CN114786713A - 与靶向CD38的工程化Fc抗原结合结构域构建体相关的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了具有CD38结合结构域和两个或更多个Fc结构域的Fc抗原结合构建体,以及使用此类构建体的方法。还描述了构成此类构建体的多肽。包含在所述构建体中的Fc结构域单体可以包括促进同源二聚化或异源二聚化的氨基酸置换。
Description
概要
CD38是II型跨膜糖蛋白,其在正常的和恶性的浆母细胞和浆细胞上以高密度表达,并且在某些淋巴细胞和骨髓细胞上以低水平表达。Darzalex(达雷木单抗)是批准用于复发的难治性多发性骨髓瘤和新诊断的多发性骨髓瘤的抗CD38溶细胞单克隆抗体。
发明内容
本公开的特征在于将CD38结合结构域与至少两个Fc结构域组合以产生具有独特生物活性的新治疗剂的组合物和方法。
在一些情况下,本公开设想将已知的靶向CD38的含单个Fc结构域的治疗剂(例如,已知的治疗性CD38抗体)的CD38结合结构域与至少两个Fc结构域组合,以产生具有比已知CD38抗体更高的生物活性的新型治疗剂。为了产生此类构建体,本公开提供了用于组装具有至少两个(例如,多个)Fc结构域的构建体,以及控制此类构建体的同源二聚化和异源二聚化,以便由有限数量的多肽组装离散大小的分子的各种方法。这些构建体的特性允许有效产生基本上同质的药物组合物。为了确保药物组合物的安全性、功效、均匀性和可靠性,药物组合物中的这种同质性是期望的。
在第一方面,本公开的特征在于一种包括增强的效应子功能的Fc抗原结合结构域构建体,其中该Fc抗原结合结构域构建体包括CD38结合结构域以及通过接头与第二Fc结构域接合的第一Fc结构域,其中该Fc抗原结合结构域构建体相对于具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有增强的效应子功能。
在第二方面,本公开的特征在于一种包含Fc抗原结合结构域构建体的基本上同质的群体的组合物,该Fc抗原结合结构域构建体包括CD38结合结构域以及通过接头与第二Fc结构域接合的第一Fc结构域。
在第三方面,本公开的特征在于一种Fc抗原结合结构域构建体,其包括CD38结合结构域以及通过接头与第二Fc结构域接合的第一Fc结构域,其中该Fc抗原结合结构域构建体包括具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体未表现出的生物活性。
在第四方面,本公开的特征在于一种包含Fc抗原结合结构域构建体的基本上同质的群体的组合物,该Fc抗原结合结构域构建体包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;b)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;c)第三多肽,该第三多肽包括第四Fc结构域单体;以及d)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽或第三多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域。
在第四方面的一些实施方案中,CD38结合结构域与第一多肽和第二多肽或第三多肽接合,或者与第二多肽和第三多肽接合,或者CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽和第三多肽接合。
在第五方面,本公开的特征在于一种包括增强的效应子功能的Fc抗原结合结构域构建体,其中该Fc抗原结合结构域构建体包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;b)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;c)第三多肽,该第三多肽包括第四Fc结构域单体;以及d)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽或第三多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,并且其中该Fc抗原结合结构域构建体相对于具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有增强的效应子功能。
在第五方面的一些实施方案中,单个Fc结构域构建体是抗体。
在第六方面,本公开的特征在于一种Fc抗原结合结构域构建体,其包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;b)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;c)第三多肽,该第三多肽包括第四Fc结构域单体;以及d)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽或第三多肽接合;
其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,并且其中该Fc抗原结合结构域构建体包括具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体未表现出的生物活性。
在第六方面的一些实施方案中,生物活性是Fc受体介导的效应子功能,诸如ADCC、ADCP和/或CDC活性(例如,ADCC和ADCP活性、ADCC和CDC活性、ADCP和CDC活性,或者ADCC、ADCP和CDC活性)。
在第七方面,本公开的特征在于一种Fc抗原结合结构域构建体,其包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的间隔区;b)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;c)第三多肽,该第三多肽包括第四Fc结构域单体;以及d)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽或第三多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域。
在本公开的第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,CD38结合结构域与第一多肽和第二多肽或第三多肽接合,或者与第二多肽和第三多肽接合,或者CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽和第三多肽接合。
在本公开的第一方面、第二方面、第三方面和第四方面的一些实施方案中,CD38结合结构域是Fab或Fab的VH。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,该结合结构域是第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列的一部分,并且在一些实施方案中,CD38结合结构域是scFv。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域,并且其中VH结构域和CH1结构域是第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中,CD38结合结构域还包括VL结构域,其中,在一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体包括第四多肽,该第四多肽包括VL结构域。在一些实施方案中,VH结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;VH结构域包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,CD38结合结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域;其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者CD38结合结构域包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域,其中IgGCH1抗体恒定结构域经由接头附接到第一多肽或第二多肽的N末端。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体包括促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化空腔和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化突起,其中工程化空腔和工程化突起被定位成形成Fc结构域单体的突起-进入-空腔对。在一些实施方案中,工程化突起包括选自S354C、T366W、T366Y、T394W、T394F和F405W的至少一种修饰,并且工程化空腔包括选自Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A和T394S的至少一种修饰。在一些实施方案中,一个Fc结构域单体包括Y407V和Y349C,而另一个Fc结构域单体包括T366W和S354C。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个结构域单体的CH3结构域中的带负电荷的氨基酸和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的带正电荷的氨基酸,其中带负电荷的氨基酸和带正电荷的氨基酸被定位成促进Fc结构域的形成。在一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D399K和K409D或K409E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392D和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392E和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括S354C和T366W,并且第三多肽和第四多肽各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第三多肽和第四多肽中的每一者包括S354C和T366W,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括E357K或E357R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K370D或K370E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K370D或K370E,并且第三多肽和第四多肽各自包括E357K或357R,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K409D或K409E,并且第三多肽和第四多肽各自包括D399K或D399R,或者第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括D399K或D399R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K409D或K409E。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,第二多肽和第三多肽具有相同的氨基酸序列。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是键。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是间隔区。在一些实施方案中,间隔区包括具有以下序列的多肽:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG或GGGGGGGGGGGGGGGG。在一些实施方案中,间隔区是甘氨酸间隔区,例如由4个至30个、8个至30个或12个至30个甘氨酸残基组成的间隔区,诸如由20个甘氨酸残基组成的间隔区。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,CD38结合结构域通过接头与Fc结构域单体接合。在一些实施方案中,该接头为间隔区。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在EU位置I253处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰独立地选自I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰为I253A。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在EU位置R292处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰独立地选自R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰为R292P。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的一者或多者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的每一者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,IgG是选自由以下项组成的组的亚型:IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,第四多肽、第五多肽、第六多肽和第七多肽中的每一者中的N末端Asp突变为Gln。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,第四多肽、第五多肽、第六多肽和第七多肽中的一者或多者缺乏C末端赖氨酸。在一些实施方案中,第四多肽、第五多肽、第六多肽和第七多肽中的每一者缺乏C末端赖氨酸。
在本公开的第四方面、第五方面、第六方面和第七方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括通过接头与所述多肽中的一者或多者的N末端或C末端接合的白蛋白结合肽。
在第八方面,本公开的特征在于一种细胞培养基,其包括Fc抗原结合结构域构建体的群体,其中以摩尔为基础,至少50%的Fc抗原结合结构域构建体在结构上是相同的,并且其中Fc抗原结合结构域构建体以至少0.1mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L或100mg/L的浓度存在于该培养基中。
在本公开的第八方面的一些实施方案中,以摩尔为基础,至少75%、至少85%或至少95%的Fc抗原结合结构域构建体在结构上是相同的。
在第九方面,本公开的特征在于一种细胞培养基,其包括Fc抗原结合结构域构建体的群体,其中以摩尔为基础,至少50%的Fc抗原结合结构域构建体包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;b)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;c)第三多肽,该第三多肽包括第四Fc结构域单体;以及d)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽或第三多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域。
在本公开的第九方面的一些实施方案中,以摩尔为基础,至少75%、至少85%或至少95%的Fc抗原结合结构域构建体包括第一Fc结构域、第二Fc结构域和CD38结合结构域。
在第十方面,本公开的特征在于一种制造Fc抗原结合结构域构建体的方法,该方法包括:a)培养表达以下项的宿主细胞:(1)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;(2)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;(3)第三多肽,该第三多肽包括第四Fc结构域单体;和(4)CD38结合结构域;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域;其中CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽或第三多肽接合,从而形成Fc抗原结合结构域构建体;并且其中以摩尔为基础,细胞培养上清液中至少50%的Fc抗原结合结构域构建体在结构上是相同的,以及b)从该细胞培养上清液中纯化Fc抗原结合结构域构建体。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,CD38结合结构域与第一多肽和第二多肽或第三多肽接合,或者与第二多肽和第三多肽接合,或者CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽和第三多肽接合。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,CD38结合结构域是Fab或VH。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,CD38结合结构域是第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列的一部分,并且在一些实施方案中,CD38结合结构域是scFv。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域,并且其中VH结构域和CH1结构域是第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中,CD38结合结构域还包括VL结构域,其中,在一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体包括第四多肽,该第四多肽包括VL结构域。在一些实施方案中,VH结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;VH结构域包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,CD38结合结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域;其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者CD38结合结构域包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域,其中IgG CH1抗体恒定结构域经由接头附接到第一多肽或第二多肽的N末端。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体包括促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化空腔和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化突起,其中工程化空腔和工程化突起被定位成形成Fc结构域单体的突起-进入-空腔对。在一些实施方案中,工程化突起包括选自S354C、T366W、T366Y、T394W、T394F和F405W的至少一种修饰,并且工程化空腔包括选自Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A和T394S的至少一种修饰。在一些实施方案中,一个Fc结构域单体包括Y407V和Y349C,而另一个Fc结构域单体包括T366W和S354C。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个结构域单体的CH3结构域中的带负电荷的氨基酸和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的带正电荷的氨基酸,其中带负电荷的氨基酸和带正电荷的氨基酸被定位成促进Fc结构域的形成。在一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D399K和K409D或K409E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392D和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392E和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括S354C和T366W,并且第三多肽和第四多肽各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第三多肽和第四多肽中的每一者包括S354C和T366W,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括E357K或E357R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K370D或K370E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K370D或K370E,并且第三多肽和第四多肽各自包括E357K或357R,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K409D或K409E,并且第三多肽和第四多肽各自包括D399K或D399R,或者第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括D399K或D399R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K409D或K409E。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,第二多肽和第三多肽具有相同的氨基酸序列。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是键。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是间隔区。在一些实施方案中,间隔区包括具有以下序列的多肽:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG或GGGGGGGGGGGGGGGG。在一些实施方案中,间隔区是甘氨酸间隔区,例如由4个至30个、8个至30个或12个至30个甘氨酸残基组成的间隔区,诸如由20个甘氨酸残基组成的间隔区(SEQ ID NO:23)。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,CD38结合结构域通过接头与Fc结构域单体接合。在一些实施方案中,该接头为间隔区。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在位置I253处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰独立地选自I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰为I253A。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在位置R292处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰独立地选自R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰为R292P。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的一者或多者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的每一者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,IgG是选自由以下项组成的组的亚型:IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽中的每一者中的N末端Asp突变为Gln。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽中的一者或多者缺乏C末端赖氨酸。在一些实施方案中,第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽中的每一者缺乏C末端赖氨酸。
在本公开的第九方面和第十方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括通过接头与所述多肽中的一者或多者的N末端或C末端接合的白蛋白结合肽。
在本公开的第十一方面的一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体包括促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,其中第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,并且其中第二多肽和第三多肽具有不同的氨基酸序列。
在本公开的第十一方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域与第一多肽接合,并且第二CD38结合结构域与第二多肽和第三多肽接合。
在本公开的第十一方面的一些实施方案中,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370D,并且第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K370D和E357K。
在本公开的第十二方面的一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体包括促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,其中第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,并且其中第二多肽和第三多肽具有不同的氨基酸序列。
在本公开的第十二方面的一些实施方案中,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括D399K和K409D,并且第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370D。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第一或CD38结合结构域是Fab或VH结构域。在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域和第二CD38结合结构域是Fab。在本公开的第九方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域、第二CD38结合结构域和第三CD38结合结构域是Fab或VH结构域。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域或第二CD38结合结构域是scFv。在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域和第二CD38结合结构域是scFv。在本公开的第九方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域、第二CD38结合结构域和第三CD38结合结构域是scFv。
在本公开的第十一方面的一些实施方案中,第一CD38结构域或第二CD38结构域包括VH结构域和CH1结构域,并且其中VH结构域和CH1结构域是第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中,CD38结合结构域还包括VL结构域,其中,在一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体包括第四多肽,该第四多肽包括VL结构域。在一些实施方案中,VH结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;VH结构域包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列。
在本公开的第十二方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域、第二CD38结合结构域或第三CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域,并且其中VH结构域和CH1结构域是第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中,CD38结合结构域还包括VL结构域,其中,在一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体包括第四多肽,该第四多肽包括VL结构域。在一些实施方案中,VH结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;VH结构域包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列。
在本公开的第十一方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域或第二CD38结合结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域;其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者CD38结合结构域包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列。
在本公开的第十二方面的一些实施方案中,第一CD38结合结构域、第二CD38结合结构域或第三CD38结合结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域;其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者CD38结合结构域包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域,其中IgG CH1抗体恒定结构域经由接头附接到第一多肽或第二多肽的N末端。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体包括促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化空腔和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化突起,其中工程化空腔和工程化突起被定位成形成Fc结构域单体的突起-进入-空腔对。在一些实施方案中,工程化突起包括选自S354C、T366W、T366Y、T394W、T394F和F405W的至少一种修饰,并且工程化空腔包括选自Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A和T394S的至少一种修饰。在一些实施方案中,一个Fc结构域单体包括Y407V和Y349C,而另一个Fc结构域单体包括T366W和S354C。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个结构域单体的CH3结构域中的带负电荷的氨基酸和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的带正电荷的氨基酸,其中带负电荷的氨基酸和带正电荷的氨基酸被定位成促进Fc结构域的形成。在一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D399K和K409D或K409E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392D和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392E和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括S354C和T366W,并且第三多肽和第四多肽各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第三多肽和第四多肽中的每一者包括S354C和T366W,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括E357K或E357R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K370D或K370E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K370D或K370E,并且第三多肽和第四多肽各自包括E357K或357R,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K409D或K409E,并且第三多肽和第四多肽各自包括D399K或D399R,或者第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括D399K或D399R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K409D或K409E。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是键。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是间隔区。在一些实施方案中,间隔区包括具有以下序列的多肽:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、PACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG或GGGGGGGGGGGGGGGG。在一些实施方案中,间隔区是甘氨酸间隔区,例如由4个至30个、8个至30个或12个至30个甘氨酸残基组成的间隔区,诸如由20个甘氨酸残基组成的间隔区。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,CD38结合结构域中的一者或多者通过接头与Fc结构域单体接合。在一些实施方案中,该接头为间隔区。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在位置I253处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰独立地选自I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰为I253A。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在位置R292处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰独立地选自R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰为R292P。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的一者或多者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的每一者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,IgG是选自由以下项组成的组的亚型:IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽中的每一者中的N末端Asp突变为Gln。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽中的一者或多者缺乏C末端赖氨酸。在一些实施方案中,第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽中的每一者缺乏C末端赖氨酸。
在本公开的第十一方面和第十二方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括通过接头与所述多肽中的一者或多者的N末端或C末端接合的白蛋白结合肽。
在第十三方面,本公开的特征在于一种包含Fc抗原结合结构域构建体的基本上同质的群体的组合物,该Fc抗原结合结构域构建体包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一接头;和b)第二多肽,该第二多肽包括i)第三Fc结构域单体、ii)第四Fc结构域单体,和iv)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的第二接头;和c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;以及d)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域。
在本公开的第十三方面的一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体中的每一者包括促进第二Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,并且第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体中的每一者包括促进第四Fc结构域单体与第六Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在第十四方面,本公开的特征在于一种包含Fc抗原结合结构域构建体的基本上同质的群体的组合物,该Fc抗原结合结构域构建体包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一接头;和b)第二多肽,该第二多肽包括i)第三Fc结构域单体、ii)第四Fc结构域单体,和iv)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的第二接头;和c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;以及e)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽接合;其中第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域。
在本公开的第十四方面的一些实施方案中,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体中的每一者包括促进第一Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,并且第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体中的每一者包括促进第三Fc结构域单体与第六Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在第十五方面,本公开的特征在于一种包含Fc抗原结合结构域构建体的基本上同质的群体的组合物,该Fc抗原结合结构域构建体包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体、iii)第三Fc结构域单体,iv)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一接头;和v)将第二Fc结构域单体与第三Fc结构域单体接合的第二接头;b)第二多肽,该第二多肽包括i)第四Fc结构域单体、ii)第五Fc结构域单体、iii)第六Fc结构域单体,iv)将第四Fc结构域单体与第五Fc结构域单体接合的第三接头;和v)将第五Fc结构域单体与第六Fc结构域单体接合的第四接头;c)第三多肽,该第三多肽包括第七Fc结构域单体;d)第四多肽,该第四多肽包括第八Fc结构域单体;e)第五多肽,该第五多肽包括第九Fc结构域单体;f)第六多肽,该第六多肽包括第十Fc结构域单体;以及g)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽或第六多肽接合;其中第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第一Fc结构域单体和第七Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第四Fc结构域单体和第八Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体组合形成第四Fc结构域,并且第六Fc结构域单体和第十Fc结构域单体组合形成第五Fc结构域。
