JP2008054563A - 深在性真菌症起因菌の検出法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)試料から真菌DNAを取得する工程、(2)2種類以上のプライマーセットを同時に用いて、一反応系でPCR反応を行い、上記工程(1)で取得された真菌DNAをテンプレートとして増幅を行う工程、(3)2種類以上の菌種特異的プローブが固相化された固相化体に上記工程(2)で得られたPCR産物を供し、ハイブリダイゼーションを行う工程、及び、(4)上記工程(3)で固相化体にハイブリダイズされた真菌DNAを検出する工程により、試料中の真菌を検出する。
【選択図】なし
Description
の開発が試みられている。広範囲の真菌症起因菌を標的として、病原真菌共通プライマーで一段階目のPCR(Polymerase Chain Reaction:ポリメラーゼ連鎖反応)をかけた後、属あるいは種特異的なプライマーによる二段階目のPCRで増幅するか、もしくは直接塩基配列決定法によって属レベルから菌種までの同定を行う手法(特許文献1〜3)や、リアルタイムPCRによる増幅を行い、Tm値または系統解析により菌種の同定を行う方法(特許文献4)が開示されている。
(1)試料から真菌DNAを取得する工程、
(2)2種類以上のプライマーセットを同時に用いて、一反応系でPCR反応を行い、上記工程(1)で取得された真菌DNAをテンプレートとして増幅を行う工程、
(3)2種類以上の菌種特異的プローブが固相化された固相化体に上記工程(2)で得られたPCR産物を供し、ハイブリダイゼーションを行う工程、
(4)上記工程(3)で固相化体にハイブリダイズされた真菌DNAを検出する工程。
[2] プライマーセットが、少なくとも真菌のITS領域増幅プライマーセットと、IGS領域増幅プライマーセットを含むことを特徴とする項1に記載の方法。
[3] ITS領域増幅プライマーセットが、配列番号28に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーと、配列番号29に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーとを含むことを特徴とする項2に記載の方法。
[4] ITS領域増幅プライマーセットが、配列番号1及び2に記載の塩基配列からなるプライマーからなることを特徴とする項2又は3に記載の方法。
[5] IGS領域増幅プライマーセットが、配列番号3に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーと、配列番号4に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーとを含むことを特徴とする項2〜4のいずれかに記載の方法。
[6] IGS領域増幅プライマーセットが、配列番号3及び4に記載の塩基配列からなるプライマーからなることを特徴とする項2〜5のいずれかに記載の方法。
[7] 菌種特異的プローブが、少なくとも、Trichosporon属、Aspergillus属、Candida属に属する真菌菌種に対する特異的プローブを含むことを特徴とする項1〜6のいずれかに記載の方法。
[8] さらにCryptococcus属に属する真菌菌種に対する特異的プローブを含むことを特徴とする項7に記載の方法。
[9] 菌種特異的プローブが、少なくとも以下の菌種に対する特異的プローブを含むことを特徴とする項8に記載の方法。
Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida albicans、Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Cryptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoides
[10] 菌種特異的プローブが、配列表の配列番号5〜22に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とする項7〜9のいずれかに記載の方法。
[11] ハイブリダイゼーション工程のハイブリダイゼーションの温度が35〜40℃であり、洗浄の温度が室温である項10記載の方法。
[12] プライマーが標識されていることを特徴とする項1〜11のいずれかに記載の方法。
[13] 固相化体がマイクロタイタープレート又はチップであることを特徴とする項1〜12のいずれかに記載の方法。
[14] 菌種特異的プローブが、特定された位置に固相化されていることを特徴とする項1〜13のいずれかに記載の方法。
[15] 項1〜14のいずれかに記載の方法により真菌の存在が確認された場合に、深在性真菌症の疑いがあると判定することを特徴とする深在性真菌症の検出方法。
[16] 少なくとも以下の真菌に対する菌種特異的プローブが固相化された固相化担体。
Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida albicans、Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Cryptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoides
[17] 少なくとも、真菌のITS領域増幅プライマーセット及びIGS領域増幅プライマーセットと、菌種特異的プローブが固相化された固相化体とを含むことを特徴とする試薬キット。
[18] 深在性真菌症検出用である項17に記載の試薬キット。
深在性真菌症では、複数菌に感染している患者が多く見られる。しかし、現在行われている遺伝子診断では複数菌感染の解析は不可能である。また、血清診断では属特異的な検出キットを複数使用して複数回解析する必要があり、菌種の同定まで可能な方法はない。本発明の方法により、感染している菌種や菌数に無関係に一度に検査を行えることは非常に有利である。
(1)試料から真菌DNAを取得する工程、
(2)2種類以上のプライマーセットを同時に用いて、一反応系でPCR反応を行い、上記工程(1)で取得された真菌DNAをテンプレートとして増幅を行う工程、
