está particularmente limitado, na medida em que ele se ligue a uma proteína DSG3 e exemplos incluem anticorpos descritos aqui.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas oral ou parenteralmente. Particularmente de preferência, o método de administração é administração parenteral e, especificamente, o método de administração é, por exemplo, administração através de injeção, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdérmica. Exemplos de administração através de injeção incluem admi- nistrações sistêmica e local de uma composição farmacêutica da presente invenção através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção in- traperitoneal, injeção subcutânea ou similar. Um método de administração adequado pode ser selecionado de acordo com a idade do paciente e os sintomas. A dosagem pode ser selecionada, por exemplo, dentro da faixa de .0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal em cada administração. Al- ternativamente, por exemplo, a dosagem para cada paciente pode ser sele- cionada dentro da faixa de 0,001 a 100.000 mg/corpo. Contudo, a composi- ção farmacêutica da presente invenção não está limitada a essas doses.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos convencionais (por exemplo, Reming- ton's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, E- aston, E.U.A) e também podem conter veículos e aditivos farmaceuticamen- te aceitáveis. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, tensoativos, excipientes, agentes de coloração, perfumes, conservantes, estabilizantes, tampões, agentes de suspensão, agentes de isotonização, aglutinantes, de- sintegrantes, lubrificantes, agentes de promoção de fluidez e agentes de fla- vorização; e outros veículos comumente usados podem ser adequadamente utilizados. Exemplos específicos incluem ácido silícico anidro leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, carmelose de sódio, carmelose de cálcio, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, dietilaminoacetato de poli- vinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média, polioxietileno de óleo de mamona 60 endurecido, sacarose, carboxi- metil celulose, amido de milho, sal inorgânico e similares.

Além disso, a presente invenção proporciona métodos para in- dução de danos em uma célula expressando DSG3 e métodos para inibição de crescimento celular através de contato de uma célula expressando DSG3 com um anticorpo de ligação à proteína DSG3. O anticorpo de ligação à pro- teína DSG3 é o mesmo conforme o anticorpo descrito acima que se liga a uma proteína DSG3, o qual tem de estar contido em um inibidor de cresci- mento celular da presente invenção. A célula que é ligada pelo anticorpo anti-DSG3 não está particularmente limitada, na medida em que a célula esteja expressando DSG3 e, de preferência, é uma célula cancerígena, mais preferivelmente uma célula de câncer de pulmão, uma célula de câncer de cólon, uma célula de câncer esofageal, uma célula de câncer de estômago, uma célula de câncer pancreático, uma célula de câncer de pele ou uma cé- lula de câncer uterino e, mais preferivelmente, câncer de pulmão de células não-pequenas.

Na presente invenção, "contato" é obtido, por exemplo, através da adição de um anticorpo a um solução de cultura de células expressando DSG3 cultivadas em um tubo de ensaio. Nesse caso, o anticorpo pode ser adicionado na forma, por exemplo, de uma solução ou um sólido obtido atra- vés de liofilização ou similar. Quando de adição do anticorpo como uma so- lução aquosa, a solução aquosa usada pode conter puramente apenas o anticorpo ou a solução pode incluir, por exemplo, os tensoativos, excipien- tes, agentes de coloração, perfumes, conservantes, estabilizantes, tampões, agentes de suspensão, agentes de isotonização, aglutinantes, desintegran- tes, lubrificantes, agentes de promoção de fluidez ou agentes de flavorização mencionados acima. A concentração para adição não está particularmente limitada, mas a concentração final na cultura que pode ser adequadamente usada está, de preferência, na faixa de 1 pg/mL a 1 g/mL, mais preferivel- mente 1 ng/mL a 1 mg/mL e, ainda mais preferivelmente, 1 μg/mL a 1 mg/mL.

Além disso, em outra modalidade, "contato", na presente inven- ção, é obtido através de administração, a um animal não-humano ao qual uma célula expressando DSG3 tenha sido transplantada no corpo ou a um animal trazendo células cancerígenas expressando endogenamente DSG3. O método de administração pode ser administração oral ou parenteral. Parti- cularmente de preferência, o método de administração é administração pa- renteral e, especificamente, o método de administração é, por exemplo, ad- ministração através de injeção, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdérmica. Exemplos de administração através de injeção incluem administrações sistêmica e local de composições farmacêuticas, inibidores de proliferação celular e agentes anticâncer da presente invenção através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similar. Um método de admi- nistração adequado pode ser selecionado de acordo com a idade do animal de teste e sintomas. Quando de administração como uma solução aquosa, a solução aquosa usada pode conter puramente apenas o anticorpo ou a solu- ção pode incluir, por exemplo, os tensoativos, excipientes, agentes de colo- ração, perfumes, conservantes, estabilizantes, tampões, agentes de suspen- são, agentes de isotonização, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, a- gentes de promoção de fluidez ou agentes de flavorização mencionados a- cima. A dosagem pode ser selecionada, por exemplo, dentro da faixa de .0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal em cada administração. Al- ternativamente, por exemplo, a dosagem para cada paciente pode ser sele- cionada dentro da faixa de 0,001 a 100.000 mg/corpo. Contudo, a dose de anticorpo da presente invenção não está limitada a essas doses.

O método a seguir é, adequadamente, usado como um método para avaliação ou medição do dano celular induzido através de contato de células expressando DSG3 com um anticorpo anti-DSG3. Exemplos de um método para avaliação ou medição da atividade citotóxica em um tubo de ensaio incluem métodos para medição da atividade de citotoxicidade célula- mediada anticorpo-dependente (ADCC) mencionada acima, atividade de citotoxicidade complemento-dependente (CDC) e similares. Se um anticorpo anti-DSG3 tem ou não atividade de ADCC ou atividade de CDC pode ser medido através de métodos conhecidos (por exemplo, Current protocols in Immunology, Capítulo 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E. Coligan e outros, John Wiley & Sons, Inc., (1993) e similares). Para medi- ções de atividade, um anticorpo de ligação tendo o mesmo isotipo que o an- ticorpo anti-DSG3, mas não tendo qualquer atividade de dano celular pode ser usado como um anticorpo de controle da mesma maneira que o anticor- po anti-DSG3 e pode ser determinado que a atividade está presente quando o anticorpo anti-DSG3 mostra uma atividade citotóxica mais forte do que o anticorpo de controle.

O isotipo de um anticorpo é definido pela seqüência de sua regi- ão constante de cadeia H na seqüência de aminoácido do anticorpo e é de- terminada como um resultado de troca de classe que surge de recombina- ções genéticas em cromossomas as quais ocorrem durante maturação de células B que produzem anticorpo. A diferença no isotipo é refletida na dife- rença de funções fisiológica e patológica de anticorpos e, por exemplo, a resistência de atividade citotóxica é conhecida por ser influenciada pelo iso- tipo do anticorpo, além do nível de expressão do antígeno. Portanto, quando de medição da atividade de dano celular descrita acima, um anticorpo do mesmo isotipo que o anticorpo de teste é, de preferência, usado como o controle.

Um método para avaliação ou medição de atividade de dano celular in vivo é, por exemplo, transplante intradérmica ou subcutaneamente de células cancerígenas expressando DSG3 a um animal de teste não- humano e, então, administração intravenosa ou intraperitoneal de um anti- corpo de teste diariamente ou no intervalo de poucos dias, começando a partir do dia de transplante ou no dia seguinte. A citotoxicidade pode ser de- finida através de medição diária do tamanho do tumor. De uma maneira simi- lar à avaliação em um tubo de ensaio, a citotoxicidade pode ser determinada através de administração de um anticorpo de controle tendo o mesmo isotipo e observando se o tamanho de tumor no grupo administrado com anticorpo anti-DSG3 é significativamente menor do que o tamanho de tumor no grupo administrado com anticorpo de controle. Quando usando um camundongo como o animal de teste não-humano, é adequado usar um camundongo nu (nu/nu) cujo timo tenha sido tornado geneticamente defectivo, de modo que sua função de linfócitos T seja perdida. O uso de tal camundongo pode eli- minar a participação de linfócitos T nos animais de teste quando de avalia- ção ou medição da citotoxicidade do anticorpo administrado.

O método a seguir pode ser usado adequadamente como um método para avaliação ou medição do efeito inibitório de um anticorpo anti- DSG3 sobre a proliferação de células expressando DSG3 através de conta- to. Um método para medição da incorporação de timidina [3H]-rotulada adi- cionada ao meio por células vivas como um indicador de capacidade de re- plicação de DNA é usado como um método para avaliação ou medição da atividade de inibição de proliferação celular em um tubo de ensaio. Como um método mais conveniente, um método de exclusão com corante que mede, sob um microscópio, a capacidade de uma célula de excluir um corante, tal como azul de tripano, para fora ou o método com MTT é usado. O último faz uso da capacidade de células vivas de converter MTT (brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio), o qual é um sal de tetrazólio, em um produto de formazano azul. Mais especificamente, um anticorpo de teste é adicionado à solução de cultura de uma célula de teste e, após um determi- nado período de tempo passar, a solução de MTT é adicionada à solução de cultura e essa é deixada descansar durante um determinado tempo para que o MTT seja incorporado na célula. Como um resultado, MTT, o qual é um composto amarelo, é convertido em um composto azul através da ação de dehidrogenase de succinato nas mitocôndrias da célula. Após dissolver esse produto azul para coloração, a absorbância é medida e usada como um indi- cador do número de células viáveis. Além de MTT, reagentes tais como MTS, XTT, WST-1 e WST-8 estão comercialmente disponíveis (Nacalai Tes- que e similares) e podem ser adequadamente usados. Para medições de atividade, um anticorpo de ligação tendo o mesmo isotipo que o anticorpo anti-DSG3, mas não tendo qualquer atividade inibitória de proliferação celu- lar, pode ser usado como um anticorpo de controle da mesma maneira que o anticorpo anti-DSG3 e pode ser determinado se a atividade está presente quando o anticorpo anti-DSG3 tem uma atividade inibitória de proliferação celular mais forte do que o anticorpo de controle.

Para um método que avalia ou mede a atividade de inibição de proliferação celular in vivo, o mesmo método conforme aquele descrito aci- ma para avaliação ou medição de citotoxicidade in vivo pode ser adequada- mente usado.

Todas as referências da técnica anterior citadas aqui são incor- poradas por referência à presente descrição. Exemplos

Aqui abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas não deve ser construída como estando limitada aos mesmos. Exemplo 1 Análise de expressão de mRNA de DSG3 em vários tipos de câncer Lasca de gene foi usada para realizar análise de expressão do gene de DSG3. Para pesquisar um gene cuja expressão é intensificada em células cancerígenas, vários RNAs e RNAs totais foram preparados a partir de vários tecidos extraídos através de métodos convencionais usando ISO- GEN (fabricado pela Nippon Gene) mostrados nas Tabelas 1 e 2 foram usa- dos. Mais especificamente, análise de expressão de gene foi realizada u- sando 10 μg de cada RNA total e submetendo os mesmos ao GeneChip U- .133A (fabricado pela Affymetrix) de acordo com o Manual Técnico de Análi- se de Expressão (fabricado pela Affymetrix). Quando de análise de adeno- carcinoma de pulmão e carcinoma hepatocelular, um total de 10 μg foi obtido combinando RNAs totais de doze casos de adenocarcinoma de pulmão e três casos de carcinoma hepatocelular para realizar a análise (Tabela 1). Tabela 1 <table>table see original document page 78</column></row><table> <table>table see original document page 79</column></row><table> Tecidos usados para análise de expressão de gene de DSG3 Tabela 2 <table>table see original document page 79</column></row><table> <table>table see original document page 80</column></row><table>

Linhagens de célula cancerígena e condições de cultura usadas para a aná- lise de expressão do gene de DSG3

Pesquisa por genes cuja expressão é intensificada em tecidos cancerígenos ou células cancerígenas foi realizada ajustando o valor médio dos escores de expressão para todos os genes para 100 e comparando os níveis de expressão relativa de cada gene. Como um resultado, embora ex- pressão do mRNA de DSG3 (ID sonda: 205595_at HG-U133A) em tecidos normais esteja limitada à pele, ela foi intensificada em tecidos de as linha- gens de células cancerígenas de câncer de pulmão (carcinoma de pulmão de células escamosas) e câncer de cólon e em TE2 (câncer esofageal), 2M (câncer de estômago) e PK-1 (câncer pancreático) (figuras 1 e 2).

A partir do acima, se torna evidente que, embora expressão do gene de DSG3 (ID sonda: 205595_at HG-U133A) seja muito baixa em outros tecidos normais que não a pele, expressão do gene de DSG3 é intensificada em uma ampla variedade de cânceres, incluindo câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago e câncer pancreático. Es- ses resultados sugerem que há uma alta possibilidade de que o desenvolvi- mento dos cânceres acima mencionados possa ser diagnosticado usando a expressão de DSG3 como um indicador. Exemplo 2 Coloração imuno-histológica de DSG3 em carcinoma de pulmão de células escamosas

Uma vez que a transcrição do gene de DSG3 é intensificada em células cancerígenas, em particular células de carcinoma de pulmão de célu- Ias escamosas, análise por coloração imuno-histológica foi realizada para confirmar a expressão da proteína DSG3.

Cada amostra foi preparada como um preparado incrustado em parafina fixo e uma seção cortada em uma espessura de 4 μιη foi montada sobre uma lâmina de vidro e, então, deixada a 37°C durante cerca de 16 horas para secar suficientemente. A seção foi desparafinizada embebendo três vezes em xileno a 100% durante cinco minutos cada e, então, hidrofili- zada embebendo três vezes em etanol a 100% durante cinco minutos cada e ainda embebendo em etanol a 70% durante cinco minutos. Então, após la- vagem três vezes em uma solução tampão de TBS a 50 mM durante cinco minutos, o antígeno na seção foi ativado através de tratamento da seção com um tampão de citrato (10 mM, pH de 7,0) a 120°C durante dez minutos. A seção na qual o antígeno tinha sido ativado foi lavada três vezes em um tampão de TBS durante cinco minutos cada e, então, tratada durante uma hora em temperatura ambiente em um tampão de TBS contendo um anticor- po anti-DSG3 (5G11) (Zymed) diluído para uma concentração final de 50 μς/mL. Para inativar a peroxidase endógena, a seção com anticorpo anti- DSG3 ligado foi tratada com peróxido de hidrogênio a 0,3% durante 15 minu- tos em temperatura ambiente. Após lavagem três vezes com uma solução tampão de TBS, a seção mencionada acima foi tratada com um anticorpo secundário, ENVISION + kit/HRP (DAKO), durante uma hora em temperatu- ra ambiente. Após lavagem três vezes com a solução tampão de TBS duran- te cinco minutos cada, DAB (tetracloreto de 3,3'-diaminobenzamida) foi adi- cionado como um substrato de coloração para corar a seção. Hematoxilina foi usada como um agente de coloração para coloração em contador do nú- cleo.