在本公开的第十五方面的一些实施方案中,第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体中的每一者包括促进第二Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,第一Fc结构域单体和第七Fc结构域单体中的每一者包括促进第一Fc结构域单体与第七Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,第四Fc结构域单体和第八Fc结构域单体中的每一者包括促进第四Fc结构域单体与第八Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体中的每一者包括促进第三Fc结构域单体与第九Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,并且第六Fc结构域单体和第十Fc结构域单体中的每一者包括促进第六Fc结构域单体与第十Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,CD38结合结构域是Fab或VH结构域。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,CD38结合结构域是所述多肽中的一者或多者的氨基酸序列的一部分,并且在一些实施方案中,CD38结合结构域是scFv。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域,并且其中VH结构域和CH1结构域是第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中,CD38结合结构域还包括VL结构域,其中,在一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体包括第四多肽,该第四多肽包括VL结构域。在一些实施方案中,VH结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;VH结构域包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,CD38结合结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;CD38结合结构域包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域;其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列相比至少95%相同、至少97%相同、至少99%相同,或至少99.5%相同;或者CD38结合结构域包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域,其中IgG CH1抗体恒定结构域经由接头附接到第一多肽或第二多肽的N末端。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化空腔和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的工程化突起,其中工程化空腔和工程化突起被定位成形成Fc结构域单体的突起-进入-空腔对。在一些实施方案中,工程化突起包括选自S354C、T366W、T366Y、T394W、T394F和F405W的至少一种修饰,并且工程化空腔包括选自Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A和T394S的至少一种修饰。在一些实施方案中,一个Fc结构域单体包括Y407V和Y349C,而另一个Fc结构域单体包括T366W和S354C。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,二聚化选择性模块包括进入一个结构域单体的CH3结构域中的带负电荷的氨基酸和进入另一个Fc结构域单体的CH3结构域中的带正电荷的氨基酸,其中带负电荷的氨基酸和带正电荷的氨基酸被定位成促进Fc结构域的形成。在一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D399K和K409D或K409E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392D和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370E,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括K392E和D399K,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括E357K和K370D,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括D356K和K439E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括S354C和T366W,并且第三多肽和第四多肽各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第三多肽和第四多肽中的每一者包括S354C和T366W,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体各自包括Y349C、T366S、L368A和Y407V,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括E357K或E357R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K370D或K370E,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K370D或K370E,并且第三多肽和第四多肽各自包括E357K或357R,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括K409D或K409E,并且第三多肽和第四多肽各自包括D399K或D399R,或者第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体中的每一者包括D399K或D399R,并且第三多肽和第四多肽各自包括K409D或K409E。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是键。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个接头是间隔区。在一些实施方案中,间隔区包括具有以下序列的多肽:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG或GGGGGGGGGGGGGGGG。在一些实施方案中,间隔区是甘氨酸间隔区,例如由4个至30个、8个至30个或12个至30个甘氨酸残基组成的间隔区,诸如由20个甘氨酸残基组成的间隔区。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,CD38结合结构域通过接头与Fc结构域单体接合。在一些实施方案中,该接头为间隔区。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在位置I253处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰独立地选自I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。在一些实施方案中,位置I253处的每个氨基酸修饰为I253A。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,所述Fc结构域中的至少一者在位置R292处包括至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰独立地选自R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。在一些实施方案中,位置R292处的每个氨基酸修饰为R292P。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的一者或多者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,所述Fc结构域单体中的每一者包括IgG铰链结构域、IgG CH2抗体恒定结构域和IgG CH3抗体恒定结构域。在一些实施方案中,IgG是选自由以下项组成的组的亚型:IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,所述多肽中的每一者中的N末端Asp突变为Gln。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,所述多肽中的一者或多者缺乏C末端赖氨酸。在一些实施方案中,所述多肽中的每一者缺乏C末端赖氨酸。
在本公开的第十三方面、第十四方面和第十五方面的一些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体还包括通过接头与所述多肽中的一者或多者的N末端或C末端接合的白蛋白结合肽。
在第十六方面,本公开的特征在于一种Fc抗原结合结构域构建体,其包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;b)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;c)第三多肽,该第三多肽包括第四Fc结构域单体;和d)第一CD38结合结构域,该第一CD38结合结构域与第一多肽接合;以及e)第二CD38结合结构域,该第二CD38结合结构域与第二多肽和/或第三多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,其中第一CD38结合结构域和第二CD38结合结构域结合不同的抗原,并且其中该Fc抗原结合结构域构建体相对于具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有增强的效应子功能。
在第二十六方面,本公开的特征在于一种Fc抗原结合结构域构建体,其包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一接头;和b)第二多肽,该第二多肽包括iv)第三Fc结构域单体、v)第四Fc结构域单体,和vi)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的第二接头;和c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;以及d)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽接合,其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域,并且其中该Fc抗原结合结构域构建体相对于具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有增强的效应子功能。
在第二十七方面,本公开的特征在于一种Fc抗原结合结构域构建体,其包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一接头;和b)第二多肽,该第二多肽包括iv)第三Fc结构域单体、v)第四Fc结构域单体,和vi)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的第二接头;和c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;以及e)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域,并且其中该Fc抗原结合结构域构建体包括具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体未表现出的生物活性。
在第二十八方面,本公开的特征在于一种Fc抗原结合结构域构建体,其包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一间隔区;和b)第二多肽,该第二多肽包括iv)第三Fc结构域单体、v)第四Fc结构域单体,和vi)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的第二间隔区;和c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;以及e)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域。
在第二十九方面,本公开的特征在于一种细胞培养基,其包括Fc抗原结合结构域构建体的群体,其中以摩尔为基础,至少50%的Fc抗原结合结构域构建体包括:a)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一接头;和b)第二多肽,该第二多肽包括iv)第三Fc结构域单体、v)第四Fc结构域单体,和vi)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的第二接头;和c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;以及e)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域。
在第三十方面,本公开的特征在于一种制造Fc抗原结合结构域构建体的方法,该方法包括:a)培养表达以下项的宿主细胞:(1)第一多肽,该第一多肽包括i)第一Fc结构域单体、ii)第二Fc结构域单体,和iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的第一接头;和(2)第二多肽,该第二多肽包括iv)第三Fc结构域单体、v)第四Fc结构域单体,和vi)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的第二接头;和(3)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;(4)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;以及(5)CD38结合结构域,该CD38结合结构域与第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽接合;其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体组合形成第一Fc结构域,并且第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体组合形成第二Fc结构域,第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体组合形成第三Fc结构域,并且其中以摩尔为基础,细胞培养上清液中至少50%的Fc抗原结合结构域构建体在结构上是相同的,以及b)从该细胞培养上清液中纯化Fc抗原结合结构域构建体。
在本公开的第二十六方面、第二十七方面、第二十八方面、第二十九方面和第三十方面的一些实施方案中,第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体中的每一者包括促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体中的每一者包括促进第二Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块,并且第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体中的每一者包括促进第四Fc结构域单体与第六Fc结构域单体之间的二聚化的互补二聚化选择性模块。
在本公开的所有方面的一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体具有减少的岩藻糖基化。因此,在一些实施方案中,包含Fc抗原结合结构域构建体的组合物中少于40%、30%、20%、15%、10%或5%的Fc结构域单体被岩藻糖基化。
在本公开的所有方面的一些实施方案中,Fc结构域单体在CH3结构域中包含图24A(SEQ ID NO:43)的具有最多10个(9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)单一氨基酸变化的氨基酸序列。
在本公开的所有方面的一些实施方案中,Fc结构域单体在CH3结构域中包含图24B(SEQ ID NO:45)的具有最多10个(9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)单一氨基酸变化的氨基酸序列。
在本公开的所有方面的一些实施方案中,Fc结构域单体在CH3结构域中包含图24C(SEQ ID NO:47)的具有最多10个(9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)单一氨基酸变化的氨基酸序列。
在本公开的所有方面的一些实施方案中,Fc结构域单体在CH3结构域中包含图24D(SEQ ID NO:42)的具有最多10个(9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)单一氨基酸变化的氨基酸序列。
在本公开的所有方面的一些实施方案中,例如,当Fc结构域单体在多肽的羧基末端时,该Fc结构域单体不包括K447。在其他实施方案中,例如,当Fc结构域单体不在多肽的羧基末端时,该Fc结构域单体包括K447。
在本公开的所有方面的一些实施方案中,例如,当Fc结构域单体在接头的氨基末端时,该Fc结构域单体不包括从E216到C220(包括端点)的铰链部分,而是包括从D221到L235(包括端点)的铰链部分。在其他实施方案中,例如,当Fc结构域单体在CH1结构域的羧基末端时,该Fc结构域单体包括从E216到L235(包括端点)的铰链部分。在本公开的所有方面的一些实施方案中,铰链结构域(例如,在多肽的氨基末端的铰链结构域)在EU位置221处具有从Asp到Gln的突变。
如上所述,本公开的Fc抗原结合结构域构建体由多肽组装而成,所述多肽包括包含两个或更多个IgG1 Fc结构域单体的多肽,并且此类多肽是本公开的一个方面。
在第四十一方面,本公开的特征在于一种多肽,其包括:CD38结合结构域;接头;第一IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;第二接头;第二IgG1Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;任选的第三接头;以及任选的第三IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域,其中至少一个Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。
在第四十一方面的各种实施方案中:CD38结合结构域包括抗体重链可变结构域;CD38结合结构域包括抗体轻链可变结构域;第一IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变;第一IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变;第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG恒定结构域单体均包含形成工程化突起的突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自包含形成工程化突起的突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变,并且第三IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变,并且第二IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变,并且第一IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在第四十一方面的各种实施方案中:包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体还包含一个、两个或三个反向电荷突变;形成工程化突起的突变和反向电荷突变在CH3结构域中;所述突变在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述突变是单一氨基酸变化;第二接头和任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG;第二接头和任选的第三接头是甘氨酸间隔区;第二接头和任选的第三接头独立地由4个至30个、4个至20个、8个至30个、8个至20个、12个至20个或12个至30个甘氨酸残基组成;第二接头和任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置I253处包含单一氨基酸突变,EU编号位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y;位置I253处的每个氨基酸突变是I253A;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置R292处包含单一氨基酸突变;EU编号位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y;位置R292处的每个氨基酸突变是R292P;每个Fc结构域单体独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL;第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL,并且第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;每个Fc结构域单体的CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过10个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过8个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过6个单一氨基酸置换;其中每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过5个单一氨基酸置换;所述单一氨基酸置换选自由以下项组成的组:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个单一氨基酸置换的氨基酸序列;最多6个所述单一氨基酸置换是CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变;所述单一氨基酸置换在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述形成工程化突起的突变中的至少一者选自由以下项组成的组:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T和T394F;所述两个或四个反向电荷突变选自:K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R;所述CD38结合结构域是scFv;所述CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域;所述CD38结合结构域还包括VL结构域;所述VH结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;所述VH结构域包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;所述VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列至少95%或98%相同;所述VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列;所述CD38结合结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;所述CD38结合结构域包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;所述CD38结合结构域包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域,其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列至少95%或98%相同;所述CD38结合结构域包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列;所述CD38结合结构域包括IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域;所述CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域,并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
还描述了一种多肽复合物,其包含上述多肽的两个拷贝,这两个拷贝通过第一或第二IgG1 Fc结构域单体的铰链内的半胱氨酸残基之间的二硫键接合。
还描述了一种多肽复合物,其包含:上述多肽,以及与之接合的第二多肽,该第二多肽包括IgG1 Fc结构域单体,该IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域,其中所述多肽和第二多肽通过所述多肽的第一、第二或第三IgG1 Fc结构域单体的铰链结构域内的半胱氨酸残基与第二多肽的铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键接合。
在所述复合物的各种实施方案中:第二多肽单体包含形成工程化空腔的突变;形成工程化空腔的突变选自由以下项组成的组:Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405A;第二多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
在第四十二方面,本公开的特征在于一种多肽,其包括:CD38结合结构域;接头;第一IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;第二接头;第二IgG1Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;任选的第三接头;以及任选的第三IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域,其中至少一个Fc结构域单体包含一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变。
在第四十二方面的各种实施方案中:CD38结合结构域包括抗体重链可变结构域;CD38结合结构域包括抗体轻链可变结构域;第一IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变;第一IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG恒定结构域单体均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第三IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第二IgG1结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第一IgG1结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体具有相同的CH3结构域;选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变在CH3结构域中;所述突变在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述突变各自是单一氨基酸变化;所述突变在从EU编号位置G341到EU编号位置K446的序列内,包括端点;所述突变是单一氨基酸变化;第二接头和任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG;第二接头和任选的第三接头是甘氨酸间隔区;第二接头和任选的第三接头独立地由4个至30个、4个至20个、8个至30个、8个至20个、12个至20个或12个至30个甘氨酸残基组成;第二接头和任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置I253处包含单一氨基酸突变,EU编号位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y;位置I253处的每个氨基酸突变是I253A;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置R292处包含单一氨基酸突变;EU编号位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y;位置R292处的每个氨基酸突变是R292P;每个Fc结构域单体独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL;第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL,并且第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;每个Fc结构域单体的CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过10个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过8个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过6个单一氨基酸置换;其中每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过5个单一氨基酸置换;所述单一氨基酸置换选自由以下项组成的组:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个单一氨基酸置换的氨基酸序列;最多6个所述单一氨基酸置换是CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变;所述单一氨基酸置换在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述形成工程化突起的突变中的至少一者选自由以下项组成的组:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T和T394F;所述两个或四个反向电荷突变选自:K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R;所述CD38结合结构域是scFv;所述CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域;所述CD38结合结构域还包括VL结构域;所述VH结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;所述VH结构域包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;所述VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列至少95%或98%相同;所述VH结构域包括表2中示出的抗体的VH序列;所述CD38结合结构域包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;所述CD38结合结构域包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;所述CD38结合结构域包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域,其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列至少95%或98%相同;所述CD38结合结构域包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列;所述CD38结合结构域包括IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域;所述CD38结合结构域包括VH结构域和CH1结构域,并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
还描述了一种多肽复合物,其包含任何上述多肽的两个拷贝,这两个拷贝通过第一或第二IgG1 Fc结构域单体的铰链内的半胱氨酸残基之间的二硫键接合。
还描述了一种多肽复合物,其包含上述多肽以及与之接合的第二多肽,该第二多肽包括IgG1 Fc结构域单体,该IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域,其中所述多肽和第二多肽通过所述多肽的第一、第二或第三IgG1 Fc结构域单体的铰链结构域内的半胱氨酸残基与第二多肽的铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键接合。在各种实施方案中:第二多肽单体包含一个、两个或三个反向电荷突变;第二多肽单体包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷突变,并且与所述多肽中选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷突变互补;第二多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
在第四十三方面,本公开的特征在于一种多肽,该多肽包含:第一IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;第二接头;第二IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;任选的第三接头;以及任选的第三IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域,其中至少一个Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。
在第四十三方面的各种实施方案中,该多肽还包含:抗体重链可变结构域,以及第一IgG1单体的氨基末端的CH1结构域或第一IgG1单体的氨基末端的scFv;第一IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变;第一IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变;第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG恒定结构域单体均包含形成工程化突起的突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自包含形成工程化突起的突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变,并且第三IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变,并且第二IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变;该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变,并且第一IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在第四十三方面的各种实施方案中:包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体还包含一个、两个或三个反向电荷突变;
形成工程化突起的突变和反向电荷突变在CH3结构域中;所述突变在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述突变是单一氨基酸变化;第二接头和任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG;第二接头和任选的第三接头是甘氨酸间隔区;第二接头和任选的第三接头独立地由4个至30个、4个至20个、8个至30个、8个至20个、12个至20个或12个至30个甘氨酸残基组成;第二接头和任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置I253处包含单一氨基酸突变,EU编号位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y;位置I253处的每个氨基酸突变是I253A;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置R292处包含单一氨基酸突变;EU编号位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y;位置R292处的每个氨基酸突变是R292P;每个Fc结构域单体独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL;第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL,并且第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;每个Fc结构域单体的CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过10个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过8个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过6个单一氨基酸置换;其中每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过5个单一氨基酸置换;所述单一氨基酸置换选自由以下项组成的组:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个单一氨基酸置换的氨基酸序列;最多6个所述单一氨基酸置换是CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变;所述单一氨基酸置换在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述形成工程化突起的突变中的至少一者选自由以下项组成的组:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T和T394F;所述两个或四个反向电荷突变选自:K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R。
在第四十四方面,本公开的特征在于一种多肽,该多肽包含:第一IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;第二接头;第二IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域;任选的第三接头;以及任选的第三IgG1 Fc结构域单体,其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域,其中至少一个Fc结构域单体包含一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变。
在第四十四方面的各种实施方案中,该多肽还包含抗体重链可变结构域,以及第一IgG1 Fc结构域单体的氨基末端的CH1结构域或第一IgG1 Fc结构域单体的氨基末端的scFv;第一IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变;第一IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第二IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG恒定结构域单体均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第三IgG1 Fc结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第一IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第二IgG1结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;该多肽还包括第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体,其中第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1Fc结构域单体各自均包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变,并且第一IgG1结构域单体包含选自表4A和表4B的一组两个反向电荷突变或选自表4A和表4B的一组四个反向电荷突变;包含选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体具有相同的CH3结构域;选自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷氨基酸突变在CH3结构域中;所述突变在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述突变各自是单一氨基酸变化;所述突变在从EU编号位置G341到EU编号位置K446的序列内,包括端点;所述突变是单一氨基酸变化;第二接头和任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG;第二接头和任选的第三接头是甘氨酸间隔区;第二接头和任选的第三接头独立地由4个至30个、4个至20个、8个至30个、8个至20个、12个至20个或12个至30个甘氨酸残基组成;第二接头和任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置I253处包含单一氨基酸突变,EU编号位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y;位置I253处的每个氨基酸突变是I253A;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU编号位置R292处包含单一氨基酸突变;EU编号位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组:R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y;位置R292处的每个氨基酸突变是R292P;每个Fc结构域单体独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL;第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL;第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL,并且第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL;每个Fc结构域单体的CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK,其具有不超过两个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列:GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过10个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过8个单一氨基酸置换;每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,其具有不超过6个单一氨基酸置换;其中每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG),其具有不超过5个单一氨基酸置换;所述单一氨基酸置换选自由以下项组成的组:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个单一氨基酸置换的氨基酸序列;最多6个所述单一氨基酸置换是CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变;所述单一氨基酸置换在从EU编号位置G341到EU编号位置K447的序列内,包括端点;所述VH结构域或scFv包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;所述VH结构域或scFv包括包含表2中示出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;所述VH结构域或scFv包括表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中示出的抗体的VH序列至少95%或98%相同;所述VH结构域或scFv包括表2中示出的抗体的VH序列;所述VH结构域或scFv包括表1中示出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;所述VH结构域或scFv包括来自表2中示出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列;所述VH结构域或scFv包括包含表2中示出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH结构域,以及包含表2中示出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL结构域,其中该VH结构域序列和该VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中示出的抗体的VH序列和VL序列至少95%或98%相同;所述VH结构域或scFv包括表2中示出的抗体的一组VH和VL序列。