(3) 2種類以上の菌種特異的プローブが固相化された固相化体に上記工程(2)で得られたPCR産物を供し、ハイブリダイゼーションを行う工程、
(4)上記工程(3)で固相化体にハイブリダイズされた真菌DNAを検出する工程。
試料としては、真菌を含む又はその可能性がある試料であればよく、代表的なものとしては、喀痰、胃液、気管支肺胞洗浄液(BALF)、胸水、腹水、髄液、全血などが挙げられる。
2種類以上のプライマーセットを同時に用いて、一反応系でPCR反応を行う方法は、マルチプレックスPCRとして知られている。本発明では、真菌DNAをテンプレートとして用いる他は、通常のマルチプレックスPCRの条件でPCR反応を行うことができる。
Regionの略であり、rRNAの一番目の小サブユニット(18S)と、大サブユニット(28S)との間に位置する内部転写スペーサー領域である。IGS領域増幅プライマーセットとは、真菌のIGS領域を増幅できるプライマーセットであり、IGS領域とは、Intergenic Spacer Regionの略であり、rRNAの大サブユニット(28S)と、二番目の小サブユニット(18S)との間に位置する遺伝子間スペーサー領域である。
アニーリング:50〜65℃、15〜60秒
伸長:72℃、30〜60秒
2種類以上の菌種特異的プローブを用いる他は、プローブが固相化された固相化体を用いるハイブリダイゼーション及び検出の方法を用いることができる。
fumi1-ami:5'-GCCGACACCCAACTTTATTTTTCTAAGG -3'(AY373851、512〜539位) (配列番号5)
Neosartorya fisheri, Aspergillus lentlusの配列と100%一致する。また、Aspergillus unilateralisと21/28、Aspergillus fumisynnematusと21/28、Aspergillus viridinutansと20/28、Neosartorya glabraと21/28、Neosartorya hiratsukaeと21/28、Neosartorya spinosaと20/28、Neosartorya udagawaeと20/28、Neosartorya aureolaと20/28、Neosartorya botucatensisと20/28の一致を示す。
しかし、これらの菌種は、臨床検体からの培養分離例がほとんどないため、実質的に問題とはならない。
fla1-ami:5'-TTGCCGAACGCAAATCAATCTTTT -3'(AY373848、508〜531位) (配列番号6)
Aspergillus orysae, Aspergillus parasiticusの配列と100%一致する。
しかし、これらの菌種は、臨床検体からの培養分離例がほとんどないため、実質的に問題とはならない。
nig1-ami:5'-CGCCTGCCGMCGTTWTCCAACCATTYTTT-3'(AF455522、534〜562位) (配列番号7)
Aspergillus foetidus, Aspergillus awamoriiの配列と100%一致する。また、Aspergillus ellipticusと25/29、Aspergillus tubingensisと25/29、Aspergillus wentiiと20/29の一致を示す。
しかし、これらの菌種は、臨床検体からの培養分離例がほとんどないため、実質的に問題とはならない。
alb1-ami:5'-CCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATT-3'(AF455428、122〜147位、100%の一致) (配列番号8)
Candida dubliniensisと23/26塩基の一致を示す。
alb2-ami:5'-ACGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGA-3'(AF455428、401〜429位、100%の一致) (配列番号9)
Candida dubliniensisと23/29塩基の一致を示す。
しかし、この菌種は、臨床検体からの培養分離例がほとんどないため、実質的に問題とはならない。
gla1-ami:5'-GGAGGGATAWGTGAGTGTTTTGTGCGTGC -3'(AF218966、308〜336位、96%の一
致) (配列番号10)
gla2-ami:5'-GACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCT -3'(AF218966、211〜239位、100%の一致) (配列番号11)
・Candida krusei検出用プローブ
kru1-ami:5'-GAGCGAAGCTGGCCGAGCGAACTAGACT -3'(AF455401、376〜403位、100%の一致) (配列番号12)
para1-ami:5'-GAAAGGCGGAGTATAAACTAATGGATAGG -3'(AF455433、418〜446位、100%の一致) (配列番号13)
para2-ami:5'-CCACTCATTGGTACAAACTCCAAAMMT -3'(AF455433、453〜479位、93%の一致) (配列番号14)
tro1-ami:5'-GTGGAAACTTATTTTAARCGACTTAGG -3'(AY939810、389〜415位、96%の一致)
(配列番号15)
tro2-ami:5'-GCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATA -3'(AY939810、438〜465位、93%の一致) (配列番号16)
neo1-ami:5'-CTCRGGTTTTATTACCTGTTGGACTTGGAT -3'(AY973273、340〜369、96%の一致) (配列番号17)
Cryptococcus amylolentusと25/30塩基の一致を示す。
しかし、この菌種は、臨床検体からの培養分離例がほとんどないため、実質的に問題とはならない。
asa1-ami:5'-GAGTGAATCAAGAWCGAAGTATAAGG -3'(AB081512、187〜212位、96%の一致) (配列番号18)
