JPWO2019123690A1 - 改良Ｔｍマッピング法 - Google Patents
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Abstract
【課題】融解温度（Ｔｍ）値測定誤差が±０．５℃以内のリアルタイムＰＣＲ機器でも少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に菌を識別・同定できる改良Ｔｍマッピング法を提供する。【解決手段】不完全一致配列の長鎖消光プローブを用いる改良Ｔｍマッピング法は、ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．５℃以内のリアルタイムＰＣＲ機器でも少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に菌を識別・同定出来る。従って、ほぼ全てのリアルタイムＰＣＲ機器でＴｍマッピング法の施行が可能となり、検体採取後４時間程度で不特定の感染症起炎菌が同定できる。【選択図】 図２
Description
本発明は、不完全一致配列の線状長鎖プローブ（Imperfect-Match Linear Long probes：IMLLプローブ）を用いたＴｍマッピング法に関する。
適切な抗菌薬治療を行い、重篤な敗血症患者を救命するためには、患者検体中の起炎菌を可能な限り迅速に検出・同定することが重要である。
しかし、現在の一般的な検査法では、検体採取から起炎菌の同定まで通常２〜３日を要する。
その結果、広域スペクトルの抗菌薬使用による多剤耐性菌の出現や、抗菌薬の選択ミスにより重篤患者が致死的となる危険性など、感染症早期の治療においては未だ重大なリスクを抱えている。
この問題を解決するために、検体採取後３時間以内に不特定の起炎菌同定を可能とするＴｍマッピング法（Melting Temperature Mapping Method）が提案されている（特許文献１、２および非特許文献１）。
しかし、現在の一般的な検査法では、検体採取から起炎菌の同定まで通常２〜３日を要する。
その結果、広域スペクトルの抗菌薬使用による多剤耐性菌の出現や、抗菌薬の選択ミスにより重篤患者が致死的となる危険性など、感染症早期の治療においては未だ重大なリスクを抱えている。
この問題を解決するために、検体採取後３時間以内に不特定の起炎菌同定を可能とするＴｍマッピング法（Melting Temperature Mapping Method）が提案されている（特許文献１、２および非特許文献１）。
Ｔｍマッピング法は、全ての細菌に共通な塩基配列領域をターゲットとして設計した細菌ユニバーサルプライマーを用い、得られた７つのＰＣＲ増幅産物のＴｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度）を測定し、その７つのＴｍ値の組合せ（＝菌種による塩基配列の相違を反映する）を菌の指紋（finger print）として、データベースとの照合により同定する方法であり、血液培養を行わず、採血から３時間程度で未知の起炎菌を同定する遺伝子検査法である。
化学療法の領域 Vol.31 S-1 2015
Ｔｍマッピング法は菌毎の塩基配列の相違を、ＰＣＲ増幅産物のＴｍ値の相違として同定に利用するため、僅か５℃程度の相違（×７つの組合せ）の中に２００菌以上がひしめくことになる。
その結果、ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．１℃以内の正確性が要求され、それを満たすリアルタイムＰＣＲ機器は市販の機器の中で僅か数台しかない。
このことは、Ｔｍマッピング法の普及の足かせとなっている。
そこで発明者らは、ＰＣＲ増幅産物ではなく、ロングプローブを用いる新たなＴｍマッピング法を検討することで、本発明に至った。
市販のほぼ全てのリアルタイムＰＣＲ機器でＴｍマッピング法が施行できるようになる。
その結果、ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．１℃以内の正確性が要求され、それを満たすリアルタイムＰＣＲ機器は市販の機器の中で僅か数台しかない。
このことは、Ｔｍマッピング法の普及の足かせとなっている。
そこで発明者らは、ＰＣＲ増幅産物ではなく、ロングプローブを用いる新たなＴｍマッピング法を検討することで、本発明に至った。
市販のほぼ全てのリアルタイムＰＣＲ機器でＴｍマッピング法が施行できるようになる。
ロングプローブとして、例えば、消光プローブを用い、４０塩基前後の非常に長いプローブで、かつ不完全一致配列として設計することで、殆どの菌に結合して幅広いＴｍ値を取得できるプローブを見出した。
数多くのミスマッチを有しても、プローブが長い分、多くの水素結合力で不可全一致配列に結合できる。
一方、長いプローブは二次構造をとって自己消光してしまう傾向が強いため、デルタＧを用いて二次構造を取らないロングプローブの試作を繰り返すなど研究を進め、動作確認をして最適なプローブを選出し、本発明を完成した。
このプローブはミスマッチの数と位置とにより、従来のＰＣＲ増幅産物のＴｍ値の菌種間の相違よりも菌種毎に幅広い、すなわち菌種間で最大２０℃以上の相違のあるＴｍ値を得ることが出来た。
発明者らは、このようなプローブをＩＭＬＬプローブ(Imperfect-Match Linear Long probe)と命名した。
数多くのミスマッチを有しても、プローブが長い分、多くの水素結合力で不可全一致配列に結合できる。
一方、長いプローブは二次構造をとって自己消光してしまう傾向が強いため、デルタＧを用いて二次構造を取らないロングプローブの試作を繰り返すなど研究を進め、動作確認をして最適なプローブを選出し、本発明を完成した。
このプローブはミスマッチの数と位置とにより、従来のＰＣＲ増幅産物のＴｍ値の菌種間の相違よりも菌種毎に幅広い、すなわち菌種間で最大２０℃以上の相違のあるＴｍ値を得ることが出来た。
発明者らは、このようなプローブをＩＭＬＬプローブ(Imperfect-Match Linear Long probe)と命名した。
実際に７つのＩＭＬＬプローブを用い、先ず７１菌種のＴｍマッピング形の予備データベースを作成した。
その結果、理論的にＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．５℃以内のリアルタイムＰＣＲ機器でも少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に菌を識別・同定出来ることが分かった。
現在市販されているリアルタイムＰＣＲ機器のＰＣＲチューブ間測定誤差は殆どが±０．３℃以内であるため、ＩＭＬＬプローブを用いれば、ほぼ全てのリアルタイムＰＣＲ機器でＴｍマッピング法の施行が可能となる。
一方で、設計したプローブの性能上、例えばEnterococcus faecalisとEnterococcus faeciumとの識別はほぼ不可能であるが、少なくとも属を間違うことは無い。
また、Staphylococcus属も配列が近いために種レベルの識別に問題があったが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を特異的に識別するショートプローブを導入した結果、僅か１０分の追加施行で黄色ブドウ球菌か、あるいは黄色ブドウ球菌以外のStaphylococcus属であるかの判定が可能となった。
以下、本発明を詳細に説明する。
その結果、理論的にＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．５℃以内のリアルタイムＰＣＲ機器でも少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に菌を識別・同定出来ることが分かった。
現在市販されているリアルタイムＰＣＲ機器のＰＣＲチューブ間測定誤差は殆どが±０．３℃以内であるため、ＩＭＬＬプローブを用いれば、ほぼ全てのリアルタイムＰＣＲ機器でＴｍマッピング法の施行が可能となる。
一方で、設計したプローブの性能上、例えばEnterococcus faecalisとEnterococcus faeciumとの識別はほぼ不可能であるが、少なくとも属を間違うことは無い。
また、Staphylococcus属も配列が近いために種レベルの識別に問題があったが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を特異的に識別するショートプローブを導入した結果、僅か１０分の追加施行で黄色ブドウ球菌か、あるいは黄色ブドウ球菌以外のStaphylococcus属であるかの判定が可能となった。
以下、本発明を詳細に説明する。
従来のＴｍマッピング法とは、図１に工程の流れを示すように、以下の工程で行う感染症起炎菌の迅速同定方法である。
なお、図１は、工程の流れを示したものであって、グラフはイメージを示したに過ぎない。
（１）血液などの検体から微生物のDNAを抽出する工程。
（２）抽出した微生物ＤＮＡを鋳型とし、複数のユニバーサルプライマーを用いてネステッドＰＣＲを行う工程。
（３ａ）上記の工程で得られた複数の遺伝子増幅物（ＰＣＲアプリコン）の融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）解析を行う工程。
（４）複数の融解温度（melting temperature：Ｔｍ）値を二次元にマッピングする工程。
（５）二次元マッピングの「形状」をデータベースと照合する工程。
により感染症起因菌を同定する方法。
なお、図１は、工程の流れを示したものであって、グラフはイメージを示したに過ぎない。
（１）血液などの検体から微生物のDNAを抽出する工程。
（２）抽出した微生物ＤＮＡを鋳型とし、複数のユニバーサルプライマーを用いてネステッドＰＣＲを行う工程。
（３ａ）上記の工程で得られた複数の遺伝子増幅物（ＰＣＲアプリコン）の融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）解析を行う工程。
（４）複数の融解温度（melting temperature：Ｔｍ）値を二次元にマッピングする工程。
（５）二次元マッピングの「形状」をデータベースと照合する工程。
により感染症起因菌を同定する方法。
本発明の改良Ｔｍマッピング法は、図２に工程の流れを示すように、上記（３ａ）の工程が、上記（２）の工程で得られた遺伝子増幅物（ＰＣＲアプリコン）に、不完全一致配列の線状長鎖プローブ（Imperfect-Match Linear Long probes：ＩＭＬＬプローブ）を加え、遺伝子増幅物のＴｍ値ではなく、ＩＭＬＬプローブのＴｍ値の解析を行う工程（３）に置き換わったものである。以後の（４）および（５）工程は、従来のＴｍマッピング法と同様である。
・工程（１）：血液などの検体から微生物のＤＮＡを抽出する工程。
臨床試料（２ｍＬの全血試料など）からＰＣＲ用鋳型として細菌ＤＮＡを直接抽出する。
抽出方法は、特に限定されず、臨床試料の採取、ＤＮＡ抽出などは公知の方法を用いればよい。
臨床試料（２ｍＬの全血試料など）からＰＣＲ用鋳型として細菌ＤＮＡを直接抽出する。
抽出方法は、特に限定されず、臨床試料の採取、ＤＮＡ抽出などは公知の方法を用いればよい。
・工程（２）：抽出した微生物ＤＮＡを鋳型とし、複数の細菌ユニバーサルプライマー（ほぼ全ての細菌を検出するプライマー）を用いてネステッドＰＣＲを行う工程。
本工程は、５〜７つの細菌ユニバーサルプライマーセット（第２のＰＣＲにおいて１つのチューブにつき１つのプライマーセット）を用いたネステッドＰＣＲを含む。
これらのプライマーはほとんどすべての種の細菌を検出することができる。
この工程の精度を高めるために、細菌ＤＮＡのコンタミネーションのない、真核生物をホスト細胞としてリコンビナントに作製した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
該ポリメラーゼを用いることにより、細菌ユニバーサルＰＣＲにおいても偽陽性結果の無い、高感度で信頼性の高い細菌検出が可能となり、それによってＰＣＲにより患者サンプルから感染症起炎菌を直接同定することが可能になる。
本工程において、ネステッドＰＣＲが実行され、複数個、例えば、５個のＰＣＲ増幅物（アンプリコン）が得られる（図３）。