Como um resultado, dos cinco casos de seções teciduais de pa- cientes com câncer afetados por carcinoma de pulmão de células escamo- sas, todos os cinco casos mostraram uma reação positiva na qual a seção é corada pelo anticorpo anti-DSG3 (5G11) (figura 3). Uma vez que uma ima- gem de coloração câncer de pulmão-específica foi obtida, se torna evidente que, em câncer de pulmão, a expressão de DSG3 é intensificada a nível de proteína também. Isso indicou que o desenvolvimento de câncer de pulmão pode ser detectado usando um anticorpo anti-DSG3. Exemplo 3

Preparo de anticorpo anti-DSG3 .3-1) Clonagem de um cDNA de comprimento total que codifica DSG3 huma- na

Um cDNA de comprimento total que codifica DSG3 humana foi obtido através de amplificação por PCR usando Human Small Intestine Ma- rathon-Ready cDNA (CLONTECH) como "template". Especificamente, 50 μΙ_ de uma solução de reação contendo 2 μΙde cDNA, 1 μΙde primer senso (SEQ ID NO: 37), 1 μΙ de primer antissenso (SEQ ID NO: 38), 5 μΙ_ de 10X tampão KOD-PIus, 5 μΙ de dNTPs a 2 mM, 2 μΙde MgSO4 a 25 mM e 1 μΙ_ de KOD-PIus foram submetidos a uma reação de PCR realizada através de cinco ciclos de um ciclo de reação consistindo em reações a 94°C durante .15 segundos e 70°C durante dois minutos, cinco ciclos de um ciclo de rea- ção consistindo em reações a 94°C durante 15 segundos e 68°C durante dois minutos e 28 ciclos de um ciclo de reação consistindo em reações a .94°C durante 15 segundos e 66°C durante dois minutos. O produto amplifi- cado obtido através da reação de PCR mencionada acima foi inserido no pGEM-T Easy usando pGEM-T Easy Vector System I (Promega). Esse foi sequenciado usando um sequenciador de DNA ABI3730 para confirmar se a seqüência de cDNA que codifica DSG3 humana foi clonada com sucesso. A seqüência representada por SEQ ID NO: 39 mostra a seqüência de nucleo- tídeo do gene de DSG3 humano e a seqüência representada por SEQ ID NO: 40 mostra uma seqüência de aminoácido da proteína DSG3 humana. .3-2) Estabelecimento de células mostrando expressão constante de DSG3 humana de comprimento total O cDNA de DSG3 de comprimento total foi clonado em um vetor (pMCN) para expressão em células de mamífero (pMCN/hDSG3). pMCN permite a expressão induzida sob o controle de um promotor de CMV de camundongo (ACESSO No. U68299) e é um vetor no qual um gene de resis- tência à neomicina foi incorporado. Uma linhagem de célula CHO que mos- tra expressão constante de DSG3 humana de comprimento total foi estabe- lecida através de introdução de pMCN/hDSG3 no gênero de célula CHO DG44 (Invitrogen) através de eletroporação e sujeição da mesma à seleção com 500 μg/mL de Geneticina. Similarmente, uma linhagem de célula A549 que mostra expressão constante de DSG3 humana de comprimento total foi estabelecida através de introdução de pMCN/hDSG3 em células A549 (li- nhagem de célula de câncer epitelial de pulmão humano) que não mostra expressão de DSG3 e seleção com 100 μg/mL de Geneticina. .3-3) Preparo de proteína de fusão de Fc de lgG2a de camundongo/DSG3 humana solúvel

A proteína de fusão de Fc de lgG2a de camundongo/DSG3 hu- mana solúvel (aqui depois, shDSG3_mlgG2aFc) foi preparada como um an- tígeno de imunização para produção de anticorpo anti-DSG3. shDSG3_mlgG2aFc foi preparada através de ligação do domínio extracelular da DSG3 humana (Meti - Leu616) com a região constante de lgG2a de ca- mundongo através da seqüência de reconhecimento Cpol na região de do- bradiça e clonada no vetor pMCDN preparado através de incorporação do gene de DHFR no vetor de expressão pMCN (pMCDN/shDSG3_mlgG2aFc). A seqüência representada por SEQ ID NO: 41 mostra a seqüência de nucle- otídeo do gene de shDSG3_mlgG2aFc e a seqüência representada por SEQ ID NO: 42 mostra a seqüência de aminoácido de shDSG3_mlgG2aFc. Uma linhagem de célula CHO que mostra expressão constante de shDSG3_mlgG2aFc foi estabelecida através de introdução de pMCDN/shDSG3_mlgG2aFc em células DG44 por meio de eletroporação e seleção com 500 μg/mL de Geneticina. Em seguida, shDSG3_mlgG2aFc foi purificado do sobrenadante de cultura da linhagem de célula CHO expres- sando shDSG3_mlgG2aFc estabelecida. O sobrenadante de cultura foi apli- cado a uma coluna Hi Trap Protein G HP (GE Healthcare Bio-Sciences) e, após lavagem com um tampão de ligação (fosfato de sódio a 20 mM (pH de .7,0)), eluição foi realizada usando um tampão de eluição (glicina-HCI a 0,1 M (pH de 2,7)). O eluato foi imediatamente neutralizado através de eluição em um tubo contendo um tampão de neutralização (Tris-HCI a 1 M (pH de 9,0)). Esse eluato foi submetido à filtração em gel usando Superdex 200 HR 10/30 (GE Healthcare Bio-Sciences), de modo que o solvente da solução contendo o anticorpo desejado fosse substituído por um tampão de PBS. A proteína purificada foi quantificada usando um kit de ensaio de proteína DC (BIO- RAD) e convertida em uma concentração usando IgG bovina, incluída no kit, como um preparado padrão. .3-4) Preparo de anticorpo anti-DSG3 Camundongos Balb/c ou camundongos MRL/MpJUmmCrj-Ipr/lpr (aqui depois camundongos MRLVIpr, adquiridos da Charles River Japão) fo- ram usados como os animais para a imunização. Imunização foi iniciada na .7- semana ou 8- semana. Para a primeira imunização, um antígeno foi pre- parado usando um tampão de PBS de modo a incluir 100 μg de shDSG3_mlgG2aFc para cada camundongo, emulsificado usando adjuvante completo de Freund (Beckton Dickinson) e administrado subcutaneamente. Duas semanas depois, um antígeno foi preparado usando um tampão de PBS1 de modo a incluir 50 μς para cada camundongo, emulsificado usando adjuvante incompleto de Freund (Beckton Dickinson) e administrado subcu- taneamente. Subseqüentemente, imunização de reforço foi realizada em intervalos de 1 semana durante duas a quatro vezes e durante a imunização final, o antígeno foi diluído em PBS a 50 μg/camundongo e, então, adminis- trado à veia caudal. Quatro dias após a imunização final, células do baço foram extirpadas e misturadas com células de mieloma de camundongo P3- X63Ag8U1 (P3U1, adquiridas da ATCC) em uma proporção de 2:1 e a fusão celular foi realizada através da adição gradual de PEG 1500 (Roche Diag- nostics). Em seguida, meio RPM11640 (Invitrogen) foi adicionado para diluir cuidadosamente o PEG 1500 e, então, o PEG 1500 foi removido através de centrifugação e remoção do sobrenadante. O grupo de células fundidas sus- pensas em RPMI1640 contendo FBS a 10% foi cultivado em uma lâmina de cultura com 96 cavidades a 100 μl_/cavidade. No dia seguinte, RPM11640 contendo FBS a 10%, 1x suplemento de meio HAT (SIGMA) e 0,5x suple- mento de clonagem BM-Condimed H1 Hybridoma (Roche Diagnostics) (aqui depois referido com meio HAT) foram adicionados a 100 μL/cavidade. No segundo ou terceiro dia, metade da solução de cultura foi substituída por meio HAT e o sobrenadante de cultura do sétimo dia foi usado na seleção na qual a atividade de ligação à molécula de DSG3 foi usada como um indica- dor. A seleção foi realizada através de análise citométrica de fluxo, a qual detecta a ligação à células CHO que mostram expressão constante de DSG3 humana de comprimento total. Clones positivos obtidos a partir dessa análise foram monoclonados através do método de diluição limitativa. Espe- cificamente, DF120, DF122, DF148, DF151, DF153, DF168, DF331, DF364 e DF366 foram estabelecidos como anticorpos que se ligam especificamente à DSG3.

De uma maneira similar ao caso com shDSG3_mlgG2aFc, os anticorpos monoclonais foram purificados usando uma coluna Hi Trap Prote- in G HP, a partir do sobrenadante de cultura de hibridomas cultivados em meio HAT que usa FBS (Ultra Iow IgG) (Invitrogen) como o soro. As frações eluídas foram submetidas a uma substituição de solvente por PBS usando uma coluna PD-10 (GE Healthcare Bio-Sciences) e, então, armazenadas a .4°C. Os anticorpos purificados foram quantificados usando um kit de ensaio de proteína DC (BIO-RAD) e convertidos em concentração usando IgG bovi- na, incluída no kit, como o preparado padrão. .3-5) Avaliação de atividade de ligação através de citometria de fluxo

Citometria de fluxo foi usada para avaliar a ligação dos anticor- pos obtidos à células CHO que mostram expressão constante de DSG3 hu- mana de comprimento total. As células foram suspensas em tampão de FACS (FBS/PBS a 1%) a 5 χ 105 células/mL e distribuídas em Lâminas com filtro MuItiscreen-HV (MiIIipore) e o sobrenadante foi removido dessa solução em suspensão de células através de centrifugação. Após adição, às células isenta de sobrenadante, de um tampão de FACS contendo anticorpos mo- noclonais anti-DSG3 os quais tinham sido diluídos para uma concentração adequada (3 μg/mL) no tampão de FACS, essas foram deixadas descansar durante 30 minutos sobre gelo para deixar as células reagirem com os anti- corpos monoclonais. Após remoção do sobrenadante dessa solução de rea- ção através de centrifugação, as células foram lavadas uma vez com tampão de FACS. Em seguida, suspendendo as células em tampão de FACS con- tendo anticorpo de IgG de camundongo FITC-rotulado como o anticorpo se- cundário, as células foram reagidas com o anticorpo secundário durante 30 minutos sobre gelo. Após a reação estar completa, o sobrenadante foi remo- vido das células através de centrifugação. As células foram suspensas em .100 μΙ_ de tampão de FACS e, então, submetidas à análise citométrica de fluxo. FACS Calibur (Becton Dickinson) foi usado como o citômetro de fluxo. A população de células vivas foi ativada em um histograma de dispersão dianteira e dispersão lateral. Conforme mostrado na figura 4, 3 μς/Γηί. de anticorpos monoclonais anti-DSG3 (DF120, DF122, DF148, DF151, DF153, DF168, DF331, DF364 e DF366) se ligaram fortemente às células CHO ex- pressando DSG3 e não se ligam às células CHO precursoras, indicando que os anticorpos monoclonais anti-DSG3 se ligam especificamente à DSG3 presente sobre a membrana celular. Exemplo 4

Medição de atividades citotóxicas dos anticorpos anti-DSG3 .4-1) Medição de atividade de citotoxicidade complemento-dependente (CDC) dos anticorpos anti-DSG3

A linhagem de célula CHO mostrando expressão constante de DSG3 humana de comprimento total (DSG3-CH0, descrita no Exemplo 3-2)) foi usada com a célula alvo. Meio CHO-S-SFM Il (Invitrogen) contendo 500 μg/mL de Geneticina (Invitrogen), suplemento HT (Invitrogen) e penicili- na/estreptomicina (Invitrogen) (aqui depois referido como "meio") foi usado para cultivar a linhagem de célula DSG3-CH0. O pélete de célula obtida a- través de centrifugação de 5 χ 105 células da linhagem de célula DSG3-CHO (1000 rpm) durante cinco minutos a 4°C foi suspensa em aproximadamente .200 μΙ_ de meio contendo 3,7 MBq de Cromo-51 (GE Healthcare Bio- Sciences) e, então, cultivada em uma incubadora com 5% de dióxido de car- bono durante uma hora a 37°C. Essas células foram lavadas três vezes com o meio, então, ajustadas para uma densidade celular de 1 χ 105 células/mL no meio e, então, distribuídas em uma lâmina de fundo plano com 96 cavi- dades a 100 μL/cavidade. Em seguida, os anticorpos anti-DSG3 e um anti- corpo de lgG2a de camundongo de controle (BD Biosciences Pharmingen) diluído com o meio foram individualmente adicionados a 50 μL7cavidade. A concentração final dos anticorpos foi ajustada para 10 μg/mL. Em seguida, complemento de coelho bebê (CederIane) diluído 5 vezes no meio foi adicio- nado a 50 μl_/cavidade e, então, a lâmina foi deixada descansar em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono durante 1,5 horas a 37°C. Após o que, esse foi centrifugada (1000 rpm) durante cinco minutos a 4°C, 100 μΙ_ do sobrenadante foram coletados de cada cavidade da lâmina e a radioativi- dade foi medida usando um contador gama (1480 WIZARD 3", Wallac). A taxa de liberação de cromo específica foi determinada baseado na seguinte equação:

Taxa de liberação de cromo específica (%) = (A - C) χ 100/(B - C)

onde A representa a radioatividade (cpm) em cada cavidade, B representa o valor médio de radioatividade (cpm) em cavidades onde 100 μΐ_ das células e 100 μί de solução a 2% de Nonidet P-40 (Nacalai Tesque) tinham sido adicionados e C representa o valor médio da radioatividade (cpm) em cavi- dades onde 100 μΙ_ das células e 100 μΙ_ do meio tinham sido adicionados.

As medições foram conduzidas em duplicata e o valor médio e desvio pa- drão foram calculados para a taxa de liberação de cromo específica.

Foi confirmado que todos os anticorpos anti-DSG3 usados no experimento tinham atividade de CDC (figura 5). Por outro lado, o anticorpo de lgG2a de camundongo de controle não mostra atividade de CDC na mesma concentração.