asa2-ami:5'-CAAGTACAAGTAGTGAGAGGAGTWGAGTG -3'(AB081512、163〜191位、96%の一致) (配列番号19)
muc1-ami:5'-CTAGGCTGGACTTTGGTTGAAATATT -3'(AB066433、127〜152位、100%の一致)
(配列番号20)
muc2-ami:5'-CCAAGTTGACCAGGTGTGGC -3'(AB066433、107〜126位、100%の一致) (配列番号21)
muc3-ami:5'-AAAGGTTGAATTTAATAGTCCAATC -3'(AB066433、185〜209位、100%の一致) (配列番号22)
ハイブリダイゼーション工程の条件は、使用するプローブ及び検出しようとする菌種に応じて適宜選択されるが、相同性の比較的高いDNAを多数用いるような場合には、一般的な条件検討の範囲として、以下のものが挙げられる。
温度:42〜60℃
塩濃度:4〜10×SSC、0.02〜0.1%SDS、又は、それと同等の条件
温度:25〜50℃
塩濃度:0.25〜2×SSC、0.1%SDS、又は、それと同等の条件
洗浄回数:2〜5回
塩濃度:5×SSC、0.02%SDS、又は、それと同等の条件
塩濃度:0.2〜2×SSC、0.1%SDS、又は、それと同等の条件
洗浄回数:2〜5回
る。あるいは、ストレプトアビジンと蛍光物質の結合体をビオチンと結合させ、蛍光を測定することにより検出を行うことができる。また、フルオレセイン等の蛍光物質の場合には、直接蛍光を測定することにより検出を行うことができる。
本発明の固相化担体は、少なくとも以下の真菌に対する菌種特異的プローブが固相化されたことを特徴とする。
Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida albicans、Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Cryptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoides
本発明の試薬キットは、好ましくは深在性真菌症検出用である。
ATCC(American Type Culture Collection)より購入したAspergillus fumigatus、Candida albicans、Candida tropicalis、Cryptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoides及びNBRC(NITE Biological Resource Center)より購入したAspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosisの真菌菌株を用いた。
1.真菌DNA
DNAは真菌菌液300μLにInstaGene(BIO-RAD社)を加えて細胞壁を破壊し、上清を取ることにより得られた。
各々のプライマーは、後のPCR増幅産物のEIA検出を考慮し、下流プライマーの5'末端をビオチン標識した。
真菌rRNA遺伝子ITS領域の増幅は以下の公知のユニバーサルITSプライマー(T. J. White, T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor, PCR protocols 1990, 315-322)を使用した。
ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCG(GenBank accession No. AF455428、19~36位)(配列番号1)
・下流プライマー(5'末端をビオチン標識)
ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC(GenBank accession No. AF455428、535~554位) (配列番号2)
Trichosporon asahii、Trichosporon mucoides rRNA遺伝子IGS領域の増幅には以下のTrichosporon属増幅用プライマー(T. Sugita, M. Nakajima, R. Ikeda, T. Matsushima, and T. Shinoda, JCM 2002, 40(5), 1826-1830)を使用した。
26SF:ATCCTTTGCAGACGACTTGA(配列番号3)
・下流プライマー(5'末端をビオチン標識)
5SR:AGCTTGACTTCGCAGATCGG(配列番号4)
先述の2種の上流プライマーと2種の下流プライマーを含む増幅反応液40μLに抽出したDNA 10μLを添加して、GeneAmp PCR System 9600(パーキン エルマー社)を使用し、以下の条件で行った。
5'末端をビオチン標識したプライマーを用いて、PCRによって増幅されたAspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida albicans、Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Cryptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoidesの各DNAは液相ハイブリダイゼーションを原理としたマイクロタイタープレートハイブリダイゼーションアッセイにて検出した。マイクロタイタープレートの各ウェルには以下に示した特異的オリゴヌクレオチドプローブを固相した。プローブはGenBankよりダウンロードをしたデータを参考に、各菌種特異的な配列を選び出して設計した。
fumi1-ami:5'-GCCGACACCCAACTTTATTTTTCTAAGG -3'(AY373851、512〜539位) (配列番号5)
fla1-ami:5'-TTGCCGAACGCAAATCAATCTTTT -3'(AY373848、508〜531位) (配列番号6)
nig1-ami:5'-CGCCTGCCGMCGTTWTCCAACCATTYTTT-3'(AF455522、534〜562位) (配列番号7)