本工程は、５〜７つの細菌ユニバーサルプライマーセット（第２のＰＣＲにおいて１つのチューブにつき１つのプライマーセット）を用いたネステッドＰＣＲを含む。
これらのプライマーはほとんどすべての種の細菌を検出することができる。
この工程の精度を高めるために、細菌ＤＮＡのコンタミネーションのない、真核生物をホスト細胞としてリコンビナントに作製した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
該ポリメラーゼを用いることにより、細菌ユニバーサルＰＣＲにおいても偽陽性結果の無い、高感度で信頼性の高い細菌検出が可能となり、それによってＰＣＲにより患者サンプルから感染症起炎菌を直接同定することが可能になる。
本工程において、ネステッドＰＣＲが実行され、複数個、例えば、５個のＰＣＲ増幅物（アンプリコン）が得られる（図３）。
・工程（３）：ＩＭＬＬプローブのＴｍ値の解析を行う工程
例えば、領域１および領域３のＰＣＲアンプリコンにそれぞれ２つのプローブターゲットを設け、合計７つ（５種類）のＰＣＲアンプリコンを７種類のＩＭＬＬプローブ（図３および図４）と混合する。
７つのＴｍ値は、７種類のＩＭＬＬプローブを分析することによって得られる。
例えば、領域１および領域３のＰＣＲアンプリコンにそれぞれ２つのプローブターゲットを設け、合計７つ（５種類）のＰＣＲアンプリコンを７種類のＩＭＬＬプローブ（図３および図４）と混合する。
７つのＴｍ値は、７種類のＩＭＬＬプローブを分析することによって得られる。
・工程（４）：複数のＴｍ値を二次元にマッピングする工程。
例えば、７つのＴｍ値を２つの次元にマッピングする。このプロットの形状（Ｔｍマッピング形状）は、図５に示すように種あるいは属に固有な形状を示す。
これは高分解能融解曲線（High Resolution Melting-curve: HRM）解析ではなく、Ｔｍ値のみが測定されている。
例えば、７つのＴｍ値を２つの次元にマッピングする。このプロットの形状（Ｔｍマッピング形状）は、図５に示すように種あるいは属に固有な形状を示す。
これは高分解能融解曲線（High Resolution Melting-curve: HRM）解析ではなく、Ｔｍ値のみが測定されている。
・工程（５）：二次元マッピングの「形状」をデータベースと照合する工程。
Ｔｍマッピング形状をデータベースの形状と比較することにより、感染症起炎菌を迅速に同定することができる。
データベースの形状との相似の程度を図６に示すように差異値（Difference Value）の計算式により定量的に示す。
このDifference Valueが０に近ければ近い程、形状がより一致していることを意味する。
Ｔｍマッピング形状をデータベースの形状と比較することにより、感染症起炎菌を迅速に同定することができる。
データベースの形状との相似の程度を図６に示すように差異値（Difference Value）の計算式により定量的に示す。
このDifference Valueが０に近ければ近い程、形状がより一致していることを意味する。
改良Ｔｍマッピング法に用いる不完全一致配列の線状長鎖プローブ（Imperfect-Match Linear Long probes：ＩＭＬＬプローブ）の「長鎖プローブ」とは、３５〜５０塩基、好ましくは、３５〜４８塩基、より好ましくは、３８〜４５塩基のオリゴヌクレオチドを意味する。
ＩＭＬＬプローブの菌種の相違によるＴｍ値の相違は、最大で２０℃以上である。
一方、従来のＴｍマッピング方法の菌種の相違によるＴｍ値の相違は、最大でも５℃程度である。
実際に７１菌種の予備データベース中での、従来のTm mapping法で得られるＴｍ値のばらつきと、改良Tm mapping法のＩＭＬＬプローブで得られるＴｍ値のばらつきの差を図７に示す。
さらに、ＩＭＬＬプローブは、標的配列にミスマッチを有する位置にも結合することができる長さのプローブである。
例として、下記で作製したＩＭＬＬプローブ１−２が予備データベース中の７１菌種それぞれと有するミスマッチを図８に示す。
本発明のＩＭＬＬプローブは、異なる塩基配列を有する多くの細菌種に結合することができる。
そして、ＩＭＬＬプローブは、長いプローブにも関わらずプローブ自体に二次構造が形成されないため、標的配列への結合が減弱してしまうことはない。
ＩＭＬＬプローブは、例えば、大腸菌１６ＳリボソーマルＲＮＡ（アクセッション番号ＡＢ５４８５８２）と結合する複数の部位とし、マルチアラインメントソフトウェアプログラム（ClustalX）を用いて設計し、化学合成すればよい。
ＩＭＬＬプローブの菌種の相違によるＴｍ値の相違は、最大で２０℃以上である。
一方、従来のＴｍマッピング方法の菌種の相違によるＴｍ値の相違は、最大でも５℃程度である。
実際に７１菌種の予備データベース中での、従来のTm mapping法で得られるＴｍ値のばらつきと、改良Tm mapping法のＩＭＬＬプローブで得られるＴｍ値のばらつきの差を図７に示す。
さらに、ＩＭＬＬプローブは、標的配列にミスマッチを有する位置にも結合することができる長さのプローブである。
例として、下記で作製したＩＭＬＬプローブ１−２が予備データベース中の７１菌種それぞれと有するミスマッチを図８に示す。
本発明のＩＭＬＬプローブは、異なる塩基配列を有する多くの細菌種に結合することができる。
そして、ＩＭＬＬプローブは、長いプローブにも関わらずプローブ自体に二次構造が形成されないため、標的配列への結合が減弱してしまうことはない。
ＩＭＬＬプローブは、例えば、大腸菌１６ＳリボソーマルＲＮＡ（アクセッション番号ＡＢ５４８５８２）と結合する複数の部位とし、マルチアラインメントソフトウェアプログラム（ClustalX）を用いて設計し、化学合成すればよい。
具体的なIMLL -プローブとして、例えば以下のプローブを作成した。
＜IMLLプローブ1-1＞
・5'-GTTATCCCACTCTAATAAGCAGGTTACCTACGTATTACTCACCC-3 '：配列番号１
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNA（アクセッション番号AB548582）の84-126］
＜IMLLプローブ1-2＞
・5'-CACCTACTAGCTAATCTTATCTGGGCACATCCGATGGC-3 '：配列番号２
［プローブサイズ：38bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの193-230］
＜IMLLプローブ2-1＞
・5'-CACGCGGCATGGCTCCATCAGGCTTTCCCCCATTGTCGAAGATTC-3'：配列番号３
［プローブサイズ：45bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの335-379］
＜IMLLプローブ3-1＞
・5'-CGCCCTGTAATTCCGAATAACGCTAGCTCCCACCGTATTAC-3 '：配列番号４
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-2＞
・5'-CCAAGTTGAGCCCGGGCCTTTCACTACTGACTTAACAAACCGCC-3 '：配列番号５
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの557-600］
＜IMLLプローブ4-1＞
・5'-GGCACAACCTCTTAATACTCATCGTTTACAGCGTGGAC-3 '：配列番号６
［プローブサイズ：38 bp, 大腸菌16S rRNAの776-813］
＜IMLLプローブ5＞
・5'-ATCTCTGCAAAGTTCTAAGGATGTCAAGATTAGGTAAGGTTC-3 '：配列番号７
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの949-990］
＜S. aureus検出用ショートプローブ＞
・5'-TATCTAATGCAGCGCGGATC-3 '：配列番号８
［プローブサイズ：20 bp、結合部位：黄色ブドウ球菌16S rRNA（Accession No. AB681291)の211-230）
ここで、ＩＭＬＬプローブは、マルチアライメントウェアプログラムを用いて設計したものであり、ターゲットとする結合部位により、次のようなＩＭＬＬプローブを使用することもできる。
＜IMLLプローブ1-3＞
・5'-CAGACCAGCTAACGATCGTCGCCTTAGTAAGCCGTTACCC-3 '：配列番号２１
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの231-270］
＜IMLLプローブ1-4＞
・5'-CTCAGACCAGCTAACGATCGTTGCCTTAGTAAGCCGTTACCT-3 '：配列番号２２
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの231-272］
＜IMLLプローブ2-2＞
・5'-GTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGC-3 ':配列番号２３
［プローブサイズ：43bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの367-409］
＜IMLLプローブ3-3＞
・5'-CCTTATCGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTAC-3 '：配列番号２４
［プローブサイズ：35bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの401-435］
＜IMLLプローブ3-4＞
・5'-CGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTAC-3 '：配列番号２５
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-5＞
・5'-GGCCGACTAATTCCGATTAACGCTTCCACGCTCCGTATTAC-3 '：配列番号２６
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-6＞
・5'-CTTAACAAACCGCCTACGCACCCTTTAAGCCCAATAATTCCGATTAACGC-3 '：配列番号２７
［プローブサイズ：50bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの521-570］
＜IMLLプローブ3-7＞
・5'-CTCAAGTTTGCCAGTTTCCGATGAAGTTCCCAGGTTGAGC-3 '：配列番号２８
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの590-629］
＜IMLLプローブ3-8＞
・5'-CTCAAGTTTGCCAGTTTCGGATGCAGTTTCCAGGTTGAGC-3 '：配列番号２９
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの590-629］
＜IMLLプローブ4-2＞
・5'-CCACCTCTATGCAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGG-3 '：配列番号３０
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの768-809］
＜IMLLプローブ6-1＞
・5'-CCTCCAGTTTGTCATCGGCAGTCTACATTGAGTTCCCAAC-3 '：配列番号３１
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1112-1151］
＜IMLLプローブ6-2＞
・5'-CCTCCAGTTTGTCACCGGCAGTCTACATTGAGTTCCCAAC-3 '：配列番号３２
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1112-1151］
＜IMLLプローブ7-1＞
・5'-CTTCATGTAATCAGGTTGCAGACTCCAATCCGGACTAAGACGC-3 ':配列番号３３