还描述了一种核酸分子,其编码第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面和第四十四方面的任何前述多肽。
还描述了:一种表达载体,其包括编码任何前述多肽的核酸;宿主细胞,其含有所述核酸或表达载体;宿主细胞,其还含有编码包含抗体VL结构域的多肽的核酸分子(例如,编码包含抗体VL结构域和抗体CL结构域的多肽的核酸分子);宿主细胞,其还含有编码包含抗体VL结构域和抗体CL结构域的多肽的核酸分子;宿主细胞,其还含有编码包含具有不超过10个单一氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体的多肽的核酸分子;宿主细胞,其还含有编码包含具有不超过10个单一氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体的多肽的核酸分子。在各种实施方案中:IgG1 Fc结构域单体在CH3结构域中包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有不超过10个、8个、6个或4个单一氨基酸突变的氨基酸序列。
还描述了一种药物组合物,其包含本文所述的任何多肽或多肽复合物。在各种实施方案中,少于40%、30%、20%、10%、5%、2%的所述多肽具有至少一种岩藻糖。
本公开的第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面和第四十四方面的多肽可用作本文所述的各种Fc抗原结合结构域构建体的组分。因此,第一方面至第四十方面中任一项的多肽(例如,那些可以包含CD38结合结构域的多肽)可以包含本公开的第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面和第四十四方面中任一项的多肽或由这些多肽组成。
在本公开的所有方面中使用的其他有用的多肽包括以下多肽:其包括具有一个、两个或三个形成空腔的突变(例如,选自Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W:Y407T、T394S:Y407A、T366W:T394S、F405T、T366S:L368A:Y407V:Y349C、S364H:F405A)的Fc结构域单体(例如,包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有不超过8个、6个、5个、4个或3个单一氨基酸置换的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成)。这些多肽可以任选地包括来自表4A和表4B的一个、两个或三个反向电荷突变。
本文还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域,和
iv)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第三Fc结构域单体,
ii)第四Fc结构域单体,
iii)第二CD38重链结合结构域,和
iv)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;
d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;
e)第五多肽,该第五多肽包括第一CD38轻链结合结构域;以及
f)第六多肽,该第六多肽包括第二CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第四Fc单体和第六Fc单体一起形成第三Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
在各种实施方案中:第一多肽和第二多肽在序列上相同;第三多肽和第四多肽在序列上相同;第五多肽和第六多肽在序列上相同;第一多肽和第二多肽在序列上相同,第三多肽和第四多肽在序列上相同,并且第五多肽和第六多肽在序列上相同;所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;与人IgG的氨基酸序列相比,所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换的氨基酸序列;所述单一氨基酸置换仅在CH3结构域中;第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第一Fc结构域单体与第三Fc结构域单体之间的同源二聚化;第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第二Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的异源二聚化,并且第四Fc结构域单体和第六Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第四Fc结构域单体与第六Fc结构域单体之间的异源二聚化;促进同源二聚化的置换选自表4A和表4B中的置换;并且促进异源二聚化的置换选自表3中的置换。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域,和
iv)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第三Fc结构域单体,
ii)第四Fc结构域单体,
iii)第二CD38重链结合结构域,和
iv)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体和第一CD38轻链结合结构域;以及
d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体和第二CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第四Fc单体和第六Fc单体一起形成第三Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域,和
iv)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第三Fc结构域单体,
ii)第四Fc结构域单体,
iii)第二CD38重链结合结构域,和
iv)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;
d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;
e)第五多肽,该第五多肽包括第一CD38轻链结合结构域;以及
f)第六多肽,该第六多肽包括第二CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第二Fc单体和第四Fc单体一起形成第三Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
在各种实施方案中:第一多肽和第二多肽在序列上相同;第三多肽和第四多肽在序列上相同;第五多肽和第六多肽在序列上相同;第一多肽和第二多肽在序列上相同,第三多肽和第四多肽在序列上相同,并且第五多肽和第六多肽在序列上相同;所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;与人IgG1的氨基酸序列相比,所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换的氨基酸序列;所述单一氨基酸置换仅在CH3结构域中;第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的同源二聚化;第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第一Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的异源二聚化,并且第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第四Fc结构域单体与第六Fc结构域单体之间的异源二聚化;促进同源二聚化的置换选自表4A和表4B中的置换;并且促进异源二聚化的置换选自表3中的置换。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第三Fc结构域单体,
iv)第一CD38重链结合结构域,
v)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第二Fc结构域单体与第三Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第四Fc结构域单体,
ii)第五Fc结构域单体,
iii)第六Fc结构域单体,
iv)第二CD38重链结合结构域,
v)将第四Fc结构域单体与第五Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第五Fc结构域单体与第六Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第七Fc结构域单体;
d)第四多肽,该第四多肽包括第八Fc结构域单体;
e)第五多肽,该第五多肽包括第九Fc结构域单体;
f)第六多肽,该第六多肽包括第十Fc结构域单体;
g)第七多肽,该第七多肽包括第一CD38轻链结合结构域;以及
h)第八多肽,该第八多肽包括第二CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第七Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第四Fc结构域单体和第八Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第二Fc单体和第五Fc单体一起形成第三Fc结构域,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体一起形成第四Fc结构域,第六Fc单体和第十Fc单体一起形成第五Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
在各种实施方案中:第一多肽和第二多肽在序列上相同;第三多肽和第四多肽在序列上相同;第五多肽和第六多肽在序列上相同;第七多肽和第八多肽在序列上相同;第一多肽和第二多肽在序列上相同,第三多肽和第四多肽在序列上相同,第五多肽和第六多肽在序列上相同,并且第七多肽和第八多肽在序列上相同;所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;与人IgG1的氨基酸序列相比,所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;所述Fc结构域单体独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换的氨基酸序列;所述单一氨基酸置换仅在CH3结构域中;第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第二Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的同源二聚化;第一Fc结构域单体和第七Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第一Fc结构域单体与第七Fc结构域单体之间的异源二聚化,第四Fc结构域单体和第八Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第四Fc结构域单体与第八Fc结构域单体之间的异源二聚化,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第三Fc结构域单体与第九Fc结构域单体之间的异源二聚化,并且第六Fc结构域单体和第十Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第六Fc结构域单体与第十Fc结构域单体之间的异源二聚化;促进同源二聚化的置换选自表4A和表4B中的置换;促进异源二聚化的置换选自表3中的置换。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第三Fc结构域单体,
iv)第一CD38重链结合结构域,
v)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第二Fc结构域单体与第三Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第四Fc结构域单体,
ii)第五Fc结构域单体,
iii)第六Fc结构域单体,
iv)第二CD38重链结合结构域,
v)将第四Fc结构域单体与第五Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第五Fc结构域单体与第六Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第七Fc结构域单体;
d)第四多肽,该第四多肽包括第八Fc结构域单体;
e)第五多肽,该第五多肽包括第九Fc结构域单体和第一CD38轻链结合结构域;以及
f)第六多肽,该第六多肽包括第十Fc结构域单体和第二CD38轻链结合结构域
其中第一Fc结构域单体和第七Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第四Fc结构域单体和第八Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第二Fc单体和第五Fc单体一起形成第三Fc结构域,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体一起形成第四Fc结构域,第六Fc单体和第十Fc单体一起形成第五Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第三Fc结构域单体,
iv)第一CD38重链结合结构域,
v)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第二Fc结构域单体与第三Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第四Fc结构域单体,
ii)第五Fc结构域单体,
iii)第六Fc结构域单体,
iv)第二CD38重链结合结构域,
v)将第四Fc结构域单体与第五Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第五Fc结构域单体与第六Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第七Fc结构域单体;
d)第四多肽,该第四多肽包括第八Fc结构域单体;
e)第五多肽,该第五多肽包括第九Fc结构域单体;
f)第六多肽,该第六多肽包括第十Fc结构域单体;
g)第七多肽,该第七多肽包括第一CD38轻链结合结构域;以及
h)第八多肽,该第八多肽包括第二CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第四Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第二Fc结构域单体和第七Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第五Fc单体和第八Fc单体一起形成第三Fc结构域,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体一起形成第四Fc结构域,第六Fc单体和第十Fc单体一起形成第五Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
在各种实施方案中:第一多肽和第二多肽在序列上相同;第三多肽和第四多肽在序列上相同;第五多肽和第六多肽在序列上相同;第七多肽和第八多肽在序列上相同;第一多肽和第二多肽在序列上相同,第三多肽和第四多肽在序列上相同,第五多肽和第六多肽在序列上相同,并且第七多肽和第八多肽在序列上相同;所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;与人IgG1的氨基酸序列相比,所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换的氨基酸序列;所述单一氨基酸置换仅在CH3结构域中;第一Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第一Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的同源二聚化;第二Fc结构域单体和第七Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第二Fc结构域单体与第七Fc结构域单体之间的异源二聚化,第五Fc结构域单体和第八Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第五Fc结构域单体与第八Fc结构域单体之间的异源二聚化,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第三Fc结构域单体与第九Fc结构域单体之间的异源二聚化,并且第六Fc结构域单体和第十Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第六Fc结构域单体与第十Fc结构域单体之间的异源二聚化;促进同源二聚化的置换选自表4A和表4B中的置换;并且促进异源二聚化的置换选自表3中的置换。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第三Fc结构域单体,
iv)第一CD38重链结合结构域,
v)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第二Fc结构域单体与第三Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第四Fc结构域单体,
ii)第五Fc结构域单体,
iii)第六Fc结构域单体,
iv)第二CD38重链结合结构域,
v)将第四Fc结构域单体与第五Fc结构域单体接合的接头,和
vi)将第五Fc结构域单体与第六Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第七Fc结构域单体;
d)第四多肽,该第四多肽包括第八Fc结构域单体;
e)第五多肽,该第五多肽包括第九Fc结构域单体和第一CD38轻链结合结构域;
f)第六多肽,该第六多肽包括第十Fc结构域单体和第二CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第四Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第二Fc结构域单体和第七Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第五Fc单体和第八Fc单体一起形成第三Fc结构域,第三Fc结构域单体和第九Fc结构域单体一起形成第四Fc结构域,第六Fc单体和第十Fc单体一起形成第五Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头,和
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第三Fc结构域单体,
ii)第四Fc结构域单体,
iii)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体和第一CD38重链结合结构域;和
d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体和第二CD38重链结合结构域;
e)第五多肽,该第五多肽包括第一CD38轻链结合结构域;以及
f)第六多肽,该第六多肽包括第二CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体一起形成第三Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
在各种实施方案中:第一多肽和第二多肽在序列上相同;第三多肽和第四多肽在序列上相同;第五多肽和第六多肽在序列上相同;第一多肽和第二多肽在序列上相同,第三多肽和第四多肽在序列上相同,并且第五多肽和第六多肽在序列上相同;所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;与人IgG1的氨基酸序列相比,所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换的氨基酸序列;所述单一氨基酸置换仅在CH3结构域中;第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的同源二聚化;第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第一Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的异源二聚化,并且第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第三Fc结构域单体与第六Fc结构域单体之间的异源二聚化;促进同源二聚化的置换选自表4A和表4B中的置换;促进异源二聚化的置换选自表3中的置换。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域,和
iv)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第三Fc结构域单体,
ii)第四Fc结构域单体,
iii)第二CD38重链结合结构域,和
iv)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体和第三CD38重链结合结构域;
d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体和第四CD38轻链结合结构域;
e)第五多肽,该第五多肽包括第一CD38轻链结合结构域;
f)第六多肽,该第六多肽包括第二CD38轻链结合结构域;
g)第七多肽,该第七多肽包括第三CD38轻链结合结构域;以及
h)第八多肽,该第八多肽包括第四CD38轻链结合结构域;
其中第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第二Fc单体和第四Fc单体一起形成第三Fc结构域,第一CD38轻链结合结构域和第三CD38重链结合结构域一起形成第一Fab,第二CD38轻链结合结构域和第四CD38重链结合结构域一起形成第二Fab,第三CD38轻链结合结构域和第一CD38重链结合结构域一起形成第三Fab;并且第四CD38轻链结合结构域和第二CD38重链结合结构域一起形成第二Fab。
在各种实施方案中:第一多肽和第二多肽在序列上相同;第三多肽和第四多肽在序列上相同;第五多肽、第六多肽、第七多肽和第八多肽在序列上相同;第一多肽和第二多肽在序列上相同,第三多肽和第四多肽在序列上相同,并且第五多肽、第六多肽、第七多肽和第八多肽在序列上相同;所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;与人IgG1的氨基酸序列相比,所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换;所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换的氨基酸序列;所述单一氨基酸置换仅在CH3结构域中;第二Fc结构域单体和第四Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第二Fc结构域单体与第四Fc结构域单体之间的同源二聚化;其中第一Fc结构域单体和第五Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第一Fc结构域单体与第五Fc结构域单体之间的异源二聚化,并且第三Fc结构域单体和第六Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进第三Fc结构域单体与第六Fc结构域单体之间的异源二聚化;促进同源二聚化的置换选自表4A和表4B中的置换;并且促进异源二聚化的置换选自表3中的置换。
在各种实施方案中:每个接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU位置I253处包含置换;EU位置I253处的每个氨基酸置换独立地选自由以下项组成的组:I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y;所述Fc结构域单体中的至少一者在EU位置R292处包含置换;EU位置R292处的每个氨基酸置换独立地选自由以下项组成的组:R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y;所述Fc结构域单体中的至少一者包含选自由以下项组成的组的置换:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K和D356R;并且每个Fc结构域单体的铰链独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成:EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL。
在本公开的所有方面,所述Fc结构域单体中的一些或全部(例如,包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有不超过10个、8个、6个或4个单一氨基酸置换(例如,仅在CH3结构域中)的氨基酸序列的Fc结构域单体)除了具有其他氨基酸置换或修饰之外,还可以具有E345K和E430G氨基酸置换中的一者或两者。E345K和E430G氨基酸置换可以增加Fc结构域多聚化。
还描述了Fc抗原结合结构域构建体,其包括:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域(例如,包括VH结构域和CH1结构域),和
iv)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括:
i)第三Fc结构域单体,
ii)第四Fc结构域单体,
iii)第二CD38重链结合结构域(例如,包括VH结构域和CH1结构域),和
iv)将第三Fc结构域单体与第四Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,该第三多肽包括第五Fc结构域单体;
d)第四多肽,该第四多肽包括第六Fc结构域单体;
e)第五多肽,该第五多肽包括第一CD38轻链结合结构域(例如,包括VL结构域和CL结构域);以及
f)第六多肽,该第六多肽包括第二CD38轻链结合结构域(例如,包括VL结构域和CL结构域);
其中第一Fc结构域单体和第三Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,第二Fc结构域单体和第五Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,第四Fc单体和第六Fc单体一起形成第三Fc结构域,第一CD38重链结合结构域和第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且第二CD38重链结合结构域和第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
在各种实施方案中:第一多肽和第二多肽在序列上相同;第三多肽和第四多肽在序列上相同;第五多肽和第六多肽在序列上相同;第一多肽和第二多肽与SEQ ID NO:B至少95%相同,第三多肽和第四多肽与SEQ ID NO:C至少95%相同,并且第五多肽和第六多肽与SEQ ID NO:A至少95%相同;第一多肽和第二多肽与SEQ ID NO:B至少98%相同,第三多肽和第四多肽与SEQ ID NO:C至少98%相同,并且第五多肽和第六多肽与SEQ ID NO:A至少98%相同;第一多肽和第二多肽包含SEQ ID NO:B或由SEQ ID NO:B组成,第三多肽和第四多肽包含SEQ ID NO:C或由SEQ ID NO:C组成,并且第五多肽和第六多肽包含SEQ ID NO:A或由SEQ ID NO:A组成;并且第一多肽和第二多肽在序列上相同,第三多肽和第四多肽在序列上相同,并且第五多肽和第六多肽在序列上相同。
还公开了一种组合物,其包含:
a)第一多肽,该第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域,和
iv)将第一Fc结构域单体与第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,该第二多肽包括第三Fc结构域单体;以及
c)第三多肽,该第三多肽包括CD38轻链结合结构域。
在各种实施方案中:第一多肽与SEQ ID NO:B至少95%相同,第二多肽与SEQ IDNO:C至少95%相同,并且第三多肽与SEQ ID NO:A至少95%相同;第一多肽与SEQ ID NO:B至少98%相同,第二多肽与SEQ ID NO:C至少98%相同,并且第三多肽与SEQ ID NO:A至少98%相同;并且第一多肽包含SEQ ID NO:B或由SEQ ID NO:B组成,第二多肽包含SEQ IDNO:C或由SEQ ID NO:C组成,并且第三多肽包含SEQ ID NO:A或由SEQ ID NO:A组成。
定义:
如本文所用,术语“Fc结构域单体”是指至少包括铰链结构域以及第二抗体恒定结构域和第三抗体恒定结构域(CH2和CH3)或它们的功能片段(例如,至少铰链结构域或其功能片段、CH2结构域或其功能片段,以及CH3结构域或其功能片段)(例如,能够(i)与另一个Fc结构域单体二聚化形成Fc结构域并且(ii)与Fc受体结合的片段)的多肽链。优选的Fc结构域单体从氨基末端到羧基末端包含IgG1铰链、IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域的至少一部分。因此,Fc结构域单体(例如,人IgG1 Fc结构域单体)可以从E316延伸到G446或K447,从P317延伸到G446或K447,从K318延伸到G446或K447,从K318延伸到G446或K447,从S319延伸到G446或K447,从C320延伸到G446或K447,从D321延伸到G446或K447,从K322延伸到G446或K447,从T323延伸到G446或K447,从K323延伸到G446或K447,从H324延伸到G446或K447,从T325延伸到G446或K447,或者从C326延伸到G446或K447。该Fc结构域单体可以是任何免疫球蛋白抗体同种型,包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD(例如,IgG)。此外,该Fc结构域单体可以是IgG亚型(例如,IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)(例如,人IgG1)。人IgG1 Fc结构域单体用于本文所述的示例中。人IgG1的全铰链结构域从EU编号E316延伸到P230或L235,CH2结构域从A231或G236延伸到K340,并且CH3结构域从G341延伸到K447。对于铰链结构域的最后一个氨基酸的位置有不同的看法。它是P230或L235。在本文的许多示例中,CH3结构域不包括K347。因此,CH3结构域可以是G341至G446。在本文的许多示例中,铰链结构域可以包括E216至L235。例如,当铰链在CH1结构域或CD38结合结构域的羧基末端时,就是如此。在一些情况下,例如当铰链位于多肽的氨基末端时,EU编号221处的Asp突变为Gln。Fc结构域单体不包括免疫球蛋白的能够充当抗原识别区域的任何部分,例如可变结构域或互补决定区(CDR)。Fc结构域单体相比野生型(例如,人)Fc结构域单体序列可以含有多达十个变化(例如,1个至10个、1个至8个、1个至6个、1个至4个氨基酸置换、添加或缺失),这些变化改变了Fc结构域与Fc受体之间的相互作用。Fc结构域单体相比野生型Fc结构域单体序列可以含有多达十个变化(例如,单一氨基酸变化)(例如,1个至10个、1个至8个、1个至6个、1个至4个氨基酸置换、添加或缺失),这些变化改变了Fc结构域单体之间的相互作用。在某些实施方案中,与以下人IgG1 CH3结构域序列相比,CH3结构域上最多有10个、8个、6个或5个单一氨基酸置换:GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG。合适变化的示例是本领域已知的。
如本文所用,术语“Fc结构域”是指能够结合Fc受体的两个Fc结构域单体的二聚体。在野生型Fc结构域中,两个Fc结构域单体通过两个CH3抗体恒定结构域之间的相互作用以及在两个二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键而二聚化。
在本公开中,术语“Fc抗原结合结构域构建体”是指形成至少两个如本文所述的Fc结构域并且包括至少一个“抗原结合结构域”的缔合多肽链。本文所述的Fc抗原结合结构域构建体可以包括具有相同或不同序列的Fc结构域单体。例如,Fc抗原结合结构域构建体可以具有三个Fc结构域,其中两个包括IgG1或IgG1衍生的Fc结构域单体,并且第三个包括IgG2或IgG2衍生的Fc结构域单体。在另一个示例中,Fc抗原结合结构域构建体可以具有三个Fc结构域,其中两个包括“突起-进入-空腔对”,并且第三个不包括“突起-进入-空腔对”。Fc结构域形成与Fc受体(例如,FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb或FcγRIV)结合的最小结构。
如本文所用,术语“抗原结合结构域”是指能够特异性结合靶分子的肽、多肽或一组缔合多肽。在一些实施方案中,“抗原结合结构域”是抗体的与该抗体所结合的抗原特异性结合的最小序列。表面等离子体共振(SPR)或本领域已知的各种免疫测定法(例如,蛋白质印迹法或ELISA)可以用于评估抗体对抗原的特异性。在一些实施方案中,“抗原结合结构域”包括抗体的可变结构域或互补决定区(CDR),例如表1中示出的抗体的一个或多个CDR、表2中示出的抗体的一个或多个CDR,或者表2中示出的抗体的VH结构域和/或VL结构域。在一些实施方案中,该CD38结合结构域可以包括VH结构域和CH1结构域,任选地具有VL结构域。在其他实施方案中,抗原(例如,CD38)结合结构域是抗体或scFv的Fab片段。因此,CD38结合结构域可以包括包含VH结构域和CH1结构域或由这些结构域组成的“CD38重链结合结构域”,以及包含VL结构域和CL结构域或由这些结构域组成的“CD38轻链结合结构域”。CD38结合结构域还可以是特异性结合靶标的合成工程化肽,诸如基于纤连蛋白的结合蛋白(例如,III型纤连蛋白结构域(FN3)单体)。
如本文所用,术语“互补决定区”(CDR)是指抗体可变结构域的氨基酸残基,其存在对于CD38结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区,被标识为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。每个互补决定区可以包括来自由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即,大约轻链可变结构域中的残基24至34(CDR-L1)、50至56(CDR-L2)和89至97(CDR-L3),以及重链可变结构域中的残基31至35(CDR-H1)、50至65(CDR-H2)和95至102(CDR-H3);Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))以及/或者来自“高变环”的那些残基(即,大约轻链可变结构域中的残基26至32(CDR-L1)、50至52(CDR-L2)和91至96(CDR-L3),以及重链可变结构域中的残基26至32(CDR-H1)、53至55(CDR-H2)和96至101(CDR-H3);Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些情况下,互补决定区可以包括来自根据Kabat定义的CDR区以及高变环两者的氨基酸。
“骨架区”(下文称为FR)是除CDR残基以外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR,被标识为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是根据Kabat定义的,则轻链FR残基位于大约残基1至23(LCFR1)、35至49(LCFR2)、57至88(LCFR3)和98至107(LCFR4)处,并且重链FR残基位于大约重链残基中的残基1至30(HCFR1)、36至49(HCFR2)、66至94(HCFR3)和103至113(HCFR4)处。如果CDR包括来自高变环的氨基酸残基,则轻链FR残基位于大约轻链中的残基1至25(LCFR1)、33至49(LCFR2)、53至90(LCFR3)和97至107(LCFR4)处,并且重链FR残基位于大约重链残基中的残基1至25(HCFR1)、33至52(HCFR2)、56至95(HCFR3)和102至113(HCFR4)处。在一些情况下,当CDR包括来自如由Kabat定义的CDR以及高变环的CDR两者的氨基酸时,将相应地调节FR残基。
“Fv”片段是含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成,该二聚体在性质上可以是共价的,例如在scFv中。在这种构型中,每个可变结构域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定CD38结合位点。
“Fab”片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域,以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包括一对Fab片段,它们通常在其羧基末端附近通过铰链半胱氨酸共价连接。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段在单个多肽链中包括抗体的VH结构域和VL结构域。一般来讲,该scFv多肽还包括在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头,该多肽接头使得该scFv能够形成CD38结合所需的结构。
如本文所用,术语“抗体恒定结构域”是指对应于抗体的恒定区结构域的多肽(例如,CL抗体恒定结构域、CH1抗体恒定结构域、CH2抗体恒定结构域,或CH3抗体恒定结构域)。
如本文所用,术语“促进”意指支持且有利于,例如有利于由彼此的结合亲和力比其他不同的Fc结构域单体更高的两个Fc结构域单体形成Fc结构域。如本文所述,组合形成Fc结构域的两个Fc结构域单体可以在其各自的CH3抗体恒定结构域的界面处具有相容氨基酸修饰(例如,工程化突起和工程化空腔,以及/或者静电转向突变)。相容氨基酸修饰促进或有利于此类Fc结构域单体相对于与缺乏此类氨基酸修饰或具有不相容氨基酸修饰的其他Fc结构域单体,彼此之间的选择性相互作用。这是因为,由于两个相互作用的CH3抗体恒定结构域的界面处的氨基酸修饰,所述Fc结构域单体对彼此的亲和力比对缺乏氨基酸修饰的其他Fc结构域单体更高。
如本文所用,术语“二聚化选择性模块”是指Fc结构域单体的促进两个Fc结构域单体之间的有利配对的序列。“互补”二聚化选择性模块是促进或有利于两个Fc结构域单体彼此的选择性相互作用的二聚化选择性模块。互补二聚化选择性模块可以具有相同或不同的序列。本文描述了示例性的互补二聚化选择性模块。
如本文所用,术语“工程化空腔”是指将CH3抗体恒定结构域中的至少一个原始氨基酸残基用侧链体积比原始氨基酸残基更小的不同氨基酸残基置换,从而在CH3抗体恒定结构域中产生三维空腔。术语“原始氨基酸残基”是指由野生型CH3抗体恒定结构域的遗传密码编码的天然存在的氨基酸残基。
如本文所用,术语“工程化突起”是指将CH3抗体恒定结构域中的至少一个原始氨基酸残基用侧链体积比原始氨基酸残基更大的不同氨基酸残基置换,从而在CH3抗体恒定结构域中产生三维突起。术语“原始氨基酸残基”是指由野生型CH3抗体恒定结构域的遗传密码编码的天然存在的氨基酸残基。
如本文所用,术语“突起-进入-空腔对”描述了包括两个Fc结构域单体的Fc结构域,其中第一Fc结构域单体在其CH3抗体恒定结构域中包括工程化空腔,而第二Fc结构域单体在其CH3抗体恒定结构域中包括工程化突起。在突起-进入-空腔对中,第一Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中的工程化突起被定位成使得其与第二Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的工程化空腔相互作用,而不显著扰乱二聚体在CH3抗体恒定结构域间界面处的正常缔合。
如本文所用,术语“异源二聚体Fc结构域”是指通过两个Fc结构域单体的异源二聚化形成的Fc结构域,其中所述两个Fc结构域单体含有促进这两个Fc结构域单体的有利形成的不同反向电荷突变(参见例如,表4A和表4B中的突变)。在具有三个Fc结构域(一个羧基末端“茎”Fc结构域和两个氨基末端“分支”Fc结构域)的Fc构建体中,每个氨基末端“分支”Fc结构域都可以是异源二聚体Fc结构域(也称为“分支异源二聚体Fc结构域”)。
如本文所用,关于Fc抗原结合结构域构建体群体的术语“在结构上相同”是指以相同比率和构型组装相同多肽序列的构建体,但不指任何翻译后修饰,诸如糖基化。
如本文所用,术语“同源二聚体Fc结构域”是指通过两个Fc结构域单体的同源二聚化形成的Fc结构域,其中所述两个Fc结构域单体含有相同的反向电荷突变(参见例如,表5和表6中的突变)。在具有三个Fc结构域(一个羧基末端“茎”Fc结构域和两个氨基末端“分支”Fc结构域)的Fc构建体中,羧基末端“茎”Fc结构域可以是同源二聚体Fc结构域(也称为“茎同源二聚体Fc结构域”)。
如本文所用,术语“异源二聚化选择性模块”是指可以在Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中产生以便促进具有相容异源二聚化选择性模块的两个Fc结构域单体的有利异源二聚化的工程化突起、工程化空腔和某些反向电荷氨基酸置换。含有异源二聚化选择性模块的Fc结构域单体可以组合形成异源二聚体Fc结构域。异源二聚化选择性模块的示例在表3和表4中示出。