Em seguida, a linhagem de célula de carcinoma epidermóide humano A431 (adquirida da ATCC), a linhagem de célula de câncer epitelial de pulmão humano A549 (adquirida da ATCC) e uma linhagem de célula A549 mostrando expressão constante de DSG3 humana de comprimento total (DSG3-A549, descrita no Exemplo 3-2)) foram usadas como células alvo para examinar se os anticorpos têm atividade de CDC. A431 e DSG3- A549 expressam DSG3 sobre a membrana celular. Meio de Eagle Modifica- do de Dulbecco (Invitrogen) (aqui depois referido como meio DMEM) con- tendo soro bovino fetal a 10% (Invitrogen) e penicilina/estreptomicina foi u- sado para cultivar A431 e A549. Meio DMEM contendo 1 mg/mL de Geneti- cina foi usado para cultivar a linhagem de célula DSG3-A549. Células A431, A549 e DSG3-A549 foram individualmente adicionadas a uma lâmina de fundo plano com 96 cavidades a 2 χ 103 células/cavidade (A549 e DSG3- A549) ou 4 χ 103 células/cavidade (A431) e cultivadas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono durante três dias a 37°C. Após cultura, Cro- mo-51 foi adicionado em uma concentração final de 1,85 MBq/mL e a cultura foi continuada durante mais uma hora. Cada cavidade foi lavada com 300 μΙ_ de meio DMEM e, então, 100 μΙ_ de meio DMEM foram adicionados. Em se- guida, as taxas de liberação de cromo específicas foram determinadas atra- vés da adição de um anticorpo anti-DSG3 e complemento de coelho bebê sob condições similares àquelas usadas para o exame usando a linhagem de célula DSG3-CHO. O anticorpo anti-DSG3 DF151 induziu à atividade de CDC con- centração-dependente contra as linhagens de célula A431 e DSG3-A549 expressando DSG3, mas não mostra atividade de CDC contra a linhagem de célula A549 a qual não expressa DSG3 (figura 6). Esses resultados mostram que o anticorpo anti-DSG3 exibe atividade de CDC antígeno-específica. .4-2) Medição de atividade de citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) de anticorpos anti-DSG3

A linhagem de célula DSG3-A549 e a linhagem de célula A431 foram usadas para medições de atividade de ADCC. Similar ao caso das medições de atividade de CDC, as células mencionadas acima foram culti- vadas em uma lâmina de fundo plano com 96 cavidades e, então, reagidas como Cromo-51. Após o que, cada cavidade foi lavada com meio RPM11640 (Invitrogen) contendo soro bovino fetal a 10% e penicilina/estreptomicina (aqui depois referido como meio RPMI) e, então, 100 μΐ_ de meio RPMI fo- ram adicionados. Em seguida, 50 μΙ_ de cada de um anticorpo anti-DSG3 e do anticorpo de lgG2a de camundongo de controle diluído em meio RPMI foram adicionados a cada cavidade. A concentração final do anticorpo foi ajustada para 10 μg/mL (células efetuadoras derivadas de medula óssea) ou .1 μg/mL (células efetuadoras derivadas de baço). Em seguida, 50 μΙ_ de uma solução de célula efetuadora (1 χ 107 células/mL), a qual será descrita de- pois, foram adicionados a cada cavidade e, então, a lâmina foi deixada des- cansar em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono durante quatro horas a 37°C. A taxa de liberação de cromo específica foi determinada a par- tir da radioatividade medida de cada cavidade nessa lâmina. Células obtidas através de cultura de células do baço de um camundongo Balb/c (Charles River Japan) em meio RPMI contendo 50 ng/mL de interleucina-2 humana recombinante (Peprotech) durante cinco dias ou células obtidas através de cultura de células da medula óssea do mesmo camundongo em meio RPMI contendo 50 ng/mL de interleucina-2 humana recombinante e 10 ng/mL de GM-CSF de camundongo recombinante (Peprotech) durante seis dias foram usadas como células efetuadoras.

Anticorpos anti-DSG3 DF151, DF364 e DF366 induziram à ADCC contra as linhagens de célula DSG3-A549 e A431 (figura 7). Os resul- tados mencionados acima mostram que os anticorpos anti-DSG3 induziram à dano celular em células expressando proteína DSG3 através de atividade de ADCC.

Exemplo 5

Determinação das seqüências genéticas de região variável de anticorpo anti- DSG3

Os genes de região variável de anticorpo foram clonados a partir de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais DF151, DF364 e DF366, os quais são anticorpos mostrando atividade de ADCC e atividade de CDC em células expressando DSG3 e suas seqüências foram determi- nadas. Genes de anticorpo que codificam os anticorpos monoclonais DF151, DF364 e DF366 foram amplificados através do método de RT-PCR usando RNAs totais extraídos dos hibridomas que produzem anticorpo anti-DSG3. RNA total foi extraído de 1 χ 107 células de hibridoma usando o RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Usando 1 μg de RNA total, o fragmento do gene da extremidade 5' foi amplificado através do SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH), usando o oligonucleotídeo sintético MHC-lgG2b (SEQ ID NO: 43) complementar à seqüência de região constante de lgG2b de ca- mundongo, o oligonucleotídeo sintético MHC-IgGI (SEQ ID NO: 100) com- plementar à seqüência de região constante de IgGI de camundongo ou o oligonucleotídeo sintético kappa (SEQ ID NO: 44) complementar à seqüên- cia de nucleotídeo de região constante de cadeia κ de camundongo. A rea- ção de transcrição inversa foi realizada durante uma hora e trinta minutos a .42°C. A reação de PCR foi realizada em 50 μΙ_ de solução de reação de PCR contendo 5 μΙ_ de 10x Tampão de PCR Advantage 2, 5 μΙ_ de 10x Uni- versal Primer A Mix1 dNTPs a 0,2 mM (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), 1 μΙ_ de Advantage 2 Polymerase Mix (os acima foram fabricados pela CLONTECH), .2,5 μΙ_ de produto de reação de transcrição inversa e 10 pmoles de oligonu- cleotídeo sintético MHC-lgG2b, MHC-IgGI ou kappa. A reação de PCR foi realizada sob as condições de reação de reação em uma temperatura inicial de 94°C durante 30 segundos, seguido por cinco ciclos de um ciclo de rea- ção consistindo em reações a 94°C durante 5 segundos e 72°C durante três minutos, cinco ciclos de um ciclo de reação consistindo em reações a 94°C durante 5 segundos, 70°C durante 10 segundos e 72°C durante três minutos e 25 ciclos de um ciclo de reação consistindo em reações a 94°C durante cinco segundos, 68°C durante dez segundos e 72°C durante três minutos. Finalmente, o produto de reação foi aquecido a 72°C durante sete minutos. Cada produto de PCR foi purificado a partir de gel de agarose usando o Ql- Aquick Gel Extraction Kit (fabricado pela QIAGEN), então, clonado no vetor pGEM-T Easy (fabricado pela Promega) e a seqüência de nucleotídeo do clone foi determinada.

Para a cadeia H de DF151, a seqüência de nucleotídeo e a se- qüência de aminoácido da CDR1 são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de ami- noácido de CDR2 são mostradas em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respec- tivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR3 são mostradas em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente. Para a cadeia L de DF151, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR1 são mostradas em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR2 são mostradas em SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, respectiva- mente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR3 são mostradas em SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

Para a cadeia H de DF364, a seqüência de nucleotídeo e a se- qüência de aminoácido de CDR1 são mostradas em SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22, respectivamente, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR2 são mostradas em SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR3 são mostradas em SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectiva- mente. For a cadeia L de DF364, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR1 são mostradas em SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: .30, respectivamente, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoá- cido de CDR2 são mostradas em SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32, respec- tivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de amínoácido de CDR3 são mostradas em SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, respectivamen- te.

Para a cadeia H de DF366, a seqüência de nucleotídeo e a se- quência de aminoácido de CDR1 são mostradas em SEQ ID NO: 80 e SEQ ID NO: 81, respectivamente, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR2 são mostradas em SEQ ID NO: 82 e SEQ ID NO: 83, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR3 são mostradas em SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 85, respectiva- mente. Para a cadeia L de DF366, a seqüência de nucleotídeo e a seqüên- cia de aminoácido de CDR1 são mostradas em SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 87, respectivamente, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de ami- noácido de CDR2 são mostradas em SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 89, res- pectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido de CDR3 são mostradas em SEQ ID NO: 90 e SEQ ID NO: 91, respectivamen- te.

Para DF151, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de ami- noácido da região variável de cadeia H são mostradas em SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a sequên- cia de aminoácido da região variável de cadeia L são mostradas em SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, respectivamente. For DF364, a seqüência de nu- cleotídeo e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia H são mostradas em SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50, respectivamente e a se- qüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia L são mostradas em SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, respectiva- mente. For DF366, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia H são mostradas em SEQ ID NO: 92 e SEQ ID NO: 93, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia L são mostradas em SEQ ID NO: .94 e SEQ ID NO: 95, respectivamente. Exemplo 6

Determinação de seqüências genéticas de comprimento total de anticorpos anti-DSG3

Quando as seqüências genéticas de região variável de DF151, DF364 e DF366 foram determinadas, as seqüências genéticas das regiões constantes adjacentes às regiões variáveis também foram determinadas.

Buscando genes que têm as mesmas seqüências conforme essas seqüên- cias usando o Basic Loca! Alignment Search Tool (BLAST) do National Cen- ter for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), as seqüências de nucleotídeo das regiões constantes inteiras podem ser obti- das. A seqüência de nucleotídeo de comprimento total pode ser determinada através de ligação da seqüência de nucleotídeo de região constante obtida à seqüência de nucleotídeo de região variável. Dessa maneira, a seqüência de nucleotídeo de lgG2b de camundongo (DDBJ Acesso No. BC025447), a se- qüência de nucleotídeo de cadeia leve kappa de camundongo (DDBJ Aces- so No. AY704179) e a seqüência de nucleotídeo de IgGI de camundongo (DDBJ Acesso No. BC057688) podem ser obtidas a partir da seqüência de nucleotídeo da região constante de cadeia H de DF151 (SEQ ID NO: 53), da seqüência de nucleotídeo da região constante de cadeia L de DF151, DF364 e DF366 (SEQ ID NO: 54) e da seqüência de nucleotídeo da região constan- te de cadeia H de DF364 e DF366 (SEQ ID NO: 55), respectivamente. Os isotipos de DF151 (lgG2bK de camundongo), DF364 (IgG 1 κ de camundongo) e DF366 (IgG 1 κ de camundongo) foram determinadas an- tecipadamente usando o Kit IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping (ROCHE). A seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido previs- tas da cadeia H de DF151 de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido previstas da cadeia L de DF151 de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido previstas da ca- deia H de DF364 de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüên- cia de aminoácido previstas da cadeia L de DF364 de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 63, respectivamente. A se- quêncía de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido previstas da cadeia H de DF366 de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido previstas da cadeia L de DF366 de comprimento total são mos- tradas em SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 104, respectivamente. Para DF151, a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da região constante de cadeia H são mostradas em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da região constante de cadeia L são mostradas em SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, respectivamente. Para DF364 e DF366, a seqüência de nucleotí- deo e a seqüência de aminoácido da região constante de cadeia H são mos- tradas em SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da região constante de cadeia L são mostradas em SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36, respectivamente. Exemplo 7 Produção de anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo-humano As seqüências de região variável de cadeia H e cadeia L de ca- da anticorpo foram ligadas em rede com as seqüências de região constante de cadeia H e cadeia L humana. PCR foi realizada usando um oligonucleotí- deo sintético tendo uma seqüência complementar à seqüência de Kozak e um sítio EcoRI na extremidade 5' de uma seqüência de nucleotídeo que co- difica a região variável de cadeia H e um oligonucleotídeo sintético comple- mentar à seqüência de nucleotídeo na extremidade 3' a qual tem um sítio Nhel inserido. PCR foi realizada usando um oligonucleotídeo sintético tendo uma seqüência complementar à seqüência de Kozak e um sítio BamHI na extremidade 5' de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região vari- ável de cadeia L e um oligonucleotídeo sintético complementar à seqüência de nucleotídeo na extremidade 3' a qual tem um sítio BsiWI inserido. Os produtos de PCR obtidos foram clonados no plasmídeo de expressão de anticorpo pMCDN_G1k. O pMCDN_G1k tem a região constante de IgGI humana (a seqüência de nucleotídeo é mostrada em SEQ ID NO: 9 e a se- qüência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 10) clonada no vetor pMCDN e tem uma estrutura na qual a região variável de cadeia H de ca- mundongo e a região constante de cadeia H humana (cadeia γ1) são ligadas por um sítio Nhel. Além disso, outra unidade de expressão compreendendo um promotor de CMV de camundongo e uma região constante κ humana (a seqüência de nucleotídeo é mostrada em SEQ ID NO: 19 e a seqüência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 20) é inserida e ela tem uma estru- tura na qual a região variável de cadeia L de camundongo e a região cons- tante de cadeia L humana (cadeia κ) são ligadas por um sítio BsiWI. Esse plasmídeo expressa o gene de resistência à neomicina, gene de DHFR e o gene de anticorpo quimérico anti-DSG3 de camundongo-humano em células de animal.

pMCDN_G1k_DF151, pMCDN_G1 k_DF364 e pMCDN_G1k_DF366, preparados conforme acima, foram introduzidos em células DG44 através de eletroporação. Seleção com Geneticina (500 μg/ml) estabeleceu células CHO que mostram expressão constante de anti- corpo quimérico de camundongo-humano DF151 (aqui depois referido como DF151c), anticorpo quimérico de camundongo-humano DF364 (aqui depois referido como DF364c) e anticorpo quimérico de camundongo-humano DF366 (aqui depois referido como DF366c). Em seguida, os anticorpos qui- méricos anti-DSG3 de camundongo-humano foram purificados dos sobrena- dantes de cultura das células CHO usando uma coluna Hi Trap rProtein A (GE Healthcare Bio-Sciences). Os anticorpos purificados foram submetidos à substituição de tampão por tampão de PBS usando colunas PD-10 (GE He- althcare Bio-Sciences), quantificados através do DC Protein Assay e, então, armazenados a 4°C. Os anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo- humano foram submetidos à análise citométrica de fluxo para confirmar se eles se ligam especificamente à DSG3 da mesma maneira conforme os anti- corpos de camundongo. A seqüência de nucleotídeo e a seqüência de ami- noácido da cadeia H de DF151c de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65, respectivamente e a seqüência de nucleo- tídeo e a seqüência de aminoácido da cadeia L de DF151c de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 67, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da cadeia H de DF364c de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da cadeia L de DF364c de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 71, respectivamente. A seqüência de nucleo- tídeo e a seqüência de aminoácido da cadeia H de DF366c de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 96 e SEQ ID NO: 97, respectivamente e a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de aminoácido da cadeia L de DF366c de comprimento total são mostradas em SEQ ID NO: 98 e SEQ ID NO: 99, respectivamente. Exemplo 8

Produção de anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo-humano com baixo teor de fucose

O método de modificação da cadeia de açúcar de um anticorpo é um método conhecido para intensificação da atividade de ADCC de um anticorpo. Por exemplo, aperfeiçoamento da atividade de ADCC através de glicosilação de anticorpo modificada é descrito no WO 99/54342. Além disso, o WO 00/61739 descreve o ajuste da atividade de ADCC pela presença ou ausência de fucose sobre uma cadeia de açúcar de anticorpo. O WO .02/31140 descreve o uso de uma linhagem de célula YB2/0 para preparar um anticorpo compreendendo uma cadeia de açúcar que não tem fucose no a-1,6-núcleo. Se as técnicas de aperfeiçoamento de ADCC descritas acima intensificam a atividade dos anticorpos anti-DSG3 foi examinado. Primeiro, como células hospedeiras, a linhagem de célula YB2/0 (adquirida da ATCC) foi cultivada em meio RPM11640 contendo FBS a 10%. Um vetor de expres- são de anticorpo quimérico anti-DSG3 de camundongo-humano preparado no Exemplo 7 foi introduzido na linhagem de célula YB2/0 através do método de eletroporação sob condições de 1,4 kV e 25 μΐ. Através de seleção com Geneticina (500 μρ/ιηί), linhagens de célula YB2/0 que mostram expressão constante de anticorpo quimérico de camundongo-humano DF151 com baixo teor de fucose (aqui depois referido como YB-DF151c), anticorpo quimérico de camundongo-humano DF364 com baixo teor de fucose (aqui depois refe- rido como YB-DF364c) e anticorpo quimérico de camundongo-humano DF366 com baixo teor de fucose (aqui depois referido como YB-DF366c) foram estabelecidas. Em seguida, os anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo-humano com baixo teor de fucose foram purificados do sobre- nadante de cultura usando uma coluna Hi Trap rProtein A. Os anticorpos purificados foram submetidos à troca de tampão com tampão de PBS usan- do uma coluna PD-10, quantificados através do DC Protein Assay e, então, armazenados a 4°C. Os anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo- humano com baixo teor de fucose purificados foram submetidos à análise citométrica de fluxo para confirmar se eles se ligam especificamente à DSG3 da mesma maneira conforme os anticorpos quiméricos anti-DSG3 de ca- mundongo-humano. Exemplo 9