［プローブサイズ：43bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1265-1307］
＜IMLLプローブ7-2＞
・5'-CTAGCGATTCCGACTTCATGAATACGAGTTGCAGCCTACAAT-3 ':配列番号３４
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1279-1320］
＜IMLLプローブ1-1＞
・5'-GTTATCCCACTCTAATAAGCAGGTTACCTACGTATTACTCACCC-3 '：配列番号１
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNA（アクセッション番号AB548582）の84-126］
＜IMLLプローブ1-2＞
・5'-CACCTACTAGCTAATCTTATCTGGGCACATCCGATGGC-3 '：配列番号２
［プローブサイズ：38bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの193-230］
＜IMLLプローブ2-1＞
・5'-CACGCGGCATGGCTCCATCAGGCTTTCCCCCATTGTCGAAGATTC-3'：配列番号３
［プローブサイズ：45bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの335-379］
＜IMLLプローブ3-1＞
・5'-CGCCCTGTAATTCCGAATAACGCTAGCTCCCACCGTATTAC-3 '：配列番号４
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-2＞
・5'-CCAAGTTGAGCCCGGGCCTTTCACTACTGACTTAACAAACCGCC-3 '：配列番号５
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの557-600］
＜IMLLプローブ4-1＞
・5'-GGCACAACCTCTTAATACTCATCGTTTACAGCGTGGAC-3 '：配列番号６
［プローブサイズ：38 bp, 大腸菌16S rRNAの776-813］
＜IMLLプローブ5＞
・5'-ATCTCTGCAAAGTTCTAAGGATGTCAAGATTAGGTAAGGTTC-3 '：配列番号７
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの949-990］
＜S. aureus検出用ショートプローブ＞
・5'-TATCTAATGCAGCGCGGATC-3 '：配列番号８
［プローブサイズ：20 bp、結合部位：黄色ブドウ球菌16S rRNA（Accession No. AB681291)の211-230）
ここで、ＩＭＬＬプローブは、マルチアライメントウェアプログラムを用いて設計したものであり、ターゲットとする結合部位により、次のようなＩＭＬＬプローブを使用することもできる。
＜IMLLプローブ1-3＞
・5'-CAGACCAGCTAACGATCGTCGCCTTAGTAAGCCGTTACCC-3 '：配列番号２１
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの231-270］
＜IMLLプローブ1-4＞
・5'-CTCAGACCAGCTAACGATCGTTGCCTTAGTAAGCCGTTACCT-3 '：配列番号２２
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの231-272］
＜IMLLプローブ2-2＞
・5'-GTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGC-3 ':配列番号２３
［プローブサイズ：43bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの367-409］
＜IMLLプローブ3-3＞
・5'-CCTTATCGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTAC-3 '：配列番号２４
［プローブサイズ：35bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの401-435］
＜IMLLプローブ3-4＞
・5'-CGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTAC-3 '：配列番号２５
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-5＞
・5'-GGCCGACTAATTCCGATTAACGCTTCCACGCTCCGTATTAC-3 '：配列番号２６
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-6＞
・5'-CTTAACAAACCGCCTACGCACCCTTTAAGCCCAATAATTCCGATTAACGC-3 '：配列番号２７
［プローブサイズ：50bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの521-570］
＜IMLLプローブ3-7＞
・5'-CTCAAGTTTGCCAGTTTCCGATGAAGTTCCCAGGTTGAGC-3 '：配列番号２８
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの590-629］
＜IMLLプローブ3-8＞
・5'-CTCAAGTTTGCCAGTTTCGGATGCAGTTTCCAGGTTGAGC-3 '：配列番号２９
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの590-629］
＜IMLLプローブ4-2＞
・5'-CCACCTCTATGCAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGG-3 '：配列番号３０
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの768-809］
＜IMLLプローブ6-1＞
・5'-CCTCCAGTTTGTCATCGGCAGTCTACATTGAGTTCCCAAC-3 '：配列番号３１
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1112-1151］
＜IMLLプローブ6-2＞
・5'-CCTCCAGTTTGTCACCGGCAGTCTACATTGAGTTCCCAAC-3 '：配列番号３２
［プローブサイズ：40bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1112-1151］
＜IMLLプローブ7-1＞
・5'-CTTCATGTAATCAGGTTGCAGACTCCAATCCGGACTAAGACGC-3 ':配列番号３３
［プローブサイズ：43bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1265-1307］
＜IMLLプローブ7-2＞
・5'-CTAGCGATTCCGACTTCATGAATACGAGTTGCAGCCTACAAT-3 ':配列番号３４
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの1279-1320］
本発明の改良Ｔｍマッピング法の工程（２）に用いるユニバーサルプライマーは、バクテリアの１６ＳリボソーマルＲＮＡ遺伝子の、例えば、７つの領域を普遍的に増幅するように、細菌保存領域（bacterial conserved region）を標的にして設計すればよい。
具体的には、マルチプルアラインメントソフトウェアプログラム（Clustal X）を用いて設計し、化学合成すればよい。
具体的なプライマーは以下とおりである。
＜ファーストＰＣＲ用プライマー＞
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'：配列番号９
・逆方向：5'-CCGGGAACGTATTCACC-3'：配列番号１０
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域１プライマー＞
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'：配列番号１１
・逆方向：5'-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3'：配列番号１２
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域２プライマー＞
・順方向：5'-GACTCCTACGGGAGGCA-3'：配列番号１３
・逆方向：5'-TATTACCGCGGCTGCTG-3'：配列番号１４
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域３プライマー＞
・順方向：5'-AGCAGCCGCGGTAATA-3'：配列番号１５
・逆方向：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3 '：配列番号１６
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域４プライマー＞
・順方向：5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3 '：配列番号１７
・逆方向：5'-AATTAAACCACATGCTCCACC-3 '：配列番号１８
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域5プライマー＞
・順方向：5'-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3 '：配列番号１９
・逆方向：5'-GAGCTGACGACAGCCAT-3'：配列番号２０
具体的には、マルチプルアラインメントソフトウェアプログラム（Clustal X）を用いて設計し、化学合成すればよい。
具体的なプライマーは以下とおりである。
＜ファーストＰＣＲ用プライマー＞
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'：配列番号９
・逆方向：5'-CCGGGAACGTATTCACC-3'：配列番号１０
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域１プライマー＞
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'：配列番号１１
・逆方向：5'-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3'：配列番号１２
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域２プライマー＞
・順方向：5'-GACTCCTACGGGAGGCA-3'：配列番号１３
・逆方向：5'-TATTACCGCGGCTGCTG-3'：配列番号１４
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域３プライマー＞
・順方向：5'-AGCAGCCGCGGTAATA-3'：配列番号１５
・逆方向：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3 '：配列番号１６
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域４プライマー＞
・順方向：5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3 '：配列番号１７
・逆方向：5'-AATTAAACCACATGCTCCACC-3 '：配列番号１８
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域5プライマー＞