如本文所用,术语“同源二聚化选择性模块”是指Fc结构域单体中的CH3结构域之间界面处的带电残基环内至少两个位置中的促进该Fc结构域单体的同源二聚化以形成同源二聚体Fc结构域的反向电荷突变。同源二聚化选择性模块的示例在表4和表5中示出。
如本文所用,术语“接合”用于描述通过包括化学缀合、重组手段和化学键(例如,肽键、二硫键和酰胺键)在内的手段来组合或附接两种或更多种元件、组分或蛋白质结构域(例如,多肽)。例如,可以通过化学缀合、化学键、肽接头或任何其他共价键合手段来接合两种单个多肽以形成一个连续的蛋白质结构。在一些实施方案中,通过从编码CD38结合结构域和Fc结构域单体两者的连续核酸序列表达来将CD38结合结构域与Fc结构域单体接合。在其他实施方案中,通过肽接头将CD38结合结构域与Fc结构域单体接合,其中通过化学键(例如,肽键)将肽接头的N末端与CD38结合结构域的C末端接合,并且通过化学键(例如,肽键)将肽接头的C末端与Fc结构域单体的N末端接合。
如本文所用,术语“缔合”用于描述多肽(或一种单一多肽内的序列)之间的相互作用,例如氢键合、疏水相互作用或离子相互作用,该相互作用使得多肽(或一种单一多肽内的序列)被定位为形成本文所述的Fc抗原结合结构域构建体(例如,具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体)。例如,在一些实施方案中,四种多肽(例如,各自包括两个Fc结构域单体的两种多肽和各自包括一个Fc结构域单体的两种多肽)缔合形成具有三个Fc结构域的Fc构建体(例如,如图50和图51所描绘)。四种多肽可以通过其各自的Fc结构域单体缔合。多肽之间的缔合不包括共价相互作用。
如本文所用,术语“接头”是指两个元件(例如,蛋白质结构域)之间的键合。接头可以是共价键或间隔区。术语“键”是指化学键(例如,酰胺键或二硫键),或由化学反应(例如,化学缀合)产生的任何种类的键。术语“间隔区”是指存在于两个多肽或多肽结构域之间以在这两个多肽或多肽结构域之间提供空间和/或灵活性的部分(例如,聚乙二醇(PEG)聚合物)或氨基酸序列(例如,3个至200个氨基酸、3个至150个氨基酸,或者3个至100个氨基酸序列)。氨基酸间隔区是多肽一级序列的部分(例如,经由多肽主链与间隔的多肽或多肽结构域接合)。例如在两个铰链区或者形成Fc结构域的两个Fc结构域单体之间形成的二硫键不被认为是接头。
如本文所用,术语“甘氨酸间隔区”是指串联接合两个Fc结构域单体的仅含有甘氨酸的接头。甘氨酸间隔区可以含有至少4个、8个或12个甘氨酸(例如,4个至30个、8个至30个或12个至30个甘氨酸;例如,12个至30个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个甘氨酸)。在一些实施方案中,甘氨酸间隔区具有序列GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:27)。
如本文所用,术语“白蛋白结合肽”是指对血清白蛋白具有亲和力并且具有结合血清白蛋白的功能的12个至16个氨基酸的氨基酸序列。白蛋白结合肽可以具有不同起源,例如人、小鼠或大鼠。在本公开的一些实施方案中,将白蛋白结合肽与Fc结构域单体的C末端融合,以增加Fc抗原结合结构域构建体的血清半衰期。可以直接或通过接头将白蛋白结合肽与Fc结构域单体的N末端或C末端融合。
如本文所用,术语“纯化肽”是指可以用于纯化、分离或鉴定多肽的任何长度的肽。可以将纯化肽与多肽接合以帮助从例如细胞裂解物混合物中纯化多肽和/或分离多肽。在一些实施方案中,纯化肽与对该纯化肽具有特异性亲和力的另一个部分结合。在一些实施方案中,将与纯化肽特异性结合的此类部分附接到固体支持物,诸如基质、树脂或琼脂糖珠。可以与Fc抗原结合结构域构建体接合的纯化肽的示例在本文中进一步详细描述。
如本文所用,术语“多聚体”是指包括至少两个本文所述的缔合Fc构建体或Fc抗原结合结构域构建体的分子。
如本文所用,术语“多核苷酸”是指寡核苷酸或核苷酸以及它们的片段或部分,并且是指基因组或合成起源的DNA或RNA,它们可以是单链或双链的,并且代表有义链或反义链。单个多核苷酸被翻译成单个多肽。
如本文所用,术语“多肽”描述了其中单体是通过酰胺键接合在一起的氨基酸残基的单个聚合物。多肽旨在涵盖天然存在、重组或合成产生的任何氨基酸序列。
如本文所用,术语“氨基酸位置”是指蛋白质或蛋白质结构域中氨基酸的位置编号。在标出地方(例如,对于CDR区和FR区)使用Kabat编号系统(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,第5版,1991)对氨基酸位置进行编号,否则使用EU编号。
图24A至图24D描绘了使用EU编号系统进行编号的人IgG1 Fc结构域。
如本文所用,术语“氨基酸修饰”是指与参考序列(例如,野生型、未突变或未修饰的Fc序列)相比可以对以下项有影响并且可以促进改善治疗免疫疾病和炎性疾病的功效的Fc结构域多肽序列的改变:Fc构建体的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性、血清半衰期、效应子功能(例如,细胞裂解(例如,抗体依赖性细胞介导的毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性活性(CDC))、吞噬作用(例如,抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDCC))、免疫激活和T细胞激活)、对Fc受体(例如,Fc-γ受体(FcγR)(例如,FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16a)和/或FcγRIIIb(CD16b))、Fc-α受体(FcαR)、Fc-ε受体(FcεR)和/或新生儿Fc受体(FcRn))的亲和力、对参与补体级联的蛋白质(例如,C1q)的亲和力、翻译后修饰(例如,糖基化、唾液酸化)、聚合特性(例如,形成二聚体(例如,同源二聚体和/或异源二聚体)和/或多聚体的能力)以及生物物理特性(例如,改变CH1与CL之间的相互作用、改变稳定性和/或改变对温度和/或pH的敏感性)。氨基酸修饰包括氨基酸置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中,氨基酸修饰是单一氨基酸的修饰。在其他实施方案中,氨基酸修饰是多个(例如,多于一个)氨基酸的修饰。氨基酸修饰可以包括氨基酸置换、缺失和/或插入的组合。包括在氨基酸修饰的描述中的是编码Fc多肽的核苷酸序列的遗传(即DNA和RNA)改变,诸如点突变(例如,单个核苷酸与另一个核苷酸的交换)、插入和缺失(例如,一个或多个核苷酸的添加和/或移除)。
在某些实施方案中,Fc构建体或Fc抗原结合结构域构建体内的至少一个(例如,一个、两个或三个)Fc结构域单体包括氨基酸修饰(例如,置换)。在一些情况下,至少一个Fc结构域单体包括一个或多个(例如,不超过两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或二十个)氨基酸修饰(例如,置换)。
如本文所用,术语“同一性百分比(%)”是指在比对序列并引入缺口(如有需要)以实现最大同一性百分比(即,可以在候选序列和参考序列中的一者或两者中引入缺口以用于最佳比对,并且可以忽略非同源序列以用于比较目的)之后,候选序列(例如,本文所述的Fc抗原结合结构域构建体中的Fc结构域单体的序列)的氨基酸(或核酸)残基与参考序列(例如,野生型Fc结构域单体的序列)的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。出于确定同一性百分比的目的进行的比对能够以本领域技术范围内的各种方式实现,例如使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中,如下计算给定候选序列和、与或相对于给定参考序列的氨基酸(或核酸)序列同一性百分比(其可以替代性地表达为给定候选序列和、与或相对于给定参考序列具有或包括一定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比):
100×(A/B的分数)
其中A是在候选序列和参考序列的比对中评分为相同的氨基酸(或核酸)残基的数目,并且其中B是参考序列中氨基酸(或核酸)残基的总数。在其中候选序列的长度不等于参考序列的长度的一些实施方案中,候选序列与参考序列的氨基酸(或核酸)序列同一性百分比将不等于参考序列与候选序列的氨基酸(或核酸)序列同一性百分比。
在特定实施方案中,用于与候选序列比较而进行比对的参考序列可以显示,跨候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核酸)残基的选定部分,候选序列表现出50%至100%的同一性(例如,50%至100%、60%至100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%、92%至100%、95%至100%、97%至100%、99%至100%,或99.5%至100%的同一性)。用于比较目的而比对的候选序列的长度为参考序列长度的至少30%,例如至少40%,例如至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。当候选序列中的位置被与参考序列中的相应位置相同的氨基酸(或核酸)残基占据时,则所述分子在该位置处是相同的。
在一些实施方案中,本文所述的Fc构建体(例如,具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可以具有与野生型Fc结构域单体的序列(例如,SEQ IDNO:42)至少95%相同(至少97%、99%或99.5%相同)的序列。在一些实施方案中,本文所述的Fc构建体(例如,具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可以具有与SEQ ID NO:44、46、48和50至53中任一者的序列至少95%相同(至少97%、99%或99.5%相同)的序列。在某些实施方案中,该Fc构建体中的Fc结构域单体可以具有与SEQ IDNO:48、52和53的序列至少95%相同(至少97%、99%或99.5%相同)的序列。
在一些实施方案中,两个Fc结构域单体之间的间隔区可以具有与本文进一步描述的SEQ ID NO:1至36(例如,SEQ ID NO:17、18、26和27)中任一者的序列至少75%相同(至少75%、77%、79%、81%、83%、85%、87%、89%、91%、93%、95%、97%、99%、99.5%或100%相同)的序列。
如本文所用,术语“宿主细胞”是指包括从其对应的核酸表达蛋白质所需的必要细胞组分(例如,细胞器)的媒介物。核酸通常包括在核酸载体中,所述核酸载体可以通过本领域已知的常规技术(转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)引入宿主细胞中。宿主细胞可以是原核细胞(例如,细菌细胞)或真核细胞(例如,哺乳动物细胞(例如,CHO细胞))。如本文所述,宿主细胞用于表达编码所需结构域的一种或多种多肽,然后可以将所述结构域组合以形成所需的Fc抗原结合结构域构建体。
如本文所用,术语“药物组合物”是指含有活性成分以及一种或多种赋形剂和稀释剂以使活性成分能够适合于施用方法的医学或药物制剂。本公开的药物组合物包含与Fc抗原结合结构域构建体相容的药学上可接受的组分。药物组合物通常是用于静脉内或皮下施用的水性形式。
如本文所用,多肽或Fc构建体的“基本上同质的群体”是指组合物(例如,细胞培养基或药物组合物)中至少50%的多肽或Fc构建体具有相同数量的Fc结构域,如通过非还原SDS凝胶电泳或尺寸排阻色谱法测定的。多肽或Fc构建体的基本上同质的群体可以在纯化之前或者在蛋白质A或蛋白质G纯化之后或者在只进行任何Fab或Fc特异性亲和色谱法之后获得。在各种实施方案中,组合物中至少55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的多肽或Fc构建体具有相同数量的Fc结构域。在其他实施方案中,组合物中最多85%、90%、92%或95%的多肽或Fc构建体具有相同数量的Fc结构域。
如本文所用,术语“药学上可接受的载剂”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载剂必须与制剂的其他成分相容并且对接受者无害。在本公开中,药学上可接受的载剂必须为Fc抗原结合结构域构建体提供足够的药物稳定性。载剂的性质因施用模式而异。例如,对于口服施用,固体载剂是优选的;对于静脉内施用,一般使用水性溶液载剂(例如,WFI和/或缓冲溶液)。
如本文所用,“治疗有效量”是指有效诱导受试者或患者中的所需生物效应或者有效治疗患有本文所述病症或障碍的患者的量,例如药物剂量。本文还应当理解,“治疗有效量”可以被解释为以一个剂量或者以任何剂量或途径单独服用或与其他治疗剂组合服用的给予所需治疗效果的量。
如本文所用,术语“片段”和术语“部分”可以互换使用。
附图说明
图1是包含两个Fc结构域和一个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体1)的图示。每个Fc结构域是两个Fc结构域单体的二聚体。两个Fc结构域单体(106和108)在其CH3抗体恒定结构域中包含突起,而另外两个Fc结构域单体(112和114)在其CH3抗体恒定结构域的并列位置中包含空腔。该构建体由三个包含Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(102)包含两个含突起的Fc结构域单体(106和108),这两个Fc结构域单体通过间隔区与N末端上包含VH结构域的CD38结合结构域(110)串联连接。包含VL的结构域(104)与VH结构域接合。第二多肽和第三多肽(112和114)中的每一者包含含空腔的Fc结构域单体。
图2是包含三个Fc结构域和一个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体2)的图示。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(202)包含三个含突起的Fc结构域(206、208和210),这些Fc结构域通过间隔区与N末端上包含VH结构域的CD38结合结构域(212)串联连接。包含VL的结构域(204)与VH结构域接合。第二多肽、第三多肽和第四多肽(214、216和218)中的每一者包含含空腔的Fc结构域单体。
图3是包含两个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体3)的图示。该构建体由三个包含Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(302)包含两个含突起的Fc结构域单体(304和306),这两个Fc结构域单体通过间隔区串联连接。第二多肽和第三多肽(320和322)中的每一者包含含空腔的Fc结构域单体(310和314),这两个Fc结构域单体与N末端上包含VH结构域的CD38结合结构域(316和318)串联接合。包含VL的结构域(308和312)与每个VH结构域接合。
图4是包含三个Fc结构域和三个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体4)的图示。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(402)包含三个含突起的Fc结构域单体(404、406和408),这三个Fc结构域单体通过间隔区串联连接。第二多肽、第三多肽和第四多肽(428、430和432)中的每一者包含含空腔的Fc结构域单体(426、420和414),这三个Fc结构域单体与N末端上包含VH结构域的CD38结合结构域(422、416和410)串联接合。包含VL的结构域(424、418和412)与每个VH结构域接合。
图5是包含两个Fc结构域和三个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体5)的图示。该构建体由三个包含Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(502)包含两个含突起的Fc结构域单体(508和506),这两个Fc结构域单体通过间隔区与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(510)串联连接。第二多肽和第三多肽(524和526)中的每一者包含含空腔的Fc结构域单体(516和522),这两个Fc结构域单体与N末端上包含VH结构域的CD38结合结构域(512和518)串联接合。包含VL的结构域(504、514和520)与每个VH结构域接合。
图6是包含三个Fc结构域和四个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体6)的图示。该构建体由四个包含Fc单体的多肽形成。第一多肽(602)包含三个含突起的Fc结构域单体(606、608和610),这三个Fc结构域单体通过间隔区与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(612)串联连接。第二多肽、第三多肽和第四多肽(632、634和636)中的每一者包含含空腔的Fc结构域单体(618、624和630),这三个Fc结构域单体与N末端上包含VH结构域的CD38结合结构域(616、622和628)串联接合。包含VL的结构域(604、616、622和628)与每个VH结构域接合。
图7是包含三个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体7)的图示。该Fc抗原结合结构域构建体包含两个Fc结构域单体(706和718)的二聚体,其中两个Fc结构域单体在它们的CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸,以促进这两个Fc结构域单体之间的有利静电相互作用。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(702和724)各自包含含突起的Fc结构域单体(710和720),这两个Fc结构域单体通过间隔区与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(706和718)以及N末端上包含VH结构域的CD38结合结构域(712和714)串联连接。第三多肽和第四多肽(708和722)各自包含含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域(704和716)与每个VH结构域接合。
图8是包含三个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体8)的图示。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(802和828)各自包含含突起的Fc结构域单体(814和820),这两个Fc结构域单体通过间隔区与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(810和816)串联连接。第三多肽和第四多肽(804和826)各自包含含空腔的Fc结构域单体(808和824),这两个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(812和818)串联接合。包含VL的结构域(806和822)与每个VH结构域接合。
图9是包含三个Fc结构域和四个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体9)的图示。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(902和936)各自包含含突起的Fc结构域单体(918和928),这两个Fc结构域单体通过间隔区与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(910和924)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(908和920)串联连接。第三多肽和第四多肽(904和934)包含含空腔的Fc结构域单体(916和932),这两个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(912和926)串联接合。包含VL的结构域(906、914、922和930)与每个VH结构域接合。
图10是包含五个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体10)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1002和1032)各自包含含突起的Fc结构域单体(1016和1030),这两个Fc结构域单体通过间隔区与另一个含突起的Fc结构域单体(1014和1028)、在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1008和1022)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1006和1018)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(1012、1010、1026和1024)各自包含含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域(1004和1020)与每个VH结构域接合。
图11是包含五个Fc结构域和四个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体11)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1102和1148)包含含突起的Fc结构域单体(1118和1132),这两个Fc结构域单体通过间隔区与另一个含突起的Fc结构域单体(1120和1130)以及在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1124和1126)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(1106、1104、1144和1146)各自包含含空腔的Fc结构域单体(1116、1110、1134和1140),这四个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1112、1122、1138和1128)串联接合。包含VL的结构域(1108、1114、1135和1142)与每个VH结构域接合。
图12是包含五个Fc结构域和六个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体12)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1202和1256)包含含突起的Fc结构域单体(1224和1230),这两个Fc结构域单体通过间隔区与另一个含突起的Fc结构域单体(1226和1228)、在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1210和1244)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1250和1248)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(1206、1204、1254和1252)各自包含含空腔的Fc结构域单体(1222、1216、1232和1238),这四个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1218、1212、1236和1242)串联接合。包含VL的结构域(1208、1214、1220、1234、1240和1246)与每个VH结构域接合。
图13是包含三个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体13)的图示。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1302和1324)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1308和1318),这两个Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体(1312和1316)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1310和1314)串联连接。第三多肽和第四多肽(1306和1320)包含含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域(1304和1322)与每个VH结构域接合。
图14是包含三个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体14)的图示。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1404和1426)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1308和1318),这两个Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体(1414和1418)串联连接。第三多肽和第四多肽(1402和1428)各自包含含空腔的Fc结构域单体(1410和1422),这两个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1408和1416)串联接合。包含VL的结构域(1406和1424)与每个VH结构域接合。
图15是包含三个Fc结构域和四个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体15)的图示。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1502和1536)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1512和1524),这两个Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体(1518和1522)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1514和1532)串联连接。第三多肽和第四多肽(1504和1534)包含含空腔的Fc结构域单体(1510和1526),这两个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1508和1530)串联接合。包含VL的结构域(1506、1516、1520和1528)与每个VH结构域接合。
图16是包含五个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体16)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1602和1632)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1610和1624),这两个Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体(1612和1622)、第二含突起的Fc结构域单体(1614和1620)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1616和1618)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(1608、1606、1626和1628)各自包含含空腔的Fc结构域。包含VL的结构域(1604和1630)与每个VH结构域接合。
图17是包含五个Fc结构域和四个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体17)的图示。该构建体由六个包含Fc单体的多肽形成。两个多肽(1702和1748)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1718和1732),这两个Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体(1720和1730)以及N末端处的第二含突起的Fc结构域单体(1722和1728)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(1706、1704、1746和1744)包含含空腔的Fc结构域单体(1716、1710、1734和1740),这四个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1712、1724、1738和1726)串联接合。包含VL的结构域(1708、1714、1736和1742)与每个VH结构域接合。
图18是包含五个Fc结构域和六个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体18)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1802和1856)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1818和1838),这两个Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体(1820和1836)、第二含突起的Fc结构域单体(1822和1834)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1826和1830)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(1806、1804、1854和1852)各自包含含空腔的Fc结构域单体(1816、1810、1840和1846),这四个Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1812、1828、1844和1850)串联接合。包含VL的结构域(1808、1814、1824、1832、1842和1848)与每个VH结构域接合。
图19是包含五个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体19)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(1902和1932)包含含突起的Fc结构域单体(1912和1930),这两个Fc结构域单体通过间隔区与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(1908和1926)、含突起的Fc结构域单体(1916和1918)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(1914和1920)串联连接。第三多肽和第四多肽(1910和1928)包含含空腔的Fc结构域单体,并且第五多肽和第六多肽(1906和1924)包含含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域(1904和1922)与每个VH结构域接合。
图20是包含五个Fc结构域和四个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体20)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(2002和2048)包含含突起的Fc结构域单体(2020和2022),这两个Fc结构域单体通过间隔区与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(2012和2030)以及N末端处的含突起的Fc结构域单体(2040和2038)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(2006、2004、2046和2044)各自包含含空腔的Fc结构域单体(2018、2010、2024和2032),这些Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(2014、2042、2028和2036)串联接合。包含VL的结构域(2008、2016、2026和2034)与每个VH结构域接合。
图21是包含五个Fc结构域和六个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体21)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(2102和2156)包含含突起的Fc结构域单体(2120和2122),这两个Fc结构域单体通过间隔区与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(2112和2130)、另一个含突起的Fc结构域单体(2144和2142)以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(2148和2138)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(2106、2104、2154和2152)各自包含含空腔的Fc结构域单体(2118、2110、2124和2132),这些Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域(2114、2150、2128和2136)串联接合。包含VL的结构域(2108、2116、2126、2134、2140和2146)与每个VH结构域接合。
图22是示出利用靶向B细胞的各种抗CD20构建体的CDC、ADCP和ADCC测定的结果的三个图。第一个图表明,S3Y Fc抗原结合结构域构建体可以介导CDC。中间图表明,SAI和S3YFc抗原结合结构域构建体在ADCP FcγRIIa报告基因测定中均表现出超过100倍的增强效力。第三个图表明,SAI和S3Y Fc抗原结合结构域构建体表现出相对于岩藻糖基化mAb增强的ADCC活性,以及与无岩藻糖基化mAb相似的活性。
图23A至图23C是可以将CD38结合结构域与Fc构建体的Fc结构域接合的三种示例性方式的示意图。小图A示出了CD38结合结构域的重链组分可以表达为Fc链的融合蛋白,并且轻链组分可以表达为单独的多肽。小图B示出了表达为长Fc链的融合蛋白的scFv。小图C示出了单独表达并且外源添加到Fc抗原结合结构域构建体中并且利用化学键与该Fc抗原结合结构域构建体接合的重链组分和轻链组分。
图24A描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)。铰链区用双下划线标出,CH2结构域未用下划线标出,而CH3区用下划线标出。
图24B描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)。缺少E216至C220(包括端点)的铰链区用双下划线标出,CH2结构域未用下划线标出,而CH3区用下划线标出并且缺少K447。
图24C描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)。铰链区用双下划线标出,CH2结构域未用下划线标出,而CH3区用下划线标出并且缺少447K。
图24D描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。缺少E216至C220(包括端点)的铰链区用双下划线标出,CH2结构域未用下划线标出,而CH3区用下划线标出。
图25描绘了抗CD38抗体的剂量依赖性结合的分析结果,显示在多种血液肿瘤细胞系中相对高、中等和低的细胞表面CD38表达。VivoTag645标记的抗CD38抗体与活细胞表面CD38结合。通过FACS分析评估细胞表面结合。
图26A至图26B描绘了分析结果,表明抗CD38构建体具有与IgG1抗CD38抗体相似的细胞结合谱,后一种抗体与人和食蟹猴CD38交叉反应。(A)将表达人CD38的Raji肿瘤细胞与VivoTag645标记的抗体、SIA-AA-Cyno(抗Cyno CD38 mAb)、S3Y-AA-Cyno–CD38(具有CynoCD38 Fab的构建体13)、抗CD38 mAb、S3Y-AA-CD38(具有抗CD38 Fab的构建体13)、IgG同种型对照和SIF1对照(不具有Fab区的Fc三聚体)在4℃下温育1小时。通过流式细胞术评估细胞表面结合的程度。(B)收获稳定表达cyno CD38的CHO细胞,并且将细胞悬液与VivoTag645标记的抗体、SIA-AA-Cyno(抗Cyno CD38 mAb)、S3Y-AA-Cyno CD38(具有抗Cyno CD38 Fab的构建体13)、抗CD38 mAb、S3Y-AA-CD38(具有抗CD38Fab的构建体13)、IgG同种型对照和SIF1对照(不具有Fab区的Fc三聚体)在4℃下温育1小时。通过流式细胞术评估细胞表面结合的程度。注:抗Cyno CD38 mAb交叉反应性抗体(S1A-AA-Cyno)和S3Y-AA-Cyno识别人和食蟹猴两者的CD38。此外,S3Y-AA-Cyno CD38比S1A-AA-Cyno(抗Cyno CD38 mAb)更好地结合细胞表面CD38。
图27A至图27D描绘了Daudi细胞和Raji细胞中抗CD38构建体的CDC活性的评估结果。
图28A至图28B描绘了人全血中抗CD38构建体的肿瘤细胞杀伤的评估结果。抗CD38构建体13(S3Y-AA-CD38)在人全血中显示出高度有效的肿瘤细胞杀伤能力。(A)抗CD38 mAb和S3Y-AA-CD38在人全血中杀伤Daudi荧光素酶肿瘤细胞的效果。(B)抗CD38 mAb和S3Y-AA-CD38在人血中杀伤肿瘤细胞的效果。在(A)和(B)两者中,通过添加荧光素底物并在发光计上测量光发射来定量活Daudi荧光素酶细胞。通过用自发裂解对照(0%细胞裂解)(无抗体添加)和总裂解对照(100%细胞裂解)标准化测试样品的发光值来计算%细胞杀伤。表示出了来自3个单独的人供体的全血的肿瘤细胞杀伤EC50值的比较。值代表平均值±SD。
图29A至图29C描绘了食蟹猴血液中的内源性B细胞耗竭的评估结果。(A)SIA-AA-Cyno(抗Cyno CD38 mAb)、S3Y-AA-Cyno-011(具有Cyno CD38 Fab的构建体13)、IgG同种型对照和SIF1对照(不具有Fab区的Fc三聚体)与cyno B细胞的剂量依赖性结合。(B)cyno B细胞与SIA-AA-Cyno、S3Y-AA-Cyno-011(具有Cyno CD38 Fab的构建体13)、IgG同种型对照和SIF1对照(不具有Fab区的Fc三聚体)结合频率的剂量依赖性增加。(C)用SIA-AA-Cyno、S3Y-AA-Cyno-001(具有Cyno CD38 Fab的构建体13)、IgG同种型对照和SIF1对照(不具有Fab区的Fc三聚体)进行的B细胞耗竭的剂量依赖性增加。抗CD38构建体(S3Y-AA-CD38)处理相比抗CD38 mAb引起更大的细胞耗竭。在未处理的对照组中将值标准化为B细胞频率。(A,B,C)在这些图中绘制的值是从同一个猴供血者产生的。
图30描绘了抗CD38构建体在淋巴瘤皮下肿瘤模型中的影响的评估结果。给SCID小鼠皮下接种人淋巴瘤(Raji)肿瘤细胞。肿瘤细胞植入后六天,将小鼠随机分为多个治疗组(每组n=10)并用0.5mL正常人血清补体(HSC)进行腹膜内治疗。第二天(第7天),再次向小鼠腹膜内注射HSC,然后注射抗CD38 mAb(单次iv剂量为5.94mg/kg)或S3Y-AA-CD38(单次iv剂量为10mg/kg)或PBS(单次IV注射)。第8天,第3次向小鼠腹膜内注射HSC。通过肿瘤体积测量常规监测肿瘤生长。相对于对应的治疗组,S3Y-AA-CD38组中用**标记的点的p值<0.0022。
图31A描绘了S3Y-AA-CD38(倒三角形)和抗CD38 mAb(圆形)在Daudi细胞中的ADCC、ADCP和CDC活性的比较结果。
图31B描绘了S3Y-AA-CD38(倒三角形)和抗CD38 mAb(圆形)对Raji肿瘤细胞(对抗CD38 mAb介导的CDC有抗性)的ADCC、ADCP(使用报告基因作为巨噬细胞进行吞噬作用的替代物测量)和CDC活性的比较结果。
图32描绘了S3Y-AA-CD38(倒三角形)和抗CD38 mAb(圆形)从人全血中耗竭肿瘤细胞的研究结果。
图33描绘了Daudi细胞中(左侧小图,相对高的CD38表达以及相对低的CD55和CD59表达)和Raji细胞中(右侧小图,相对低的CD38表达以及相对高的CD55和CD59表达)补体介导的S3Y-AA-CD38(倒三角形)和抗CD38 mAb(圆形)细胞毒性的研究结果。
图34A描绘了S3Y-AA-Cyno CD38(倒三角形)和抗cyno CD38 mAb(圆形)的ADCC活性(左侧小图)和CDC活性(右侧小图)的研究结果。
图34B描绘了S3Y-AA-Cyno CD38(倒三角形)和抗cyno CD38 mAb(圆形)的ADCC活性(左侧小图)、ADCP活性(中央小图)和CDC活性(右侧小图)的研究结果。使用对抗CD38 mAb介导的CDC有抗性的Raji细胞测量CDC活性。
图35描绘了S3Y-AA-Cyno CD38(倒三角形)和抗Cyno CD38 mAb(圆形)耗竭肿瘤细胞的研究结果。
图36描绘了比较S3Y-AA-Cyno CD38(每个对中的第二条柱)和抗cyno CD38 mAb(每个对中的第一条柱)在体外(左侧小图)和体内(右侧小图)耗竭B细胞的研究结果。
图37描绘了比较S3Y-AA-CD38(倒三角形)和抗CD38 mAb(圆形)在体外耗竭浆细胞的研究结果。来自多发性骨髓瘤患者MM536的总骨髓单核细胞(BM-MNC)内抗CD38 mAb或S3Y-AA-CD38耗竭浆细胞的百分比。将耗竭计算为每种浓度下相对于未处理的BM-MNC的基线值的活CD138+细胞总数。
图38A描绘了表明S3Y-AA-CD38与FcgRIIa、FcgRIIIa和补体的结合为抗CD38 mAb的至少100倍的研究结果。
图38B描绘了表明S3Y-AA-CD38与FcγRIIA、FcγRIIIA的结合比抗CD38 mAb增强超过500倍而S3Y-AA-CD38调理过的肿瘤细胞与人补体蛋白C1q的结合比抗CD38 mAb增强12倍的研究结果。
图39描绘了各种构建体对食蟹猴中B细胞计数的影响的分析结果。
图40A至图40B是包含三个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体的示意图。(A)该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体,这些Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体以及N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域串联连接。第三多肽和第四多肽包含含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域与每个VH结构域接合。R292P突变(由菱形表示)已被引入所有六个CH2结构域中。这六个CH2结构域是三个Fc结构域的一部分,由四个组分多肽组装而成。S3Y-CD38(CC R292P)是该构建体的一个示例。(B)是包含三个Fc结构域和两个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体(构建体14)的示意图。该构建体由四个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体,这些Fc结构域单体通过间隔区与含突起的Fc结构域单体串联连接。第三多肽和第四多肽各自包含含空腔的Fc结构域单体,这些Fc结构域单体与N末端处包含VH结构域的CD38结合结构域串联接合。包含VL的结构域与每个VH结构域接合。R292P突变(由菱形表示)已被引入所有六个CH2结构域中。这六个CH2结构域是三个Fc结构域的一部分,由四个组分多肽组装而成。