alb1-ami:5'-CCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATT-3'(AF455428、122〜147位) (配列番号8)
alb2-ami:5'-ACGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGA-3'(AF455428、401〜429位) (配列番号9)
gla1-ami:5'-GGAGGGATAWGTGAGTGTTTTGTGCGTGC -3'(AF218966、308〜336位) (配列番号10)
gla2-ami:5'-GACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCT -3'(AF218966、211〜239位) (配列番号11)
kru1-ami:5'-GAGCGAAGCTGGCCGAGCGAACTAGACT -3'(AF455401、376〜403位) (配列番号12)
para1-ami:5'-GAAAGGCGGAGTATAAACTAATGGATAGG -3'(AF455433、418〜446位) (配列番号13)
para2-ami:5'-CCACTCATTGGTACAAACTCCAAAMMT -3'(AF455433、453〜479位) (配列番号14)
tro1-ami:5'-GTGGAAACTTATTTTAARCGACTTAGG -3'(AY939810、389〜415位) (配列番号15)
tro2-ami:5'-GCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATA -3'(AY939810、438〜465位) (配列番号16)
neo1-ami:5'-CTCRGGTTTTATTACCTGTTGGACTTGGAT -3'(AY973273、340〜369) (配列番号17)
asa1-ami:5'-GAGTGAATCAAGAWCGAAGTATAAGG -3'(AB081512、187〜212位) (配列番号18)
asa2-ami:5'-CAAGTACAAGTAGTGAGAGGAGTWGAGTG -3'(AB081512、163〜191位) (配列番号19)
muc1-ami:5'-CTAGGCTGGACTTTGGTTGAAATATT -3'(AB066433、127〜152位) (配列番号20)
muc2-ami:5'-CCAAGTTGACCAGGTGTGGC -3'(AB066433、107〜126位) (配列番号21)
muc3-ami:5'-AAAGGTTGAATTTAATAGTCCAATC -3'(AB066433、185〜209位) (配列番号22)
(1)マルチプレックスPCRの検出感度
Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida albicans、Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Cr
yptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoidesのDNAはPCRで全て増幅された。それらのPCR産物を挿入して、各々組換えプラスミドを作製し、更にプラスミド希釈系列を調製した。このプラスミド希釈系列を用いてマルチプレックスPCRの感度を求めたところ、各々以下の表のようになった。
先述のプラスミド希釈系列を鋳型としたPCR増幅産物を用いて、マイクロタイタープレートハイブリダイゼーションを行い、検出感度を求めた。その結果、PCRと同様、102コピー/チューブ以上の鋳型濃度のサンプルは陰性コントロール(ブランク)に比べ、以下の表のように有意に高いOD値を示した。
各プローブに、PCR検出対象となる真菌プラスミド104コピー/チューブの増幅産物をハイブリダイゼーションさせ、交差反応を確認した。その結果、各々のプローブに交差反応は認められず、特異性は高かった。表中、網掛けは特異的反応を示す。
PCRによる増幅の有無を確認するためにPCRチューブにインターナルコントロールを加えた。インターナルコントロールとしては、本法で使用しているプライマーで増幅されるが、いずれのプローブともハイブリダイズしないものを用い、PCRによる真菌DNAの増幅が問題なく行われていることを確認する。
ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC(GenBank accession No. AF455428、535〜554位) (配列番号2)
真菌プラスミドの希釈系列に50コピー/チューブのインターナルコントロールを加えたところ、以下の表の様にCandida glabrataの感度が102から103コピー/チューブへと低下した。そこでCandida glabrataの検出感度を上げるために新たにCandida glabrata増幅用の上流プライマーを追加した。
・上流プライマー
glaF:GTTTGGTAGTGAGTGATACTC(GenBank accession no. AF218966、147〜167位) (配列番号23)
インターナルコントロール検出用プローブの配列を以下に示す。
IC1-ami:5'-CCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTGGTT-3'(GenBank accession no. DQ645426、1052〜1080位) (配列番号24)
IC2-ami:5'-GCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTG-3' (GenBank accession no. DQ645426、1048〜1077位) (配列番号25)
複数菌検出反応を確認するために2種の真菌プラスミド(各102コピー/チューブ)を混合し、マルチプレックスPCR-マイクロタイタープレートハイブリダイゼーションを実施した。ただし、インターナルコントロールのプローブはIC2-amiである。
結果、以下の表のように添加した真菌プラスミドは同時に検出された。このことから本法は複数菌の検出が可能であることがわかった。表10中、網掛けは特異的反応を示す。