・順方向：5'-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3 '：配列番号１９
・逆方向：5'-GAGCTGACGACAGCCAT-3'：配列番号２０
・ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピングデータベースの構築。
QIAGEN社のRotorGeneQ（温度均一性：±0.1℃）を使用して複数回（例えば３回）で測定したＴｍ値の平均を用い、先ず７１菌種のＴｍマッピング形状を有する予備データベースを構築した（図５）。
細菌は臨床検体から得られ、次にシーケンスにて配列決定され、種レベルで同定された。
データベースはデータ量の変更が出来、容易にデータの変更および更新が可能である。
データベース中の個々のＴｍマッピング形状は、各細菌種のＩＭＬＬ Ｑプローブのハイブリダイゼーションにおけるプローブ−標的ミスマッチの数および位置を反映する。
すなわち、各細菌種の特異的塩基配列を反映して、ユニークな形状を示す。
一部のＴｍマッピング形状にはデータポイントがない。
これは、ＩＭＬＬプローブがそれらの標的領域に結合しないので、そのポイントのＴｍ値を得ることができないという事実による。
起炎菌を同定するために、同定ソフトウェアプログラムは、Ｔｍマッピング形状の相同性を示す差異値（Difference Value）の計算に加えて、ＩＭＬＬプローブ結合の有無の同じパターンを絞り込むことで、データベース中の細菌の検索範囲を狭める。
すなわち、ＩＭＬＬプローブ結合のパターンも細菌種を見分ける特徴として利用する。
QIAGEN社のRotorGeneQ（温度均一性：±0.1℃）を使用して複数回（例えば３回）で測定したＴｍ値の平均を用い、先ず７１菌種のＴｍマッピング形状を有する予備データベースを構築した（図５）。
細菌は臨床検体から得られ、次にシーケンスにて配列決定され、種レベルで同定された。
データベースはデータ量の変更が出来、容易にデータの変更および更新が可能である。
データベース中の個々のＴｍマッピング形状は、各細菌種のＩＭＬＬ Ｑプローブのハイブリダイゼーションにおけるプローブ−標的ミスマッチの数および位置を反映する。
すなわち、各細菌種の特異的塩基配列を反映して、ユニークな形状を示す。
一部のＴｍマッピング形状にはデータポイントがない。
これは、ＩＭＬＬプローブがそれらの標的領域に結合しないので、そのポイントのＴｍ値を得ることができないという事実による。
起炎菌を同定するために、同定ソフトウェアプログラムは、Ｔｍマッピング形状の相同性を示す差異値（Difference Value）の計算に加えて、ＩＭＬＬプローブ結合の有無の同じパターンを絞り込むことで、データベース中の細菌の検索範囲を狭める。
すなわち、ＩＭＬＬプローブ結合のパターンも細菌種を見分ける特徴として利用する。
・ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング法の精度の評価（７１菌種）。
ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング方法の精度を評価するために、予備データベースに登録された同じ７１種の細菌ＤＮＡを用いて、QIAGEN社のRotorGeneQ（温度均一性：±０．１℃）を使用してブラインドテストを行った。
すなわち、細菌の名前を隠して、細菌ＤＮＡを同定した。７１菌種の試験では、Staphylococcus属においては種レベル（Staphylococcus aureusまたはStaphylococcus hemolyticusまたはStaphylococcus hominisまたはStaphylococcus lugdunensis）でのＴｍマッピング結果を絞り込むことはできなかった。
同様にEnterococcus faecalisとEnterococcus faeciumとは区別して同定することは出来なかった。
残り６５菌種のＴｍマッピング結果は、データベース中の配列決定された細菌ＤＮＡと一致した。
Difference Value値の平均値は０．２４２であり、範囲は０．０９〜０．３０（標準偏差＝０．０８）であった。
ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング方法の精度を評価するために、予備データベースに登録された同じ７１種の細菌ＤＮＡを用いて、QIAGEN社のRotorGeneQ（温度均一性：±０．１℃）を使用してブラインドテストを行った。
すなわち、細菌の名前を隠して、細菌ＤＮＡを同定した。７１菌種の試験では、Staphylococcus属においては種レベル（Staphylococcus aureusまたはStaphylococcus hemolyticusまたはStaphylococcus hominisまたはStaphylococcus lugdunensis）でのＴｍマッピング結果を絞り込むことはできなかった。
同様にEnterococcus faecalisとEnterococcus faeciumとは区別して同定することは出来なかった。
残り６５菌種のＴｍマッピング結果は、データベース中の配列決定された細菌ＤＮＡと一致した。
Difference Value値の平均値は０．２４２であり、範囲は０．０９〜０．３０（標準偏差＝０．０８）であった。
・予備データベース中の７１種の細菌のＴｍマッピング形状の類似性を評価
評価を表１（図９）に示す。
定義したDifference Value値が、Ｔｍマッピング形状のデータベースに登録されたそれぞれの細菌種と、その他の細菌種との差異を反映している。
Difference Value値がゼロに近づくほど、データベースに登録された細菌種の形状とＴｍマッピング形状がより似る。
測定機器におけるＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差（＝測定機器の温度均一性）が±０．１℃以内であれば、Difference Value値の測定誤差範囲は、０．２８以内になる。
同様に、測定機器におけるＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．２℃、±０．３℃、±０．４℃、±０．５℃、±０．６℃以内であれば、Difference Value値の測定誤差範囲は０．５３，０．８０，１．０６，１．３３，１．５９以内となる。
Difference Value値による各細菌種の類似性の解析の結果、Enterococcus faecalisとEnterococcus faeciumとは区別して同定することは出来ないと分かった。
また、Staphylococcus属においては種レベルでの同定が難しいことも判明した。
その他の６５菌種においては、他菌種とのDifference Value値を相互に１．３３以上有している為、機器の温度均一性（ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差）が±０．５℃以内の測定機器を用いれば、少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に同定可能であると分かった。
すなわち、従来のＴｍマッピング法では、ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．１℃の測定機器しか使用できないものが、本発明により、Ｔｍマッピング法を実施できる機器が格段に拡大する。
評価を表１（図９）に示す。
定義したDifference Value値が、Ｔｍマッピング形状のデータベースに登録されたそれぞれの細菌種と、その他の細菌種との差異を反映している。
Difference Value値がゼロに近づくほど、データベースに登録された細菌種の形状とＴｍマッピング形状がより似る。
測定機器におけるＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差（＝測定機器の温度均一性）が±０．１℃以内であれば、Difference Value値の測定誤差範囲は、０．２８以内になる。
同様に、測定機器におけるＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．２℃、±０．３℃、±０．４℃、±０．５℃、±０．６℃以内であれば、Difference Value値の測定誤差範囲は０．５３，０．８０，１．０６，１．３３，１．５９以内となる。
Difference Value値による各細菌種の類似性の解析の結果、Enterococcus faecalisとEnterococcus faeciumとは区別して同定することは出来ないと分かった。
また、Staphylococcus属においては種レベルでの同定が難しいことも判明した。
その他の６５菌種においては、他菌種とのDifference Value値を相互に１．３３以上有している為、機器の温度均一性（ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差）が±０．５℃以内の測定機器を用いれば、少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に同定可能であると分かった。
すなわち、従来のＴｍマッピング法では、ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．１℃の測定機器しか使用できないものが、本発明により、Ｔｍマッピング法を実施できる機器が格段に拡大する。
例えば、７つのＩＭＬＬプローブ（配列番号１〜７）を用い、先ず７１菌種のＴｍマッピング形状予備データベースを作成した結果、ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．５℃以内のリアルタイムＰＣＲ機器でも少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に菌を識別・同定出来ることを示した。
現在市販されているリアルタイムＰＣＲ機器のＰＣＲチューブ間測定誤差は殆どが±０．３℃以内であるため、ＩＭＬＬプローブを用いれば、ほぼ全ての機器でＴｍマッピング法の施行が可能となった。
現在市販されているリアルタイムＰＣＲ機器のＰＣＲチューブ間測定誤差は殆どが±０．３℃以内であるため、ＩＭＬＬプローブを用いれば、ほぼ全ての機器でＴｍマッピング法の施行が可能となった。
一方、敗血症患者から採取した全血検体（ＥＤＴＡ採血管２ｍＬ）１４検体を用いて、ＩＭＬＬローブ（配列番号１〜７）を用いたＴｍマッピング法の精度を従来の培養法のそれと比較して評価した。
リアルタイムPCR機器はQIAGEN社のRotorGeneQ（温度均一性：±０．１℃）を用い、起炎菌データベースは７１菌種の予備データベースを使用した。
培養法またはシーケンス結果と比較したＩＭＬＬプローブを用いた個々のＴｍマッピング法起炎菌同定結果を表２（図１０）に示す。
Ｔｍマッピング法起炎菌同定結果が培養結果と一致しない場合、シーケンス法を用いて再度菌種同定を行った。合計１４検体でＴｍマッピング法による起炎菌同定を行った結果、１４検体全て（１４／１４）において、培養結果またはシーケンス結果と一致した。
但し、ＩＭＬＬプローブ法にてStaphylococcus属と同定された場合、S. aureus検出用ショートプローブを用い、S. aureusか？或いはそれ以外のStaphylococcus属（=CNS）か？…の追加検査を行っている（約１０分の追加検査で判定可能）。
リアルタイムPCR機器はQIAGEN社のRotorGeneQ（温度均一性：±０．１℃）を用い、起炎菌データベースは７１菌種の予備データベースを使用した。
培養法またはシーケンス結果と比較したＩＭＬＬプローブを用いた個々のＴｍマッピング法起炎菌同定結果を表２（図１０）に示す。
Ｔｍマッピング法起炎菌同定結果が培養結果と一致しない場合、シーケンス法を用いて再度菌種同定を行った。合計１４検体でＴｍマッピング法による起炎菌同定を行った結果、１４検体全て（１４／１４）において、培養結果またはシーケンス結果と一致した。
但し、ＩＭＬＬプローブ法にてStaphylococcus属と同定された場合、S. aureus検出用ショートプローブを用い、S. aureusか？或いはそれ以外のStaphylococcus属（=CNS）か？…の追加検査を行っている（約１０分の追加検査で判定可能）。