Medição de atividade de CDC e atividade de ADCC de anticorpos quiméri- cos anti-DSG3 de camundongo-humano e anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo-humano com baixo teor de fucose 9-1) Estabelecimento de linhagens de célula que mostram expressão constante de DSG3 humana de comprimento total

O cDNA de DSG3 humana de comprimento total foi clonado em um vetor (pMCDN) para expressão em células de mamífero (pMCDN/hDSG3). O vetor pMCDN, no qual um gene de resistência à neomi- cina e um gene de DHFR são incorporados, permite expressão induzida sob o controle de um promotor de CMV de camundongo (ACESSO No. U68299). Uma linhagem de célula Ba/F3 (DSG3-Ba/F3), que mostra expressão cons- tante de DSG3 humana de comprimento total, foi estabelecida através de introdução de pMCDN/hDSG3 em células Ba/F3 (adquiridas da RIKEN Bio- Resource Center) através de eletroporação e submetendo as mesmas à se- leção com 500 μg/mL de Geneticina (Invitrogen). Células DSG3-Ba/F3 foram cultivadas usando meio RPMI1640 (Invitrogen) contendo 500 μg/mL de Ge- neticina, penicilina/estreptomicina (Invitrogen), interleucina-3 de camundon- go recombinante (R&D Systems) e soro fetal bovino a 10% (Invitrogen). .9-2) Estabelecimento de células mostrando expressão constante de CD16 humana de comprimento total

CD16 humana de comprimento total (RefSeq ID1 NM_000569) foi clonada no pMCDN, então, introduzida em células NK-92 (adquiridas da ATCC) através de eletroporação e, então, submetidas à seleção com Gene- ticina (500 μς/ιτιΐ.) para estabelecer uma linhagem de célula NK-92 (CD16- NK92) que mostra expressão constante de CD16 humana de comprimento total. A linhagem de célula CD16-NK92 foi cultivada usando Meio Alfa Es- sencial Mínimo com L-glutamina, sem ribonucleosídeos, deoxiribonucleosí- deos (Invitrogen) contendo 500 Mg/mL de Geneticina, penicili- na/estreptomicina, inositol a 0,2 mM (Sigma), 2-mercaptoetanol a 0,1 mM (Invitrogen), ácido fólico a 0,02 mM (Sigma), 100 U/mL de interleucina-2 hu- mana recombinante (Peprotech), soro de cavalo a 12,5% (Invitrogen) e soro fetal bovino a 12,5%. .9-3) Medição de atividade de CDC de anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo-humano

Uma suspensão de 5 χ 105 células DSG3-Ba/F3 foi centrifugada (1000 rpm durante cinco minutos a 4°C), o pélete de célula resultante foi suspenso em aproximadamente 200 μ!_ de meio RPM11640 contendo soro fetal bovino a 10%, penicilina/estreptomicina e 3,7 MBq de Cromo-51 (GE Healthcare Bio-Sciences) (aqui depois referido como meio) e as células fo- ram cultivadas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono durante uma hora a 37°C. Essas células foram lavadas três vezes no meio, então, ajustadas para 2 χ 105 células/mL e, então, adicionadas a uma lâmina de fundo redondo com 96 cavidades a 50 μL/cavidade. Em seguida, DF151c, DF364c, DF366c e um anticorpo de IgG humana de controle (Zymed) foram individualmente adicionados a 50 μlJ'cavidade. A concentração final dos an- ticorpos foi ajustada para 10 μς/ηιΙ.. Em seguida, complemento de coelho bebê (CederIane) diluído 5 vezes no meio foi adicionado a 100 μί cada. A lâmina foi deixada descansar em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante quatro horas. Após cultura, a lâmina foi centrifugada (1000 rpm durante cinco minutos a 4°C) e 100 μΐ do sobrenadante foram usados para a medição de radioatividade sobre um contador gama (1480 WIZARD 3", Wallac). A taxa de liberação de cromo específica foi determina- da de acordo com a seguinte equação:

Taxa de liberação de cromo específica (%) = (A - C) χ 100/(B - C) onde A representa a radioatividade (cpm) em cada cavidade, B representa o valor médio da radioatividade (cpm) em cavidades onde 50 μΙ_ das células e .150 μΙ_ de solução a 2% de Nonidet P-40 (Nacalai Tesque) foram adiciona- dos e C representa o valor médio de radioatividade (cpm) em cavidades on- de 50 μΐ_ das células e 150 μί do meio foram adicionados. O ensaio foi con- duzido em duplicata e o valor médio e o desvio padrão foram calculados pa- ra a taxa de liberação de cromo específica. Foi mostrado que DF151c, DF364c e DF366c têm atividade de CDC (figura 8). 9-4) Medição de atividade de ADCC de anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo-humano e anticorpos quiméricos anti-DSG3 de camundongo- humano com baixo teor de fucose Células DSG3-Ba/F3 foram rotuladas com Cromo-51 e, então, adicionadas a uma lâmina de fundo redondo com 96 cavidades a 50 μl_/cavidade. Em seguida, DF364c, DF366c, YB-DF364c, YB-DF366C e um anticorpo de IgG humana de controle foram individualmente adicionados a .50 μl_/cavidade. As concentrações finais dos anticorpos foram ajustadas pa- ra quatro diluições seriais de 10 vezes, começando a partir de 1 μg/mL Subseqüentemente, células CD16-NK92 a 2 χ 105 células/mL foram adicio- nadas a 100 μl_/cavidade. A lâmina foi deixada descansar em uma incubado- ra com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante quatro horas e, então, a taxa de liberação de cromo específica foi determinada usando o mesmo mé- todo conforme aquele de 9-3). Todos os anticorpos mostraram atividade de ADCC de uma ma- neira concentração de anticorpo-dependente (figura 9). Em particular, os anticorpos com baixo teor de fucose YB-DF364c e YB-DF366c mostraram forte atividade de ADCC. ExempIoIO Coloração imuno-histológica de DSG3 em câncer de pulmão, câncer de pele e câncer uterino A expressão de DSG3 foi intensificada a nível de proteína em carcinoma de pulmão de células escamosas (vide Exemplo 2). Portanto, análises de coloração imuno-histológica foram recentemente realizadas para confirmar a expressão de proteína DSG3 em câncer de pele, câncer uterino e adenocarcinoma de pulmão, o qual é um câncer de pulmão que afeta um grande número de pessoas. Primeiro, um bloco incrustado em parafina A- MeX fixado em paraformaldeído a 4% (PFA) ou em periodato-lisina- paraformaldeído (PLP) e um bloco incrustado em parafina fixado em tampão de formaldeído neutro a 10% foram preparados a partir de cada amostra e seções de 3 μιτι de espessura foram preparadas. Após desparafinização, essas seções foram coradas imuno-histoquimicamente conforme descrito abaixo, usando o Ventana HX Discovery System (Ventana Medicai Systems, Inc., Arizona, EUA). Cada preparado foi lavado com água após desparafini- zação e reagido com solução de peróxido de hidrogênio a 3,0% (Inibidor D) durante quatro minutos em temperatura ambiente para eliminar a peroxidase endógena. Essa foi lavada e, com a adição de bloqueador de proteína para eliminar reações não-específicas, essa foi reagida durante 30 minutos em temperatura ambiente. Após lavagem, um anticorpo anti-Desmogleína 3 hu- mana de camundongo (Clone 5G11, ZYMED Laboratories Inc., Califórnia, EUA) foi adicionado como um anticorpo primário e, então, reagido durante uma hora em temperatura ambiente. Após lavagem, um anticorpo secundá- rio (Ventana Universal Secondary Antibody, Ventana Medicai Systems) foi adicionado e reagido durante 30 minutos em temperatura ambiente. Após lavagem, reagido durante 30 minutos em temperatura ambiente. Após Iava- gem, reação com Bloqueador D foi realizada durante dois minutos em tem- peratura ambiente para remover as reações não-específicas e, então, es- treptavidina/peroxidase de armorácia (SA-HRP, Ventana Medicai Systems) foi adicionada e reagida a 37°C durante 16 minutos. Após lavagem, uma mistura de diaminobenzidina (DAB Map Solution, Ventana Medicai Systems) e solução de peróxido de hidrogênio (DAB Map Solution, Ventana Medicai Systems) foram adicionadas e reagidas durante oito minutos a 37°C para desenvolvimento de cor do substrato. Em seguida, a cor foi intensificada u- sando uma solução de sulfato de cobre (Ventana Medicai Systems). Após lavagem, essa foi submetida à coloração nuclear com hematoxilina, desidra- tação, penetração e inclusão.

Como um resultando, expressão de DSG3 foi confirmada em dois de três casos em carcinoma de pulmão de células escamosas, um de nove casos em adenocarcinoma de pulmão, dois de dois casos em carcino- ma de células escamosas de pele, um de um caso em carcinoma de células basais de pele e um de um caso em carcinoma de células escamosas uteri- nas (Tabela 3).

Tabela 3 <table>table see original document page 101</column></row><table> Abreviações: BCC, carcinoma de células basais; M, câncer metastático; SCC, carcinoma de células escamosas a) local tecidual de câncer b) tipo de tecido

c) grau de câncer (1, bem diferenciado; 2, moderadamente dife- renciado; 3, pobremente diferenciado)

d) número do caso

e) 1, desbotada; 2, fraca; 3, moderada; 4, forte

f) 1, raro (menos de 10%); 2, ocasional (10% e acima, menos de .50%); 3, freqüente (50% e acima, menos de 90%); 4, constante (90% e aci- ma)

Exemplo 11

Avaliação de atividade antitumor de anticorpos anti-DSG3 .11-1) Produção de anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo DF366 (DF366m)

A seqüência de nucleotídeo do gene de região variável de ca- deia H do anticorpo DF366 foi ligada em rede à seqüência de nucleotídeo do gene de região constante de cadeia H de lgG2a de camundongo. Primeiro, PCR foi realizada usando um primer (SEQ ID NO: 105) tendo a seqüência de nucleotídeo na extremidade 5' do gene de região variável de cadeia H, uma seqüência de Kozak e uma seqüência de enzima de restrição EcoRI e um primer antissenso (SEQ ID NO: 106) tendo um resíduo c preso à se- qüência complementar à seqüência de nucleotídeo na extremidade 3'. O produto amplificado obtido foi tratado com a enzima de restrição EcoRI e, então, incorporada no sítio EcoRI-NruI de um plasmídeo de expressão de cadeia H quimérica de lgG2a de camundongo (pMCD/G2a) para construir um vetor de expressão de cadeia H de anticorpo quimérico de lgG2a de ca- mundongo DF366 (pMCD/G2a-DF366). pMCD/G2a tem o gene de região constante de cadeia H de lgG2a de camundongo (seqüência de nucleotídeo: SEQ ID NO: 107; seqüência de aminoácido: SEQ ID NO: 108) clonado em um plasmídeo pMCD para expressão em células de mamífero e a seqüência da enzima de restrição Nrul da região constante de cadeia H é ligada à regi- ão variável de cadeia Η. O vetor pMCD, no qual um gene de DHFR tinha sido incorporado, permite expressão induzida sob o controle de um promotor de CMV de camundongo (ACESSO No. U68299).

A seqüência de nucleotídeo do gene de região variável de cadeia L do anti- corpo DF366 foi ligada em rede à seqüência de nucleotídeo de um gene de região constante de cadeia L (cadeia κ) de lgG2a de camundongo. Primeiro, PCR foi realizada usando (SEQ ID NO: 109) tendo a seqüência de nucleotí- deo na extremidade 5' do gene de região variável de cadeia L, uma seqüên- cia de Kozak e a seqüência da enzima de restrição EcoRI e um primer antis- senso (SEQ ID NO: 110) tendo resíduos gcccg presos a uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo na extremidade 3'. O produto amplificado obtido foi tratado com a enzima de restrição EcoRI e, então, in- corporado no sítio EcoRI-NruI de um plasmídeo de expressão (pMCN/k) de cadeia L quimérica de lgG2a de camundongo (cadeia κ) para construir um vetor de expressão de cadeia L de anticorpo quimérico de lgG2a de camun- dongo DF366 (pMCN/k-DF366). pMCN/k tem o gene de região constante de cadeia L (cadeia κ) de lgG2a de camundongo (seqüência de nucleotídeo: SEQ ID NO: 111; seqüência de aminoácido: SEQ ID NO: 112) clonado no plasmídeo pMCN e a seqüência da enzima de restrição Nrul da região cons- tante de cadeia L (cadeia κ) é ligada à região variável de cadeia L.

O plasmídeo pMCD/G2a-DF366 e o plasmídeo pMCN/k-DF366 foram introduzidos em células DG44 através de eletroporação. Células CHO (DF366m-DG44) mostrando expressão constante do anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo DF366 (DF366m) foram estabelecidas através de seleção com Geneticina (500 μg/mL) e meio isento de ácido nucleico (su- plemento HT). Subseqüentemente, o anticorpo DF366m foi purificado do sobrenadante de cultura de DF366m-DG44 usando uma coluna Hi Trap Pro- tein G HP. O solvente foi substituído por PBS usando uma coluna PD-10. A concentração do anticorpo DF366m purificado foi quantificada usando um kit DC Protein Assay. O anticorpo DF366m foi submetido à análise citométrica de fluxo para confirmar se ele se liga especificamente à DSG3 da mesma forma conforme o anticorpo DF366 (descrito no Exemplo 3-5). A seqüência de nucleotídeo do gene de cadeia H do anticorpo DF366m de comprimento total e a seqüência de aminoácido correspondente são mostradas em SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 114, respectivamente e a seqüência de nucleotí- deo do gene de cadeia L do anticorpo DF366m de comprimento total e a se- qüência de aminoácido correspondente são mostradas em SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 116, respectivamente. .11-2) Produção de anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo com baixo teor de fucose DF366 (DF366m com baixo teor de fucose)

O plasmídeo pMCD/G2a-DF366 e o plasmídeo pMCN/k-DF366 foram introduzidos em células CHO knockout para o transportador de fucose (células FTPKO-DXB11, Publicações de Patente Internacional Nos. WO .2006/067913 e WO 2006/067847) através de eletroporação. Células CHO (DF366m-DXB11) mostrando expressão constante do anticorpo quimérico de lgG2a de camundongo com baixo teor de fucose DF366 (DF366m com baixo teor de fucose) foram estabelecidas através de seleção com Genetici- na (500 μς/ιηΐ-) e meio isento de ácido nucleico (suplemento HT). Subse- qüentemente, o anticorpo DF366m com baixo teor de fucose foi purificado do sobrenadante de cultura de DF366m-DXB11 usando uma coluna Hi Trap Protein G HP. O solvente foi substituído por PBS usando uma coluna PD-10 e a concentração de anticorpo foi quantificada usando um kit DC Protein As- say.