以下に検討プローブを記す。各プローブはGenBankよりダウンロードしたデータを参考に設計した。
fumi1-ami:5'-GCCGACACCCAACTTTATTTTTCTAAGG -3'(AY373851、512〜539位) (配列番号5)
fumi2-ami:5'-CCAACTTTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGG-3' (AY373851、520〜549位) (配列番号26)
fumi3-ami:5'-CCTCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCA-3'(AY373851、412〜440位) (配列番号27)
Claims (18)
- 少なくとも以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の真菌の検出方法。
(1)試料から真菌DNAを取得する工程、
(2)2種類以上のプライマーセットを同時に用いて、一反応系でPCR反応を行い、上記工程(1)で取得された真菌DNAをテンプレートとして増幅を行う工程、
(3)2種類以上の菌種特異的プローブが固相化された固相化体に上記工程(2)で得られたPCR産物を供し、ハイブリダイゼーションを行う工程、
(4)上記工程(3)で固相化体にハイブリダイズされた真菌DNAを検出する工程。 - プライマーセットが、少なくとも真菌のITS領域増幅プライマーセットと、IGS領域増幅プライマーセットを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ITS領域増幅プライマーセットが、配列番号28に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーと、配列番号29に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーとを含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- ITS領域増幅プライマーセットが、配列番号1及び2に記載の塩基配列からなるプライマーからなることを特徴とする請求項2又は3に記載の方法。
- IGS領域増幅プライマーセットが、配列番号3に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーと、配列番号4に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する15塩基を含むプライマーとを含むことを特徴とする請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
- IGS領域増幅プライマーセットが、配列番号3及び4に記載の塩基配列からなるプライマーからなることを特徴とする請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
- 菌種特異的プローブが、少なくとも、Trichosporon属、Aspergillus属、Candida属に属する真菌菌種に対する特異的プローブを含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- さらにCryptococcus属に属する真菌菌種に対する特異的プローブを含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 菌種特異的プローブが、少なくとも以下の菌種に対する特異的プローブを含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。
Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida albicans、Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Cryptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoides - 菌種特異的プローブが、配列表の配列番号5〜22に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とする請求項7〜9のいずれかに記載の方法。
- ハイブリダイゼーション工程のハイブリダイゼーションの温度が35〜40℃であり、洗浄の温度が室温である請求項10記載の方法。
- プライマーが標識されていることを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 固相化体がマイクロタイタープレート又はチップであることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 菌種特異的プローブが、特定された位置に固相化されていることを特徴とする請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の方法により真菌の存在が確認された場合に、深在性真菌症の疑いがあると判定することを特徴とする深在性真菌症の検出方法。
- 少なくとも以下の真菌に対する菌種特異的プローブが固相化された固相化担体。
Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Candida albicans、
Candida glabrata、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Cryptococcus neoformans、Trichosporon asahii、Trichosporon mucoides - 少なくとも、真菌のITS領域増幅プライマーセット及びIGS領域増幅プライマーセットと、菌種特異的プローブが固相化された固相化体とを含むことを特徴とする試薬キット。
- 深在性真菌症検出用である請求項17に記載の試薬キット。
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