图41描绘了通过SPR测量的人CD38与抗CD38抗体和SIF抗体结合的分析结果。抗CD38分子的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在左侧,Y轴是反应百分比,X轴是时间(500s和1000s)。动力学常数和平衡常数显示在中央和右上方。人CD38与抗CD38分子结合的化学计量显示在右下方。
图42描绘了通过SPR测量的人CD38与食蟹猴CD38抗体和SIF抗体结合的分析结果。cyno-CD38分子的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在左侧。动力学常数和平衡常数显示在中央和右上方。人CD38与cyno-CD38分子结合的化学计量显示在右下方。
图43描绘了通过SPR测量的食蟹猴CD38与cyno-CD38抗体、cyno-CD38 SIF抗体和CD38 mAb结合的分析结果。cyno-CD38分子的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在左侧小图和中央下部小图上。CD38 mAb的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在中央上部小图上。平衡常数显示在右侧小图上。
图44描绘了使用Fc-γ受体均相时间分辨荧光(HTRF)测定进行的S3Y-AA-CD38和S3Y-CC-CD38与人FcgR的结合相对于CD38 mAb的分析结果。
图45描绘了各种细胞系上的CD38表达的分析结果。
图46描绘了抗CD38 mAb和S3Y-CC-CD38分子与(A)Daudi细胞和(B)Raji细胞结合的分析结果。
图47A至图47B描绘了抗CD38 mAb抗性细胞中S3Y-CC-CD38对靶细胞耗竭的作用的分析结果。将Daudi细胞(A)或Raji细胞(B)与人血清补体和S3Y-CC-CD38或S3Y-CC-CD38或抗CD38 mAb在96孔板中在37℃下温育2小时,以促进补体介导的裂解。然后将阿尔玛蓝(细胞活力试剂)添加到每个孔中并在37℃下温育18小时,使用荧光计测量活细胞荧光。%细胞裂解=(RFU测试-RFU背景)×100(总细胞裂解时的RFU-RFU背景)。值代表平均值±SD(n=3)。
图48A至图48B描绘了S3Y-CC-CD38A的溶细胞活性的分析结果。(A)将原代人NK细胞以5:1的比率添加到96孔板中的Daudi肿瘤细胞中。然后将细胞混合物与药物分子中的任一种在37℃下温育5小时,接着通过CytoTox Glo试剂检测死细胞。(B)将纯化自人PBMC的单核细胞在M-CSF中培养,然后在37℃下与IL-10一起培养,以产生M2c巨噬细胞。然后将pHrodo Red标记的Raji细胞添加到含有巨噬细胞单层的96孔板中,接着在IncuCyte活细胞成像系统中与药物分子和IL-10在37℃下温育过夜。巨噬细胞对pHrodo Red标记的肿瘤细胞的吞噬作用导致实时成像捕获的pHrodo荧光增加。A、B中的值代表平均值±SD(n=3)。
图49描绘了S3Y-CC-CD38A在全血中耗竭肿瘤细胞的分析结果。将用CFSE标记的Daudi(A)和Raji(B)淋巴瘤细胞添加到全血中,并且在抗CD38A mAb或S3Y-CC-CD38或S3Y-AA-CD38存在下在37℃下温育18小时。裂解RBC,然后对细胞进行表面标记物染色,固定,并且在流式细胞仪上采集。当与没有药物处理相比时,在药物分子存在下CFSE+(Daudi或Raji)细胞的频率降低是选择性细胞耗竭的指示。值代表平均值±SD。
图50描绘了S3Y-CC-CD38和S3Y-AA-CD38对来自患者活检物的浆细胞的影响的分析结果。通过IMWG标准从临床诊断为多发性骨髓瘤(MM)的患者收集骨髓(BM)活检物。在来自患者的自体血浆存在下,用药物分子(S3Y和Darzalex)处理从患者收集的新鲜骨髓抽吸物,在CO2培养箱中维持37℃的天然微环境3小时。然后将样品染色,并且通过流式细胞术分析CD138+细胞的耗竭(用作表达CD38的浆细胞/骨髓瘤细胞的替代标记物)。使用总单细胞中的活CD138+细胞频率测定细胞耗竭,所有相对细胞频率被标准化为使用细胞计数作为因变量进行的先前拟合的基础参数。每种药物的顶部渐近线用作基线(设为100%活浆细胞)。
图51描绘了S3Y-CC-Cyno-CD38、S3Y-AA-Cyno-CD38和抗Cyno-CD38 mAb与人淋巴瘤细胞系上的细胞表面CD38的结合的分析结果。将Daudi或Raji细胞与VivoTag 645标记的S3Y或CD38 mAb在4℃下温育40分钟。然后洗涤细胞,固定,并在Cytek Aurora流式细胞仪上获取单细胞事件。使用SpectroFlo分析数据,其间数据不混合,然后在FlowJo上分析。值代表平均值±SD。
图52描绘了S3Y-CC-Cyno-CD38和抗Cyno-CD38对Fc效应子功能的作用的分析结果。(A)将Daudi细胞与人血清补体和S3Y或CD38 mAb在96孔板中在37℃下温育2小时,以促进补体介导的裂解。然后将阿尔玛蓝(细胞活力试剂)添加到每个孔中并在37℃下温育18小时,使用荧光计测量活细胞荧光。%细胞裂解=(RFU测试-RFU背景)×100(总细胞裂解时的RFU-RFU背景)。值代表平均值±SD(n=3)。(B)将原代人NK细胞以5:1的比率添加到96孔板中的Daudi肿瘤细胞中。然后将细胞混合物与药物分子中的任一种在37℃下温育5小时,接着通过CytoTox Glo试剂检测死细胞。(C)将纯化自人PBMC的单核细胞在M-CSF中培养,然后在37℃下与IL-10一起培养,以产生M2c巨噬细胞。然后将pHrodo Red标记的Raji细胞添加到含有巨噬细胞单层的96孔板中,接着在IncuCyte活细胞成像系统中与药物分子和IL-10在37℃下温育过夜。巨噬细胞对pHrodo Red标记的肿瘤细胞的吞噬作用导致实时成像捕获的pHrodo荧光增加。A、B、C中的值代表平均值±SD(n=3)。
图53描绘了单剂量PK研究的结果。该图显示了食蟹猴(n=4只/组)单次IV施用后指定药物分子的血清浓度。值代表平均值±SEM。
图54描绘了单剂量研究的结果。该图显示了用一个剂量的S3Y-AA-Cyno-CD38(1.7mg/kg)、3剂量组的S3Y-CC-Cyno-CD38(0.51mg/Kg、1.7mg/Kg、5.1mg/Kg)或1摩尔当量剂量的抗Cyno-CD38-mAb(1.0mg/Kg)或盐水(对照)处理一次后血液中的B细胞变化。绘制静脉内输注后组中每只猴的外周血中CD3-CD20+B细胞的绝对细胞计数相对于给药前基线的变化百分比。值代表平均值±SEM。
图55A至图55B描绘了多重复剂量研究的结果。(A)该图显示了每周用单剂量的S3Y-CC-Cyno-CD38处理后血液中的B细胞变化。绘制静脉内输注后组中每只猴的外周血中CD3-CD20+B细胞的绝对细胞计数相对于给药前基线的变化百分比。值代表平均值±SEM。(B)在每周给药一次,共给药4次S3Y-CC-Cyno-CD38后,在终末尸检前收集组织。从骨髓和脾产生单细胞悬液,并且通过流式细胞术测定CD138+浆细胞计数。值代表平均值±SD。
图56A至图56B描绘了在食蟹猴中皮下注射S3Y-CC-Cyno-CD38的分析结果。为了评价生物利用率,将S3Y-CC-Cyno-CD38静脉内或通过皮下注射作为单剂量施用于食蟹猴。(A)该图显示了食蟹猴(n=4只/组)单次IV或SC施用后S3Y-CC-Cyno-CD38的血清浓度。值代表平均值±SEM。(B)该图显示了用S3Y-CC-Cyno-CD38进行一次处理后血液中的B细胞变化。绘制静脉内输注后组中每只猴的外周血中CD3-CD20+B细胞的绝对细胞计数相对于给药前基线的变化百分比。值代表平均值±SEM。
具体实施方式
许多治疗性抗体通过Fc结构域的效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC))募集先天免疫系统的元件而发挥作用。在一些情况下,本公开设想将已知的含单个Fc结构域的治疗剂(例如,已知的治疗性抗体)的CD38结合结构域与至少两个Fc结构域组合,以产生具有独特生物活性的新型治疗剂。在一些情况下,本文所公开的新型治疗剂具有比已知的含Fc结构域的治疗剂(例如,已知的治疗性抗体)更大的生物活性。至少两个Fc结构域的存在可以增强效应子功能并且激活多种效应子功能,诸如ADCC结合ADCP和/或CDC,从而提高治疗性分子的功效。为了产生具有一致生物功能的产物,控制Fc结构域的数量是至关重要的。本公开的特征在于一组Fc工程化工具,其用于控制编码Fc结构域的肽的同源二聚化和异源二聚化,以便由有限数量的多肽链组装离散大小的分子。国际公布号WO/2015/168643、WO2017/151971、WO 2017/205436和WO 2017/205434公开了用于组装具有两个或更多个Fc结构域的分子的Fc工程化工具和方法,并且全文以引用方式并入本文。这些工程化工具包括显著改善制造结果的结构特征(例如,甘氨酸接头)。这些构建体的特性允许有效产生基本上同质的药物组合物。为了确保药物组合物的安全性、功效、均匀性和可靠性,药物组合物中的这种同质性是期望的。在药物组合物中具有高度同质性还使由不需要的材料(例如,降解产物和/或聚集产物或多聚体)引起的药物产品的潜在聚集或降解降到最低,以及限制由不需要的材料引起的脱靶效应和不良副作用。
如本文详细描述的,我们通过使用以下方法来工程化Fc抗原结合结构域构建体的Fc结构域组分,改善了该组合物的同质性,所述方法包括:使用仅包含甘氨酸残基的间隔区串联接合两个Fc结构域单体,使用已移除末端赖氨酸残基的多肽序列,以及使用两组异源二聚化选择性模块:(i)具有不同反向电荷突变的异源二聚化选择性模块,以及(ii)具有工程化空腔和工程化突起的异源二聚化选择性模块。
我们使用一条包含多个被接头分开的Fc序列的长肽链以及包含单个Fc序列的短链的多个拷贝设计了一系列其中Fc结构域串联连接的Fc抗原结合结构域构建体(Fc抗原结合结构域构建体1至6;图1至图6)。将异源二聚化突变引入每个Fc序列中,以确保组装成所需的串联构型,而最小化形成较小或较大的复合物。能够以这种方式串联连接任意数量的Fc结构域,从而允许创建具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个Fc结构域的构建体。对于具有N个Fc结构域的肽,可以将此类构建体制备成具有1个至N+1个CD38结合结构域,这分别取决于是将CD38结合结构域引入长肽链中、短肽链中,还是两者中。
在Fc抗原结合结构域构建体1至6(图1至图6)中,Fc结构域与所述Fc结构域之间的单个分支点连接。这些构建体包括包含多个被接头分开的Fc序列的长肽链的两个拷贝,其中分支Fc序列包含同源二聚化突变,并且非分支Fc结构域包含异源二聚化突变。包含单个Fc序列且具有与长链中的异源二聚化突变互补的突变的短链的多个拷贝用于完成多聚体Fc支架。异源二聚化Fc结构域可以与以下各项连接:C末端(例如,Fc抗原结合结构域构建体7至12;图7至图12)、N末端(例如,Fc抗原结合结构域构建体13至18;图13至图18),或者分支Fc结构域的两端(例如,Fc抗原结合结构域构建体19至21;图19至图21)。串联的多个Fc结构域可以与分支Fc结构域的任一端连接。可以将CD38结合结构域引入长肽链中,使得每个组装蛋白质分子有两个CD38结合结构域。替代性地,可以将CD38结合结构域引入短肽链中,使得每个组装蛋白质分子有N-1个CD38结合结构域,其中N是组装蛋白质分子中Fc结构域的数量。如果将CD38结合结构域引入短肽链和长肽链两者中,则所得的组装蛋白质分子包含N+1个CD38结合结构域。
过去针对单克隆抗体(mAb)和Fc结构域进行的工程化工作包括在Fc结构域中进行突变以增强与FcγRIIIa的结合,从而增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)反应,以及对Fc结构域进行无岩藻糖基化以增强与FcγRIIIa的结合,从而增强ADCC反应。
本公开中所公开的Fc抗原结合结构域构建体与具有Fc结构域中的突变以增强与FcγRIIIa的结合或者具有Fc结构域的无岩藻糖基化的抗体相比,出乎意料地具有以下特征:与多种类型的Fcγ受体的结合更强,以及多种细胞毒性途径的活性增强。本公开的Fc抗原结合结构域构建体与它们对应的岩藻糖基化和无岩藻糖基化亲本单克隆抗体相比,可以增强与FcγRIIa和FcγRIIIa两者的结合(参见实施例46)。另外,本公开的Fc抗原结合结构域构建体除了增强ADCC途径响应之外,出乎意料地能够介导补体依赖性细胞毒性(CDC)途径和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)途径(参见实施例47)。
I.Fc结构域单体
Fc结构域单体包括铰链结构域、CH2抗体恒定结构域和CH3抗体恒定结构域(例如,人IgG1铰链、CH2抗体恒定结构域,以及具有任选氨基酸置换的CH3抗体恒定结构域)的至少一部分。Fc结构域单体可以是免疫球蛋白抗体同种型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。Fc结构域单体还可以是任何免疫球蛋白抗体同种型(例如,IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。Fc结构域单体还可以是杂合体,例如,具有来自IgG1的铰链和CH2以及来自IgA的CH3,或者具有来自IgG1的铰链和CH2以及来自IgG3的CH3。Fc结构域单体的二聚体是可以结合Fc受体(例如,FcγRIIIa,一种位于白细胞表面上的受体)的Fc结构域(本文进一步定义)。在本公开中,Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域可以在CH3-CH3抗体恒定结构域的界面处含有氨基酸置换,以促进它们彼此的缔合。在其他实施方案中,Fc结构域单体包括附接到N末端或C末端的附加部分,例如白蛋白结合肽或纯化肽。在本公开中,Fc结构域单体不含有任何类型的抗体可变区,例如VH、VL、互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。
在一些实施方案中,本文所述的Fc抗原结合结构域构建体(例如,具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可以具有与SEQ ID NO:42的序列至少95%相同(至少97%、99%或99.5%相同)的序列。在一些实施方案中,本文所述的Fc抗原结合结构域构建体(例如,具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可以具有与SEQ ID NO:44、46、48和50至53中任一者的序列至少95%相同(至少97%、99%或99.5%相同)的序列。在某些实施方案中,该Fc抗原结合结构域构建体中的Fc结构域单体可以具有与SEQ ID NO:48、52和53中任一者的序列至少95%相同(至少97%、99%或99.5%相同)的序列。
SEQ ID NO:42DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:44DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:46DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:48DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:50DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:51DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:52DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:53DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
II.Fc结构域
如本文所定义,Fc结构域包括两个Fc结构域单体,它们通过CH3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化。Fc结构域形成与Fc受体(例如,Fc-γ受体(即Fcγ受体(FcγR))、Fc-α受体(即Fcα受体(FcαR))、Fc-ε受体(即Fcε受体(FcεR))和/或新生儿Fc受体(FcRn))结合的最小结构。在一些实施方案中,本公开的Fc结构域与Fcγ受体(例如,FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b))和/或FcγRIV和/或新生儿Fc受体(FcRn)结合。
III.CD38结合结构域
抗原结合结构域包括特异性结合靶分子的一种或多种肽或者多肽。CD38结合结构域可以包括抗体的CD38结合结构域。在一些实施方案中,CD38结合结构域可以是抗体或抗体构建体的片段,例如,抗体的与靶抗原结合的最小部分。CD38结合结构域还可以是特异性结合靶标的合成工程化肽,诸如基于纤连蛋白的结合蛋白(例如,FN3单体)。
片段抗原结合(Fab)片段是抗体上与靶抗原结合的区域。它由重链和轻链中每一者的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。Fab片段包括VH结构域、VL结构域、CH1结构域和CL结构域。可变结构域VH和VL各自在单体的氨基末端处包含一组3个互补决定区(CDR)。该Fab片段可以是免疫球蛋白抗体同种型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。该Fab片段单体还可以是任何免疫球蛋白抗体同种型(例如,IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。在一些实施方案中,在对免疫球蛋白进行蛋白酶(例如,胃蛋白酶)处理之后,Fab片段可以共价附接到第二相同的Fab片段,从而形成F(ab’)2片段。在一些实施方案中,该Fab可以表达为单个多肽,该单个多肽包括例如与结构域之间的接头融合的可变结构域和恒定结构域两者。
在一些实施方案中,可以仅使用Fab片段的一部分作为CD38结合结构域。在一些实施方案中,可以仅使用Fab的轻链组分(VL+CL),或者可以仅使用Fab的重链组分(VH+CH)。在一些实施方案中,可以使用单链可变片段(scFv),该单链可变片段是Fab可变区的VH链和VL链的融合蛋白。在其他实施方案中,可以使用线性抗体,该线性抗体包括一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1),这对串联Fd区段连同互补轻链多肽一起形成一对CD38结合区。
在一些实施方案中,本公开的CD38结合结构域包括表1中列出的靶标或抗原,以及表1中针对所列出的靶标或抗原列出的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR序列,如下表1进一步详细提供。
表1:CDR序列
表2:VH序列和VL序列
Fc抗原结合结构域构建体1的CD38结合结构域(图1中的110/104)可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体2的CD38结合结构域(图2中的212/204)可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体3的CD38结合结构域(图3中的308/316和312/318)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体4的CD38结合结构域(图4中的410/412、416/418和422/424)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体5的CD38结合结构域(图5中的510/504、512/514和518/520)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体6的CD38结合结构域(图6中的612/604、614/616、620/622和626/628)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体7的CD38结合结构域(图7中的712/714和714/716)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体8的CD38结合结构域(图8中的812/806和818/822)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体9的CD38结合结构域(图9中的908/906、920/922、912/914和926/930)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体10的CD38结合结构域(图10中的1006/1004和1018/1020)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体11的CD38结合结构域(图11中的1112/1114、1122/1108、1128/1142和1138/1136)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体12的CD38结合结构域(图12中的1218/1220、1212/1214、1250/1208、1248/1246、1242/1240和1236/1234)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体13的CD38结合结构域(图13中的1310/1304和1314/1322)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体14的CD38结合结构域(图14中的1408/1406和1416/1424)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体15的CD38结合结构域(图15中的1508/1506、1514/1516、1532/1520和1530/1528)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体16的CD38结合结构域(图16中的1616/1604和1618/1630)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体17的CD38结合结构域(图17中的1712/1714、1724/1708、1726/1742和1738/1736)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体18的CD38结合结构域(图18中的1812/1814、1828/1808、1826/1824、1830/1832、1850/1848和1844/1842)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体19的CD38结合结构域(图19中的1914/1904和1920/1922)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体20的CD38结合结构域(图20中的2014/2016、2042/2008、2036/2034和2028/2026)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
Fc抗原结合结构域构建体21的CD38结合结构域(图21中的2114/2116、2150/2108、2148/2146、2138/2140、2136/2134和2128/2126)各自可以包括表1中列出的抗体中的任一种抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列。
IV.二聚化选择性模块
在本公开中,二聚化选择性模块包括Fc结构域单体内的组分或选择性氨基酸,所述组分或选择性氨基酸促进两个Fc结构域单体的优选配对以形成Fc结构域。具体地,二聚化选择性模块是Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的部分,该部分包括位于两个Fc结构域单体的相互作用的CH3抗体恒定结构域之间的界面处的氨基酸置换。在二聚化选择性模块中,由于针对氨基酸置换选择的氨基酸的相容性,那些置换使得两个CH3抗体恒定结构域的二聚化变得有利。有利的Fc结构域的最终形成选择性超过其他Fc结构域,所述其他Fc结构域由缺少二聚化选择性模块的Fc结构域单体形成,或者由在二聚化选择性模块中具有不相容的氨基酸置换的Fc结构域单体形成。这种类型的氨基酸置换可以使用本领域众所周知的常规分子克隆技术(诸如诱变)产生。
在一些实施方案中,二聚化选择性模块在CH3抗体恒定结构域中包括工程化空腔(或本文进一步描述的“臼”)。在其他实施方案中,二聚化选择性模块在CH3抗体恒定结构域中包括工程化突起(或本文进一步描述的“杵”)。为了选择性地形成Fc结构域,具有相容二聚化选择性模块的两个Fc结构域单体(例如,含有工程化空腔的一个CH3抗体恒定结构域和含有工程化突起的另一个CH3抗体恒定结构域)组合形成Fc结构域单体的突起-进入-空腔(或“杵臼”)对。工程化突起和工程化空腔是异源二聚化选择性模块的示例,它们可以在Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中产生,以便促进具有相容异源二聚化选择性模块的两个Fc结构域单体的有利异源二聚化。表3列出了合适的突变。
在其他实施方案中,通过使用具有包含带正电荷的氨基酸置换的二聚化选择性模块的Fc结构域单体和具有包含带负电荷的氨基酸置换的二聚化选择性模块的Fc结构域单体而实现的异源二聚化可以通过带电荷氨基酸的有利静电转向(本文进一步描述)选择性地组合形成Fc结构域。在一些实施方案中,Fc结构域单体可以包括以下带正电荷和带负电荷的氨基酸置换中的一者:K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439D和K439E。在一个示例中,包含带正电荷的氨基酸置换(例如,D356K或E357K)的Fc结构域单体和包含带负电荷的氨基酸置换(例如,K370D或K370E)的Fc结构域单体可以通过带电荷氨基酸的有利静电转向选择性地组合形成Fc结构域。在另一个示例中,包含E357K的Fc结构域单体和包含K370D的Fc结构域单体可以通过带电荷氨基酸的有利静电转向选择性地组合形成Fc结构域。在一些实施方案中,可以将反向电荷氨基酸置换用作异源二聚化选择性模块,其中包含不同但相容的反向电荷氨基酸置换的两个Fc结构域单体组合形成异源二聚体Fc结构域。表3列出了用于促进异源二聚化的各种带相反电荷的二聚化选择性模块。
除了杵臼突变和静电转向突变之外,还存在可以用于促进异源二聚化的附加类型的突变。这些突变也在表3中列出。
在其他实施方案中,两个Fc结构域单体包括在CH3结构域之间的界面处的带电荷残基环内至少两个位置中包含相同的反向电荷突变的同源二聚化选择性模块。同源二聚化选择性模块是促进Fc结构域单体的同源二聚化以形成同源二聚体Fc结构域的反向电荷氨基酸置换。通过逆转两个Fc结构域单体中的两个或更多个互补残基对的两个成员的电荷,突变的Fc结构域单体保持与相同突变序列的Fc结构域单体互补,但与不含那些突变的Fc结构域单体具有更低的互补性。在一个实施方案中,Fc结构域包括Fc结构域单体,其包括双重突变体K409D/D399K、K392D/D399K、E357K/K370E、D356K/K439D、K409E/D399K、K392E/D399K、E357K/K370D或D356K/K439E。在另一个实施方案中,Fc结构域包括Fc结构域单体,其包括组合任何一对双重突变体的四重突变体,例如K409D/D399K/E357K/K370E。表4A和表4B列出了促进同源二聚化的各种选择性。
在另外的实施方案中,含有(i)至少一个反向电荷突变和(ii)至少一个工程化空腔或至少一个工程化突起的Fc结构域单体可以与另一个含有(i)至少一个反向电荷突变和(ii)至少一个工程化突起或至少一个工程化空腔的Fc结构域单体选择性地组合形成Fc结构域。例如,含有反向电荷突变K370D和工程化空腔Y349C、T366S、L368A和Y407V的Fc结构域单体以及另一个含有反向电荷突变E357K和工程改化突起S354C和T366W的Fc结构域单体可以选择性地组合形成Fc结构域。
此类Fc结构域的形成通过CH3抗体恒定结构域中的相容氨基酸置换来促进。含有不相容氨基酸置换的两个二聚化选择性模块(例如,两者均含有工程化空腔、两者均含有工程化突起,或两者均在CH3-CH3界面处含有相同的带电荷氨基酸)不会促进异源二聚体Fc结构域的形成。
此外,用于促进具有明确的Fc结构域单体的Fc结构域的形成的其他方法包括但不限于:LUZ-Y方法(美国专利申请公开号WO2011034605),该方法包括使亮氨酸拉链的单体α–螺旋与每个Fc结构域单体进行C末端融合,以允许异源二聚体形成;以及链交换工程化结构域(SEED)主体方法(Davis等人,Protein Eng Des Sel.23:195-202,2010),该方法生成具有异源二聚体Fc结构域单体的Fc结构域,这些异源二聚体Fc结构域单体各自包括IgA和IgGCH3序列的交替区段。
V.工程化空腔和工程化突起
Carter和同事(Ridgway等人,Protein Eng.9:617-612,1996;Atwell等人,J MolBiol.270:26-35,1997;Merchant等人,Nat Biotechnol.16:677-681,1998)描述了工程化空腔和工程化突起(或“杵-进入-臼”策略)的用途。杵臼相互作用有利于异源二聚体形成,而杵-杵和臼-臼相互作用由于空间冲突和有利相互作用的缺失,阻碍同源二聚体形成。“杵-进入-臼”技术也在美国专利号5,731,168中公开。
在本公开中,工程化空腔和工程化突起用于制备本文所述的Fc抗原结合结构域构建体。工程化空腔是当用具有较小侧链体积的不同氨基酸替换蛋白质中的原始氨基酸时产生的空隙。工程化突起是当用具有较大侧链体积的不同氨基酸替换蛋白质中的原始氨基酸时产生的凸起。具体地,被替换的氨基酸位于Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中,并且涉及两个Fc结构域单体的二聚化。在一些实施方案中,产生一个CH3抗体恒定结构域中的工程化空腔,以容纳另一个CH3抗体恒定结构域中的工程化突起,使得两个CH3抗体恒定结构域均充当促进或有利于这两个Fc结构域单体的二聚化的二聚化选择性模块(例如,异源二聚化选择性模块)(上文描述)。在其他实施方案中,产生一个CH3抗体恒定结构域中的工程化空腔,以更好地容纳另一个CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸。在另外其他实施方案中,产生一个CH3抗体恒定结构域中的工程化突起,以与另一个CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸形成另外的相互作用。
可以通过用含有较小侧链的氨基酸(诸如丙氨酸、缬氨酸或苏氨酸)替换含有较大侧链的氨基酸(诸如酪氨酸或色氨酸)来构建工程化空腔。具体地,一些二聚化选择性模块(例如,异源二聚化选择性模块)(上文进一步描述)含有工程化空腔,诸如CH3抗体恒定结构域中的Y407V突变。类似地,可以通过用含有较大侧链的氨基酸替换含有较小侧链的氨基酸来构建工程化突起。具体地,一些二聚化选择性模块(例如,异源二聚化选择性模块)(上文进一步描述)含有工程化突起,诸如CH3抗体恒定结构域中的T366W突变。在本公开中,还将工程化空腔和工程化突起与CH3结构域间二硫键工程化组合,以增强异源二聚体形成。在一个示例中,含有工程化空腔Y349C、T366S、L368A和Y407V的Fc结构域单体可以与含有工程化突起S354C和T366W的另一个Fc结构域单体选择性地组合形成Fc结构域。在另一个示例中,含有添加有Y349C的工程化空腔的Fc结构域单体和含有添加有S354C的工程化突起的Fc结构域单体可以选择性地组合形成Fc结构域。与二硫键工程化或结构计算(混合HA-TF)组合的其他工程化空腔和工程化突起包括在表3中,但不限于此。
用不同的氨基酸残基替换CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸残基可以通过改变编码原始氨基酸残基的核酸来实现。可以被替换的原始氨基酸残基的数量上限是CH3抗体恒定结构域的界面中的残基总数,只要仍维持该界面处充分的相互作用。
将工程化空腔和工程化突起与静电转向组合
可以将静电转向与杵-进入-臼技术组合,以有利于例如两个不同多肽中的Fc结构域单体之间的异源二聚化作用。下文更详细描述的静电转向利用肽、蛋白质结构域和蛋白质中带相反电荷的氨基酸之间的有利静电相互作用来控制更高级蛋白质分子的形成。可以使用静电转向来促进同源二聚化或异源二聚化,可以将后者有效地与杵-进入-臼技术组合。在异源二聚化的情况下,将不同但相容的突变引入要异源二聚化的每个Fc结构域单体中。因此,可以修饰Fc结构域单体以包括以下带正电荷和带负电荷的氨基酸置换中的一者:D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439D和K439E。例如,一个Fc结构域单体(例如,具有空腔(Y349C、T366S、L368A和Y407V)的Fc结构域单体)还可以包括K370D突变,并且另一个Fc结构域单体(例如,具有突起(S354C和T366W)的Fc结构域单体)可以包括E357K。
更一般地,可以将以下任何空腔突变(或突变组合)与表3中的静电转向突变组合:Y407T、Y407A、F405A、Y407T、T394S、T394W:Y407A、T366W:T394S、T366S:L368A:Y407V:Y349C和S3364H:F405,并且可以将以下任何突起突变(或突变组合)与表3中的静电转向突变组合:T366Y、T366W、T394W、F405W、T366Y:F405A、T366W:Y407A、T366W:S354C和Y349T:T394F。
VI.静电转向
静电转向利用肽、蛋白质结构域和蛋白质中带相反电荷的氨基酸之间的有利静电相互作用来控制更高级蛋白质分子的形成。在美国专利申请公开号2014-0024111中公开了使用静电转向效应来改变抗体结构域的相互作用,从而在双特异性抗体的生成中减少同源二聚体形成且有利于异源二聚体形成的方法。
在本公开中,使用静电转向来控制Fc结构域单体的二聚化和Fc抗原结合结构域构建体的形成。具体地,为了使用静电转向来控制Fc结构域单体的二聚化,用带正电荷或带负电荷的氨基酸残基替换构成CH3-CH3界面的一个或多个氨基酸残基,使得相互作用取决于引入的具体带电荷氨基酸而变得在静电上有利或不利。在一些实施方案中,用带负电荷的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)替换界面中带正电荷的氨基酸(诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。在其他实施方案中,用带正电荷的氨基酸替换界面中带负电荷的氨基酸。可以将带电荷氨基酸引入相互作用的CH3抗体恒定结构域中的一者或两者。通过将带电荷氨基酸引入相互作用的CH3抗体恒定结构域,产生二聚化选择性模块(上文进一步描述),这些二聚化选择性模块可以选择性地形成Fc结构域单体的二聚体,如由来源于带电荷氨基酸之间的相互作用的静电转向效应所控制。
在一些实施方案中,为了产生包括反向电荷的二聚化选择性模块(该二聚化选择性模块可以选择性地形成Fc结构域单体的二聚体,如由静电转向效应所控制),可以通过异源二聚化或同源二聚化选择性地形成两个Fc结构域单体。
Fc结构域单体的异源二聚化
可以通过在两个Fc结构域单体中引入不同但相容的突变(诸如表3中包括的电荷残基对,但不限于此)来促进Fc结构域单体的异源二聚化。在一些实施方案中,Fc结构域单体可以包括以下带正电荷和带负电荷的氨基酸置换之一:D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439D和K439E。在一个示例中,包含带正电荷的氨基酸置换(例如,D356K或E357K)的Fc结构域单体和包含带负电荷的氨基酸置换(例如,K370D或K370E)的Fc结构域单体可以通过带电荷氨基酸的有利静电转向选择性地组合形成Fc结构域。在另一个示例中,包含E357K的Fc结构域单体和包含K370D的Fc结构域单体可以通过带电荷氨基酸的有利静电转向选择性地组合形成Fc结构域。
例如,在具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体中,这三个Fc结构域中的两个可以通过两个Fc结构域单体的异源二聚化形成,如通过静电转向效应所促进。“异源二聚体Fc结构域”是指通过两个Fc结构域单体的异源二聚化形成的Fc结构域,其中所述两个Fc结构域单体含有促进这两个Fc结构域单体的有利形成的不同反向电荷突变(异源二聚化选择性模块)(参见例如,表4A和表4B中的突变)。在具有三个Fc结构域(一个羧基末端“茎”Fc结构域和两个氨基末端“分支”Fc结构域)的Fc抗原结合结构域构建体中,每个氨基末端“分支”Fc结构域都可以是异源二聚体Fc结构域(也称为“分支异源二聚体Fc结构域”)(例如,由图1中的Fc结构域单体106和114或Fc结构域单体112和116形成的异源二聚体Fc结构域;由图2中的Fc结构域单体206和214或Fc结构域单体212和216形成的异源二聚体Fc结构域)。分支异源二聚体Fc结构域可以由含有E357K的Fc结构域单体和另一个含有K370D的Fc结构域单体形成。
表3.Fc异源二聚化方法
注意:所有残基均按EU编号方案(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85,1969)进行编号
Fc结构域单体的同源二聚化
可以通过以对称方式在两个Fc结构域单体中引入相同的静电转向突变(同源二聚化选择性模块)来促进Fc结构域单体的同源二聚化。在一些实施方案中,两个Fc结构域单体包括在CH3结构域之间的界面处的带电荷残基环内至少两个位置中包含相同的反向电荷突变的同源二聚化选择性模块。通过逆转两个Fc结构域单体中的两个或更多个互补残基对的两个成员的电荷,突变的Fc结构域单体保持与相同突变序列的Fc结构域单体互补,但与不含那些突变的Fc结构域单体具有更低的互补性。可以被引入Fc结构域单体中以促进其同源二聚化的静电转向突变在表4A和表4B中示出,但不限于此。在一个实施方案中,Fc结构域包括两个Fc结构域单体,每个单体均包括双重反向电荷突变体(表4A和表4B),例如K409D/D399K。在另一个实施方案中,Fc结构域包括两个Fc结构域单体,每个单体均包括四重反向电荷突变体(表4A和表4B),例如K409D/D399K/K370D/E357K。
例如,在具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体中,这三个Fc结构域中的一个可以通过两个Fc结构域单体的同源二聚化形成,如通过静电转向效应所促进。“同源二聚体Fc结构域”是指通过两个Fc结构域单体的同源二聚化形成的Fc结构域,其中所述两个Fc结构域单体含有相同的反向电荷突变(参见例如,表5和表6中的突变)。在具有三个Fc结构域(一个羧基末端“茎”Fc结构域和两个氨基末端“分支”Fc结构域)的Fc抗原结合结构域构建体中,羧基末端“茎”Fc结构域可以是同源二聚体Fc结构域(也称为“茎同源二聚体Fc结构域”)。茎同源二聚体Fc结构域可以由两个Fc结构域单体形成,每个单体均含有双重突变体K409D/D399K。
表4A.Fc同源二聚化方法—每条链中两个突变
表4B.Fc同源二聚化方法—每条链中四个突变
VII.接头
在本公开中,接头用于描述多肽或蛋白质结构域和/或缔合的非蛋白质部分之间的键合或连接。在一些实施方案中,接头是至少两个Fc结构域单体之间的键合或连接,由此,接头将第一Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的C末端与第二Fc结构域单体的铰链结构域的N末端连接,使得这两个Fc结构域单体彼此串联接合。在其他实施方案中,接头是Fc结构域单体与附接到其上的任何其他蛋白质结构域之间的键合。例如,接头可以将Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的C末端附接到白蛋白结合肽的N末端。
接头可以是简单的共价键(例如,肽键)、合成聚合物(例如,聚乙二醇(PEG)聚合物),或者由化学反应(例如,化学缀合)产生的任何种类的键。在接头是肽键的情况下,在一个蛋白质结构域的C末端处的羧酸基团可以在缩合反应中与另一个蛋白质结构域的N末端处的氨基反应,以形成肽键。具体地,肽键可以通过本领域众所周知的常规有机化学反应由合成手段形成,或者通过天然产生由宿主细胞形成,其中编码串联的两种蛋白质(例如,两个Fc结构域单体)的DNA序列的多核苷酸序列可以通过宿主细胞中的必需分子机器(例如,DNA聚合酶和核糖体)直接转录并翻译成编码这两种蛋白质的连续多肽。
在接头是合成聚合物(例如PEG聚合物)的情况下,该聚合物可以在每个末端处用反应性化学官能团官能化,以与在两种蛋白质的连接末端处的末端氨基酸反应。
在接头(除了上文提到的肽键之外)由化学反应制成的情况下,可以分别将化学官能团(例如,胺、羧酸、酯、叠氮化物,或本领域常用的其他官能团)合成地附接到一种蛋白质的C末端和另一种蛋白质的N末端。然后这两个官能团可以通过合成化学手段反应,以形成化学键,因此将两种蛋白质连接在一起。此类化学缀合程序对于本领域技术人员是常规的。
间隔区