.11-3) Medição de atividade de ADCC

Meio RPMI1640 (Invitrogen) contendo penicilina/estreptomicina e soro fetal bovino a 10% (aqui depois referido como meio RPMI) foi usado para o experimento. 1 χ 106 células DSG3-Ba/F3 foram suspensas em apro- ximadamente 200 μΙ_ de meio RPMI contendo 3,7 MBq de Cromo-51 (GE Healthcare Bio-Sciences) e, então, cultivadas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono durante uma hora a 37°C. Após lavagem, a densidade celular foi ajustada para 2 χ 105 células/mL e, então, distribuídas em uma lâmina de fundo em U com 96 cavidades a 50 μUcavidade. Em seguida, a solução de anticorpo foi adicionada a 50 μΐ-ycavidade. Após incubação em temperatura ambiente durante 15 minutos, células efetuadoras (descritas depois) foram adicionadas a 100 μΙ_ cada. A lâmina foi deixada descansar em uma incubado com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante seis horas. Após o que, 100 μΙ_ do sobrenadante foram coletados de cada cavidade e a radioatividade foi medida com um contador gama (1480 WIZARD 3", Wal- lac). A taxa de liberação de cromo específica foi calculada de acordo com a equação a seguir: Taxa de liberação de cromo específica (%) = (A - C) χ 100/(B - C) onde A representa a radioatividade (cpm) em cada cavidade, B representa o valor médio de radioatividade (cpm) em cavidades onde 50 μΙ_ das células e .150 μΙ_ de solução a 2% de Nonidet P-40 (Nacalai Tesque) tinham sido adi- cionados e C representa o valor médio de radioatividade (cpm) em cavida- des onde 50 μΙ_ das células e 150 μί de meio RPMI tinham sido adiciona- dos. As medições foram conduzidas em duplicata e o valor médio e desvio padrão foram calculados para a taxa de liberação de cromo específica.

Células obtidas através da adição de 50 ng/mL de interleucina-2 humana recombinante (Peprotech) à células de baço preparadas a partir de um camundongo C3H (Charles River Japão) (aqui depois referidas como SPL) ou células obtidas através de cultura de células de baço durante quatro dias na presença de 50 ng/mL de interleucina-2 humana recombinante (aqui depois referidas como SPL-LAK) foram usadas como células efetuadoras. O número de células efetuadoras por cavidade foi ajustado para 5 χ 105 células (SPL) ou 2 χ 105 células (SPL-LAK). lgG2a de camundongo (Cat. No. .553453, Becton Dickinson) e IgGI humana (Cat. No. PHP010, Serotec) fo- ram usadas como controles negativos.

A atividade de ADCC foi detectada em DF366m e DF366m com baixo teor de fucose, mas a atividade de ADCC dificilmente foi observada em DF366c e YB-DF366c (figuras 10 e 11). Portanto, DF366m e DF366m com baixo teor de fucose foram considerados como mostrando um efeito medicinal mais forte do que DF366c e YB-DF366c em camundongos.

.11 -4) Estabelecimento da linhagem de célula mostrando expressando cons- tante de DSG3 humana de comprimento total

Após digestão do pMCDN/hDSG3 com a enzima de restrição Pvul, esse foi introduzido em células SK-HEP-1 (adquiridas da ATCC) atra- vés de transfecção usando FuGENE (Roche) e uma linhagem de célula SK- HEP-1 (aqui depois referida como DSG3-SK) mostrando expressão constan- te de DSG3 humana de comprimento total foi estabelecida através de sele- ção com Geneticina (1 mg/mL). Meio D-MEM (Sigma) contendo 1 mg/mL de Geneticina e soro fetal bovino a 10% foram usados para cultivar as células DSG3-SK.

.11-5) Avaliação de atividade antitumor de DF366m e DF366m com baixo teor de fucose Células DSG3-SK foram ajustadas para 1 χ 108 células/mL em uma solução contendo uma proporção a 1:1 de meio D-MEM e MATRIGEL (Cat. No. 354234, BD Bioscience) e 100 μΙ_ dessa solução de célula foram subcutaneamente implantados no abdome de um camundongo SCID (fê- mea, 9 semanas de idade, CLEA Japão) que tinha sido submetido à admi- nistração intraperitoneal de 100 μί de anticorpo antiasialo GM1 (Wako Pure Chemicals, após dissolução de um frasco usando 1 mL de água destilada para injeção, 4 mL de solução salina fisiológica foram adicionados) no dia anterior. A partir do 19° dia após transplante, DF366m e DF366m com baixo teor de fucose foram administrados através da veia caudal durante quatro semanas. Os anticorpos foram preparados em PBS a 1 mg/mL (grupo admi- nistrado com 10 mg/kg) ou 0,2 mg/mL (grupo administrado com 2 mg/kg) e administrados a 10 mLVkg. PBS (veículo) foi administrado similarmente como um controle negativo. O ensaio foi realizado usando cinco animais em cada grupo. A atividade antitumor foi avaliada baseado no volume do tumor. O volume do tumor foi determinado baseado na equação a seguir e o valor médio e desvio padrão foram calculados: Volume de tumor = eixo maior χ eixo menor χ eixo menor/2

Comparação múltipla de Dunnett não-paramétrica foi usada para o teste de diferença significativa e um P valor de menos de 0,05 foi conside- rado significativo.

Como um resultado do exame, DF366m e DF366m com baixo teor de fucose suprimiram significativamente o crescimento de tumor no gru- po administrado com 10 mg/kg quando comparado com o grupo administra- do com veículo (figura 12). Além disso, embora não significativo, o DF366m com baixo teor de fucose indicou uma tendência supressiva também a 2 mg/kg. A partir do acima, foi confirmado que anticorpos anti-DSG3 mostram atividade antitumor. Aplicabilidade Industrial Os anticorpos específicos à proteína DSG3 da presente inven- ção podem ser usados como um agente diagnóstico não apenas para câncer de pulmão, mas também para câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele e câncer uterino. Além disso, usando os anticorpos anti-DSG3 após rotulação dos mesmos com uma substância química ou um radioisótopo, a presença de câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou câncer uterino pode ser detectada in vivo.

Além disso, anticorpos anti-DSG3 tendo atividade citotóxica de acordo com a presente invenção podem ser usados como agentes citotóxi- cos ou inibidores de crescimento celular para vários tipos de células cance- rígenas que expressam uma proteína DSG3, tais como células de câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou câncer uterino.

Além disso, anticorpos anti-DSG3 tendo atividade citotóxica de acordo com a presente invenção podem ser usados como agentes terapêuti- cos contra vários tipos de cânceres, tais como câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou câncer uterino. Além disso, anticorpos anti-DSG3 da presente inven- ção podem ser usados como agentes terapêuticos para esses cânceres sem induzir à condições de pemphigus.

Adicionalmente, genes que codificam anticorpos da presente invenção e células recombínantes transformadas por esses genes podem ser usados para produzir anticorpos recombinantes que exibem os efeitos mencionados acima e mais efeitos preferidos. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> FORERUNNER PHARMA RESEARCH CD., LTDA.

THE UNIVERSITY OF TOKYO

<120> Diagnóstico e tratamento de câncer usando anticorpo anti-Desmogleina-3

<130> C1-A0613Y1P

<150> JP 2006-221330

<151> 14/08/2006

<150> JP 2007--01910B

<151> 30/01/2007

<160> 116

<170> PatentIn versão 3.4

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

gcctactaca tgcac

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ala Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 3

<211> 51

<212> DMA

<213> Mus musculus <400> 3

cagattaatc ctagcactgg tggtactacc tacaaccaga agttcaaggc c 51

<210> 4

<211> 17 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5

tggggtgact ct 12

<210> 6 <211> 4 <212> PRT

<213> Mus musculus <400> 6 Trp Gly Asp Ser 1

<210> 7 <211> 1011 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 60 tcctctgtga ctctgggatg cctggtcaag ggctacttcc ctgagtcagt gactgtgact 120 tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 180 ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 240 acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 300 gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 360 cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 420 atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 480 gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 540 catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag 600 gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccatcaccc 660 atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacatcttg 720 ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 780 ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 840 aaggacaccg caccagtcct ggactctgac ggttcttact tcatatacag caagctcgat 900 ataaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 960 ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaatg a 1011

<210> 8 <211> 336 <Z12> PRT <213> Mus musculus <400> 8

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45

Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80

Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys

85 90 95

Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 130 135 140 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro 145 150 155 160

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

165 170 175

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val

180 185 190

Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

195 200 205

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr 210 215 220

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu 225 230 235 240

Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys 245 250 255

Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser 260 265 270

Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp

275 280 285

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asp Ile Lys Thr Ser 290 295 300

Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly 305 310 315 320

Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 325 330 335

<210> 9 <211> 1004 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgataagcgg ccgc 1004

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100

Pro Ala Pro Glu Leu 115

Lys Pro Lys Asp Thr 130

Val Val Val Asp Val

145

Tyr Val Asp Gly Val 165

Glu Gln Tyr Asn Ser 180

His Gln Asp Trp Leu 195

Lys Ala Leu Pro Ala 210

Gln Pro Arg Glu Pro 225

Leu Thr Lys Asn Gln 245

Pro Ser Asp Ile Ala 260

Asn Tyr Lys Thr Thr 275

Leu Tyr Ser Lys Leu 290

Val Phe Ser Cys Ser 305

Gln Lys Ser Leu Ser 325

<210> 11 <211> 45 <212> DNA

105

Leu Gly Gly Pro Ser Val 120

Leu Met Ile Ser Arg Thr 135

Ser His Glu Asp Pro Glu 150 155

Glu Val His Asn Ala Lys 170

Thr Tyr Arg Val Val Ser 185

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 200

Pro Ile Glu Lys Thr Ile 215

Gln Val Tyr Thr Leu Pro 230 235

Val Ser Leu Thr Cys Leu 250

Val Glu Trp Glu Ser Asn 265

Pro Pro Val Leu Asp Ser 280

Thr Val Asp Lys Ser Arg 295

Val Met His Glu Ala Leu 310 315

Leu Ser Pro Gly Lys 330

110

Phe Leu Phe Pro Pro 125

Pro Glu Val Thr Cys 140

Val Lys Phe Asn Trp 160

Thr Lys Pro Arg Glu 175

Val Leu Thr Val Leu 190

Cys Lys Val Ser Asn 205

Ser Lys Ala Lys Gly 220

Pro Ser Arg Asp Glu 240

Val Lys Gly Phe Tyr 255

Gly Gln Pro Glu Asn 270

Asp Gly Ser Phe Phe 285

Trp Gln Gln Gly Asn 300

His Asn His Tyr Thr 320 <213> Mus musculus <400> 11

agagccagtg aaagtgttga atattatggc actagtttaa tgcag 45 <210> 12 <211> 15 <212> PRT

<213> Mus musculus <400> 12

Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln

1 5 10 15

<210> 13

<211> 21

<212> DMA

<213> Mus musculus

<400> 13

ggtgcatccg acgtagaatc t 21

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Gly Ala Ser Asp Val Glu Ser

1 5

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 15

cagcaaagta ggaaggttcc gtatacg 27 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 16

Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr 1 5

<210> 17

<211> 324

<212> DNA

<213> Mus musculus <400> 17

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240 cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300 agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324

<210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105

<210> 19 <211> 335 <212> DMA

<213> Homo sapiens <400> 19

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttgataagcg gccgc 335

<210> 20 <211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 21

<211> 15

<212> DMA

<213> Mus musculus

<400> 21

agctactgga ttcac 15 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Ser Tyr Trp Ile His 1 5

<210> 23 <211> 51 <212> DNA

<213> Mus musculus <400> 23

tctatttatc ctggaaatag tgatactacc tacaaccaga agttcaaggg c 51

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 25 cctacttact atagttacga cgattactat gctatggact at 42

<210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28

Pro Thr Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 27 <211> 975

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 27

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480

gtgcacacag ctcagacaaa accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgttcagtc 540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720

agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900

acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960

tctcctggta aatga 975 <210> 28 <211> 324 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29

agtgtcagct caagtataag ttccagcaac ttacac 36

<210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His

1 5 10

<210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31

ggcacatcca accttgcttc t 21

<210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

<210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33

caacagtgga gtagttaccc gctcacg 27

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 34

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 35 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35

<210> 36 <211> 107 <212 > PRT

<213> Mus musculus

<400> 36

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105

<210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Uma seqüência de primer artificialmente sintetizada <400> 37

taacccgggc caccatgatg gggctcttcc ccag 34

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de primer artificialmente sintetizada <400> 38 ttagcggccg cttatcatat tagacgggag caagg <210> 39 <211> 3000 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39

atgatggggc tcttccccag aactacaggg gctctggcca tcttcgtggt ggtcatattg 60

gttcatggag aattgcgaat agagactaaa ggtcaatatg atgaagaaga gatgactatg 120

caacaagcta aaagaaggca aaaacgtgaa tgggtgaaat ttgccaaacc ctgcagagaa 180

ggagaagata actcaaaaag aaacccaatt gccaagatta cttcagatta ccaagcaacc 240

cagaaaatca cctaccgaat ctctggagtg ggaatcgatc agccgccttt tggaatcttt 300

gttgttgaca aaaacactgg agatattaac ataacagcta tagtcgaccg ggaggaaact 360

ccaagcttcc tgatcacatg tcgggctcta aatgcccaag gactagatgt agagaaacca 420

cttatactaa cggttaaaat tttggatatt aatgataatc ctccagtatt ttcacaacaa 480

attttcatgg gtgaaattga agaaaatagt gcctcaaact cactggtgat gatactaaat 540

gccacagatg cagatgaacc aaaccacttg aattctaaaa ttgccttcaa aattgtctct 600

caggaaccag caggcacacc catgttcctc ctaagcagaa acactgggga agtccgtact 660

ttgaccaatt ctcttgaccg agagcaagct agcagctatc gtctggttgt gagtggtgca 720

gacaaagatg gagaaggact atcaactcaa tgtgaatgta atattaaagt gaaagatgtc 780

aacgataact tcccaatgtt tagagactct cagtattcag cacgtattga agaaaatatt 840

ttaagttctg aattacttcg atttcaagta acagatttgg atgaagagta cacagataat 900

tggcttgcag tatatttctt tacctctggg aatgaaggaa attggtttga aatacaaact 960

gatcctagaa ctaatgaagg catcctgaaa gtggtgaagg ctctagatta tgaacaacta 1020

caaagcgtga aacttagtat tgctgtcaaa aacaaagctg aatttcacca atcagttatc 1080

tctcgatacc gagttcagtc aaccccagtc acaattcagg taataaatgt aagagaagga 1140

attgcattcc gtcctgcttc caagacattt actgtgcaaa aaggcataag tagcaaaaaa 1200

ttggtggatt atatcctggg aacatatcaa gccatcgatg aggacactaa caaagctgcc 1260

tcaaatgtca aatatgtcat gggacgtaac gatggtggat acctaatgat tgattcaaaa 1320

actgctgaaa tcaaatttgt caaaaatatg aaccgagatt ctactttcat agttaacaaa 1380

acaatcacag ctgaggttct ggccatagat gaatacacgg gtaaaacttc tacaggcacg 1440

gtatatgtta gagtacccga tttcaatgac aattgtccaa cagctgtcct cgaaaaagat 1500

gcagtttgca gttcttcacc ttccgtggtt gtctccgcta gaacactgaa taatagatac 1560 actggcccct atacatttgc actggaagat caacctgtaa agttgcctgc cgtatggagt 1620

atcacaaccc tcaatgctac ctcggccctc ctcagagccc aggaacagat acctcctgga 1680

gtataccaca tctccctggt acttacagac agtcagaaca atcggtgtga gatgccacgc 1740

agcttgacac tggaagtctg tcagtgtgac aacaggggca tctgtggaac ttcttaccca 1800

accacaagcc ctgggaccag gtatggcagg ccgcactcag ggaggctggg gcctgccgcc 1860

atcggcctgc tgctccttgg tctcctgctg ctgctgttgg ccccccttct gctgttgacc 1920

tgtgactgtg gggcaggttc tactggggga gtgacaggtg gttttatccc agttcctgat 1980

ggctcagaag gaacaattca tcagtgggga attgaaggag cccatcctga agacaaggaa 2040

atcacaaata tttgtgtgcc tcctgtaaca gccaatggag ccgatttcat ggaaagttct 2100

gaagtttgta caaatacgta tgccagaggc acagcggtgg aaggcacttc aggaatggaa 2160

atgaccacta agcttggagc agccactgaa tctggaggtg ctgcaggctt tgcaacaggg 2220

acagtgtcag gagctgcttc aggattcgga gcagccactg gagttggcat ctgttcctca 2280

gggcagtctg gaaccatgag aacaaggcat tccactggag gaaccaataa ggactacgct 2340

gatggggcga taagcatgaa ttttctggac tcctactttt ctcagaaagc atttgcctgt 2400

gcggaggaag acgatggcca ggaagcaaat gactgcttgt tgatctatga taatgaaggc 2460

gcagatgcca ctggttctcc tgtgggctcc gtgggttgtt gcagttttat tgctgatgac 2520

ctggatgaca gcttcttgga ctcacttgga cccaaattta aaaaacttgc agagataagc 2580

cttggtgttg atggtgaagg caaagaagtt cagccaccct ctaaagacag cggttatggg 2640

attgaatcct gtggccatcc catagaagtc cagcagacag gatttgttaa gtgccagact 2700

ttgtcaggaa gtcaaggagc ttctgctttg tccgcctctg ggtctgtcca gccagctgtt 2760

tccatccctg accctctgca gcatggtaac tatttagtaa cggagactta ctcggcttct 2820

ggttccctcg tgcaaccttc cactgcaggc tttgatccac ttctcacaca aaatgtgata 2880

gtgacagaaa gggtgatctg tcccatttcc agtgttcctg gcaacctagc tggcccaacg 2940

cagctacgag ggtcacatac tatgctctgt acagaggatc cttgctcccg tctaatatga 3000

<210> 40

<211> 999 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Met Met Gly Leu Phe Pro Arg Thr Thr Gly Ala Leu Ala Ile Phe Val 1 5 10 15