次に本発明の７つのＩＭＬＬプローブ（配列番号１〜７）を使用してQIAGEN社のRotorGeneQ（温度均一性：±0.1℃）で複数回（例えば３回）測定したＴｍ値の平均を用い、１４６菌種のＴｍマッピング形状を有する広範なデータベースを構築した。
登録した１４５菌種（６５菌属）は以下のとおり：Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas hydrophila, Alistipes onderdonkii, Anaerococcus vaginalis, Arthrobacter cumminsii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis subsp. Subtilis, Bacteroides dorei, Bacteroides finegoldii, Bacteroides fragilis, Bacteroides nordii, Bacteroides salyersiae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides vulgatus, Bartonella henselae, Bifidobacterium bifidum, Bilophila wadsworthia, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni subsp.jejuni, Campylobacter rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga granulosa, Capnocytophaga haemolytica, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Chryseobacterium gleum, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum, Clostridium hylemonae, Clostridium paraputrificum, Clostridium perfringus, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminal, Clostridium tertium, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium striatum, Corynebacterium xerosis, Eggerthella lenta, Eikenella corrodens, Empedobacter brevis, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae subsp.cloacae, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus raffinosus, Escherichia albertii, Escherichia coli, Eubacterium limosum, Finegoldia magna, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium varium, Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Geobacillus stearothermophilus, Haemophilus influenzae, Halmonas venusta, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Kocuria rosea, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactococcus garvieae, Legionella pneumophila subsp.pneumophila, Leptospira interrogans serovar Copenhageni, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Morganella morganii, Nocardia cyriacigeorgica, Odoribacter splanchinicus, Pantoea agglomerans, Parvimonas micra, Pasteurella multocida, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptoniphilus gorbachii, Peptostreptococcus anaerobius, Plesiomonas shigelloides, Porphyromonas gingivalis, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella timonensis, Prevotella veronalis, Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Serratia plymuthia, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis/epidermidis, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus, Staphylococcus schleiferi subsp.coagulans, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus orali, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Tannerella forsythus, Treponema denticola, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis
登録した１４５菌種（６５菌属）は以下のとおり：Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas hydrophila, Alistipes onderdonkii, Anaerococcus vaginalis, Arthrobacter cumminsii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis subsp. Subtilis, Bacteroides dorei, Bacteroides finegoldii, Bacteroides fragilis, Bacteroides nordii, Bacteroides salyersiae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides vulgatus, Bartonella henselae, Bifidobacterium bifidum, Bilophila wadsworthia, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni subsp.jejuni, Campylobacter rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga granulosa, Capnocytophaga haemolytica, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Chryseobacterium gleum, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum, Clostridium hylemonae, Clostridium paraputrificum, Clostridium perfringus, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminal, Clostridium tertium, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium striatum, Corynebacterium xerosis, Eggerthella lenta, Eikenella corrodens, Empedobacter brevis, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae subsp.cloacae, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus raffinosus, Escherichia albertii, Escherichia coli, Eubacterium limosum, Finegoldia magna, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium varium, Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Geobacillus stearothermophilus, Haemophilus influenzae, Halmonas venusta, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Kocuria rosea, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactococcus garvieae, Legionella pneumophila subsp.pneumophila, Leptospira interrogans serovar Copenhageni, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Morganella morganii, Nocardia cyriacigeorgica, Odoribacter splanchinicus, Pantoea agglomerans, Parvimonas micra, Pasteurella multocida, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptoniphilus gorbachii, Peptostreptococcus anaerobius, Plesiomonas shigelloides, Porphyromonas gingivalis, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella timonensis, Prevotella veronalis, Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Serratia plymuthia, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis/epidermidis, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus, Staphylococcus schleiferi subsp.coagulans, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus orali, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Tannerella forsythus, Treponema denticola, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis
・ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング法の精度の評価（１４５菌種）。
ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング方法の精度をより詳細に評価するため、先ず１４５種（６５菌属）の細菌ＤＮＡを用いて広範なデータベースを作成し、次に１４５菌種のデータベースに登録されたのと同じ細菌ＤＮＡを用い、ロシュ・ライフサイエンス社のLight Cycler（登録商標）480（温度均一性：±０．４℃）を使用してブラインドテストを行った。
すなわち、細菌の名前を隠して、ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング法にて細菌ＤＮＡを同定した。
結果を表３−１（図１１）及び表３−２（図１２）に示す。
ブラインドテストの結果、種レベルでは１４５菌種中１１５菌種が一致、属レベルでは６５菌属の全てが一致した。種レベルで不一致の３０菌種は、データベースを作成した時点で温度均一性が±０．４℃の機器では同じ属の菌同士で絞り込めないことが分かっていた。
つまり、予測通りの結果であった。
温度均一性が±０．４℃の機器で種レベルにおいて同定出来ない菌は、Bacillus属では６菌種中３菌種、Bacteroides属では８菌種中２菌種、Campylobacter属では３菌種中２菌種、Corynebacterium属では４菌種中２菌種、Enterococcus属では７菌種中５菌種、Proteus属では２菌種中２菌種、Staphylococcus属では１１菌種中９菌種、Streptococcus属では１４菌種中５菌種、であった。
以上の結果、温度均一性が±0.4℃の機器を使用した場合でも、６５菌属を属レベルで正確に同定出来、種レベルでも１４５菌種中１１５菌種を正確に同定出来ることを示した。
少なくとも属レベルで起炎菌が迅速に同定できれば、殆どの場合は抗菌薬の選択が可能だが、種レベルの同定が必要な場合は菌種特異的ショートプローブを用いれば良い。
属が判明した後にショートプローブを絞って選択でき、１０分程度の追加検査で菌種を種レベルで同定することが出来る。
ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング方法の精度をより詳細に評価するため、先ず１４５種（６５菌属）の細菌ＤＮＡを用いて広範なデータベースを作成し、次に１４５菌種のデータベースに登録されたのと同じ細菌ＤＮＡを用い、ロシュ・ライフサイエンス社のLight Cycler（登録商標）480（温度均一性：±０．４℃）を使用してブラインドテストを行った。
すなわち、細菌の名前を隠して、ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング法にて細菌ＤＮＡを同定した。
結果を表３−１（図１１）及び表３−２（図１２）に示す。
ブラインドテストの結果、種レベルでは１４５菌種中１１５菌種が一致、属レベルでは６５菌属の全てが一致した。種レベルで不一致の３０菌種は、データベースを作成した時点で温度均一性が±０．４℃の機器では同じ属の菌同士で絞り込めないことが分かっていた。
つまり、予測通りの結果であった。
温度均一性が±０．４℃の機器で種レベルにおいて同定出来ない菌は、Bacillus属では６菌種中３菌種、Bacteroides属では８菌種中２菌種、Campylobacter属では３菌種中２菌種、Corynebacterium属では４菌種中２菌種、Enterococcus属では７菌種中５菌種、Proteus属では２菌種中２菌種、Staphylococcus属では１１菌種中９菌種、Streptococcus属では１４菌種中５菌種、であった。
以上の結果、温度均一性が±0.4℃の機器を使用した場合でも、６５菌属を属レベルで正確に同定出来、種レベルでも１４５菌種中１１５菌種を正確に同定出来ることを示した。
少なくとも属レベルで起炎菌が迅速に同定できれば、殆どの場合は抗菌薬の選択が可能だが、種レベルの同定が必要な場合は菌種特異的ショートプローブを用いれば良い。
属が判明した後にショートプローブを絞って選択でき、１０分程度の追加検査で菌種を種レベルで同定することが出来る。
最後に、敗血症患者から採取した全血検体（ＥＤＴＡ採血管２ｍＬ）４０検体（９菌種）を用いて、ＩＭＬＬローブ（配列番号１〜７）を用いたＴｍマッピング法の精度を従来の培養法のそれと比較して評価した。
リアルタイムＰＣＲ機器はロシュ・ライフサイエンス社のLight Cycler（登録商標）480（温度均一性：±０．４℃）を用い、起炎菌データベースは１４５菌種のデータベースを使用した。
培養法またはシーケンス結果と比較したＩＭＬＬプローブを用いた個々のＴｍマッピング法起炎菌同定結果を表４（図１３）に示す。
Ｔｍマッピング法起炎菌同定結果がStaphylococcus属までしか絞り込めない場合、S. aureus検出用ショートプローブを追加で使用し、S. aureusか、あるいはS. aureus以外のStaphylococcus属（CNS）であるか、の判定を行った。
合計４０検体でＴｍマッピング法による起炎菌同定を行った結果、３９検体（３９／４０）において従来の培養結果と一致した。
但し、培養で複数菌が検出された場合、Ｔｍマッピング法では数的に優位な菌のみを同定する。
複数菌が数的に同程度存在する場合（検体Ｎｏ．４０）、Ｔｍマッピング法では同定出来ず、不一致結果とした。
以上の結果、温度均一性が±０．４℃の機器を使用した場合でも、敗血症患者４０検体（９菌種）中３９検体を正確に同定出来ることを示した。
少なくとも属レベルで起炎菌が迅速に同定できれば、殆どの場合は抗菌薬の選択が可能だが、種レベルの同定が必要な場合は今回のS. aureus検出用ショートプローブのように菌種特異的ショートプローブを用いれば良い。
属が判明した後にショートプローブを絞って選択でき、１０分程度の追加検査で菌種を種レベルで同定することが出来る。
リアルタイムＰＣＲ機器はロシュ・ライフサイエンス社のLight Cycler（登録商標）480（温度均一性：±０．４℃）を用い、起炎菌データベースは１４５菌種のデータベースを使用した。
培養法またはシーケンス結果と比較したＩＭＬＬプローブを用いた個々のＴｍマッピング法起炎菌同定結果を表４（図１３）に示す。
Ｔｍマッピング法起炎菌同定結果がStaphylococcus属までしか絞り込めない場合、S. aureus検出用ショートプローブを追加で使用し、S. aureusか、あるいはS. aureus以外のStaphylococcus属（CNS）であるか、の判定を行った。
合計４０検体でＴｍマッピング法による起炎菌同定を行った結果、３９検体（３９／４０）において従来の培養結果と一致した。
但し、培養で複数菌が検出された場合、Ｔｍマッピング法では数的に優位な菌のみを同定する。
複数菌が数的に同程度存在する場合（検体Ｎｏ．４０）、Ｔｍマッピング法では同定出来ず、不一致結果とした。
以上の結果、温度均一性が±０．４℃の機器を使用した場合でも、敗血症患者４０検体（９菌種）中３９検体を正確に同定出来ることを示した。
少なくとも属レベルで起炎菌が迅速に同定できれば、殆どの場合は抗菌薬の選択が可能だが、種レベルの同定が必要な場合は今回のS. aureus検出用ショートプローブのように菌種特異的ショートプローブを用いれば良い。
属が判明した後にショートプローブを絞って選択でき、１０分程度の追加検査で菌種を種レベルで同定することが出来る。
次に、本発明の不完全一致配列の線状長鎖プローブを用いた改良Ｔｍマッピング法を実施例で説明する。
なお、本発明に係るプローブをＩＭＬＬプローブ（Imperfect-Match Linear Long probes）と表現した。
全体の流れ（ワークフロー）を図２に示す。
血液検体は、富山大学病院と流杉病院において、敗血症が疑われる患者から採取した全血であり、以下の実施例のすべての手技は、富山大学倫理委員会の承認並びにすべての患者から文書による同意を得て行われ、また実施例の方法は、承認されたガイドラインに従って実施された。
なお、本発明に係るプローブをＩＭＬＬプローブ（Imperfect-Match Linear Long probes）と表現した。
全体の流れ（ワークフロー）を図２に示す。
血液検体は、富山大学病院と流杉病院において、敗血症が疑われる患者から採取した全血であり、以下の実施例のすべての手技は、富山大学倫理委員会の承認並びにすべての患者から文書による同意を得て行われ、また実施例の方法は、承認されたガイドラインに従って実施された。
＜全血からの細菌ゲノムＤＮＡの単離＞
例えば、静脈からＥＤＴＡ採血管で採血し、軽度の遠心操作（100×g）にて血球を分離して上清を得る。この上清をチューブに移し、強い遠心操作（20,000×g）を行うことで細菌のペレットを得る。
具体的には、ＥＤＴＡチューブ（EDTA-2K真空採血管、ニプロ株式会社,）に２ｍＬの静脈血を採取した。
その後、血液サンプルを１００×ｇで５分間遠心分離して血液細胞をスピンダウンし、得られた上清画分（１ｍＬ、バフィーコートも含む）を使用した。
上清を再び２０,０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを乱さないように上清画分を除去した。
次に、分子レベルの蒸留水（分子生物学のために脱イオン滅菌された水、NACALAI TESQUE、INC；以下、滅菌水）を１ｍＬ添加し、穏やかに上下逆さまにした後、２０,０００×ｇで５分間遠心分離した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットを使用する前に、ペレットを再懸濁しないように、上清画分を再度注意深く取り除いた。
次に、供給者のプロトコールに従ってＤＮＡ抽出キット（QIAamp UCP Pathogen Mini Kit、Qiagen、Germany）を用いてペレットからＤＮＡを単離した。
次いで、１００μＬの溶出緩衝液で細菌ＤＮＡを溶出させた。
例えば、静脈からＥＤＴＡ採血管で採血し、軽度の遠心操作（100×g）にて血球を分離して上清を得る。この上清をチューブに移し、強い遠心操作（20,000×g）を行うことで細菌のペレットを得る。
具体的には、ＥＤＴＡチューブ（EDTA-2K真空採血管、ニプロ株式会社,）に２ｍＬの静脈血を採取した。
その後、血液サンプルを１００×ｇで５分間遠心分離して血液細胞をスピンダウンし、得られた上清画分（１ｍＬ、バフィーコートも含む）を使用した。
上清を再び２０,０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを乱さないように上清画分を除去した。
次に、分子レベルの蒸留水（分子生物学のために脱イオン滅菌された水、NACALAI TESQUE、INC；以下、滅菌水）を１ｍＬ添加し、穏やかに上下逆さまにした後、２０,０００×ｇで５分間遠心分離した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットを使用する前に、ペレットを再懸濁しないように、上清画分を再度注意深く取り除いた。
次に、供給者のプロトコールに従ってＤＮＡ抽出キット（QIAamp UCP Pathogen Mini Kit、Qiagen、Germany）を用いてペレットからＤＮＡを単離した。
次いで、１００μＬの溶出緩衝液で細菌ＤＮＡを溶出させた。
＜細菌コロニーからの細菌ゲノムＤＮＡの単離＞
細菌コロニーを滅菌接種ループで拾い上げ、滅菌水１ｍＬに懸濁した。
続いて２０,０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去しペレットを得た。
供給者のプロトコールに従って、ＤＮＡ抽出キット（QIAamp UCP Pathogen Mini Kit、Qiagen）を用いて、得られたペレットからＤＮＡを単離した。次に、１００μＬの溶出緩衝液で細菌ＤＮＡを溶出させた。
細菌コロニーを滅菌接種ループで拾い上げ、滅菌水１ｍＬに懸濁した。
続いて２０,０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去しペレットを得た。
供給者のプロトコールに従って、ＤＮＡ抽出キット（QIAamp UCP Pathogen Mini Kit、Qiagen）を用いて、得られたペレットからＤＮＡを単離した。次に、１００μＬの溶出緩衝液で細菌ＤＮＡを溶出させた。
＜ＰＣＲアッセイ＞