在本公开中,两个Fc结构域单体之间的接头可以是包括3个至200个氨基酸(例如,3个至200个、3个至180个、3个至160个、3个至140个、3个至120个、3个至100个、3个至90个、3个至80个、3个至70个、3个至60个、3个至50个、3个至45个、3个至40个、3个至35个、3个至30个、3个至25个、3个至20个、3个至15个、3个至10个、3个至9个、3个至8个、3个至7个、3个至6个、3个至5个、3个至4个、4个至200个、5个至200个、6个至200个、7个至200个、8个至200个、9个至200个、10个至200个、15个至200个、20个至200个、25个至200个、30个至200个、35个至200个、40个至200个、45个至200个、50个至200个、60个至200个、70个至200个、80个至200个、90个至200个、100个至200个、120个至200个、140个至200个、160个至200个,或180个至200个氨基酸)的氨基酸间隔区。在一些实施方案中,两个Fc结构域单体之间的接头是含有至少12个氨基酸,诸如12个至200个氨基酸(例如,12个至200个、12个至180个、12个至160个、12个至140个、12个至120个、12个至100个、12个至90个、12个至80个、12个至70个、12个至60个、12个至50个、12个至40个、12个至30个、12个至20个、12个至19个、12个至18个、12个至17个、12个至16个、12个至15个、12个至14个,或12个至13个氨基酸)(例如,14个至200个、16个至200个、18个至200个、20个至200个、30个至200个、40个至200个、50个至200个、60个至200个、70个至200个、80个至200个、90个至200个、100个至200个、120个至200个、140个至200个、160个至200个、180个至200个,或190个至200个氨基酸)的氨基酸间隔区。在一些实施方案中,两个Fc结构域单体之间的接头是含有12个至30个氨基酸(例如,12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸)的氨基酸间隔区。合适的肽间隔区是本领域已知的,并且包括例如含有柔性氨基酸残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)的肽接头。在某些实施方案中,间隔区可以含有基序(例如多个或重复基序)GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:1)、GGSG(SEQ ID NO:2)或SGGG(SEQ ID NO:3)。在某些实施方案中,间隔区可以含有2个至12个氨基酸,包括基序GS,例如GS、GSGS(SEQID NO:4)、GSGSGS(SEQ ID NO:5)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:6)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:7)或GSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:8)。在某些其他实施方案中,间隔区可以含有3个至12个氨基酸,包括基序GGS,例如GGS、GGSGGS(SEQ ID NO:9)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO:10)和GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:11)。在另外其他实施方案中,间隔区可以含有4个至20个氨基酸,包括基序GGSG(SEQ ID NO:2),例如,GGSGGGSG(SEQ ID NO:12)、GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:13)、GGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:14),或GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:15)。在其他实施方案中,间隔区可以含有基序GGGGS(SEQ ID NO:1),例如GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)。在某些实施方案中,间隔区为SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中,两个Fc结构域单体之间的间隔区仅含有甘氨酸残基,例如至少4个甘氨酸残基(例如,4个至200个、4个至180个、4个至160个、4个至140个、4个至40个、4个至100个、4个至90个、4个至80个、4个至70个、4个至60个、4个至50个、4个至40个、4个至30个、4个至20个、4个至19个、4个至18个、4个至17个、4个至16个、4个至15个、4个至14个、4个至13个、4个至12个、4个至11个、4个至10个、4个至9个、4个至8个、4个至7个、4个至6个,或4个至5个甘氨酸残基)(例如,4个至200个、6个至200个、8个至200个、10个至200个、12个至200个、14个至200个、16个至200个、18个至200个、20个至200个、30个至200个、40个至200个、50个至200个、60个至200个、70个至200个、80个至200个、90个至200个、100个至200个、120个至200个、140个至200个、160个至200个、180个至200个,或190个至200个甘氨酸残基)。在某些实施方案中,间隔区具有4个至30个甘氨酸残基(例如,4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个甘氨酸残基)。在一些实施方案中,仅含有甘氨酸残基的间隔区可以不被糖基化(例如,O-连接糖基化,也称为O-糖基化),或者与例如含有一个或多个丝氨酸残基的间隔区(例如,SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18))相比,可以具有降低水平的糖基化(例如,降低水平的O-糖基化)(例如,降低水平的用聚糖(诸如木糖、甘露糖、唾液酸、岩藻糖(Fuc)和/或半乳糖(Gal)(例如,木糖))进行的O-糖基化)。
在一些实施方案中,仅含有甘氨酸残基的间隔区可以不被O-糖基化(例如,O-木糖基化),或者与例如含有一个或多个丝氨酸残基的间隔区(例如,SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18))相比,可以具有降低水平的O-糖基化(例如,降低水平的O-木糖基化)。
在一些实施方案中,仅含有甘氨酸残基的间隔区可以不经历蛋白水解,或者与例如含有一个或多个丝氨酸残基的间隔区(例如,SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18))相比,可以具有降低速率的蛋白水解。
在某些实施方案中,间隔区可以含有基序GGGG(SEQ ID NO:19),例如GGGGGGGG(SEQ ID NO:20)、GGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:21)、GGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:22)或GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:23)。在某些实施方案中,间隔区可以含有基序GGGGG(SEQ ID NO:24),例如GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:25)或GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:26)。在某些实施方案中,间隔区为GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:27)。
在其他实施方案中,间隔区还可以含有除甘氨酸和丝氨酸外的氨基酸,例如GENLYFQSGG(SEQ ID NO:28)、SACYCELS(SEQ ID NO:29)、RSIAT(SEQ ID NO:30)、RPACKIPNDLKQKVMNH(SEQ ID NO:31)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(SEQ IDNO:32)、AAANSSIDLISVPVDSR(SEQ ID NO:33)或GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(SEQ ID NO:34)。
在本公开中的某些实施方案中,使用12个或20个氨基酸的肽间隔区串联连接两个Fc结构域单体,所述12个和20个氨基酸的肽间隔区分别由序列GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:35)和SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18)组成。在其他实施方案中,可以使用由序列GGSGGGSGGGSGGGSGGS(SEQ ID NO:36)组成的18个氨基酸的肽间隔区。
在一些实施方案中,两个Fc结构域单体之间的间隔区可以具有与上文所述的SEQID NO:1至36中任一者的序列至少75%相同(例如,至少77%、79%、81%、83%、85%、87%、89%、91%、93%、95%、97%、99%或99.5%相同)的序列。在某些实施方案中,两个Fc结构域单体之间的间隔区可以具有与SEQ ID NO:17、18、26和27中任一者的序列至少80%相同(例如,至少82%、85%、87%、90%、92%、95%、97%、99%或99.5%相同)的序列。在某些实施方案中,两个Fc结构域单体之间的间隔区可以具有与SEQ ID NO:18或27的序列至少80%相同(例如,至少82%、85%、87%、90%、92%、95%、97%、99%或99.5%相同)的序列。
在某些实施方案中,Fc结构域单体的铰链的氨基末端与同一多肽中的Fc单体的羧基末端之间的接头(即,该接头将第一Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的C末端与第二Fc结构域单体的铰链结构域的N末端连接,使得这两个Fc结构域单体彼此串联接合)是具有3个或更多个氨基酸的间隔区(例如,3个至200个氨基酸(例如,3个至200个、3个至180个、3个至160个、3个至140个、3个至120个、3个至100个、3个至90个、3个至80个、3个至70个、3个至60个、3个至50个、3个至45个、3个至40个、3个至35个、3个至30个、3个至25个、3个至20个、3个至15个、3个至10个、3个至9个、3个至8个、3个至7个、3个至6个、3个至5个、3个至4个、4个至200个、5个至200个、6个至200个、7个至200个、8个至200个、9个至200个、10个至200个、15个至200个、20个至200个、25个至200个、30个至200个、35个至200个、40个至200个、45个至200个、50个至200个、60个至200个、70个至200个、80个至200个、90个至200个、100个至200个、120个至200个、140个至200个、160个至200个,或180个至200个氨基酸),或者含有至少12个氨基酸,诸如12个至200个氨基酸(例如,12个至200个、12个至180个、12个至160个、12个至140个、12个至120个、12个至100个、12个至90个、12个至80个、12个至70个、12个至60个、12个至50个、12个至40个、12个至30个、12个至20个、12个至19个、12个至18个、12个至17个、12个至16个、12个至15个、12个至14个,或12个至13个氨基酸)(例如14个至200个、16个至200个、18个至200个、20个至200个、30个至200个、40个至200个、50个至200个、60个至200个、70个至200个、80个至200个、90个至200个、100个至200个、120个至200个、140个至200个、160个至200个、180个至200个,或190个至200个氨基酸)的氨基酸间隔区)而不是共价键。
间隔区还可以存在于Fc结构域单体的铰链结构域的N末端与CD38结合结构域(例如,CD38重链结合结构域的CH1结构域,或者CD38轻链结合结构域的CL结构域)的羧基末端之间,使得这些结构域通过3个或更多个氨基酸的间隔区(例如,3个至200个氨基酸(例如,3个至200个、3个至180个、3个至160个、3个至140个、3个至120个、3个至100个、3个至90个、3个至80个、3个至70个、3个至60个、3个至50个、3个至45个、3个至40个、3个至35个、3个至30个、3个至25个、3个至20个、3个至15个、3个至10个、3个至9个、3个至8个、3个至7个、3个至6个、3个至5个、3个至4个、4个至200个、5个至200个、6个至200个、7个至200个、8个至200个、9个至200个、10个至200个、15个至200个、20个至200个、25个至200个、30个至200个、35个至200个、40个至200个、45个至200个、50个至200个、60个至200个、70个至200个、80个至200个、90个至200个、100个至200个、120个至200个、140个至200个、160个至200个,或180个至200个氨基酸)或者含有至少12个氨基酸,诸如12个至200个氨基酸(例如,12个至200个、12个至180个、12个至160个、12个至140个、12个至120个、12个至100个、12个至90个、12个至80个、12个至70个、12个至60个、12个至50个、12个至40个、12个至30个、12个至20个、12个至19个、12个至18个、12个至17个、12个至16个、12个至15个、12个至14个,或12个至13个氨基酸)(例如,14个至200个、16个至200个、18个至200个、20个至200个、30个至200个、40个至200个、50个至200个、60个至200个、70个至200个、80个至200个、90个至200个、100个至200个、120个至200个、140个至200个、160个至200个、180个至200个,或190个至200个氨基酸)的氨基酸间隔区)接合。
VIII.血清蛋白结合肽
与血清蛋白肽结合可以改善蛋白质药物的药代动力学,并且具体地,可以将本文所述的Fc抗原结合结构域构建体与血清蛋白结合肽融合。
作为一个示例,可以用于本文所述的方法和组合物中的白蛋白结合肽在本领域中是公知的。在一个实施方案中,白蛋白结合肽包括序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:37)。在一些实施方案中,白蛋白结合肽具有与SEQ ID NO:37的序列至少80%相同(例如,80%、90%或100%相同)的序列。
在本公开中,可以将白蛋白结合肽附接到Fc抗原结合结构域构建体中的某些多肽的N末端或C末端。在一个实施方案中,可以将白蛋白结合肽附接到包含CD38结合结构域的Fc构建体中的一个或多个多肽的C末端。在另一个实施方案中,可以将白蛋白结合肽融合到包含CD38结合结构域的Fc构建体中的编码串联连接的两个Fc结构域单体的多肽的C末端。在又一个实施方案中,可以将白蛋白结合肽附接到与编码串联连接的两个Fc结构域单体的多肽中的第二Fc结构域单体接合的Fc结构域单体(例如,图1中的Fc结构域单体114和116;图2中的Fc结构域单体214和216)的C末端。可以将白蛋白结合肽遗传融合到Fc抗原结合结构域构建体或者通过化学手段(例如,化学缀合)附接到Fc抗原结合结构域构建体。如果需要,可以在Fc抗原结合结构域构建体与白蛋白结合肽之间插入间隔区。不受理论束缚,预期在本公开的Fc抗原结合结构域构建体中包括白蛋白结合肽可以通过其与血清白蛋白结合而延长治疗性蛋白质的保留。
I.Fc抗原结合结构域构建体
一般来讲,本公开的特征在于具有2个至10个Fc结构域以及附接的一个或多个CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体。这些Fc结构域对于Fc受体(例如,FcγRIIIa)可以具有比单个野生型Fc结构域更高的结合亲和力和/或亲合力。本公开公开了工程化两个相互作用的CH3抗体恒定结构域的界面处的氨基酸的方法,使得Fc结构域的两个Fc结构域单体彼此选择性地形成二聚体,从而防止形成不需要的多聚体或聚集体。Fc抗原结合结构域构建体包括偶数数量的Fc结构域单体,其中每对Fc结构域单体形成Fc结构域。Fc抗原结合结构域构建体至少包括由四个Fc结构域单体和一个CD38结合结构域的二聚体形成的两个功能性Fc结构域。可以例如用接头、间隔区、肽键、化学键或化学部分将CD38结合结构域与Fc结构域接合。
这些Fc抗原结合结构域构建体能够以许多方式组装。这些Fc抗原结合结构域构建体可以由不对称串联Fc结构域组装而成(图1至图6)。这些Fc抗原结合结构域构建体可以由单分支的Fc结构域组装而成,其中分支点在N末端Fc结构域处(图7至图12)。这些Fc抗原结合结构域构建体可以由单分支的Fc结构域组装而成,其中分支点在C末端Fc结构域处(图13至图18)。这些Fc抗原结合结构域构建体可以由单分支的Fc结构域组装而成,其中分支点既不在N末端Fc结构域处,也不在C末端Fc结构域处(图19至图21)。
CD38结合结构域能够以许多方式与Fc抗原结合结构域构建体接合。可以将CD38结合结构域表示为Fc链的融合蛋白。可以将CD38结合Fab的重链组分表达为Fc链的融合蛋白,并且可以将轻链组分表达为单独的多肽(图50,小图A)。在一些实施方案中,将scFv用作CD38结合结构域。可以将scFv表达为长Fc链的融合蛋白(图50,小图B)。在一些实施方案中,单独表达重链组分和轻链组分,并且将其外源添加到Fc抗原结合结构域构建体中。在一些实施方案中,单独表达CD38结合结构域,稍后利用化学键将其与Fc抗原结合结构域构建体接合(图50,小图C)。
在一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个Fc多肽缺乏C末端赖氨酸残基。在一些实施方案中,Fc抗原结合结构域构建体中的所有Fc多肽缺乏C末端赖氨酸残基。在一些实施方案中,在Fc抗原结合结构域构建体中的一个或多个Fc多肽中不存在C末端赖氨酸可以改善Fc抗原结合结构域构建体(例如,具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体)的群体(例如,具有至少85%、90%、95%、98%或99%同质性的具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体的群体)的同质性。
在一些实施方案中,可以将本文所述的Fc抗原结合结构域构建体中的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽或第六多肽(例如,图1中的多肽102、112和114,图2中的多肽202、214、216和218,图3中的多肽302、320和322,图4中的多肽402、428、430和432,图5中的多肽502、524和526,图6中的多肽602、632、634和636,图7中的多肽702、708、722和724,图8中的多肽802、804、826和828,图9中的多肽902、904、934和936,图10中的多肽1002、1010、1012、1024、1026和1032,图11中的多肽1102、1104、1106、1144、1146和1148,图12中的多肽1202、1204、1206、1252、1254和1256,图13中的多肽1302、1306、1320和1324,图14中的多肽1402、1404、1426和1428,图15中的多肽1502、1504、1534和1536,图16中的多肽1602、1606、1608、1626、1628和1632,图17中的多肽1702、1704、1706、1744、1746和1748,图18中的多肽1802、1804、1806、1852、1854和1856,图19中的多肽1902、1906、1910、1924、1928和1932,图20中的多肽2002、2004、2006、2044、2046和2048,图21中的多肽2102、2104、2106、2152、2154和2156)中的一者或多者中的N末端Asp突变为Gln。
对于本文实施例中所述的示例性Fc抗原结合结构域构建体,Fc抗原结合结构域构建体1至21可以分别在杵亚基和臼亚基中包含E357K和K370D电荷对。
本文所述的示例性Fc抗原结合结构域构建体(例如,Fc抗原结合结构域构建体1至21)中的任何一种相对于具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体可以在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有增强的效应子功能,或者可以包括具有单个Fc结构域和CD38结合结构域的构建体未表现出的生物活性。
X.宿主细胞和蛋白质产生
在本公开中,宿主细胞是指包括从其对应的核酸表达本文所述多肽和构建体所需的必要细胞组分(例如,细胞器)的媒介物。核酸可以包括在核酸载体中,所述核酸载体可以通过本领域已知的常规技术(转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)引入宿主细胞中。宿主细胞可以是哺乳动物、细菌、真菌或昆虫起源。哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO(或CHO衍生的细胞株,例如CHO-K1、CHO-DXB11 CHO-DG44)、鼠宿主细胞(例如NS0、Sp2/0)、VERY、HEK(例如HEK293)、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。还可以选择宿主细胞,其调节蛋白质构建体的表达,或者以所需的特定方式修饰并加工蛋白质产物。不同的宿主细胞具有蛋白质产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统,以确保表达的蛋白质的正确修饰和加工。
为了从其对应的DNA质粒构建体表达和分泌蛋白质产物,可以用通过本领域已知的适当表达控制元件控制的DNA来转染或转化宿主细胞,所述表达控制元件包括启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点和选择性标记物。用于表达治疗性蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如,Paulina Balbas、Argelia Lorence(编辑),RecombinantGene Expression:Reviews and Protocols(Methods in Molecular Biology),HumanaPress;第2版,2004版(2004年7月20日);Vladimir Voynov和Justin A.Caravella(编辑),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press;第2版,2012版(2012年6月28日)。
XI.无岩藻糖基化
每个Fc单体在Asn 297处包括N-糖基化位点。聚糖能够以多种不同形式存在于给定的Fc单体上。在含有抗体或本文所述的抗原结合Fc构建体的组合物中,聚糖可以是非常异质的,并且存在的聚糖的性质尤其可以取决于用于产生抗体或抗原结合Fc构建体的细胞的类型、细胞的生长条件(包括生长培养基)和产生后纯化。在各种情况下,包含本文所述的构建体或多肽复合物或多肽的组合物被无岩藻糖基化至少某种程度。例如,至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或95%存在于该组合物中的聚糖(例如,Fc聚糖)缺乏岩藻糖残基。因此,5%至60%、5%至50%、5%至40%、10%至50%、10%至50%、10%至40%、20%至50%或20%至40%的聚糖缺乏岩藻糖残基。可以通过在1,3,4-三-O-乙酰基-2-脱氧基-2-氟-L-岩藻糖抑制剂存在下培养产生抗体的细胞来产生无岩藻糖基化至少某种程度的组合物。可以使用多种其他方法来产生本文所述的构建体和多肽的相对无岩藻糖基化形式,包括:在FUT8表达降低或不表达的细胞中表达(例如,通过敲除FUT8或用RNAi(siRNA、miRNA或shRNA)降低表达),以及在过表达β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GnT-III)的细胞中表达。
XII.纯化
可以通过蛋白质纯化领域中已知的任何方法来纯化Fc抗原结合结构域构建体,例如通过色谱法(例如,离子交换色谱法、亲和(例如,蛋白A亲和)色谱法和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度,或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。例如,可以通过适当选择并组合亲和柱(诸如蛋白A柱)与色谱柱、过滤、超滤、盐析和透析程序来分离和纯化Fc抗原结合结构域构建体(参见例如,Process Scale Purification of Antibodies,UweGottschalk(编辑),John Wiley&Sons,Inc.,2009;以及Subramanian(编辑)Antibodies-Volume I-Production and Purification,Kluwer Academic/Plenum Publishers,NewYork(2004))。
在一些情况下,可以将Fc抗原结合结构域构建体缀合到一种或多种纯化肽,以促进从例如全细胞裂解物混合物中纯化和分离该Fc抗原结合结构域构建体。在一些实施方案中,纯化肽与对该纯化肽具有特异性亲和力的另一个部分结合。在一些实施方案中,将与纯化肽特异性结合的此类部分附接到固体支持物,诸如基质、树脂或琼脂糖珠。可以与Fc抗原结合结构域构建体接合的纯化肽的示例包括但不限于六组氨酸肽、FLAG肽、myc肽和血凝素(HA)肽。六组氨酸肽(HHHHHH(SEQ ID NO:38))以微摩尔亲和力结合镍功能化的琼脂糖亲和柱。在一些实施方案中,FLAG肽包括序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:39)。在一些实施方案中,FLAG肽包括串联的整数倍的序列DYKDDDDK,例如3×DYKDDDDK。在一些实施方案中,myc肽包括序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:40)。在一些实施方案中,myc肽包括串联的整数倍的序列EQKLISEEDL,例如3×EQKLISEEDL。在一些实施方案中,HA肽包括序列YPYDVPDYA(SEQ IDNO:41)。在一些实施方案中,HA肽包括串联的整数倍的序列YPYDVPDYA,例如3×YPYDVPDYA。特异性地识别并结合FLAG、myc或HA纯化肽的抗体是本领域众所周知的,并且通常可商购获得。用这些抗体功能化的固体支持物(例如,基质、树脂或琼脂糖珠)可以用于纯化包括FLAG、myc或HA肽的Fc抗原结合结构域构建体。
对于Fc抗原结合结构域构建体,可以将蛋白A柱色谱法用作纯化过程。蛋白A配体通过Fc区与Fc抗原结合结构域构建体相互作用,使得蛋白A色谱法成为能够去除大部分宿主细胞蛋白的高选择性捕获过程。在本公开中,可以使用如实施例2中所述的蛋白A柱色谱法来纯化Fc抗原结合结构域构建体。
XIII.药物组合物/制备物
本公开的特征在于包括一种或多种本文所述的Fc抗原结合结构域构建体的药物组合物。在一个实施方案中,药物组合物包括在结构上相同或基本相同的基本上同质的Fc抗原结合结构域构建体群体。在各种示例中,药物组合物包括Fc抗原结合结构域构建体1至42中的任何一种的基本上同质的群体。
可以将本公开的治疗性蛋白质构建体(例如,本文所述的Fc抗原结合结构域构建体(例如,具有三个Fc结构域的Fc抗原结合结构域构建体))结合到药物组合物中。包括治疗性蛋白质的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法进行配制。该药物组合物能够以可注射制剂的形式肠胃外施用,所述可注射制剂包括在水或另一种药学上可接受的液体中的无菌溶液剂或混悬剂。例如,该药物组合物可以通过以下过程进行配制:将Fc抗原结合结构域构建体与药学上可接受的媒介物或介质(诸如无菌注射用水(WFI)、生理盐水、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、稀释剂、粘结剂、赋形剂)适当组合,随后以普遍接受的药学实践所需的单位剂量形式混合。药物制剂中包含的活性成分的量使得提供指定范围内的合适剂量。
用于注射的无菌组合物可根据常规的药学实践使用注射用蒸馏水作为媒介物来配制。例如,生理盐水或含有葡萄糖和其他补充剂(诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的等渗溶液可以用作注射用水溶液,任选与本领域普遍已知的合适的增溶剂(例如,醇诸如乙醇和多元醇诸如丙二醇或聚乙二醇)和非离子表面活性剂(诸如聚山梨醇酯80TM、HCO-50)等组合。用于治疗性蛋白质产物的配制方法是本领域已知的,参见例如,Banga(编辑)Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing and DeliverySystems(第2版),Taylor&Francis Group,CRC Press(2006)。
XIV.治疗方法和剂量
本文所述的Fc抗原结合结构域构建体可以用于治疗多种癌症(例如,血液恶性肿瘤和实体肿瘤)和自身免疫疾病。
癌症可以是对达雷木单抗或任何其他治疗性抗CD38单克隆抗体治疗有抗性的癌症。癌症可以选自:胃癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、NK细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、浆细胞白血病和多发性骨髓瘤。这些构建体还可以用于治疗:淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、Castleman病、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、意义未明的双克隆丙种球蛋白病、重链病、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤。在一些情况下,这些构建体可以用于通过免疫复合物介导的诱导预防性和/或治疗性疫苗效果来增强对癌细胞的免疫调节功能。
这些构建体还可以用于治疗:浆细胞恶液质或单克隆丙种球蛋白病,诸如:轻链沉积性疾病、膜增生性肾小球肾炎(MGRS)、自身免疫性溶血性贫血、Tempi综合症(毛细血管扩张-红细胞增多-单克隆丙种球蛋白病-肾周液集合-肺内分流)、类风湿性关节炎、红斑狼疮、POEMS综合征(多发性神经病变-器官肿大-内分泌病-单克隆血浆增生性障碍-皮肤)和巨球蛋白血症。
这些构建体可以用于治疗自身抗体介导的疾病,诸如:重症肌无力(MG)、MuSK-MG、心肌炎、Lambert Eaton肌无力综合征、神经性肌强直、视神经脊髓炎、嗜睡症、急性运动轴突性神经病、Guillain-Barré综合征、Fisher综合征、急性感觉性共济失调性神经病、副肿瘤僵人综合征、慢性神经病变、周围神经病变、急性播散性脑脊髓炎、多发性硬化症、Goodpasture综合征、膜性肾病、肾小球性肾炎、肺泡蛋白沉着症、CIPD、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、大疱性类天疱疮、妊娠性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、新生儿红斑狼疮、疱疹样皮炎、Graves病、Addison病、卵巢功能不全、自身免疫性睾丸炎、Sjogren病、自身免疫性胃炎、类风湿关节炎、SLE、干眼病、血管炎(急性)、心脏炎和抗体介导的排斥反应。
药物组合物以与剂量制剂相容的方式施用,并且以治疗有效的量施用,以引起症状的改善或纠正。药物组合物以多种剂型施用,例如静脉内剂型、皮下剂型、口服剂型(诸如可摄取溶液剂、药物释放胶囊剂)等等。用于各个受试者的适当剂量取决于治疗目标、施用途径和患者的状况。一般来讲,重组蛋白以1mg/kg至200mg/kg(例如1mg/kg至100mg/kg,例如20mg/kg至100mg/kg)给药。因此,医疗保健提供者将有必要根据需要定制并滴定剂量且修改施用途径,以获得最佳治疗效果。
除了治疗人类之外,这些构建体还可以用于治疗伴侣动物(诸如狗和猫),以及其他兽医对象。
XV.补体依赖性细胞毒性(CDC)
本公开中所述的Fc抗原结合结构域构建体能够激活各种Fc受体介导的效应子功能。免疫系统的一个组分是补体依赖性细胞毒性(CDC)系统,它是先天免疫系统的一部分,用于增强抗体和吞噬细胞清除外源病原体的能力。三种生化途径激活该补体系统:经典补体途径、替代性补体途径和凝集素途径,所有这些途径都需要一组复杂的激活和信号传导级联。
在经典补体途径中,IgG或IgM触发补体激活。C1q蛋白与抗原结合后与这些抗体结合,从而形成C1复合物。该复合物产生C1s酯酶,该酯酶将C4和C2蛋白裂解并激活为C4a和C4b以及C2a和C2b。然后,C2a和C4b片段形成称为C3转化酶的蛋白复合物,该蛋白复合物将C3裂解为C3a和C3b,从而使信号放大并形成膜攻击复合物。
本公开的Fc抗原结合结构域构建体能够通过免疫系统增强CDC活性。
可以通过使用比色测定来评价CDC,在该比色测定中,将Raji细胞(ATCC)用连续稀释的抗体、Fc抗原结合结构域构建体或IVIg包被。可以将人血清补体(Quidel)以25%v/v添加到所有孔中,并且在37℃下温育2小时。在添加WST-1细胞增殖试剂(Roche AppliedScience)后,可以将细胞在37℃下温育12小时。然后可以将板放置在振荡器上2分钟,并且可以测量450nm处的吸光度。
XVI.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
本公开的Fc抗原结合结构域构建体还能够通过免疫系统增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。ADCC是适应性免疫系统的一部分,在该系统中,抗体与外源病原体的表面抗原结合并靶向它们以致死亡。ADCC涉及通过抗体激活自然杀伤(NK)细胞。NK细胞表达Fc受体,这些受体与抗体(诸如IgG和IgM)的Fc部分结合。当抗体与病原体感染的靶细胞表面结合后,它们随后结合NK细胞并激活它们。NK细胞释放细胞因子(诸如IFN-γ)和蛋白质(诸如穿孔素和颗粒酶)。穿孔素是在钙存在下低聚的成孔溶细胞素。颗粒酶是在靶细胞中诱导程序性细胞死亡的丝氨酸蛋白酶。除NK细胞外,巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导ADCC。
可以使用发光测定来评价ADCC。将人原代NK效应细胞(Hemacare)解冻,并使其在淋巴细胞生长培养基-3(Lonza)中以5×105个/mL在37℃下静息过夜。第二天,收获人类淋巴母细胞系Raji靶细胞(ATCC CCL-86),将其重悬于测定培养基(无酚红RPMI,10%FBSΔ,GlutaMAXTM)中,并在37℃下在各种浓度的每种感兴趣探针存在下铺板30分钟。然后收获静息NK细胞,将其重悬于测定培养基中,并且添加到含有抗CD20包被的Raji细胞的板中。将板在37℃下温育6小时,其中效应物与靶细胞的最终比率为5:1(5×104个NK细胞:1×104个Raji细胞)。
使用CytoTox-GloTM细胞毒性测定试剂盒(Promega)来确定ADCC活性。CytoTox-GloTM测定使用发光肽底物来测量死细胞蛋白酶活性,该蛋白酶活性由已经丧失膜完整性的细胞(例如,裂解的Raji细胞)释放。温育6小时后,将制备的试剂(底物)添加到板的每个孔中,并在室温下置于定轨板振荡器上15分钟。使用PHERAstar F5读板仪(BMG Labtech)测量发光。从测试条件中减去对照条件(仅NK细胞+Raji细胞)的读数以消除背景后,分析数据。
XVII.抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)
本公开的Fc抗原结合结构域构建体还能够通过免疫系统增强抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。ADCP(也称为抗体调理作用)是吞噬细胞标记病原体摄入和清除的过程。吞噬细胞是通过摄入有害的外源病原体以及死亡或垂死的细胞来保护人体的细胞。该过程被病原体相关分子模式(PAMPS)激活,从而引起NF-κB激活。然后,调理素(诸如C3b)和抗体可以附接到靶标病原体上。当靶标被调理素包被时,Fc结构域经由其Fc受体吸引吞噬细胞。然后吞噬细胞将细胞吞噬,并且摄入物质的吞噬体与溶酶体融合。然后,随后的吞噬溶酶体以蛋白水解方式将细胞物质消化。
可以使用生物发光测定来评价ADCP。抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)是治疗性抗体的重要作用机制。ADCP可以由单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞经由FcγRIIa(CD32a)、FcγRI(CD64)和FcγRIIIa(CD16a)介导。所有三种受体都可以参与抗体识别、免疫受体聚簇和导致ADCP的信号传导事件;但是,阻断研究表明,FcγRIIa是参与该过程的主要Fcγ受体。
FcγRIIa-H ADCP报告基因生物测定是一种基于生物发光细胞的测定,可以用于测量抗体和具有Fc结构域(特异性地结合和激活FcγRIIa)的其他生物制剂的效力和稳定性。该测定由表达高亲和力人FcγRIIa-H变体的遗传工程化Jurkat T细胞系组成,该变体在氨基酸131处含有组氨酸(H)并且含有由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的荧光素酶报告基因。
当与靶细胞和相关抗体共培养时,FcγRIIa-H效应细胞结合抗体的Fc结构域,从而引起FcγRIIa信号传导和NFAT-RE介导的荧光素酶活性。检测生物发光信号并用荧光素酶测定和标准发光计进行定量。
实施例
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供完整的公开内容以及对如何执行、制备和评价本文所要求保护的方法和化合物的描述,并且这些实施例旨在仅仅是本公开的示例,并非旨在限制发明人视为其公开内容的范围。
实施例1.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体7的设计和纯化
蛋白质表达
Fc抗原结合结构域构建体被设计成提高折叠效率,以最小化不受控制的亚基缔合(不受控制的亚基缔合可能产生不需要的高分子量低聚体和多聚体),并且产生基本上同质(例如,至少85%、90%、95%、98%或99%同质)的用于药物用途的组合物。考虑到这些目标,如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体7(CD38)各自包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(抗CD38长Fc链(SEQ ID NO:ZZ1)的两个拷贝,以及短Fc链(SEQ ID NO:ZZ2)的两个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:ZZ3)的两个拷贝。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体7(CD38)),该Fc结构域单体具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化),并与电荷突变(K409D/D399K突变)Fc结构域单体(以促进同源二聚化)串联。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进源二聚化)的Fc结构域单体。还可以将抗CD38轻链表达为作为scFv的一部分与长Fc链的N末端融合。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。表7中的氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链(抗CD38),并且一个质粒编码短Fc链)。
表5.构建体7(CD38)序列
使用Poros MabCapture A(LifeTechnologies)柱,通过基于蛋白质A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质,然后通过离子交换色谱法进一步分级分离。将经纯化的样品浓缩至大约30mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
实施例2.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体13的设计和纯化
蛋白质表达
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体13(CD38)各自包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(抗CD38长Fc链(SEQ ID NO:ZZ中的任一者)的两个拷贝,以及短Fc链(SEQ ID NO:ZZ)的两个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:ZZ)的两个拷贝。长Fc链包含电荷突变(K409D/D399K突变)Fc结构域单体(以促进同源二聚化)和N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体13(CD38)),该Fc结构域单体与具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进源二聚化)的Fc结构域单体。抗CD38轻链以及抗CD38VH和CH1取自抗CD38单克隆抗体。具有该轻链以及抗CD38 VH和CH1的构建体用缩写CD38表示。可以使用取自与食蟹猴表达的CD38发生交叉反应的完全人单克隆抗体的抗CD38轻链以及抗CD38 VH和CH1来产生相关的构建体。这些构建体用缩写Cyno表示。还可以将CD38轻链表达为作为scFv的一部分与长Fc链的N末端融合。可以用抗CD38重链制备构建体13的其他版本,其中每个版本在长Fc链多肽的Fc结构域单体之间携带不同大小的甘氨酸间隔区(G4、G10、G15或G20接头)。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。以下构建体中的每一者的氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链(抗CD38),并且一个质粒编码短Fc链):
表6.构建体13(CD38)序列
使用Poros MabCapture A(LifeTechnologies)柱,通过基于蛋白A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质,然后将经纯化的样品浓缩至大约30mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
实施例3.Fc抗原结合结构域构建体1的设计和纯化
如下所述制备由不对称串联Fc结构域形成的无支链构建体。Fc抗原结合结构域构建体1(图1)包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(长Fc链,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含两个串联的Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起(以促进异源二聚化)。可以将CD38结合结构域表达为与长Fc链相同的氨基酸序列的一部分(例如,以形成scFv)。短Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔(以促进异源二聚化)。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。在该实施例中,以及在Fc抗原结合结构域构建体2至42的以下每个实施例中,细胞可以包含表达抗体可变轻链的第三质粒。
使用Poros MabCapture A(LifeTechnologies)柱,通过基于蛋白质A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。将捕获的Fc抗原结合结构域构建体用磷酸盐缓冲盐水(低盐洗涤液)洗涤,并用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱。洗脱物通过添加1M TRIS(pH7.4)快速中和,并且通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。使用Poros XS树脂(AppliedBiosciences),通过离子交换色谱法进一步分级分离蛋白质。用50mM MES(pH 6,缓冲液A)对柱进行预平衡,并且使用50mM MES、400mM氯化钠(pH 6,缓冲液B)作为洗脱缓冲液用步进梯度洗脱样品。在离子交换后,在切向流过滤系统上,使用10kDa截止聚醚砜(PES)膜滤筒将目标级分缓冲交换到PBS缓冲液中。将样品浓缩至大约30mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
将样品在95℃的Laemmli样品缓冲液(4%SDS,Bio-Rad)中变性10分钟。使样品在Criterion TGX无染色凝胶(4%至15%聚丙烯酰胺,Bio-Rad)上运行。通过紫外光照射或考马斯蓝染色对蛋白质条带进行可视化。通过ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad)对凝胶进行成像。使用Imagelab4.0.1软件(Bio-Rad)执行条带的定量。