Val Val Ile Leu Val His Gly Glu Leu Arg Ile Glu Thr Lys Gly Gln 20 25 30

Tyr Asp Glu Glu Glu Met Thr Met Gln Gln Ala Lys Arg Arg Gln Lys

35 40 45

Arg Glu Trp Val Lys Phe Ala Lys Pro Cys Arg Glu Gly Glu Asp Asn

50 55 60

Ser Lys Arg Asn Pro Ile Ala Lys Ile Thr Ser Asp Tyr Gln Ala Thr

65 70 75 80

Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Ser Gly Val Gly Ile Asp Gln Pro Pro

85 90 95

Phe Gly Ile Phe Val Val Asp Lys Asn Thr Gly Asp Ile Asn Ile Thr

100 105 110

Ala Ile Val Asp Arg Glu Glu Thr Pro Ser Phe Leu Ile Thr Cys Arg

115 120 125

Ala Leu Asn Ala Gln Gly Leu Asp Val Glu Lys Pro Leu Ile Leu Thr

130 135 140

Val Lys Ile Leu Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Val Phe Ser Gln Gln

145 150 155 160

Ile Phe Met Gly Glu Ile Glu Glu Asn Ser Ala Ser Asn Ser Leu Val

165 170 175

Met Ile Leu Asn Ala Thr Asp Ala Asp Glu Pro Asn His Leu Asn Ser

180 185 190

Lys Ile Ala Phe Lys Ile Val Ser Gln Glu Pro Ala Gly Thr Pro Met

195 200 205

Phe Leu Leu Ser Arg Asn Thr Gly Glu Val Arg Thr Leu Thr Asn Ser

210 215 220

Leu Asp Arg Glu Gln Ala Ser Ser Tyr Arg Leu Val Val Ser Gly Ala

225 230 235 240

Asp Lys Asp Gly Glu Gly Leu Ser Thr Gln Cys Glu Cys Asn Ile Lys

245 250 255

Val Lys Asp Val Asn Asp Asn Phe Pro Met Phe Arg Asp Ser Gln Tyr

260 265 270

Ser Ala Arg Ile Glu Glu Asn Ile Leu Ser Ser Glu Leu Leu Arg Phe 275 280 285

Gln Val Thr Asp Leu Asp Glu Glu Tyr Thr Asp Asn Trp Leu Ala Val

290 295 300

Tyr Phe Phe Thr Ser Gly Asn Glu Gly Asn Trp Phe Glu Ile Gln Thr

305 310 315 320 Asp Pro Arg Thr Asn Glu Gly Ile Leu Lys Val Val Lys Ala Leu Asp

325 330 335

Tyr Glu Gln Leu Gln Ser Val Lys Leu Ser Ile Ala Val Lys Asn Lys

340 345 350

Ala Glu Phe His Gln Ser Val Ile Ser Arg Tyr Arg Val Gln Ser Thr

355 360 365

Pro Val Thr Ile Gln Val Ile Asn Val Arg Glu Gly Ile Ala Phe Arg

370 375 380

Pro Ala Ser Lys Thr Phe Thr Val Gln Lys Gly Ile Ser Ser Lys Lys 385 390 395 400

Leu Val Asp Tyr Ile Leu Gly Thr Tyr Gln Ala Ile Asp Glu Asp Thr

405 410 415

Asn Lys Ala Ala Ser Asn Val Lys Tyr Val Met Gly Arg Asn Asp Gly

420 425 430

Gly Tyr Leu Met Ile Asp Ser Lys Thr Ala Glu Ile Lys Phe Val Lys

435 440 445

Asn Met Asn Arg Asp Ser Thr Phe Ile Val Asn Lys Thr Ile Thr Ala

450 455 460

Glu Val Leu Ala Ile Asp Glu Tyr Thr Gly Lys Thr Ser Thr Gly Thr 465 470 475 480

Val Tyr Val Arg Val Pro Asp Phe Asn Asp Asn Cys Pro Thr Ala Val

485 490 495

Leu Glu Lys Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser Pro Ser Val Val Val Ser

500 505 510

Ala Arg Thr Leu Asn Asn Arg Tyr Thr Gly Pro Tyr Thr Phe Ala Leu

515 520 525

Glu Asp Gln Pro Val Lys Leu Pro Ala Val Trp Ser Ile Thr Thr Leu 530 535 540

Asn Ala Thr Ser Ala Leu Leu Arg Ala Gln Glu Gln Ile Pro Pro Gly

545 550 555 560

Val Tyr His Ile Ser Leu Val Leu Thr Asp Ser Gln Asn Asn Arg Cys

565 570 575

Glu Met Pro Arg Ser Leu Thr Leu Glu Val Cys Gln Cys Asp Asn Arg

580 585 590

Gly Ile Cys Gly Thr Ser Tyr Pro Thr Thr Ser Pro Gly Thr Arg Tyr

595 600 605

Gly Arg Pro His Ser Gly Arg Leu Gly Pro Ala Ala Ile Gly Leu Leu

610 615 620

Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Thr 625 630 635 640

Cys Asp Cys Gly Ala Gly Ser Thr Gly Gly Val Thr Gly Gly Phe Ile

645 650 655

Pro Val Pro Asp Gly Ser Glu Gly Thr Ile His Gln Trp Gly Ile Glu

660 665 670

Gly Ala His Pro Glu Asp Lys Glu Ile Thr Asn Ile Cys Val Pro Pro

675 680 685

Val Thr Ala Asn Gly Ala Asp Phe Met Glu Ser Ser Glu Val Cys Thr

690 695 700

Asn Thr Tyr Ala Arg Gly Thr Ala Val Glu Gly Thr Ser Gly Met Glu

705 710 715 720

Met Thr Thr Lys Leu Gly Ala Ala Thr Glu Ser Gly Gly Ala Ala Gly

725 730 735

Phe Ala Thr Gly Thr Val Ser Gly Ala Ala Ser Gly Phe Gly Ala Ala

740 745 750

Thr Gly Val Gly Ile Cys Ser Ser Gly Gln Ser Gly Thr Met Arg Thr

755 760 765

Arg His Ser Thr Gly Gly Thr Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Gly Ala Ile

770 775 780

Ser Met Asn Phe Leu Asp Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Ala Phe Ala Cys 785 790 795 800

Ala Glu Glu Asp Asp Gly Gln Glu Ala Asn Asp Cys Leu Leu Ile Tyr

805 810 815

Asp Asn Glu Gly Ala Asp Ala Thr Gly Ser Pro Val Gly Ser Val Gly

820 825 830

Cys Cys Ser Phe Ile Ala Asp Asp Leu Asp Asp Ser Phe Leu Asp Ser

835 840 845

Leu Gly Pro Lys Phe Lys Lys Leu Ala Glu Ile Ser Leu Gly Val Asp

850 855 860

Gly Glu Gly Lys Glu Val Gln Pro Pro Ser Lys Asp Ser Gly Tyr Gly

865 870 875 880

Ile Glu Ser Cys Gly His Pro Ile Glu Val Gln Gln Thr Gly Phe Val

885 890 895

Lys Cys Gln Thr Leu Ser Gly Ser Gln Gly Ala Ser Ala Leu Ser Ala

900 905 910

Ser Gly Ser Val Gln Pro Ala Val Ser Ile Pro Asp Pro Leu Gln His

915 920 925

Gly Asn Tyr Leu Val Thr Glu Thr Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Leu Val

930 935 940 Gln Pro Ser Thr Ala Gly Phe Asp Pro Leu Leu Thr Gln Asn Val Ile

945 950 955 960

Val Thr Glu Arg Val Ile Cys Pro Ile Ser Ser Val Pro Gly Asn Leu

965 970 975

Ala Gly Pro Thr Gln Leu Arg Gly Ser His Thr Met Leu Cys Thr Glu

980 985 990

Asp Pro Cys Ser Arg Leu Ile 995

<210> 41 <211> 2550 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Uma seqüência de primer artificialmente sintetizada <400> 41

atgatggggc tcttccccag aactacaggg gctctggcca tcttcgtggt ggtcatattg 60

gttcatggag aattgcgaat agagactaaa ggtcaatatg atgaagaaga gatgactatg 120

caacaagcta aaagaaggca aaaacgtgaa tgggtgaaat ttgccaaacc ctgcagagaa 180

ggagaagata actcaaaaag aaacccaatt gccaagatta cttcagatta ccaagcaacc 240

cagaaaatca cctaccgaat ctctggagtg ggaatcgatc agccgccttt tggaatcttt 300

gttgttgata aaaacactgg agatattaac ataacagcta tagtcgaccg ggaggaaact 360

ccaagcttcc tgatcacatg tcgggctcta aatgcccaag gactagatgt agagaaacca 420

cttatactaa cggttaaaat tttggatatt aatgataatc ctccagtatt ttcacaacaa 480

attttcatgg gtgaaattga agaaaatagt gcctcaaact cactggtgat gatactaaat 540

gccacagatg cagatgaacc aaaccacttg aactctaaaa ttgccttcaa aattgtctct 600

caggaaccag caggcacacc catgttcctc ctaagcagaa acactgggga agtccgtact 660

ttgaccaatt ctcttgaccg agagcaagct agcagctatc gtctggttgt gagtggtgca 720

gacaaagatg gagaaggact atcaactcaa tgtgaatgta atattaaagt gaaagatgtc 780

aacgataact tcccaatgtt tagagactct cagtattcag cacgtattga agaaaatatt 840

ttaagttctg aattacttcg atttcaagta acagatttgg atgaagagta cacagataat 900

tggcttgcag tatatttctt tacctctggg aatgaaggaa attggtttga aatacaaact 960

gatcctagaa ctaatgaagg catcctgaaa gtggtgaagg ctctagatta tgaacaacta 1020

caaagcgtga aacttagtat tgctgtcaaa aacaaagctg aatttcacca atcagttatc 1080

tctcgatacc gagttcagtc aaccccagtc acaattcagg taataaatgt aagagaagga 1140

attgcattcc gtcctgcttc caagacattt actgtgcaaa aaggcataag tagcaaaaaa 1200

ttggtggatt atatcctggg aacatatcaa gccatcgatg aggacactaa caaagctgcc 1260

tcaaatgtca aatatgtcat gggacgtaac gatggtggat acctaatgat tgattcaaaa 1320

actgctgaaa tcaaatttgt caaaaatatg aaccgagatt ctactttcat agttaacaaa 1380

acaatcacag ctgaggttct ggccatagat gaatacacgg gtaaaacttc tacaggcacg 1440

gtatatgtta gagtacccga tttcaatgac aattgtccaa cagctgtcct cgaaaaagat 1500

gcagtttgca gttcttcacc ttccgtggtt gtctccgcta gaacactgaa taatagatac 1560

actggcccct atacatttgc actggaagat caacctgtaa agttgcctgc cgtatggagt 1620

atcacaaccc tcaatgctac ctcggccctc ctcagagccc aggaacagat acctcctgga 1680

gtataccaca tctccctggt acttacagac agtcagaaca atcggtgtga gatgccacgc 1740

agcttgacac tggaagtctg tcagtgtgac aacaggggca tctgtggaac ttcttaccca 1800 accacaagcc ctgggaccag gtatggcagg ccgcactcag ggaggctgga acctcgcgga 1860

ccgacaatca agccctgtcc tccatgcaaa tgcccagcac ctaacctctt gggtggacca 1920

tccgtcttca tcttccctcc aaagatcaag gatgtactca tgatctccct gagccccata 1980

gtcacatgtg tggtggtgga tgtgagcgag gatgacccag atgtccagat cagctggttt 2040

gtgaacaacg tggaagtaca cacagctcag acacaaaccc atagagagga ttacaacagt 2100

actctccggg tggtcagtgc cctccccatc cagcaccagg actggatgag tggcaaggag 2160

ttcaaatgca aggtcaacaa caaagacctc ccagcgccca tcgagagaac catctcaaaa 2220

cccaaagggt cagtaagagc tccacaggta tatgtcttgc ctccaccaga agaagagatg 2280

actaagaaac aggtcactct gacctgcatg gtcacagact tcatgcctga agacatttac 2340

gtggagtgga ccaacaacgg gaaaacagag ctaaactaca agaacactga accagtcctg 2400

gactctgatg gttcttactt catgtacagc aagctgagag tggaaaagaa gaactgggtg 2460

gaaagaaata gctactcctg ttcagtggtc cacgagggtc tgcacaatca ccacacgact 2520

aagagcttct cccggactcc gggtaaatga 2550 <210> 42

<211> 649

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada <400> 42

Met Met Gly Leu Phe Pro Arg Thr Thr Gly Ala Leu Ala Ile Phe Val 1 5 10 15

Val Val Ile Leu Val His Gly Glu Leu Arg Ile Glu Thr Lys Gly Gln 20 25 30

Tyr Asp Glu Glu Glu Met Thr Met Gln Gln Ala Lys Arg Arg Gln Lys 35 40 45

Arg Glu Trp Val Lys Phe Ala Lys Pro Cys Arg Glu Gly Glu Asp Asn

50 55 60

Ser Lys Arg Asn Pro Ile Ala Lys Ile Thr Ser Asp Tyr Gln Ala Thr

65 70 75 80

Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Ser Gly Val Gly Ile Asp Gln Pro Pro 85 90 95 Phe Gly Ile Phe Val Val Asp Lys Asn Thr Gly Asp Ile Asn Ile Thr