増幅にはVeritiTM Thermal Cycler（Applied Biosystems）を使用し、ＩＭＬＬプローブのＴｍ値解析にはLightCycler Nano（Roche Applied Science）を使用した。
ここで、２つの独立したサーマルブロックを持つLightCycler Nanoを使用する場合、Ｔｍマッピング法による起炎菌同定のために７つのＰＣＲチューブすべてに同じサーマルブロックを使用することが好ましい。
すべてのＰＣＲアッセイは、単一チューブアッセイ（マルチプレックスＰＣＲなし）として行った。
最初のＰＣＲ［PCR (one tube)］にはＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅフリーのＰＣＲチューブ（Eppendorf、Germany）、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ（Qiagen）、ネスティドＰＣＲ［Nested PCR (five tubes)］は0.1 mLのStrip Tubes and Caps（Qiagen）を使用した。
すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、マルチアラインメントソフトウェアプログラム（Clustal X）を用いて設計され、ライフテクノロジーズジャパン株式会社（東京、日本）によって合成された。
本施行においては、IMLLプローブとして消光プローブ（Q-プローブ）を採用した。
すべての消光プローブはマルチプルアラインメントソフトウェア（Clustal X）を用いて設計され、日鉄住金環境株式会社（筑波、日本）によって合成された。
バクテリアの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の７つの領域を普遍的に増幅するようにバクテリアユニバーサルプライマーを設計した（図３）。
増幅にはVeritiTM Thermal Cycler（Applied Biosystems）を使用し、ＩＭＬＬプローブのＴｍ値解析にはLightCycler Nano（Roche Applied Science）を使用した。
ここで、２つの独立したサーマルブロックを持つLightCycler Nanoを使用する場合、Ｔｍマッピング法による起炎菌同定のために７つのＰＣＲチューブすべてに同じサーマルブロックを使用することが好ましい。
すべてのＰＣＲアッセイは、単一チューブアッセイ（マルチプレックスＰＣＲなし）として行った。
最初のＰＣＲ［PCR (one tube)］にはＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅフリーのＰＣＲチューブ（Eppendorf、Germany）、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ（Qiagen）、ネスティドＰＣＲ［Nested PCR (five tubes)］は0.1 mLのStrip Tubes and Caps（Qiagen）を使用した。
すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、マルチアラインメントソフトウェアプログラム（Clustal X）を用いて設計され、ライフテクノロジーズジャパン株式会社（東京、日本）によって合成された。
本施行においては、IMLLプローブとして消光プローブ（Q-プローブ）を採用した。
すべての消光プローブはマルチプルアラインメントソフトウェア（Clustal X）を用いて設計され、日鉄住金環境株式会社（筑波、日本）によって合成された。
バクテリアの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の７つの領域を普遍的に増幅するようにバクテリアユニバーサルプライマーを設計した（図３）。
＜ファーストＰＣＲプライマー＞
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 '
・逆方向：5'-CCGGGAACGTATTCACC-3'、
（アンプリコンサイズ：1378bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域１プライマー＞
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3
・逆方向：5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′
（アンプリコンサイズ：338 bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域２プライマー＞
・順方向：5'-GACTCCTACGGGAGGCA-3 '
・逆方向：5'-TATTACCGCGGCTGCTG-3'
（アンプリコンサイズ：199bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域３プライマー＞
・順方向：5'-AGCAGCCGCGGTAATA-3'
・逆方向：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3 '
（アンプリコンサイズ：287bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域４プライマー＞
・順方向：5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3 '
・逆方向：5'-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′
（アンプリコンサイズ：181 bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域5プライマー＞
・順方向：5'-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3 '
・逆方向：5'-GAGCTGACGACAGCCAT-3'
（アンプリコンサイズ：120bp）
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 '
・逆方向：5'-CCGGGAACGTATTCACC-3'、
（アンプリコンサイズ：1378bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域１プライマー＞
・順方向：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3
・逆方向：5′-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3′
（アンプリコンサイズ：338 bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域２プライマー＞
・順方向：5'-GACTCCTACGGGAGGCA-3 '
・逆方向：5'-TATTACCGCGGCTGCTG-3'
（アンプリコンサイズ：199bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域３プライマー＞
・順方向：5'-AGCAGCCGCGGTAATA-3'
・逆方向：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3 '
（アンプリコンサイズ：287bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域４プライマー＞
・順方向：5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3 '
・逆方向：5'-AATTAAACCACATGCTCCACC-3′
（アンプリコンサイズ：181 bp）
＜セカンドＰＣＲ（nested PCR）用、領域5プライマー＞
・順方向：5'-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3 '
・逆方向：5'-GAGCTGACGACAGCCAT-3'
（アンプリコンサイズ：120bp）
上記の細菌ユニバーサルプライマーによるネステッドPCRで得られた５つのアンプリコンの、それぞれに結合する以下の７つのQ-プローブを設計した（図３および図４）。
＜IMLLプローブ1-1＞
・5'-GTTATCCCACTCTAATAAGCAGGTTACCTACGTATTACTCACCC-3 '
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNA（アクセッション番号AB548582）の84-126］
＜IMLLプローブ1-2＞
・5'-CACCTACTAGCTAATCTTATCTGGGCACATCCGATGGC-3 '
［プローブサイズ：38bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの193-230］
＜IMLLプローブ2-1＞
・5'-CACGCGGCATGGCTCCATCAGGCTTTCCCCCATTGTCGAAGATTC-3'
［プローブサイズ：45bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの335-379］
＜IMLLプローブ3-1＞
・5'-CGCCCTGTAATTCCGAATAACGCTAGCTCCCACCGTATTAC-3 '
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-2＞
・5'-CCAAGTTGAGCCCGGGCCTTTCACTACTGACTTAACAAACCGCC-3 '
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの557-600］
＜IMLLプローブ4-1＞
・5'-GGCACAACCTCTTAATACTCATCGTTTACAGCGTGGAC-3 '
［プローブサイズ：38 bp, 大腸菌16S rRNAの776-813］
＜IMLLプローブ5＞
・5'-ATCTCTGCAAAGTTCTAAGGATGTCAAGATTAGGTAAGGTTC-3 '
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの949-990］
＜S. aureus検出用ショートプローブ＞
・5'-TATCTAATGCAGCGCGGATC-3 '：配列番号８
［プローブサイズ：20 bp、結合部位：黄色ブドウ球菌16S rRNA（Accession No. AB681291)の211-230）
＜IMLLプローブ1-1＞
・5'-GTTATCCCACTCTAATAAGCAGGTTACCTACGTATTACTCACCC-3 '
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNA（アクセッション番号AB548582）の84-126］
＜IMLLプローブ1-2＞
・5'-CACCTACTAGCTAATCTTATCTGGGCACATCCGATGGC-3 '
［プローブサイズ：38bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの193-230］
＜IMLLプローブ2-1＞
・5'-CACGCGGCATGGCTCCATCAGGCTTTCCCCCATTGTCGAAGATTC-3'
［プローブサイズ：45bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの335-379］
＜IMLLプローブ3-1＞
・5'-CGCCCTGTAATTCCGAATAACGCTAGCTCCCACCGTATTAC-3 '
［プローブサイズ：41bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの503-543］
＜IMLLプローブ3-2＞
・5'-CCAAGTTGAGCCCGGGCCTTTCACTACTGACTTAACAAACCGCC-3 '
［プローブサイズ：44bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの557-600］