实施例4.Fc抗原结合结构域构建体2的设计和纯化
如下所述制备由不对称串联Fc结构域形成的无支链构建体。Fc抗原结合结构域构建体2(图2)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链,以及短Fc链的三个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含三个与N末端处的CD38结合结构域串联的Fc结构域单体,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起。短Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例5.Fc抗原结合结构域构建体3的设计和纯化
如下所述制备由不对称串联Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体3(图3)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含两个串联的Fc结构域单体,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例6.Fc抗原结合结构域构建体4的设计和纯化
如下所述制备由不对称串联Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体4(图4)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链,以及短Fc链的三个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含三个串联的Fc结构域单体,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例7.Fc抗原结合结构域构建体5的设计和纯化
如下所述制备由不对称串联Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体5(图5)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含两个与N末端处的CD38结合结构域串联的Fc结构域单体,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例8.Fc抗原结合结构域构建体6的设计和纯化
如下所述制备由不对称串联Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体6(图6)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链,以及短Fc链的三个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含三个与N末端处的CD38结合结构域串联的Fc结构域单体,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例9.Fc抗原结合结构域构建体7的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体7(图7)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例10.Fc抗原结合结构域构建体8的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体8(图8)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例11.Fc抗原结合结构域构建体9的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体9(图9)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例12.Fc抗原结合结构域构建体10的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体10(图10)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含两个串联的Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例13.Fc抗原结合结构域构建体11的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体11(图11)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含两个串联的Fc结构域单体,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并在N末端处与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的抗原结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例14.Fc抗原结合结构域构建体12的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体12(图12)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含两个串联的Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,其中每个Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的抗原结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例15.Fc抗原结合结构域构建体13的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体13(图13)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变),并与具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例16.Fc抗原结合结构域构建体14的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体14(图14)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变),并在N末端处与具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例17.Fc抗原结合结构域构建体15的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体15(图15)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的两个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变),并与具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例18.Fc抗原结合结构域构建体16的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体16(图16)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变),并与各自具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的两个Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例19.Fc抗原结合结构域构建体17的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体17(图17)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变),并在N末端处与各自具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的两个Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例20.Fc抗原结合结构域构建体18的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体18(图18)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变),并与各自具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的两个Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例21.Fc抗原结合结构域构建体19的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点既不在N末端Fc结构域处也不在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体19(图19)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体和具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的另一个Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例22.Fc抗原结合结构域构建体20的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体20(图20)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并在N末端处与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体和具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的另一个Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例23.Fc抗原结合结构域构建体21的设计和纯化
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体21(图21)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝,以及短Fc链的四个拷贝)以及一个轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起,并与具有选自表4A或表4B的反向电荷突变(例如,K409D/D399K突变)的Fc结构域单体、具有通过引入选自表3的至少一个突起形成突变(例如,S354C和T366W突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,E357K)而产生的工程化突起的另一个Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的CD38结合结构域,该Fc结构域单体具有通过引入选自表3的至少一个空腔形成突变(例如,Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选地选自表4A或表4B的一个或多个反向电荷突变(例如,K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。如实施例3中所述将表达的蛋白质纯化。
实施例24.Fc抗原结合结构域构建体对CDC、ADCP和ADCC的激活
使用三种测定来测试亲本mAb和各种Fc抗原结合结构域构建体对CDC、ADCP和ADCC途径的激活。创建了四个构建体,它们包含来自Gazyva(奥滨尤妥珠单抗)(抗CD20 mAb)的CDR。制备了岩藻糖基化和无岩藻糖基化抗CD20 mAb以及S3Y-AA-CD20(构建体13的结构,图13,如实施例2所述)和SAI-AA-CD20(构建体7的结构,图7,如实施例1所述)Fc抗原结合结构域构建体。
如下进行CDC测定。
1.抗CD20 CDC测定中使用的靶细胞是Raji细胞(ATCC CCL-86)。将Raji细胞(表达CD20的肿瘤细胞)以6×105个细胞/ml重悬于X-VIVO 15培养基中。然后将细胞以每孔100μl的体积(6×104个细胞/孔)转移到96孔平底测定板中。
2.将抗CD20 mAb和Fc抗原结合结构域构建体在X-VIVO 15培养基中稀释至3.33μM。然后在1.5ml聚丙烯管中用每种分子进行1:3连续稀释,得到11点稀释系列。
3.将这些分子的每种稀释液以50μl/孔转移到测定板上的适当孔中。转移到测定板后,立即将50μl正常人血清补体添加到每个孔中。
4.将测定板在37℃和5%CO2下温育2小时。温育2小时后,将20μl的WST-1增殖试剂添加到测定板的每个孔中。将该板放回到37℃、5%CO2的培养箱保持14小时。
5.温育14小时后,将板在板振荡器上振荡1分钟,并立即使用分光光度计以600nm校正在450nm处测定孔的吸光度。
在靶细胞是Raji的CDC测定中(图22,左侧小图),S3Y-AA-CD20(具有抗CD20 Fab的构建体13)能够介导细胞毒性,而其他构建体则不能。
如下进行ADCP测定:
FcγRIIa-H ADCP报告基因生物测定完整试剂盒(Promega,目录号G9901)是一种基于生物发光细胞的测定,可以用于测量抗体和具有Fc结构域(特异性地结合和激活FcγRIIa)的其他生物制剂的效力和稳定性。该测定由表达高亲和力人FcγRIIa-H变体的遗传工程化Jurkat T细胞系组成,该变体在氨基酸131处含有组氨酸(H)并且含有由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的荧光素酶报告基因。当与靶细胞和相关抗体共培养时,FcγRIIa-H效应细胞与抗体的Fc结构域结合后引起FcγRIIa信号传导和NFAT-RE介导的荧光素酶活性。使用Bio-GloTM荧光素酶测定系统和发光计检测并定量生物发光信号。将浓度递增的抗CD20mAb和构建体7(具有抗CD20 Fab)或构建体13(具有抗CD20 Fab)与Raji靶细胞和FcγRIIa-H效应细胞(比率为2:1)一起温育。在37℃下温育6小时后,添加Bio-GloTM试剂,并在PHERAstar FS仪器中测量发光。使用GraphPad Prism软件将数据拟合为4PL曲线(图22,中间小图)。S3I-AA-CD20构建体(具有抗CD20 Fab的构建体7)和S3Y-AA-CD20构建体(具有抗CD20 Fab的构建体13)均显示出相对于抗CD20 mAb增强的效力(EC50),超过后者的100倍。
如下进行ADCC测定:
将人原代NK效应细胞解冻,并使其在淋巴细胞生长培养基-3(Lonza)中以5×105个/mL在37℃下静息过夜。第二天,收获Raji细胞,将其重悬于测定培养基(无酚红RPMI,10%FBS,GlutaMAXTM)中,并在37℃下在各种浓度的每种感兴趣分子存在下铺板30分钟。然后收获静息NK细胞,将其重悬于测定培养基中,并且添加到含有抗CD20包被的Raji细胞的板中。将板在37℃下温育6小时,其中效应物与靶细胞的最终比率为5:1(5×104个NK细胞:1×104个Raji细胞)。
使用CytoTox-GloTM细胞毒性测定试剂盒(Promega)来确定ADCC活性。CytoTox-GloTM测定使用发光肽底物来测量死细胞蛋白酶活性,该蛋白酶活性由已经丧失膜完整性的细胞(例如,裂解的Raji细胞)释放。温育6小时后,将制备的试剂(底物)添加到板的每个孔中,并在室温下置于定轨板振荡器上15分钟。使用PHERAstar F5读板仪(BMG Labtech)测量发光。从测试条件中减去对照条件(仅NK细胞+Raji细胞)的读数以消除背景后,分析数据。(图47,右侧小图)。S3I构建体(具有抗CD20 Fab的构建体7)和S3Y构建体(具有抗CD20 Fab的构建体13)均显示出相对于岩藻糖基化mAb增强的细胞毒性,以及相对于无岩藻糖基化mAb相似的细胞毒性。
实施例25.用于表征Fc抗原结合结构域构建体的实验测定
肽和糖肽液相色谱-MS/MS
将蛋白质在6M胍(Sigma)中稀释至1μg/μL。添加二硫苏糖醇(DTT),使浓度为10mM,以在65℃的变性条件下还原二硫键30分钟。在冰上冷却后,将样品与30mM碘乙酰胺(IAM)一起在黑暗中温育1小时,以使游离硫醇烷基化(氨甲酰甲基化)。然后将蛋白质通过10kDa膜透析到25mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.8)中,以除去IAM、DTT和胍。在Barocycler(NEP 2320;Pressure Biosciences,Inc.)中用胰蛋白酶消化蛋白质。使压力在37℃下在20,000psi与环境压力之间循环,1小时内总共进行30次循环。在Ultimate 3000(Dionex)色谱系统和Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific)质谱仪上进行肽的LC-MS/MS分析。使用0.1%FA的水溶液和0.1%FA的乙腈溶液作为流动相,在BEH PepMap(Waters)柱上分离肽。基于双重荷电离子(z=2)m/z 842.5与±1.5Da的四极分离宽度,靶向单个木糖基化的接头肽。
完整的质谱分析
在由78.98%水、20%乙腈、1%甲酸(FA)和0.02%三氟乙酸组成的运行缓冲液中将蛋白质稀释至2μg/μL的浓度。尺寸排阻色谱法分离在串联的两个Zenix-C SEC-300(Sepax Technologies,Newark,DE)2.1mm×350mm上执行,总柱长度为700mm。使用上述运行缓冲液以80μL/min的流速从SEC柱中洗脱蛋白质。在以正模式操作的QSTAR Elite(AppliedBiosystems)Q-ToF质谱仪上获得质谱。通过对跨色谱峰的整个宽度的光谱求和,使用贝叶斯峰解卷积,将各个尺寸级分下的中性质量解卷积。
毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)测定
将样品稀释至1mg/mL,并与HT Protein Express变性缓冲液(PerkinElmer)混合。将混合物在40℃下温育20分钟。将样品用70μL水稀释并转移至96孔板。通过配备有HTProtein Express LabChip(PerkinElmer)的Caliper GXII仪器(PerkinElmer)分析样品。使用荧光强度来计算每种尺寸变体的相对丰度。
非还原SDS-PAGE
将样品在95℃的Laemmli样品缓冲液(4%SDS,Bio-Rad)中变性10分钟。使样品在Criterion TGX无染色凝胶(4%至15%聚丙烯酰胺,Bio-Rad)上运行。通过紫外光照射或考马斯蓝染色对蛋白质条带进行可视化。通过ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad)对凝胶进行成像。使用Imagelab 4.0.1软件(Bio-Rad)执行条带的定量。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
如之前在实施例24中所述对CDC进行评价。
实施例26.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体4的设计和纯化
蛋白质表达
如下所述制备由不对称串联Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体4(CD38)各自包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(长Fc链(SEQ ID NO:66),以及抗CD38Fc链(SEQ ID NO:68)的三个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:49)的三个拷贝。长Fc链包含三个串联的Fc结构域单体,其中每个Fc结构域单体具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化)。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进异源二聚化)的Fc结构域单体,以及N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体4(CD38))。还可以将CD38轻链表达为作为scFv的一部分与短Fc链的N末端融合。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。表7中每个构建体的以下氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链,并且一个质粒编码短Fc链(抗CD38)):
表7.构建体4(CD38)序列
使用Poros MabCapture A(Life Technologie)柱,通过基于蛋白质A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。将捕获的Fc抗原结合结构域构建体用磷酸盐缓冲盐水(低盐洗涤液)洗涤,并用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱。洗脱物通过添加1M TRIS(pH7.4)快速中和,并且通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。使用Poros XS树脂(AppliedBiosciences),通过离子交换色谱法进一步分级分离蛋白质。用50mM MES(pH 6,缓冲液A)对柱进行预平衡,并且使用50mM MES、400mM氯化钠(pH 6,缓冲液B)作为洗脱缓冲液用步进梯度洗脱样品。在离子交换后,在切向流过滤系统上,使用10kDa截止聚醚砜(PES)膜滤筒将目标级分缓冲交换到PBS缓冲液中。将样品浓缩至大约30mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
实施例27.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体8的设计和纯化
蛋白质表达
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体8(CD38)各自包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(长Fc链(SEQ ID NO:69)的两个拷贝,以及抗CD38短Fc链(SEQ ID NO:68)的两个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:49)的拷贝。长Fc链包含Fc结构域单体,该Fc结构域单体具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化),并与具有反向电荷突变K409D和D399K(以促进同源二聚化)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进异源二聚化)的Fc结构域单体,以及N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体8(CD38))。还可以将CD38轻链表达为作为scFv的一部分与短Fc链的N末端融合。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。表8中每个构建体的以下氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链,并且一个质粒编码短Fc链(抗CD38)):
表8.构建体8(CD38)序列
使用Poros MabCapture A(LifeTechnologies)柱,通过基于蛋白质A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。将捕获的Fc抗原结合结构域构建体用磷酸盐缓冲盐水(低盐洗涤液)洗涤,并用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱。洗脱物通过添加1M TRIS(pH7.4)快速中和,并且通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。使用Poros XS树脂(AppliedBiosciences),通过离子交换色谱法进一步分级分离蛋白质。用50mM MES(pH 6,缓冲液A)对柱进行预平衡,并且使用50mM MES、400mM氯化钠(pH 6,缓冲液B)作为洗脱缓冲液用步进梯度洗脱样品。在离子交换后,在切向流过滤系统上,使用10kDa截止聚醚砜(PES)膜滤筒将目标级分缓冲交换到PBS缓冲液中。将样品浓缩至大约30mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
实施例28.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体9的设计和纯化
蛋白质表达
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体9(CD38)包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(抗CD38长Fc链(SEQ ID NO:54)的两个拷贝,以及抗CD38短Fc链(SEQ ID NO:68)的两个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:49)的拷贝。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体9(CD38)),该Fc结构域单体具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化),并与具有反向电荷突变K409D和D399K(以促进同源二聚化)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进异源二聚化)的Fc结构域单体,以及N末端处的抗CD38重链(构建体9(CD38))。还可以将CD38轻链表达为作为scFv的一部分与长Fc链和/或短Fc链的N末端融合。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。表9中每个构建体的以下氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链(抗CD38),并且一个质粒编码短Fc链(抗CD38)):
表9.构建体9(CD38)序列
实施例29.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体10的设计和纯化
蛋白质表达
如下所述制备由其中分支点在N末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体10(CD38)各自分别包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(抗CD38长Fc链(SEQ ID NO:71)的两个拷贝),以及短Fc链(SEQ ID NO:63)的四个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:49)的拷贝。长Fc链包含两个串联的Fc结构域单体和N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体10(CD38)),其中每个Fc结构域单体具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化),并与具有反向电荷突变K409D和D399K(以促进同源二聚化)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进源二聚化)的Fc结构域单体。还可以将抗CD38轻链表达为作为scFv的一部分与长Fc链的N末端融合。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。表10中每个构建体的以下氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链(抗CD38),并且一个质粒编码短Fc链):
表10.构建体10(CD38)序列
使用Poros MabCapture A(LifeTechnologies)柱,通过基于蛋白质A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。将捕获的Fc抗原结合结构域构建体用磷酸盐缓冲盐水(低盐洗涤液)洗涤,并用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱。洗脱物通过添加1M TRIS(pH7.4)快速中和,并且通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。使用Poros XS树脂(AppliedBiosciences),通过离子交换色谱法进一步分级分离蛋白质。用50mM MES(pH 6,缓冲液A)对柱进行预平衡,并且使用50mM MES、400mM氯化钠(pH 6,缓冲液B)作为洗脱缓冲液用步进梯度洗脱样品。在离子交换后,在切向流过滤系统上,使用10kDa截止聚醚砜(PES)膜滤筒将目标级分缓冲交换到PBS缓冲液中。将样品浓缩至大约30mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
实施例30.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体16的设计和纯化
蛋白质表达
如下所述制备由其中分支点在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体16(CD38)各自分别包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(抗CD38长Fc链(SEQ ID NO:73)的两个拷贝),以及短Fc链(SEQ ID NO:63)的四个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:49)的三个拷贝。长Fc链包含具有反向电荷突变K409D和D399K(以促进同源二聚化)的Fc结构域单体和N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体10(CD38)),该Fc结构域单体与各自具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化)的两个串联的Fc结构域单体串联。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进源二聚化)的Fc结构域单体。还可以将抗CD38轻链表达为作为scFv的一部分与长Fc链的N末端融合。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。表11中每个构建体的以下氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链(抗CD38),并且一个质粒编码短Fc链):
表11构建体16(CD38)序列
使用Poros MabCapture A(LifeTechnologies)柱,通过基于蛋白质A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。将捕获的Fc抗原结合结构域构建体用磷酸盐缓冲盐水(低盐洗涤液)洗涤,并用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱。洗脱物通过添加1M TRIS(pH7.4)快速中和,并且通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。使用Poros XS树脂(AppliedBiosciences),通过离子交换色谱法进一步分级分离蛋白质。用50mM MES(pH 6,缓冲液A)对柱进行预平衡,并且使用50mM MES、400mM氯化钠(pH 6,缓冲液B)作为洗脱缓冲液用步进梯度洗脱样品。在离子交换后,在切向流过滤系统上,使用10kDa截止聚醚砜(PES)膜滤筒将目标级分缓冲交换到PBS缓冲液中。将样品浓缩至大约30mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
实施例31.具有CD38结合结构域的Fc抗原结合结构域构建体19的设计和纯化
蛋白质表达
如下所述制备由其中分支点既不在N末端Fc结构域处也不在C末端Fc结构域处的单分支Fc结构域形成的构建体。Fc抗原结合结构域构建体19(CD38)分别包括两个不同的含Fc结构域单体的多肽(抗CD38长Fc链(SEQ ID NO:75)的两个拷贝),以及短Fc链(SEQ IDNO:63)的四个拷贝),以及抗CD38轻链多肽(SEQ ID NO:49)的拷贝。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处的抗CD38 VH结构域和CH1结构域(EU位置1至220)(构建体19(CD38)),该Fc结构域单体具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化),并与具有反向电荷突变K409D和D399K(以促进同源二聚化)的Fc结构域单体串联,并与具有E357K电荷突变以及S354C和T366W突起形成突变(以促进异源二聚化)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含具有K370D电荷突变以及Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变(以促进源二聚化)的Fc结构域单体。还可以将抗CD38轻链表达为作为scFv的一部分与长Fc链的N末端融合。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。表12中每个构建体的以下氨基酸序列由三个单独的质粒编码(一个质粒编码轻链(抗CD38)、一个质粒编码长Fc链(抗CD38),并且一个质粒编码短Fc链):
表12.构建体19(CD38)序列
实施例32.抗CD38构建体与表达人和食蟹猴CD38的人肿瘤细胞系和稳定细胞系的
结合
将含有10%FBS的培养基中的肿瘤细胞悬液与浓度递增的VivoTag645标记的抗CD38抗体在4℃下温育1小时。然后将细胞在冷缓冲液中洗涤并悬浮在FACS缓冲液中。然后在BD FACS Verse流式细胞仪的APC通道上读取标记的细胞悬液的读数。使用未标记的细胞对活细胞群体进行门控。使用FlowJo软件根据门控群体计算几何平均荧光强度(gMFI)值。该分析的结果呈现在图25中。
使用Raji细胞来评价亲本IgG1抗CD38抗体和对应的抗CD38构建体的剂量依赖性相对结合。由于抗CD38 mAb(其是各种抗CD38 Fc构建体的Fab的来源)不与猴CD38发生交叉反应,因此我们生成了与食蟹猴CD38(S1A-AA-Cyno CD38)反应的替代物抗CD38人单克隆IgG1抗体,以及与食蟹猴CD38(S3Y-AA-Cyno CD38)反应的使用相同Fab序列的替代物抗CD38构建体13;这被用于评价存在食蟹猴血清补体的情况下的CDC活性,以及非人灵长类全血中靶向内源性食蟹猴CD38的药效动力学反应。这些结合研究的结果呈现在图26中。
实施例33.抗CD38构建体的CDC活性
通过体外CDC测定评估抗CD38抗体和抗CD38 Fc构建体促进表达CD38的肿瘤细胞系(Daudi和Raji)的细胞杀伤的能力。将人血清补体用作补体来源。将含有0.1%BSA的RPMI-1640培养基用作制备细胞悬液、抗体和血清稀释液的缓冲液。首先在缓冲液中洗涤CD38阳性肿瘤细胞,并以106个细胞/ml的密度重悬。在典型的测定中,将50μl抗体或抗CD38Fc构建体、50μl稀释的补体(5X稀释液)和50μl细胞悬液(50,000个细胞/孔)添加到平底组织培养96孔板中。然后将混合物在5%CO2培养箱中在37℃下温育2小时,以促进补体介导的细胞裂解。然后,将50μl阿尔玛蓝添加到每个孔中,并在37℃下温育18小时。使用96孔荧光计通过在530nm处激发并且在590nm处发射来读取荧光。
在存在人或食蟹猴血清补体的情况下对Daudi细胞和Raji细胞进行测定,以评价由抗CD38 mAb或抗CD38构建体诱导的相对CDC介导的肿瘤细胞裂解。表13中呈现的结果以与活细胞数量成比例的相对荧光单位(RFU)表示。通过相对于Ab浓度(添加阿尔玛蓝之前的最终浓度)的对数绘制CDC活性百分比来检查各种突变体的活性。如下计算CDC活性百分比:%CDC活性=(RFU测试-RFU背景)×100(总细胞裂解时的RFU-RFU背景)。值表示代表性实验(n=3个单独的实验)的平均值±SD。该研究表明,抗CD38构建体在抗CD38 mAb-CDC敏感细胞(Daudi)和抗CD38 mAb-CDC抗性细胞(Raji)中表现出比抗CD38 mAb更大的功效(最大肿瘤细胞杀伤)和效力。抗CD38 mAb敏感或抗性术语是指在基于细胞的CDC测定中对抗CD38 mAb介导的靶细胞裂解具有敏感性或抗性。
表13:CD38构建体在Daudi细胞和Raji细胞中的CDC活性
1除非另外指明,否则所有构建体均包括G20接头(SEQ ID NO:23)。
食蟹猴CD38交叉反应性抗CD38构建体13(S3Y-AA-Cyno CD38)比对应的mAb(S1A-AA-Cyno(抗Cyno CD38 mAb))在敏感和抗性肿瘤细胞中在诱导CDC方面均显示出显著较高的效力和功效。以与上述类似的方式进行该测定,但是使用Daudi肿瘤细胞和猴血清补体(图27,小图A)、Raji肿瘤细胞和猴血清补体(图27,小图B)、Daudi肿瘤细胞和人血清补体(图27,小图C)、Raji肿瘤细胞和人血清补体(图27,小图D)。表14中呈现的这些构建体的CDC活性表明,在诱导针对Daudi细胞和Raji细胞的CDC中,S3Y-AA-Cyno CD38的功效和效力比S1A-AA-Cyno(抗Cyno CD38 mAb)显著增强。
表14:食蟹猴CD38反应性构建体在Daudi细胞和Raji细胞中的CDC活性
实施例34.抗CD38 Fc构建体对抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激活
从人全血中分离出单核细胞,并通过在6孔板中用人M-CSF和IL-10处理单核细胞使其分化为巨噬细胞。然后使用冷冻的PBS+2mM EDTA使这些附着的巨噬细胞脱离,随后接种到测定孔中。将2×105个巨噬细胞接种在96孔平底板中的含2%超低FBS的RPMI-1640培养基中。将板短暂离心并在37℃下温育1小时,以使巨噬细胞附着到96孔板的底部。将Raji肿瘤细胞用Calcein-AM染色,然后在存在抗CD38 mAb或各种抗CD38构建体的连续稀释液的情况下,以3:1的效应物(巨噬细胞):靶标(肿瘤细胞)比率添加到含有巨噬细胞的板上。然后将板在CO2培养箱中在37℃下温育2小时。将上清液收集在V型底96孔板中。通过用含2mMEDTA的冷冻PBS进行脱离来收集附着细胞。将来自上清液的细胞和脱离的附着细胞合并在一起。然后在4℃下将这些细胞与抗CD11b APC抗体和抗CD19 BV421抗体一起温育1小时,来用这些抗体将细胞染色。在FACS Verse流式细胞仪上读取标记的细胞悬液的读数。将表面CD19染色阴性的双阳性巨噬细胞(CD11b+/Calcein-AM+)视为吞噬事件。表15中的结果表明,抗CD38构建体在诱导原代人巨噬细胞对调理过的Raji细胞的吞噬作用中具有优越的效力。
表15.抗CD38 Fc构建体在ADCP测定中的效力
1除非另外指明,否则所有构建体均包括G20接头。
实施例35.抗CD38 Fc构建体对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的激活
将Raji细胞以5000个细胞/50μL培养基/孔的浓度悬浮在96孔板中含10%超低IgGFBS的RPMI培养基中。然后将样品与浓度递增的抗体和构建体(10μL/孔)在25℃下温育15分钟。以5:1的效应物与靶标比率添加原代人NK细胞(效应细胞)。然后将效应细胞和靶细胞混合物在5%CO2培养箱中在37℃下温育5小时。添加CytoTox Glo试剂(50μL),并将板在25℃下温育15分钟以标记死细胞。然后在Pherastar发光计上读取样品,以测量来自死细胞的发光信号。我们的结果表明,在诱导ADCC中,S3Y(构建体13)分子的效力是抗CD38 mAb的5至7倍。如下表15所示,抗CD38构建体13在诱导针对Raji肿瘤细胞的原代人NK细胞介导的ADCC中显示出比抗CD38 mAb优越的效力。在37℃下用药物分子处理靶细胞和效应细胞5小时,然后通过CytoTox Glo试剂检测死细胞。测定对照、自发释放对照(仅靶细胞);无抗体对照;仅NK细胞+抗体;IgGk同种型对照
表15.抗CD38Fc构建体在ADCC测定中的效力
实施例36:人全血中抗CD38构建体的肿瘤细胞杀伤
将Daudi细胞悬浮在50μl培养基(RPMI-1640+10%超低IgG FBS)中,并接种到96孔板的每个孔中。将50μL人全血或ACK裂解的人全血细胞(不含血清和RBC)添加到肿瘤细胞悬液中。随后添加50μL抗体和抗CD38构建体稀释液(在RPMI-1640培养基+10%FBS中)。混合样品,然后在CO2培养箱中在37℃下温育4小时。温育后,通过添加50μL新鲜制备的荧光素溶液(储备液浓度,50mg/mL)来评价剩余的活Daudi细胞。然后将板置于板振荡器上5分钟。使用Pherastar发光计读取活Daudi荧光素酶细胞发出的发光。
图28中呈现的结果表明,抗CD38构建体13(S3Y-AA-CD38)在从3个单独的供体收集的人全血中的靶细胞杀伤的效力是抗CD38 mAb的10倍至36倍。然而,在用RBC裂解和洗涤的全血的情况下,在抗CD38 mAb或抗CD38构建体中未观察到肿瘤细胞耗竭。用从同一供体制备的自体血清补充RBC裂解和洗涤的人全血细胞恢复了肿瘤细胞耗竭,表明血清蛋白在促进全血中抗CD38 mAb和抗CD38构建体诱导的肿瘤细胞杀伤中发挥了作用。
实施例37:猴全血中内源性表达CD38的B细胞的耗竭
将食蟹猴全血与每种VivoTag645标记的分子(SIF1、IgG同种型对照、S1A-AA-Cyno-001(抗cyno CD38 mAb)、抗cyno CD38构建体13 S3Y-AA-Cyno-001)的连续稀释液分别与细胞表面标记物抗体混合物一起混合。然后将血液样品在4℃下温育30分钟以确定细胞表面结合,或者分别在CO2培养箱中在37℃下温育3小时以确定处理对细胞耗竭的影响。这些处理之后,通过将样品与冷氯化铵溶液混合来裂解RBC。然后洗涤样品,并将其重悬于含有1%多聚甲醛的缓冲液中,并在第二天进行FACS分析。基于CD38结合与结合频率数据来评估CD38+B细胞群体。测量CD38+B细胞类型的频率,以确定由于用构建体分子处理3小时而引起的耗竭。以剂量依赖性方式观察10nM(1Log nM)和超过10nM的剂量下抗CD38构建体13(S3Y-AA-Cyno-001)的B细胞耗竭。耗竭开始出现在100nm至1000nM(2Log nM至3Log nM)。与抗cyno CD38 mAb(S1A-AA-Cyno-001)相比,在抗cynoCD38构建体13(S3Y-AA-Cyno-001)中观察到更大的耗竭。
实施例38:体内淋巴瘤模型