100 105 110

Ala Ile Val Asp Arg Glu Glu Thr Pro Ser Phe Leu Ile Thr Cys Arg

115 120 125

Ala Leu Asn Ala Gln Gly Leu Asp Val Glu Lys Pro Leu Ile Leu Thr

130 135 140

Val Lys Ile Leu Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Val Phe Ser Gln Gln 145 150 155 160

Ile Phe Met Gly Glu Ile Glu Glu Asn Ser Ala Ser Asn Ser Leu Val

165 170 175

Met Ile Leu Asn Ala Thr Asp Ala Asp Glu Pro Asn His Leu Asn Ser

180 185 190

Lys Ile Ala Phe Lys Ile Val Ser Gln Glu Pro Ala Gly Thr Pro Met

195 200 205

Phe Leu Leu Ser Arg Asn Thr Gly Glu Val Arg Thr Leu Thr Asn Ser

210 215 220

Leu Asp Arg Glu Gln Ala Ser Ser Tyr Arg Leu Val Val Ser Gly Ala 225 230 235 240

Asp Lys Asp Gly Glu Gly Leu Ser Thr Gln Cys Glu Cys Asn Ile Lys

245 250 255

Val Lys Asp Val Asn Asp Asn Phe Pro Met Phe Arg Asp Ser Gln Tyr

260 265 270

Ser Ala Arg Ile Glu Glu Asn Ile Leu Ser Ser Glu Leu Leu Arg Phe

275 280 285

Gln Val Thr Asp Leu Asp Glu Glu Tyr Thr Asp Asn Trp Leu Ala Val

290 295 300

Tyr Phe Phe Thr Ser Gly Asn Glu Gly Asn Trp Phe Glu Ile Gln Thr 305 310 315 320

Asp Pro Arg Thr Asn Glu Gly Ile Leu Lys Val Val Lys Ala Leu Asp

325 330 335

Tyr Glu Gln Leu Gln Ser Val Lys Leu Ser Ile Ala Val Lys Asn Lys 340 345 350 Ala Glu Phe His Gln Ser Val Ile Ser Arg Tyr Arg Val Gln Ser Thr

355 360 365

Pro Val Thr Ile Gln Val Ile Asn Val Arg Glu Gly Ile Ala Phe Arg

370 375 380

Pro Ala Ser Lys Thr Phe Thr Val Gln Lys Gly Ile Ser Ser Lys Lys 385 390 395 400

Leu Val Asp Tyr Ile Leu Gly Thr Tyr Gln Ala Ile Asp Glu Asp Thr

405 410 415

Asn Lys Ala Ala Ser Asn Val Lys Tyr Val Met Gly Arg Asn Asp Gly

420 425 430

Gly Tyr Leu Met Ile Asp Ser Lys Thr Ala Glu Ile Lys Phe Val Lys

435 440 445

Asn Met Asn Arg Asp Ser Thr Phe Ile Val Asn Lys Thr Ile Thr Ala

450 455 460

Glu Val Leu Ala Ile Asp Glu Tyr Thr Gly Lys Thr Ser Thr Gly Thr 465 470 475 480

Val Tyr Val Arg Val Pro Asp Phe Asn Asp Asn Cys Pro Thr Ala Val

485 490 495

Leu Glu Lys Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser Pro Ser Val Val Val Ser

500 505 510

Ala Arg Thr Leu Asn Asn Arg Tyr Thr Gly Pro Tyr Thr Phe Ala Leu

515 520 525

Glu Asp Gln Pro Val Lys Leu Pro Ala Val Trp Ser Ile Thr Thr Leu

530 535 540

Asn Ala Thr Ser Ala Leu Leu Arg Ala Gln Glu Gln Ile Pro Pro Gly 545 550 555 560

Val Tyr His Ile Ser Leu Val Leu Thr Asp Ser Gln Asn Asn Arg Cys

565 570 575

Glu Met Pro Arg Ser Leu Thr Leu Glu Val Cys Gln Cys Asp Asn Arg

580 585 590

Gly Ile Cys Gly Thr Ser Tyr Pro Thr Thr Ser Pro Gly Thr Arg Tyr 595 600 605 Gly Arg Pro His Ser Gly Arg Leu Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys

610 615 620

Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 625 630 635 640

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser

645 650 655

Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp

660 665 670

Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr

675 680 685

Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val

690 695 700

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 705 710 715 720

Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

725 730 735

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val

740 745 750

Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr

755 760 765

Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr

770 775 780

Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 785 790 795 800

Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys

805 810 815

Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu

820 825 830

Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 835 840 845

Lys

<210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Uma seqüência de oligonucleotídeo artificialmente sintetizada <400> 43

caggggccag tggatagact gatg 24

<210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Uma seqüência de oligonucleotídeo artificialmente sintetizada <400> 44

gctcactgga tggtgggaag atg 23

<210> 45 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 45

atgggatgga actggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctggttactc attcactgcc tactacatgc actgggtgaa gcaaagtcct 180

gaaaagtgcc ttgagtggat tggacagatt aatcctagca ctggtggtac tacctacaac 240

cagaagttca aggccaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt attgtgcaag atggggtgac 360

tcttggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 396 <210> 46 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45

Thr Ala Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Cys Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Gln Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125

Thr Val Ser Ser 130

<210> 47

<211> 393

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 47

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagtgtcacc 120 atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca ctagtttaat gcagtggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg gtgcatccga cgtagaatct 240 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 300 cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaggaa ggttccgtat 360 acgttcggat cggggaccaa gttggaaata aaa 393

<210> 48 <211> 131 <212> PRT

<213> Mus musculus <400> 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45

Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asp Val Glu Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser 85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Glu Ile Lys 130 <210> 49 <211> 426 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 49

atggaatcta actggatact tccttttatt ctgtcggtaa cttcaggggt ctactcagag 60 gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg gcaaggcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac ctttgccagc tactggattc actgggtaaa gcagaggcct 180 ggacagggtc tggaatggat tggctctatt tatcctggaa atagtgatac tacctacaac 240 cagaagttca agggcaaggc caaactgact gtagtcacat ctgccagctc tgcctacatg 300 gagctcagca gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgtacaga acctacttac 360 tatagttacg acgattacta tgctatggac tattggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420 tcctca 426

<210> 50 <211> 142 <212> PRT

<213> Mus musculuE <400> 50

Met Glu Ser Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15

Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ala Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Val Thr Ser Ala Ser 85 90 95

Ser Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Glu Pro Thr Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala

115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140

<210> 51 <211> 390 <212> DNA

<213> Mus musculus <400> 51

atggattttc atgtgcagat tttcagcttc atgctaatca gtgtcacagt catattgtcc 60

agtggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca gcactcatgg ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcaccatca cctgcagtgt cagctcaagt ataagttcca gcaacttaca ctggtaccag 180 cagaagtcag gaacctcccc caaaccctgg atttatggca catccaacct tgcttctgga 240 gtccctgttc gcttcagtgg cagtggatct gggacctctt attctctcac aatcagcacc 300 atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgtcaacagt ggagtagtta cccgctcacg 360 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 390

<210> 52 <211> 130 <Ζ12> PRT <213> Mus muEculus <400> 52

Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr 1 5 10 15

Val Ile Leu Ser Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu 20 25 30

Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80

Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110

Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125

Leu Lys 130 <210> 53

<211> 32

<212> DNA

<213> Mus musculus <400> 53

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ct 32

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 54

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 30

<210> 55

<211> 33

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 55

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctg 33

<210> 56

<211> 1407

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 56

atgggatgga actggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctggttactc attcactgcc tactacatgc actgggtgaa gcaaagtcct 180

gaaaagtgcc ttgagtggat tggacagatt aatcctagca ctggtggtac tacctacaac 240

cagaagttca aggccaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt attgtgcaag atggggtgac 360

tcttggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcca aaacaacacc cccatcagtc 420

tatccactgg cccctgggtg tggagataca actggttcct ctgtgactct gggatgcctg 480

gtcaagggct acttccctga gtcagtgact gtgacttgga actctggatc cctgtccagc 540

agtgtgcaca ccttcccagc tctcctgcag tctggactct acactatgag cagctcagtg 600

actgtcccct ccagcacctg gccaagtcag accgtcacct gcagcgttgc tcacccagcc 660

agcagcacca cggtggacaa aaaacttgag cccagcgggc ccatttcaac aatcaacccc 720

tgtcctccat gcaaggagtg tcacaaatgc ccagctccta acctcgaggg tggaccatcc 780 gtcttcatct tccctccaaa tatcaaggat gtactcatga tctccctgac acccaaggtc 840

acgtgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagacg tccagatcag ctggtttgtg 900

aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact 960

atccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggagttc 1020

aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca tcacccatcg agagaaccat ctcaaaaatt 1080

aaagggctag tcagagctcc acaagtatac atcttgccgc caccagcaga gcagttgtcc 1140

aggaaagatg tcagtctcac ttgcctggtc gtgggcttca accctggaga catcagtgtg 1200

gagtggacca gcaatgggca tacagaggag aactacaagg acaccgcacc agtcctggac 1260

tctgacggtt cttacttcat atacagcaag ctcgatataa aaacaagcaa gtgggagaaa 1320

acagattcct tctcatgcaa cgtgagacac gagggtctga aaaattacta cctgaagaag 1380

accatctccc ggtctccggg taaatga 1407

<210> 57

<211> 468

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 57

Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly .1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Ala Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Cys Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Gln Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn

.65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu

.145 150 155 160

Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly

180 185 190

Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro

195 200 205

Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr

210 215 220

Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro

.225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu

260 265 270

Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu

290 295 300

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr

.305 310 315 320

Ile Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser

325 330 335

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro

340 345 350

Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val

370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val 385 390 395 400

Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala 405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asp 420 425 430

Ile Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val

435 440 445

Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg 450 455 460

Ser Pro Gly Lys 465

<210> 58 <211> 717 <212> DNA

<213> Mus musculus <400> 58

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagtgtcacc 120 atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca ctagtttaat gcagtggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg gtgcatccga cgtagaatct 240 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 300 cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaggaa ggttccgtat 360 acgttcggat cggggaccaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

<210> 59 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 59

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro .1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asp Val Glu Ser

.65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

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130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

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Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

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Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

.225 230 235 <210> 60

<211> 1401

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 60

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<210> 61

<211> 466

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 61

Met Glu Ser Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15

Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg

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Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

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Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Val Thr Ser Ala Ser

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Ser Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Glu Pro Thr Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala

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Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln 145 150 155 160

Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

195 200 205

Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys

210 215 220

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val 225 230 235 240 Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val

245 250 255

Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile

260 265 270

Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp

275 280 285

Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His

290 295 300

Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

.305 310 315 320

Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp

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Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile

405 410 415

Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln

420 425 430

Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His

435 440 445

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

.465

<210> 62

<211> 714 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 62

atggattttc atgtgcagat tttcagcttc atgctaatca gtgtcacagt catattgtcc 60

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<211> 237

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 63

Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr

.1 5 10 15

Val Ile Leu Ser Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu

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Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

.65 70 75 80

Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

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Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

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Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn

.145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser

165 170 175

Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu

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Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser

210 215 220

Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

.225 230 235

<210> 64

<211> 1389

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de nucleotídeo artificialmente sintetizada

<400> 64

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ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080

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ggtaaatga 1389 <210> 65 <211> 462 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada <400> 65 Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

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Thr Ala Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Cys Leu

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Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

115 120 125

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

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165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

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325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445

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450 455 460

<210> 66 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de nucleotídeo artificialmente sintetizada

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gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagtgtcacc 120

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<210> 67

<211> 238

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 67

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

.1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

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Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

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Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

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Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys

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Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

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atggaatcta actggatact tccttttatt ctgtcggtaa cttcaggggt ctactcagag 60

gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg gcaaggcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac ctttgccagc tactggattc actgggtaaa gcagaggcct 180

ggacagggtc tggaatggat tggctctatt tatcctggaa atagtgatac tacctacaac 240

cagaagttca agggcaaggc caaactgact gtagtcacat ctgccagctc tgcctacatg 300

gagctcagca gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgtacaga acctacttac 360

tatagttacg acgattacta tgctatggac tattggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420

tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

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<223> Uma seqüência de peptideo artificialmente sintetizada <400> 69

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Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg

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Ser Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Glu Pro Thr Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala 115 120 125 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

.145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

.225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

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Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

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355 360 365

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<210> 70

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de nucleotideo artificialmente sintetizada

<400> 70

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<212> PRT

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<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 71

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.1 5 10 15

Val Ile Leu Ser Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu

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Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser

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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

50 55 60

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165 170 175

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180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

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210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 72

Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 73

Ser Gly Gly Gly

1

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 74

Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 75 <211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 75

Ser Gly Gly Gly Gly

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 76

Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 77

Ser Gly Gly Gly Gly Gly

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<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada <400> 78

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptideo artificialmente sintetizada

<400> 79

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5

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<211> 15

<212> DNA

<213> Mus musculus

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gactacaaca tggac

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<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 81

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<212> DNA

<213> Mus musculus

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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.1 5 10 15

Ser

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 84

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<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 85

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 86

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 88

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<213> Mus musculus

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de nucleotideo artificialmente sintetizada

<400> 96

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cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720

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aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

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gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260

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<210> 97 <211> 472

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptideo artificialmente sintetizada

<400> 97

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Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

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100 105 110

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180 185 190

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<220>

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<400> 98

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gaagattttg ggaagtatta ctgtcaacat tcttatggta ctccgtggac gttcggtgga 360

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<210> 99

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 99

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1 5 10 15

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210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Um oligonucleotídeo artificialmente sintetizado <400> 100

gggccagtgg atagacagat g 21

<210> 101

<211> 1401

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 101

atgggatgga actggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tacaacatgg actgggtgaa gcagagccat 180

ggagagagcc ttgagtggat tggatatatt tatcctaaca atggtggttc tggctacaac 240

cagaagttca agagcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 300

gagctccaca gcctgacatc tgaagactct gcagtctatt actgtgcaag acgggatagt 360

tactatggtt tcgacatggc ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 420

tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa 480

actaactcca tggtgaccct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtgaca 540

gtgacctgga actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 600

tctgacctct acactctgag cagctcagtg actgtcccct ccagcacctg gcccagccag 660

accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg 720

cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc 780

atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt 840

gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat 900

gtggaggtgc acacagctca gacaaaaccc cgggaggagc agttcaacag cactttccgt 960

tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag gactggctca atggcaagga gttcaaatgc 1020

agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc 1080

agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt ccacctccca aggagcagat ggccaaggat 1140

aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg 1200

cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac aagaacactc agcccatcat ggacacagat 1260

ggctcttact tcgtctacag caagctcaat gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat 1320

actttcacct gctctgtgtt acatgagggc ctgcacaacc accatactga gaagagcctc 1380

tcccactctc ctggtaaatg a 1401

<210> 102 <211> 466

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 102

Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly .1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Gly Tyr Asn