通过肿瘤体积测量,在人淋巴瘤的皮下肿瘤模型中评价药剂对疾病进展和治疗反应的影响。根据IACUC规程,在使用前将CB17重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(雌性,6-7周大,平均体重20克,来自Charles River Laboratories的品系236)饲养在Momenta动物护理设施中48小时。随意提供水和食物。所有实验均由机构动物伦理委员会批准。每天检查小鼠的不适迹象和一般状况。对于皮下肿瘤异种移植模型,将悬浮在高浓度基质胶中的5×106个人伯基特淋巴瘤Raji细胞皮下注射到小鼠的右侧腹中。每周测量肿瘤体积两次,直到肿瘤达到大约250mm3(大约在第6至第7天),此时将小鼠分为治疗组(每组8只小鼠)。在治疗前一天、就在静脉治疗注射(用PBS、抗CD38 mAb或S3Y-AA-CD38)前和治疗后第二天,向所有3组小鼠腹膜内注射0.5mL正常人血清补体。每周记录体重和肿瘤体积两次。当体积接近2000mm3时,每天测量肿瘤。每天观察所有动物;根据IACUC规程对病态动物实施安乐死。图30中示出的结果表明,当在存在人血清补体的情况下进行治疗时,在该人淋巴瘤小鼠模型中,抗CD38构建体13(S3Y-AA-CD38)比抗CD38 mAb更有效。
实施例39:构建体中的Fc结构域保持与抗体中的Fc结构域相似的与Fcγ受体的结
合
利用抗CD20构建体和抗CD38构建体来评价同源二聚化突变、异源二聚化突变、多肽接头和Fab结构域的各种组合是否影响与Fcγ受体的结合。利用表面等离子体共振(SPR)来评估与CD64(Fcγ受体I)的1:1结合。将构建体捕获在芯片表面上,并测量与可溶性受体的结合以确保1:1结合。在这种格式下,结合价是对Fc功能改变最敏感的读数;动力学常数和平衡常数对Fc结构域的子集改变不敏感。
细胞培养
将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达,并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。经由脂质体将DNA质粒构建体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。抗体由两种不同的质粒表达:一种编码重链,并且第二种编码轻链。SIF抗体由三种单独的质粒表达:在大多数情况下,一种质粒编码抗体轻链,一种质粒编码包含附接到氨基末端Fc的CH1-VH FAB部分的长Fc链,并且第三种质粒编码短Fc链。S3A和S3W Sif抗体除外。对于S3W,一种质粒编码抗体轻链,第二种质粒编码包含两个Fc结构域的长链,并且第三种质粒编码包含CH1-VH FAB部分的单条Fc链。对于S3A,一种质粒编码抗体轻链,第二种质粒编码包含附接到氨基末端Fc的CH1-VH FAB部分的长Fc链,并且一种质粒编码也包含CH1-VH FAB部分的短Fc链。
蛋白质纯化
使用Poros MabCapture A柱,通过基于蛋白质A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。上样后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.0)洗涤捕获的SIF抗体构建体,并进一步用中间洗涤缓冲液50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)洗涤,以除去其他与工艺有关的杂质。用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱结合的SIF抗体物质,并通过添加1M TRIS(pH 7.4)快速中和洗脱液,然后离心并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
使用Poros XS树脂,通过离子交换色谱法进一步分级分离蛋白质。用50mM MES(pH6,缓冲液A)对柱进行预平衡,并且在平衡缓冲液中稀释(1:3)样品以便上样。使用12-15CV线性梯度(从50mM MES(100%A)至400mM氯化钠(pH 6,100%B))作为洗脱缓冲液将样品洗脱。通过分析尺寸排阻色谱法(SEC)分析洗脱期间收集的所有级分,并且合并目标级分以产生经纯化的SIF抗体物质。
在离子交换后,在切向流过滤系统上,使用30kDa截止聚醚砜(PES)膜滤筒将合并物质缓冲交换到1X-PBS缓冲液中。将样品浓缩至大约10mg/mL至15mg/mL,并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
物理化学分析
将分析尺寸排阻色谱法(SEC)用于后蛋白A、合并的离子交换级分和最终的经纯化物质的纯度评估。
使用1X-PBS将经纯化物质稀释至1mg/ml,并在具有UV&FLD检测器的Agilent 1200系统上使用Zenix SEC-300(4.6mm×300mm,3μm,Sepax目录号213300-4630)作为分析柱进行分析。
在分析前,将柱用100mM磷酸钠、200mM精氨酸、300mM氯化钠(pH=6.7)和0.05%w/v叠氮化钠缓冲液以0.3ml/min平衡1小时。进样量为大约10μl至15μl,柱温为300℃,在280nm处进行UV检测,通过在280mm处激发并且在330nm处发射进行FLD,总运行时间为15分钟。
尺寸纯度结果在表16中示出。所有材料仅显示出低水平的更高级物质(HOS)。
表16:Fc结合测定中使用的构建体的尺寸纯度
结合分析
使用CM3 Series S传感器芯片在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上进行结合实验。为了进行FcgR结合的价分析,经由直接胺偶联固定天然蛋白A。在运行缓冲液中稀释配体并将其捕获。使人重组CD32a或CD64(R&D Systems)的6点稀释系列流经捕获的配体。如下计算每种配体的价:
配体价=Rmax/[(MW分析物/MW配体)*配体捕获水平]。
CD64与抗CD20构建体结合的分析结果在表17中示出。在所有情况下,CD64结合价均等于Fc结构域的数量,表明所有Fc结构域均具有结合CD64的功能。在序列上与S3Y-AA-OBI和S3Y-AA-AVE相同但缺少Fab结构域的对照化合物与那些构建体相当地结合CD64,表明包含Fab结构域未改变与Fc受体的结合。
表17:某些抗CD20构建体的价
构建体 | 抗原 | Fc结构域数量 | 通过SPR测量的CD64价 |
mAb | CD20 | 1 | 1.5 |
构建体13(S3Y) | CD20 | 3 | 3.4 |
构建体7(S3I) | CD20 | 3 | 3.0 |
构建体8(S3W) | CD20 | 3 | 2.9 |
构建体9(S3A) | CD20 | 3 | 3.1 |
构建体10(S5I) | CD20 | 5 | 5.5 |
构建体19(S5X) | CD20 | 5 | 4.9 |
构建体16(S5Y) | CD20 | 5 | 5.5 |
对照(S3Y) | 无抗原结合结构域 | 3 | 3. |
实施例40:构建体与细胞表面Fcγ受体更紧密地结合
使用抗CD20构建体在时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定(CisBio)中评价构建体与细胞表面CD32a的相对结合。测定试剂根据制造商的说明来制备。使用FreedomEVOware 150自动化液体处理机(Tecan)为每个样品生成10点、3倍连续稀释系列,将其添加到带有标记受体的细胞中。然后添加标记的竞争抗体,并将板在室温下温育。使用PHERAstar荧光读取器(BMG Labtech GmbH)在665nm和620nm处读取测定板。将对数转换的样品浓度相对于对应的HTRF信号比(665nm/620nm)进行绘图。在XY-绘图上进行四参数非线性回归分析(最小二乘拟合),以计算未标记样品的EC50,其中EC50与样品对Fcγ受体的亲和力成反比。
通过TR-FRET测定的对CD32a的竞争性结合的测量结果汇总在表17中。Fc结构域的数量增加极大地提高了构建体与免疫球蛋白竞争CD32a的能力,如降低的IC50值所反映。在序列上与S3Y-AA-OBI和S3Y-AA-AVE相同但缺少Fab结构域的对照化合物与那些构建体相当地竞争细胞表面CD32a,表明包含Fab结构域未改变与Fc受体的结合。
表17:某些抗CD20构建体的Fc受体结合
实施例41:抗原结合保留在抗CD38构建体中
使用SPR评价抗原结合。使用先前固定的抗6X His抗体在传感器上捕获带有组氨酸标签的重组CD38(9049-B7 R&D Systems)蛋白。使稀释系列的同族抗体和SIF抗体通过传感器,在分析物进样之间用低pH甘氨酸溶液对所述传感器进行再生。使用1:1Langmuir相互作用模型计算结合。
抗CD38构建体的结合在表18中示出。通过SEC,所有测试的化合物的纯度不低于93%。在有利于1:1结合的测定中,构建体具有与对应单克隆抗体相当的抗原结合。
表18.通过SPR测量的CD38与抗CD38构建体的结合
构建体 | KD(nM) |
mAb | 670 |
S3Y | 703 |
S3A | 757 |
表19提供了单独研究中有关抗CD38构建体结合的数据。
表19:人CD38与某些抗CD38构建体结合
构建体 | 25℃下的KD(nM) | 37℃下的KD(nM) |
抗CD38 mAb | 129 | 410 |
S3Y-AA-CD38 | 142 | 661 |
S3I-AA-CD38 | 132 | 442 |
S5X-AA-CD38 | 166 | 553 |
S3A-AA-CD38 | 126 | 410 |
实施例42:抗CD38 Fc构建体对人淋巴瘤细胞表现出增强的溶细胞活性
如图31A和图31B所示,S3Y-AA-CD38抗CD38 Fc构建体在ADCC(原代人类NK细胞介导)、ADCP(原代人类巨噬细胞介导)和CDC中比具有相同Fab的抗CD38 mAb更强效。
实施例43:抗CD38 Fc构建体比抗CD38抗体以更好的效力和功效增强了全血中的
肿瘤细胞耗竭
在该测定(其结果在图32中示出)中,将人全血与CFSE标记的Daudi细胞掺在一起,然后用S3Y-AA-CD38或具有相同Fab的抗CD38mAb处理。通过流式细胞术测量全血中的肿瘤细胞群体(CFSE+CD19+)相对于基线的变化。抗CD38 Fc构建体显示出为抗CD38 mAb的40倍至100倍的效力(n=5个供体)。
实施例44:抗CD38 Fc构建体在表达高和低CD38补体抑制蛋白的肿瘤细胞系中均
介导细胞毒性
对靶向CD38的抗体即抗CD38 mAb的反应与肿瘤细胞上的CD38表达水平相关。此外,补体抑制蛋白(CD55、CD59)的表达增加显著降低抗CD38 mAb诱导的肿瘤细胞耗竭,从而导致疾病进展(Nijhof等人,(2016)Blood 128:959)。如图33所示,在Daudi细胞中(相对高的CD38表达以及相对低的CD55和CD59表达)以及重要地在Raji细胞中(相对低的CD38表达以及相对高的CD55和CD59表达),S3Y-AA-CD38抗CD38 Fc构建体(倒三角形)均比具有相同Fab的抗CD38 mAb(圆形)具有更强效的CDC活性。
实施例45:抗CD38 Fc构建体在表达高和低CD38补体抑制蛋白的肿瘤细胞系中均
介导细胞毒性
与具有相同Fab的mAb(抗cyno CD38 mAb)相比,S3Y-AA-Cyno即上文表6中所述的抗cyno CD38 Fc构建体(其与人和食蟹猴CD38两者结合)对人淋巴瘤细胞显示出改善的ADCC、ADCP和CDC活性,如图34A和图34B所示。
实施例46:抗Cyno CD38 Fc构建体比抗Cyno CD38抗体以更好的效力和功效增强
了食蟹猴全血中的肿瘤细胞耗竭
在该测定(其结果在图35中示出)中,将食蟹猴全血与CFSE标记的Daudi细胞掺在一起,然后用S3Y-AA-Cyno CD38或具有相同Fab的抗CD38 mAb处理。通过流式细胞术测量全血中的肿瘤细胞群体(CFSE+CD19+)相对于基线的变化。抗Cyno CD38 Fc构建体显示出比抗cyno CD38 mAb显著更高的效力(n=3)。
实施例47:抗Cyno CD38 Fc构建体在食蟹猴中显示出比抗Cyno CD38 mAb更优越
的CD38高B细胞耗竭
在该测定(其结果在图36中示出)中,S3A-AA-Cyno在体外(如通过从食蟹猴收集的外周血中的B细胞耗竭所测量的(左侧小图))和在体内(如在食蟹猴中4小时后检查B细胞耗竭的单剂量PD研究中所测量的(右侧小图))均优于抗Cyno CD38 mAb。
实施例48:抗CD38 Fc构建体显示出骨髓浆细胞负载较高的多发性骨髓瘤患者的
优越浆细胞耗竭
在该测定(其结果在图37中示出)中,S3Y-AA-CD38优于具有相同Fab序列的抗CD38mAb。来自多发性骨髓瘤患者MM536(BM浆细胞负载为82%的复发患者)的冷冻骨髓单核细胞(BM-MNC)是从供应商获得的。在存在或不存在不同浓度的抗CD38 mAb或S3Y-AA-CD38的情况下,将BM-MNC解冻并在RPMI 1640+20%人血清补体中温育(以允许CDC介导的细胞杀伤)18小时。第二天,将样品染色并通过FACS分析,以评估CD138+细胞(基于通过对未处理细胞进行表型分析确定的两种标记物的共表达,将其用作表达CD38的浆细胞/骨髓瘤细胞的替代物标记物)的耗竭。使用总单细胞中活CD138+细胞频率确定细胞耗竭,其中将所有相对细胞频率均标准化为在未处理对照中观察到的基线频率(设置为0%变化)。
在100nM或1000nM下进行S3Y-AA-CD38或抗CD38 mAb处理后,观察到患者MM536的总BM-MNC中CD138+细胞的耗竭,而在10nM浓度下进行的处理中均未观察到耗竭。在100nM或1000nM的S3Y-AA-CD38浓度下观察到超过90%的活CD138+细胞发生饱和耗竭。抗CD38mAb介导的耗竭远远低于在S3Y-AA-CD38中观察到的耗竭,其中在100nM和1000nM的浓度下最大耗竭水平为24%,似乎达到或接近饱和。考虑到患者MM536中的BM浆细胞频率很高(约82%),这些结果可以表明在骨髓浆细胞负载较高(已被证明在临床应用中对抗CD38 mAb治疗的客观反应率较低)的MM患者中使用抗CD38 Fc构建体具有更大反应的潜力。
实施例48:抗CD38 Fc构建体显示出与细胞表面FcγR和人血清补体的结合增强
图38A描绘了表明S3Y-AA-CD38与FcgRIIa、FcgRIIIa和补体的结合为抗CD38 mAb的至少100倍的研究结果。
图38B描绘了表明S3Y-AA-CD38与免疫细胞表面上的FcγRIIa、FcγRIIIa的结合比抗CD38 mAb增强超过500倍以及与C1q补体蛋白的结合比抗CD38 mAb增强12倍的研究结果。
实施例49:具有突变型Fc CH2结构域的抗CD38 Fc构建体表现出更持久的B细胞耗
竭
与实施例38类似,将食蟹猴全血与每种抗cyno CD38 mAb、抗cyno CD38构建体13(S3Y-AA-Cyno-001)的连续稀释液混合,并测量B细胞耗竭。此外,作为变体,测试了抗cynoCD 13构建体。每个CH2结构域均具有R292P突变(参见图24A至图24B的Fc结构域编号)。因此,该构建体具有上述Fc结构域突变。下表20提供了构成该CD38构建体13变体的多肽的氨基酸序列(突变以粗体突出显示,并且用下划线标出)。S3Y-CD38(CC R292P)是与人CD38结合的版本,并且S3Y-Cyno-001(CC R292P)与食蟹猴CD38结合。从图39中可以看出,S3Y-Cyno-001(CC R292P)(“第2代SIF抗体”)与S3Y-Cyno-001(无R292P突变)(“第1代SIF抗体”)相比,表现出优异的B细胞耗竭持久性。
表20.具有R292P Fc CH2结构域突变的构建体13(CD38)序列
实施例50:CD38 mAb和SIF抗体与CD38的结合
使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)测量CD38与mAb和SIF抗体的结合。固定在CM5传感器芯片上的蛋白A用于从溶液中捕获测试分子(SIF抗体或抗体)。使CD38的稀释系列流经捕获的测试分子。该测定作为单循环动力学测定进行,其中在捕获的测试分子上注射浓度递增的CD38,并在最后监测解离。从传感图中减去双参照,并将其拟合为1:1结合模型。测量动力学缔合常数(ka)和解离常数(kd),并通过将kd除以ka计算平衡解离常数(KD)。还测量了测试分子的结合化学计量。将以反应单位(RU)测量的每种测试分子的捕获水平乘以CD38与测试分子的分子量比率,获得理论最大结合水平。将实验的RMax值除以理论最大结合水平,获得化学计量。通过测量400nM和200nM下蛋白质与每种测试分子的结合来测试食蟹猴CD38结合。
图41描绘了通过SPR测量的人CD38与食蟹猴抗CD38抗体和食蟹猴SIF抗体结合的分析结果。抗CD38分子的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在左侧。动力学常数和平衡常数显示在中央和右上方。人CD38与抗CD38分子结合的化学计量显示在右下方。所有构建体等同地结合人CD38。S3Y-CC-CD38是在Fc CH2突变中具有R292P突变的构建体13,并且S3Y-AA-CD38缺少R292P突变,但其他方面是相同的。
图42描绘了通过SPR测量的人CD38与Cyno-CD38抗体和Cyno-SIF抗体结合的分析结果。cyno-CD38分子的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在左侧。动力学常数和平衡常数显示在中央和右上方。人CD38与cyno-CD38分子结合的化学计量显示在右下方。所有构建体等同地结合人CD38。
图43描绘了通过SPR测量的食蟹猴CD38与cyno-CD38抗体、cyno-CD38 SIF抗体和CD38 mAb结合的分析结果。cyno-CD38分子的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在左侧小图和中央下部小图上。CD38 mAb的结合传感图和1:1结合模型拟合显示在中央上部小图上。平衡常数显示在右侧小图上。所有cyno-CD38构建体等同地结合食蟹猴CD38。CD38 mAb不与食蟹猴CD38结合。
实施例51:S3Y-AA-CD38和S3Y-CC-CD38与人FcγR的结合
图44描绘了使用Fc-γ受体均相时间分辨荧光(HTRF)测定进行的S3Y-AA-CD38和S3Y-CC-CD38与人FcγR的结合相对于CD38 mAb的分析结果。竞争性HTRF测定用于确定S3Y-AA-CD38、S3Y-CC-CD38和CD38 mAb与人的FCGR1A、FCGR2A(H167)、FCGR2A(R167)、FCGR2B、FCGR3A(F176)和FCGR3A(V176)的结合。IC50抑制常数由数据得出。S3Y-AA-CD38和S3Y-CC-CD38的结合表示为IC50相对于CD38 MAb IC50的倍数变化。S3Y SIF抗体显示与细胞表面受体的密切结合大大增强。与亲本S3Y-AA-CD38分子相比,S3Y-CC-CD38中的R292P突变导致与FcgR2b的结合降至低于1/100。
Fc-γ受体竞争性HTRF测定购自Cis-Bio,并且根据制造商的说明书运行。对FCGR1A、FCGR2A(H167)、FCGR2A(R167)、FCGR2B、FCGR3A(F176)和FCGR3A(V176)进行测定。用BMG Pharastar荧光计在620nm和655nm进行荧光测量。对每个孔计算655/620的比率*10000。将数据复制到GraphPad Prism中进行分析。对浓度值进行对数转换,并将数据拟合到四参数曲线,该曲线将顶部值和底部值限制为在所有测试样品中通用。估计并报告每个独立稀释液的IC50值。
实施例52:抗CD38 mAb和S3Y-CC-CD38分子与人肿瘤细胞上的内源性CD38受体的 结合。
CD38是具有大的胞外区和非常短的胞质结构域的细胞表面II型糖蛋白受体。该受体在来源于B细胞谱系和浆细胞谱系的多种血液恶性肿瘤(包括多发性骨髓瘤(MM))中表达。选择来源于淋巴瘤患者和骨髓瘤患者的细胞系进行CD38表达分析。通过用流式细胞术结合荧光标记的抗CD38 mAb来测定CD38水平。将细胞与VivoTag 645标记的抗CD38 mAb在4℃下温育30分钟。然后洗涤细胞,固定,并在Verse流式细胞仪上获取单细胞事件。值代表平均值±SD。细胞表面CD38表达的层次结构为:Daudi细胞(淋巴瘤细胞系)>Raji(淋巴瘤细胞系)>SU-DHL(淋巴瘤细胞系)>MM.1S(骨髓瘤细胞系)>RPMI8226(骨髓瘤细胞系)(图45)。
选择具有高水平和中等水平细胞表面CD38的Daudi细胞系和Raji细胞系进行基于细胞的功能测定。在Daudi细胞系和Raji细胞系两者中,在用抗CD38 mAb和S3Y分子饱和后,存在结合的剂量依赖性增加(图46)。抗CD38 mAb、S3Y-CC-CD38和S3Y-AA-CD38的结合分布是相似的,表明S3Y-CC-CD38的Fc结构域中的突变对这些分子与内源性细胞表面CD38的相互作用没有影响。将细胞与VivoTag 645标记的抗CD38 mAb或者S3Y-AA或S3Y-CC分子在4℃下温育30分钟。然后洗涤细胞,固定,并在Cytek Aurora流式细胞仪上获取单细胞事件。值代表平均值±SD。如图46所示,S3Y-CC-CD38和抗CD38 mAb显示与淋巴瘤细胞表面CD38相似的结合。
实施例53:基于S3Y-CC-CD38和抗CD38 mAb对Fc效应子功能的影响的细胞耗竭测
定
治疗性抗CD38抗体达雷木单抗(Darzalex)经由Fc依赖性免疫效应机制杀伤肿瘤细胞,这些免疫效应机制包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。为了评估S3Y-CC-CD38相对于其亲本版本S3Y-AA-CD38和抗CD38 mAb的相对细胞毒性,进行了CDC、ADCC和ADCP测定。
为了评估CDC活性,将Daudi细胞或Raji细胞与人血清补体和药物分子一起在37℃下温育2小时,以促进补体介导的裂解。然后将阿尔玛蓝(细胞活力试剂)添加到每个孔中并在37℃下温育18小时,使用荧光计测量活细胞荧光以确定细胞裂解程度。S3Y和抗CD38 mAb都证明了补体介导的Daudi细胞裂解的剂量依赖性增加(图47A,左侧小图)。Raji细胞比Daudi细胞具有更低的CD38表达,然而它们在其细胞表面上还具有较高水平的补体抑制蛋白。抗CD38 mAb不能诱导针对Raji细胞的CDC,而S3Y分子显示出明显的剂量依赖性细胞毒性(图47B,右侧小图)。总而言之,S3Y-CC-CD38在细胞中显示出更好的效力和最大的靶细胞裂解,其中抗CD38 mAb不能通过CDC诱导裂解。
实施例54:S3Y-CC-CD38A在诱导针对CD38+人淋巴瘤细胞的溶细胞活性中的增强 的效力和功效。
ADCC和ADCC依赖于抗体的Fc区与免疫效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)之间的有效相互作用。在ADCC诱导期间,发生效应细胞对抗体包被的肿瘤细胞的裂解。NK细胞在由治疗性抗体介导的ADCC中起关键作用。重要的是,靶向CD38的S3Y分子与抗CD38 mAb的区别在于,它们由于与FcγR的密切结合而能够以强得多的亲和力结合。评估S3Y-CC-CD38、S3Y-AA-CD38和抗CD38 mAb的相对ADCC活性。对于该测定,将原代人NK细胞添加到肿瘤细胞中。然后将细胞混合物与药物分子中的任一种在37℃下温育5小时,接着通过CytoTox Glo试剂检测死细胞。S3Y分子清楚地展示比参考抗CD38 mAb显著增强的效力(图48A)。
在ADCP过程中,抗体调理过的肿瘤细胞的吞噬作用经由结合存在于单核细胞和巨噬细胞上的FcγR(诸如FcγRIIA和FcγRIIIA)而发生。吞噬作用有助于靶向CD38的抗体的抗肿瘤活性。有趣的是,各个巨噬细胞具有快速和连续吞噬多个达雷木单抗包被的肿瘤细胞的能力,表明ADCP是达雷木单抗(Darzalex)的有效杀伤机制。我们选择M2c巨噬细胞表型作为效应细胞,因为它们在血液恶性肿瘤的骨髓微环境中更普遍。为了确定S3Y分子和参考抗CD38 mAb的相对ADCP活性,将从人PBMC纯化的单核细胞在M-CSF中培养,然后用IL-10培养以产生M2c巨噬细胞。通过实时成像捕获巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。S3Y-CC-CD38和S3Y-AA-CD38清楚地展示在诱导ADCP方面比参考抗CD38 mAb显著增强的效力(图48B)。
实施例55:S3Y-CC-CD38以更好的效力和细胞毒性增强淋巴瘤细胞从全血中耗竭。
在全血肿瘤细胞(高CD38 Daudi细胞,以及表达中等CD38的Raji细胞)耗竭测定中进一步比较S3Y分子相对于抗CD38 mAb的相对细胞毒性活性,所述耗竭测定整合了不同的抗体作用模式(CDC、ADCC,以及诱导细胞死亡)。将健康志愿者的肝素化血液样品与用CFSE染料标记的Daudi或Raji淋巴瘤细胞掺在一起,并在抗CD38 mAb或S3Y-CC-CD38或S3Y-AA-CD38存在下在37℃下温育18小时。然后对血细胞进行表面标记物染色,固定,并且在流式细胞仪上采集。当与没有药物处理相比时,在抗CD38 mAb或S3Y分子存在下CFSE+(Daudi或Raji)细胞的频率降低是选择性细胞耗竭的指示。S3Y-CC-CD38与抗CD38 mAb相比的优越性通过全血中较高的效力值和较高的最大CFSE+Daudi或Raji细胞耗竭而示出(图49A和图49B)。
实施例56:S3Y-CC-CD38和S3Y-AA-CD38在离体天然环境测定中在来自多发性骨髓 瘤患者的骨髓活检物中介导增强的对浆细胞的细胞毒性。
FDA基于在先前治疗线超过4条且临床反应率为31%的复发性和难治性多发性骨髓瘤(RRMM)患者群体中的单一疗法试验批准了治疗性抗CD38 mAb Darzalex。现在,Darzalex通常与iMID和蛋白酶体抑制剂结合地用于MM患者的前沿以及复发性和难治性环境。在这些组合试验中,通过流式细胞术获得更高的最小残留疾病(MRD)状态被认为是患者中更好的无进展存活率的主要预测因素之一。如果在通过经验证的临床流式细胞术测定进行测试时,患者在100,000个骨髓细胞中具有小于1个浆细胞(CD138+),则认为患者为MRD阴性。来自Darzalex组合试验(POLLUX研究)的回顾性数据显示,有相当数量的患者未达到MRD阴性状态。因此,在RRMM患者中,较好的浆细胞耗竭剂可以实现比当前SOC更好的无病缓解持续时间。
在使用来自多发性骨髓瘤(MM)患者的骨髓抽吸物的离体测定中研究S3Y-CC-CD38及其亲本分子S3Y-AA-CD38与达雷木单抗(Darzalex)相比的浆细胞耗竭活性。从复发性和难治性MM患者(n=5)收集骨髓抽吸物,所述MM患者的先前治疗线包括皮质类固醇、干细胞移植、蛋白酶体抑制剂(Velcade)、iMID(来那度胺)。所有这些患者在其骨髓中具有不同水平的浆细胞负载,如使用流式细胞术通过一组浆细胞表面标记物所测定的。用新鲜骨髓抽吸物进行离体浆细胞耗竭测定(图50)。将骨髓样品提取到含有肝素作为抗凝剂的Vacutainer管中,并用补充有20%(v/v)自体血浆的IMDM进一步稀释以维持天然环境。将混合物分配到装有各种浓度的达雷木单抗(Darzalex)或者S3Y-CC-CD38或其亲本分子S3Y-AA-CD38的96孔板中。然后将装有样品的板在37℃下在含有5%CO2的潮湿空气中温育3小时。为了制备用于流式细胞术分析的样品,在温育结束时,将RBC裂解,然后用针对细胞表面标记物(CD38、CD16、CD319、CD45、CD56、CD3)的荧光标记的单克隆抗体组和膜联蛋白V染色,以鉴定和定量每个孔中剩余的活的浆细胞。
如所预期的,Darzalex以剂量依赖性方式从骨髓中耗竭浆细胞(图50)。两种S3Y分子(S3Y-CC-CD38和S3Y-AA-CD38)在所有患者中均显示出多发性骨髓瘤肿瘤细胞的优异的剂量依赖性耗竭。S3Y-CC-CD38和S3Y-AA-CD38显示出比Darzalex更好的效力(图50)。此外,在5名患者中的2名患者的骨髓样品中,S3Y分子消除了大多数浆细胞(>95%)。总而言之,来自这5名患者的数据表明,S3Y-CC-CD38分子和S3Y-AA-CD38分子在从骨髓抽吸物中耗竭MM肿瘤细胞方面优于Darzalex(图50)。
实施例57:S3Y-CC-Cyno-CD38、S3Y-AA-Cyno-CD38和抗Cyno-CD38 mAb示出与人淋 巴瘤细胞系上的细胞表面CD38具有相似的结合。
在S3Y-AA-Cyno-CD38分子的Fc结构域中引入突变(R292P),产生S3Y-CC-Cyno-CD38。Fc突变降低了该分子与FcγRIIB的结合(参见图45)。功能活性在基于细胞的测定中是一致的。然后在食蟹猴中测试PK优化的分子以确定Fc突变是否增强了PD反应的深度和持续时间,并是否改善了S3Y-CC-Cyno-CD38分子的血清半衰期。
S3Y-CC-Cyno-CD38、S3Y-AA-Cyno-CD38和抗Cyno-CD38 mAb与人CD38和食蟹猴CD38两者结合(图51)。为了证实S3Y-CC-Cyno-CD38分子中的R292P Fc突变对其结合细胞表面CD38的能力没有影响,在Daudi细胞和Raji细胞中将标记的S3Y-CC-Cyno-CD38的结合与其亲本分子(S3Y-AA-Cyno-CD38)和参考抗Cyno-CD38 mAb进行了比较。S3Y-CC-Cyno-CD38示出与亲本S3Y-AA-Cyno-CD38和参考抗Cyno-CD38 mAb相似的结合和EC50值。
实施例58:S3Y-CC-Cyno-CD38显示出Fc效应子功能介导的靶细胞毒性比抗Cyno- CD38 mAb增强。
S3Y-CC-Cyno-CD38和参考抗Cyno-CD38 mAb均与人CD38和食蟹猴CD38结合。使用具有Fc突变的该S3Y分子,基于细胞耗竭活性对Fc效应子功能进行评估。许多Fc突变影响补体与抗体调理过的细胞表面的结合,并且还影响与NK细胞和巨噬细胞上的Fcγ受体的相互作用。因此,将Daudi细胞和Raji细胞用作靶细胞系。如前所述,在CDC、ADCC和ADCP测定中检查S3Y-CC-Cyno-CD38中的Fc突变对细胞杀伤活性的影响。S3Y-CC-Cyno-CD38在使用人补体、原代人NK细胞和M2c巨噬细胞的所有基于Fc效应子功能的测定中显示出诱导细胞毒性的显著优越的效力(图52)。
实施例59:使用S3Y-CC-Cyno-CD38在食蟹猴中进行探索性PK/PD和耐受性研究
在食蟹猴中进行单剂量研究以评估S3Y-CC-Cyno-CD38(在Fc结构域中具有R292P突变)的药代动力学(PK)、耐受性和药效动力学效应(B细胞耗竭)的持久性。还检查了相比亲本分子S3Y-AA-Cyno-CD38和参考抗Cyno-CD38 mAb的优势和区别。为此,在向食蟹猴静脉内输注S3Y-CC-Cyno-CD38、S3Y-AA-Cyno-CD38和抗Cyno-CD38 mAb后,对它们进行了15天单剂量药代动力学、药效动力学和耐受性研究。稳态下的暴露(从施用剂量至给药后360小时的血清浓度-时间曲线下的面积)通常以剂量成比例方式增加(图53)。S3Y-CC-Cyno-CD38显示出与其亲本分子S3Y-AA-Cyno-CD38相比,在较高的血清药物浓度下PK谱显著改善(图53)。
使用针对CD138、CD159a、CD27、CD20、CD19和CD3的抗体,对用S3Y-CC-Cyno-CD38、S3Y-AA-Cyno-CD38和抗Cyno-CD38 mAb处理的动物的外周血进行细胞免疫表型分析。阳性细胞相对百分比的评估使用流式细胞术测量并用于计算绝对细胞计数。将每个时间点的绝对细胞计数标准化为个体动物的给药前水平。这里讨论的结果代表相对于给药前基线(设定为100%)标准化的外周血中B细胞计数的变化百分比。流式细胞术分析表明,在所有治疗组中,施用药物分子导致CD19+CD20+/-(总B细胞)的绝对细胞计数轻微至显著降低(图54)。S3Y-CC-Cyno-CD38(1.7mg/Kg)在其对B细胞的药效动力学效应方面相比其亲本分子S3Y-AA-Cyno-CD38(1.7mg/Kg)和抗Cyno-CD38 mAb(1.0mg/Kg)在等摩尔剂量下显示出高得多的效力和功效(图54)。
实施例60:多重复剂量研究:所有S3Y-CC-Cyno-CD38剂量在重复剂量设定中都是 强效和有效的;浆细胞(CD138+)仅表示所有淋巴样细胞的小群体。S3Y-CC-Cyno-CD38能够 以剂量依赖性方式从组织中耗竭浆细胞。
在食蟹猴的4周重复剂量(每周一次,持续4周)研究中检查S3Y-CC-Cyno-CD38的药效动力学效应。对于该研究,与早期研究(图53和图54)相比,使用10倍以上高剂量的S3Y-CC-Cyno-CD38(1.7mg/Kg、17mg/Kg、51mg/Kg)来评估最大耐受性、安全性,以及功效的多重PD读数、血中的细胞耗竭和淋巴组织的浆细胞耗竭。在研究期间收集血液样品用于血液学评估、流式细胞术,并且在完成给药后收获组织以评估治疗对浆细胞耗竭的影响。所有治疗组均耐受良好。S3Y-CC-CD38B治疗以剂量依赖性方式耗竭循环B细胞,其作用持久性随剂量增加而改善(图55A)。骨髓和脾代表主要的淋巴组织。浆细胞(CD138+)仅表示所有淋巴样细胞的小群体(图55B)。S3Y-CC-Cyno-CD38以剂量依赖性方式从骨髓和脾中耗竭浆细胞(图55B)。
S3Y-CC-Cyno-CD38是新型蛋白质结构,对于其没有皮下(SC)给药可行性的证据。该分子的增加的分子量可能阻碍经由SC途径的吸收。CD38治疗剂能够以IV和SC这两种呈现形式商购获得,并且S3Y-CC-Cyno-CD38能够以这两种呈现形式获得将是理想的。在食蟹猴中对S3Y-CC-Cyno-CD38进行非GLP单次IV和SC剂量药代动力学(PK)、药效动力学(PD)和耐受性评估。该研究未示出耐受性方面的发现,PK和PD结果显示出S3Y-CC-Cyno-CD38分子在非人灵长类中皮下递送的可行性。数据还表明高剂量SC注射具有相对更好的生物利用度和PD效应(图56A,图56B)。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文,其程度如同每个独立的出版物或专利申请具体地且个别地指出以引用的方式并入。
虽然本公开已结合其具体实施方案进行描述,但是应当理解,进一步的修改是可能的,并且本申请旨在覆盖一般而言遵循本公开的原理的本公开的任何变型形式、用途或改编,并且包括与本公开的此类偏离,所述偏离在本公开所属领域内的已知或惯常实践内,并且可以应用于上文所述的基本特征,并且落入权利要求的范围内。
其他实施方案在权利要求范围内。
Claims (26)
1.一种Fc抗原结合结构域构建体,所述Fc抗原结合结构域构建体包括:
a)第一多肽,所述第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域,和
iv)将所述第一Fc结构域单体与所述第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,所述第二多肽包括:
i)第三Fc结构域单体,
ii)第四Fc结构域单体,
iii)第二CD38重链结合结构域,和
iv)将所述第三Fc结构域单体与所述第四Fc结构域单体接合的接头;
c)第三多肽,所述第三多肽包括第五Fc结构域单体;
d)第四多肽,所述第四多肽包括第六Fc结构域单体;
e)第五多肽,所述第五多肽包括第一CD38轻链结合结构域;以及
f)第六多肽,所述第六多肽包括第二CD38轻链结合结构域;
其中所述第一Fc结构域单体和所述第三Fc结构域单体一起形成第一Fc结构域,所述第二Fc结构域单体和所述第五Fc结构域单体一起形成第二Fc结构域,所述第四Fc单体和所述第六Fc单体一起形成第三Fc结构域,所述第一CD38重链结合结构域和所述第一CD38轻链结合结构域一起形成第一Fab;并且所述第二CD38重链结合结构域和所述第二CD38轻链结合结构域一起形成第二Fab。
2.根据权利要求1所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第一多肽和所述第二多肽在序列上相同。
3.根据权利要求1所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第三多肽和所述第四多肽在序列上相同。
4.根据权利要求1所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第五多肽和所述第六多肽在序列上相同。
5.根据权利要求1所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第一多肽和所述第二多肽与SEQ ID NO:B至少95%相同,所述第三多肽和所述第四多肽与SEQ ID NO:C至少95%相同,并且所述第五多肽和所述第六多肽与SEQ ID NO:A至少95%相同。
6.根据权利要求1所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第一多肽和所述第二多肽与SEQ ID NO:B至少98%相同,所述第三多肽和所述第四多肽与SEQ ID NO:C至少98%相同,并且所述第五多肽和所述第六多肽与SEQ ID NO:A至少98%相同。
7.根据权利要求1所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第一多肽和所述第二多肽包含SEQ ID NO:B或由SEQ ID NO:B组成,所述第三多肽和所述第四多肽包含SEQ ID NO:C或由SEQ ID NO:C组成,并且所述第五多肽和所述第六多肽包含SEQ ID NO:A或由SEQ ID NO:A组成。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第一多肽和所述第二多肽在序列上相同,所述第三多肽和所述第四多肽在序列上相同,并且所述第五多肽和所述第六多肽在序列上相同。
9.一种组合物,所述组合物包含:
a)第一多肽,所述第一多肽包括:
i)第一Fc结构域单体,
ii)第二Fc结构域单体,
iii)第一CD38重链结合结构域,和
iv)将所述第一Fc结构域单体与所述第二Fc结构域单体接合的接头;
b)第二多肽,所述第二多肽包括第三Fc结构域单体;以及
c)第三多肽,所述第三多肽包括CD38轻链结合结构域。
10.根据权利要求9所述的组合物,其中所述第一多肽与SEQ ID NO:B至少95%相同,所述第二多肽与SEQ ID NO:C至少95%相同,并且所述第三多肽与SEQ ID NO:A至少95%相同。
11.根据权利要求9所述的组合物,其中所述第一多肽与SEQ ID NO:B至少98%相同,所述第二多肽与SEQ ID NO:C至少98%相同,并且所述第三多肽与SEQ ID NO:A至少98%相同。
12.根据权利要求9所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:B或由SEQ ID NO:B组成,所述第二多肽包含SEQ ID NO:C或由SEQ ID NO:C组成,并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:A或由SEQ ID NO:A组成。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述Fc结构域单体中的每一者的CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换。
14.根据前述权利要求中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中与人IgG1 CH3结构域的氨基酸序列相比,所述Fc结构域单体中的每一者的所述CH3结构域包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换。
15.根据前述权利要求中任一项中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述Fc结构域单体中的每一者独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有最多10个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
16.根据前述权利要求中任一项中任一项所述的Fc抗原结构域单体,其中所述单一氨基酸置换仅在所述CH3结构域中。
17.根据前述权利要求中任一项中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第一Fc结构域单体和所述第三Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进所述第一Fc结构域单体与所述第三Fc结构域单体之间的同源二聚化。
18.根据前述权利要求中任一项中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中所述第二Fc结构域单体和所述第五Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进所述第二Fc结构域单体与所述第五Fc结构域单体之间的异源二聚化,并且所述第四Fc结构域单体和所述第六Fc结构域单体包括最多8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个单一氨基酸置换,所述氨基酸置换促进所述第四Fc结构域单体与所述第六Fc结构域单体之间的异源二聚化。
19.根据前述权利要求中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中促进同源二聚化的所述置换选自表4A和表4B中的置换。
20.根据前述权利要求中任一项所述的Fc抗原结构域构建体,其中促进异源二聚化的所述置换选自表3中的置换。
21.一种治疗癌症或自身免疫疾病的方法,所述方法包括施用根据前述权利要求中任一项所述的组合物或构建体。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述癌症选自由以下项组成的适应症组:血液恶性肿瘤和/或实体肿瘤。
23.根据权利要求21所述的方法,其中所述癌症选自:诸如胃癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、NK细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、浆细胞白血病和多发性骨髓瘤。
24.根据权利要求22或23所述的方法,其中所述癌症对达雷木单抗或任何其他治疗性抗CD38单克隆抗体治疗有抗性。
25.根据权利要求21所述的方法,其中所述自身免疫疾病选自由以下自身抗体介导的疾病组成的组:重症肌无力(MG)、MuSK-MG、心肌炎、Lambert Eaton肌无力综合征、神经性肌强直、视神经脊髓炎、嗜睡症、急性运动轴突性神经病、Guillain-Barré综合征、Fisher综合征、急性感觉性共济失调性神经病、副肿瘤僵人综合征、慢性神经病变、周围神经病变、急性播散性脑脊髓炎、多发性硬化症、Goodpasture综合征、膜性肾病、肾小球性肾炎、肺泡蛋白沉着症、CIPD、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、大疱性类天疱疮、妊娠性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、新生儿红斑狼疮、疱疹样皮炎、Graves病、Addison病、卵巢功能不全、自身免疫性睾丸炎、Sjogren病、自身免疫性胃炎、类风湿关节炎、SLE、干眼病、血管炎(急性)、心脏炎、抗体介导的排斥反应。
26.一种治疗疾病的方法,所述疾病选自:AL淀粉样变性、Castleman病、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、意义未明的双克隆丙种球蛋白病、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)、重链病、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤,所述方法包括施用根据权利要求1至20中任一项所述的构建体或组合物。
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Application publication date: 20220722 |