.65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Met Ala Trp

115 120 125

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln

.145 150 155 160

Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

195 200 205

Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys

210 215 220 Αεη Val Ala His 225

Pro Arg Asp Cys

Ser Ser Val Phe 260

Thr Leu Thr Pro 275

Asp Pro Glu Val 290

Thr Ala Gln Thr 305

Ser Val Ser Glu

Glu Phe Lys Cys 340

Lys Thr Ile Ser 355

Thr Ile Pro Pro 370

Thr Cys Met Ile 385

Gln Trp Asn Gly

Met Asp Thr Asp 420

Lys Ser Asn Trp 435

Glu Gly Leu His

450 Gly Lys 465

Pro Ala Ser Ser Thr Lys 230

Gly Cys Lys Pro Cys Ile 245 250

Ile Phe Pro Pro Lys Pro 265

Lys Val Thr Cys Val Val 280

Gln Phe Ser Trp Phe Val 295

Lys Pro Arg Glu Glu Gln 310

Leu Pro Ile Met His Gln 325 330

Arg Val Asn Ser Ala Ala 345

Lys Thr Lys Gly Arg Pro 360

Pro Lys Glu Gln Met Ala 375

Thr Asp Phe Phe Pro Glu 390

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr 405 410

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr 425

Glu Ala Gly Asn Thr Phe 440

Asn His His Thr Glu Lys 455

Val Asp Lys Lys Ile Val 235 240

Cys Thr Val Pro Glu Val 255

Lys Asp Val Leu Thr Ile 270

Val Asp Ile Ser Lys Asp 285

Asp Asp Val Glu Val His 300

Phe Asn Ser Thr Phe Arg 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys 335

Phe Pro Ala Pro Ile Glu 350

Lys Ala Pro Gln Val Tyr 365

Lys Asp Lys Val Ser Leu 380

Asp Ile Thr Val Glu Trp 395 400

Lys Asn Thr Gln Pro Ile 415

Ser Lys Leu Asn Val Gln 430

Thr Cys Ser Val Leu His 445

Ser Leu Ser His Ser Pro 460 <210> 103

<211> 705

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 103

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120

atcacatgtc gaccaagtga gaatatttac aataatttag catggtatca acagaaacag 180

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgtt gcaacaaatt tagcagaagg tgtgccatca 240

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacgg ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 300

gaagattttg ggaagtatta ctgtcaacat tcttatggta ctccgtggac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggagatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 104

<211> 234

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 104

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Tyr Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser

65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Lys Tyr Tyr Cys Gln His Ser Tyr

100 105 110

Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

.145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

165 170 175

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

195 200 205

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

210 215 220

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

.225 230

<210> 105

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de primer artificialmente sintetizada

<400> 105

taagaattcc accatgggat ggaactggat c 31

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Uma seqüência de primer artificialmente sintetizada

<400> 106

cagagacagt gaccagagtc c 21

<210> 107

<211> 1006

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 107

tcgcgaaaac aacagcccca tcggtctatc cactggcccc tgtgtgtgga gatacaactg 60

gctcctcggt gactctagga tgcctggtca agggttattt ccctgagcca gtgaccttga 120

cctggaactc tggatccctg tccagtggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg 180

acctctacac cctcagcagc tcagtgactg taacctcgag cacctggccc agccagtcca 240

tcacctgcaa tgtggcccac ccggcaagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgagccca 300

gagggcccac aatcaagccc tgtcctccat gcaaatgccc agcacctaac ctcttgggtg 360

gaccatccgt cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc tccctgagcc 420

ccatagtcac atgtgtggtg gtggatgtga gcgaggatga cccagatgtc cagatcagct 480

ggtttgtgaa caacgtggaa gtacacacag ctcagacaca aacccataga gaggattaca 540

acagtactct ccgggtggtc agtgccctcc ccatccagca ccaggactgg atgagtggca 600

aggagttcaa atgcaaggtc aacaacaaag acctcccagc gcccatcgag agaaccatct 660

caaaacccaa agggtcagta agagcaccac aggtatatgt cttgcctcca ccagaagaag 720

agatgactaa gaaacaggtc actctgacct gcatggtcac agacttcatg cctgaagaca 780

tttacgtgga gtggaccaac aacgggaaaa cagagctaaa ctacaagaac actgaaccag 840

tcctggactc tgatggttct tacttcatgt acagcaagct gagagtggaa aagaagaact 900

gggtggaaag aaatagctac tcctgttcag tggtccacga gggtctgcac aatcaccaca 960

cgactaagag cttctcccgg actccgggta aatgataagc ggccgc 1006

<210> 108

<211> 330

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 108

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 109 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Uma seqüência de primer artificialmente sintetizada <400> 109 taagaattcc accatgagtg tgcccactca gg <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Uma seqüência de primer artificialmente sintetizada <400> 110 gcccgtttga tctccagctt g <210> 111 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 111 tcgcgatgcg gccccaactg tatccatctt cccaccatcc agtgagcagt taacatctgg 60 aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc aaagacatca atgtcaagtg 120 gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac agttggactg atcaggacag 180

caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg accaaggacg agtatgaacg 240

acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca acttcaccca ttgtcaagag 300

cttcaacagg aatgagtgtt gataagcggc cgc 333

<210> 112

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 112

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu . 1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

.65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 113

<211> 1430

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de nucleotideo artificialmente sintetizada

<400> 113

atgggatgga actggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tacaacatgg actgggtgaa gcagagccat 180

ggagagagcc ttgagtggat tggatatatt tatcctaaca atggtggttc tggctacaac 240

cagaagttca agagcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 300

gagctccaca gcctgacatc tgaagactct gcagtctatt actgtgcaag acgggatagt 360

tactatggtt tcgacatggc ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 420

tctgcagcga aaacaacagc cccatcggtc tatccactgg cccctgtgtg tggagataca 480

actggctcct cggtgactct aggatgcctg gtcaagggtt atttccctga gccagtgacc 540

ttgacctgga actctggatc cctgtccagt ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 600

tctgacctct acaccctcag cagctcagtg actgtaacct cgagcacctg gcccagccag 660

tccatcacct gcaatgtggc ccacccggca agcagcacca aggtggacaa gaaaattgag 720

cccagagggc ccacaatcaa gccctgtcct ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg 780

ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg atgtactcat gatctccctg 840

agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc 900

agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac acagctcaga cacaaaccca tagagaggat 960

tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt 1020

ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc 1080

atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagca ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 1140

gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 1200

gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 1260

ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 1320

aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 1380

cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaatgat aagcggccgc 1430

<210> 114

<211> 472

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada

<400> 114

Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Gly Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Met Ala Trp

115 120 125

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys

130 135 140

Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr 145 150 155 160

Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

195 200 205

Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys

210 215 220

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu 225 230 235 240

Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile

260 265 270

Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val 275 280 285

Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

290 295 300

Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp

.305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln

325 330 335

Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val

355 360 365

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu

.385 390 395 400

Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr

405 410 415

Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr

435 440 445

Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys

450 455 460

Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys .465 470

<210> 115

<211> 716

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Uma seqüência de nucleotideo artificialmente sintetizada

<400> 115 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gaccaagtga gaatatttac aataatttag catggtatca acagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgtt gcaacaaatt tagcagaagg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacgg ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 300 gaagattttg ggaagtatta ctgtcaacat tcttatggta ctccgtggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggagatcaa acgggccgat gcggccccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttgataagc ggccgc 716

<210> 116 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma seqüência de peptídeo artificialmente sintetizada <400> 116

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Tyr Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Lys Tyr Tyr Cys Gln His Ser Tyr 100 105 110

Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr .145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

165 170 175

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

195 200 205

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

210 215 220 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys .225 230

Claims

1. Composição farmacêutica compreendendo, como um ingredi- ente ativo, um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3.

2. Inibidor do crescimento celular compreendendo, como um in- grediente ativo, um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3.

3. Agente anticâncer compreendendo, como um ingrediente ati- vo, um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3.

4. Agente anticâncer de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 é um anticorpo que tem ativida- de citotóxica.

5. Agente anticâncer de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 é um anticorpo descrito em qualquer um de (1) a (47) abaixo: (1) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 como CDR1, a seqüência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 4 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como CDR3; (2) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 como CH; (3) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (4) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 12 como CDR1, a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 14 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16comoCDR3; (5) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 como CL; (6) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (7) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (4); (8) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (5); (9) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (6); (10) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 24 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 26 como CDR3; (11) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH; (12) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (13) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 32 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 34 como CDR3; (14) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL; (15) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (16) um anticorpo compreendendo a cadeia H (10) e a cadeia L de (13); (17) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (14); (18) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (15); (19) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia Lde (13); (20) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (14); (21) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia Lde (15); (22) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia L de (4); (23) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (5); (24) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (6); (25) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 como CDR2 e a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 como CDR3; (26) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH; (27) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (28) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- minoácido de SEQ ID NO: 89 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 como CDR3; (29) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL; (30) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (31) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (28); (32) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (29); (33) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia L de (30); (34) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (28); (35) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (29); (36) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (30) (37) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia L de (28) (38) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (29) (39) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (30) (40) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (4) (41) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (5) (42) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia L de (6) 43) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (13) (44) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia Lde (14) (45) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia L de (15) (46) um anticorpo compreendendo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções de aminoácido no anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (45), o qual tem atividade equivalente ao anticorpo de qualquer um de (1) a (45); e (47) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo de proteína DSG3 que o anticorpo de qualquer um de (1) a (45).

6. Agente anticâncer de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 5, em que o câncer é câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou cân- cer ute ri no.

7. Agente anticâncer de acordo com a reivindicação 6, em que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não-pequenas.

8. Método de indução de dano celular em células expressando DSG3 através de contato de células que expressam uma proteína DSG3 com um anticorpo que se liga à proteína DSG3.

9. Método de supressão do crescimento de células expressando DSG3 através de contato de células que expressam uma proteína DSG3 com um anticorpo que se liga à proteína DSG3.

10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o an- ticorpo que se liga à proteína DSG3 tem atividade citotóxica.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a .10, em que o anticorpo que se liga à proteína DSG3 é um anticorpo de qual- quer um de (1) a (47) abaixo: (1) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 como CDR1, a seqüência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 4 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como CDR3; (2) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 como CH; (3) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (4) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 12 como CDR1, a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 14 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 como CDR3; (5) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 como CL; (6) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (7) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (4); (8) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (5); (9) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (6); (10) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 24 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 26 como CDR3; (11) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH; (12) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (13) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 32 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 34 como CDR3; (14) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL; (15) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (16) um anticorpo compreendendo a cadeia H (10) e a cadeia L de (13); (17) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (14); (18) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia Lde (15); (19) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (13); (20) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (14); (21) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia Lde (15); (22) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia L de (4); (23) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (5); (24) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (6); (25) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 como CDR2 e a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 como CDR3; (26) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH; (27) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (28) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 87 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 89 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 como CDR3; (29) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL; (30) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (31) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (28); (32) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (29); (33) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia L de (30); (34) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (28); (35) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (29); (36) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (30); (37) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia L de (28); (38) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (29); (39) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (30); (40) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (4); (41) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (5); (42) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia L de (6); (43) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia Lde (13); (44) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (14); (45) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia Lde (15); (46) um anticorpo compreendendo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções de aminoácido no anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações (1) a (45), o qual tem atividade equivalente ao anticorpo de qualquer um de (1) a (45); e (47) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo de proteína DSG3 que o anticorpo de qualquer um de (1) a (45).

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a .11, em que as células que expressam uma proteína DSG3 são células can- cerígenas.

13. Anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 e tem atividade citotóxica contra células que expressam uma proteína DSG3.

14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, em que a ativi- dade citotóxica é atividade de ADCC.

15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, em que a ativi- dade citotóxica é atividade de CDC.

16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações .13 a 15, em que um agente quimioterapêutico de baixo peso molecular ou um peptídeo tóxico está ligado ao anticorpo.

17. Anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 em que o agente quimioterapêutico de baixo peso molecular ou um peptídeo tóxico está ligado ao anticorpo.

18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações .13 a 17, em que o anticorpo é um anticorpo de qualquer um de (1) a (47) abaixo: (1) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 como CDR1, a seqüência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 4 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como CDR3; (2) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 como CH; (3) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (4) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 12 como CDR1, a seqüência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 14 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16comoCDR3; (5) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 como CL; (6) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (4), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (7) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (4); (8) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (5); (9) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (6); (10) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 24 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 26 como CDR3; (11) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH; (12) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (13) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 32 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQIDNO: 34 como CDR3; (14) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL; (15) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (13), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (16) um anticorpo compreendendo a cadeia H (10) e a cadeia L de (13); (17) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia Lde (14) (18) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (15) (19) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia Lde (13) (20) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia Lde (14); (21) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (15); (22) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia L de (4); (23) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (5); (24) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (6); (25) um anticorpo compreendendo uma cadeia H tendo a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 como CDR1, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 como CDR2 e a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 como CDR3; (26) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 como CH; (27) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25), em que a cadeia H tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como CH; (28) um anticorpo compreendendo uma cadeia L tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 87 como CDR1, a seqüência de a- minoácido de SEQ ID NO: 89 como CDR2 e a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 como CDR3; (29) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 como CL; (30) um anticorpo compreendendo a cadeia L de (28), em que a cadeia L tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 como CL; (31) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (28); (32) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (29); (33) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia L de (30); (34) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (1) e a cadeia L de (28); (35) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (2) e a cadeia L de (29); (36) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (3) e a cadeia L de (30); (37) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (10) e a cadeia L de (28); (38) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (11) e a cadeia L de (29); (39) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (12) e a cadeia L de (30); (40) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (4); (41) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (5); (42) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia L de (6); 43) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (25) e a cadeia L de (13); (44) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (26) e a cadeia L de (14); (45) um anticorpo compreendendo a cadeia H de (27) e a cadeia Lde (15); (46) um anticorpo compreendendo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções de aminoácido no anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (45), o qual tem atividade equivalente ao anticorpo de qualquer um de (1) a (45); e (47) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo de proteína DSG3 que o anticorpo de qualquer um de (1) a (45).

19. Uso de uma proteína DSG3 como um marcador diagnóstico de câncer.

20. Método de diagnóstico de câncer compreendendo detecção de uma proteína DSG3 usando um anticorpo que se liga à proteína DSG3.

21. Método de diagnóstico de câncer compreendendo as etapas de: (a) coleta de uma amostra do indivíduo; e (b) detecção de uma proteína DSG3 contida na amostra coleta- da usando um anticorpo que se liga à proteína DSG3.

22. Método de diagnóstico de acordo com a reivindicação 20 ou .21 em que o anticorpo que se liga à proteína DSG3 é um anticorpo rotulado com um nuclídeo que emite positron.

23. Método de diagnóstico de acordo com a reivindicação 22, em que o nuclídeo que emite positron é um nuclídeo selecionado de qualquer um de 11C, 13N, 150, 18F, 45Ti, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr e .1241.

24. Método de diagnóstico de câncer compreendendo detecção de expressão de um gene que codifica uma proteína DSG3.

25. Método de diagnóstico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 20 a 24, em que o câncer é câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de pele ou câncer uterino.

26. Método de diagnóstico de acordo com a reivindicação 25, em que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não-pequenas.

27. Agente diagnóstico a ser usado para o método diagnóstico como definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 26.

28. Kit a ser usado para o método diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26.

29. Uso de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 na produção de um inibidor do crescimento celular.

30. Uso de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3 na produção de um agente anticâncer.

31. Método de supressão de crescimento celular compreenden- do a etapa de administração, a um indivíduo, de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3.

32. Método de prevenção ou tratamento de câncer compreen- dendo a etapa de administração, a um indivíduo, de um anticorpo que se liga a uma proteína DSG3.