＜IMLLプローブ4-1＞
・5'-GGCACAACCTCTTAATACTCATCGTTTACAGCGTGGAC-3 '
［プローブサイズ：38 bp, 大腸菌16S rRNAの776-813］
＜IMLLプローブ5＞
・5'-ATCTCTGCAAAGTTCTAAGGATGTCAAGATTAGGTAAGGTTC-3 '
［プローブサイズ：42bp、結合部位：大腸菌16S rRNAの949-990］
＜S. aureus検出用ショートプローブ＞
・5'-TATCTAATGCAGCGCGGATC-3 '：配列番号８
［プローブサイズ：20 bp、結合部位：黄色ブドウ球菌16S rRNA（Accession No. AB681291)の211-230）
＜ファーストＰＣＲの手順＞
ＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）の組成は以下の通り：２００μＭの各ホットスタートｄＮＴＰ（CleanAmpTM Hot Start dNTP Mix、Sigma-Aldrich、USA：使用前にAmicon Ultra 50K遠心フィルター Merck Millipore Germany でろ過した）、ＤＮＡ鋳型２μＬ、5０ｍＭ塩化カリウム、２．２５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３）、０．３μＭの各プライマー、ストックバッファー溶液に溶解した「真核生物をホスト細胞として作製した耐熱性DNAポリメラーゼ」１．０単位（０．５μＬ）。
このＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）にて1st ＰＣＲを実施した。
なお、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を用いた「真核生物をホスト細胞としての耐熱性DNAポリメラーゼの作製」は公知方法に従った。
陽性コントロールとして大腸菌（ATCC 25922）から抽出された２μＬ（８．０ｎｇ／μＬ）のＤＮＡを、陰性コントロールとして２μＬの滅菌水（NACALAI TESQUE、INC.）を、それぞれ２μＬのＤＮＡテンプレートの代わりに使用した。
各サンプルを９５℃で５分間インキュベートしてホットスタートｄＮＴＰを活性化した後、９４℃で１０秒間変性させ、５７℃で１０秒間アニールし、７２℃で３０秒間４０サイクル伸長させた。
上記の結果生じたPCR産物を滅菌水（NACALAI TESQUE、INC）で１００倍に希釈し、次いで セカンド（ネステッド）ＰＣＲのテンプレートとして使用した。
ＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）の組成は以下の通り：２００μＭの各ホットスタートｄＮＴＰ（CleanAmpTM Hot Start dNTP Mix、Sigma-Aldrich、USA：使用前にAmicon Ultra 50K遠心フィルター Merck Millipore Germany でろ過した）、ＤＮＡ鋳型２μＬ、5０ｍＭ塩化カリウム、２．２５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３）、０．３μＭの各プライマー、ストックバッファー溶液に溶解した「真核生物をホスト細胞として作製した耐熱性DNAポリメラーゼ」１．０単位（０．５μＬ）。
このＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）にて1st ＰＣＲを実施した。
なお、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を用いた「真核生物をホスト細胞としての耐熱性DNAポリメラーゼの作製」は公知方法に従った。
陽性コントロールとして大腸菌（ATCC 25922）から抽出された２μＬ（８．０ｎｇ／μＬ）のＤＮＡを、陰性コントロールとして２μＬの滅菌水（NACALAI TESQUE、INC.）を、それぞれ２μＬのＤＮＡテンプレートの代わりに使用した。
各サンプルを９５℃で５分間インキュベートしてホットスタートｄＮＴＰを活性化した後、９４℃で１０秒間変性させ、５７℃で１０秒間アニールし、７２℃で３０秒間４０サイクル伸長させた。
上記の結果生じたPCR産物を滅菌水（NACALAI TESQUE、INC）で１００倍に希釈し、次いで セカンド（ネステッド）ＰＣＲのテンプレートとして使用した。
＜セカンド（ネステッド）ＰＣＲの手順＞
ＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）の組成は以下の通り：２００μＭの各ホットスタートｄＮＴＰ（CleanAmpTM Hot Start dNTP Mix、Sigma-Aldrich、USA：使用前にAmicon Ultra 50K遠心フィルター Merck Millipore Germany でろ過した）、1st PCR産物を１００倍希釈したDNAテンプレート2μL、5０ｍＭ塩化カリウム、２．２５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３）、各フォワードプライマー０．７５μＭ、各リバースプライマー０．２５μＭ、およびストックバッファー溶液に溶解した「真核生物をホスト細胞として作製した耐熱性DNAポリメラーゼ」１．０単位（０．５μＬ）。
領域１〜５を増幅するために使用した７つのＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）を９５℃で５分間インキュベートしてホットスタートｄＮＴＰを活性化し、次いで９４℃で１０秒間変性し、５７℃で１０秒間アニールし、７２℃で１０秒間伸長させた。
３０サイクル実施。
ＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）の組成は以下の通り：２００μＭの各ホットスタートｄＮＴＰ（CleanAmpTM Hot Start dNTP Mix、Sigma-Aldrich、USA：使用前にAmicon Ultra 50K遠心フィルター Merck Millipore Germany でろ過した）、1st PCR産物を１００倍希釈したDNAテンプレート2μL、5０ｍＭ塩化カリウム、２．２５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３）、各フォワードプライマー０．７５μＭ、各リバースプライマー０．２５μＭ、およびストックバッファー溶液に溶解した「真核生物をホスト細胞として作製した耐熱性DNAポリメラーゼ」１．０単位（０．５μＬ）。
領域１〜５を増幅するために使用した７つのＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）を９５℃で５分間インキュベートしてホットスタートｄＮＴＰを活性化し、次いで９４℃で１０秒間変性し、５７℃で１０秒間アニールし、７２℃で１０秒間伸長させた。
３０サイクル実施。
＜Ｔｍ値の解析＞
セカンドＰＣＲの増幅産物２０μＬ中８μＬを採取し、それぞれ０．１２μＭのIMLL Q-プローブ（合計１０μＬ）と混合した。
Ｔｍ値解析のための前段階工程として、得られた７種の混合物を９５℃で５分間加熱し、４℃／秒で段階的に低下させ、次いで４０℃で１分間冷却した。
Ｔｍ値の解析は、４０℃〜８０℃で、０．１℃／ステップで温度を増加させて行った。
続いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｎａｎｏソフトウェアプログラムを使用してデータプロファイルを分析し、Ｔｍ値を測定した。
セカンドＰＣＲの増幅産物２０μＬ中８μＬを採取し、それぞれ０．１２μＭのIMLL Q-プローブ（合計１０μＬ）と混合した。
Ｔｍ値解析のための前段階工程として、得られた７種の混合物を９５℃で５分間加熱し、４℃／秒で段階的に低下させ、次いで４０℃で１分間冷却した。
Ｔｍ値の解析は、４０℃〜８０℃で、０．１℃／ステップで温度を増加させて行った。
続いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｎａｎｏソフトウェアプログラムを使用してデータプロファイルを分析し、Ｔｍ値を測定した。
＜起炎菌同定感度の測定＞
ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング法による菌の同定および検出の限界は、既知の菌数（ＣＦＵ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をリン酸生理食塩液中に溶解し、その菌液を連続的に（ｌｏｇ２倍に）希釈して後、IMLL Qプローブを用いて各希釈菌液をＴｍマッピング法で同定を施すことによって決定した。
同定の限界は、「Ｔｍマッピング法による同定結果（Difference Value値が0.5以下）が正しい場合で、希釈系列の最も薄いｌｏｇ２希釈である」と定義された上で測定した。
ＬＯＤ（= Limit Of Detection, すなわち検出限界）は、「７つのＴｍ値の少なくとも１つが測定された場合のDNAテンプレートの最終ｌｏｇ２希釈である」と定義された上で測定した。
ＩＭＬＬプローブを用いたＴｍマッピング法による菌の同定および検出の限界は、既知の菌数（ＣＦＵ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をリン酸生理食塩液中に溶解し、その菌液を連続的に（ｌｏｇ２倍に）希釈して後、IMLL Qプローブを用いて各希釈菌液をＴｍマッピング法で同定を施すことによって決定した。
同定の限界は、「Ｔｍマッピング法による同定結果（Difference Value値が0.5以下）が正しい場合で、希釈系列の最も薄いｌｏｇ２希釈である」と定義された上で測定した。
ＬＯＤ（= Limit Of Detection, すなわち検出限界）は、「７つのＴｍ値の少なくとも１つが測定された場合のDNAテンプレートの最終ｌｏｇ２希釈である」と定義された上で測定した。
＜シーケンスによる細菌ゲノムＤＮＡ配列に基づく菌種同定＞
最初のＰＣＲ手順で使用されたサンプルからのアンプリコンを精製し（QIAquick PCR精製キット; QIAGEN）、その後、領域１フォワードプライマーおよび領域５リバースプライマーを用いてシーケンスを行い（3500 Genetic Analyzer; Applied Biosystems）、塩基配列を決定した。
細菌ゲノムＤＮＡ配列に基づく菌種同定方法は、DNAデータバンク（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）のＢＬＡＳＴヌクレオチドデータベースツールを用いて、菌種のオンライン相同性検索を行った。
最初のＰＣＲ手順で使用されたサンプルからのアンプリコンを精製し（QIAquick PCR精製キット; QIAGEN）、その後、領域１フォワードプライマーおよび領域５リバースプライマーを用いてシーケンスを行い（3500 Genetic Analyzer; Applied Biosystems）、塩基配列を決定した。
細菌ゲノムＤＮＡ配列に基づく菌種同定方法は、DNAデータバンク（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）のＢＬＡＳＴヌクレオチドデータベースツールを用いて、菌種のオンライン相同性検索を行った。
＜従来の培養法を用いた細菌の生化学的同定＞
同じ穿刺部位から、血培用全血液サンプル（１つの好気性血液培養ボトルおよび１つの嫌気性血液培養ボトル）をＴｍ値分析のための血液サンプルと同時に収集した。
細菌の生化学的同定では、富山大学附属病院検査部（ＩＳＯ１５１８９認証）の標準的な方法に従って全血検体を分析した。
血液培養手順は、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄシステム（bioMerieux、Inc.、Mercy-l'Etoile、France）を用いて行った。
陽性の血液培養ボトルを適切な培地で継代培養し、十分な増殖が得られるまで（通常１８〜２４時間）好気的または嫌気的にインキュベートした。
好気性菌は主にＭｉｃｒｏＳｃａｎ ＷａｌｋＡｗａｙシステム（Siemens Healthcare Diagnostics、IL、USA）、ＲａｐＩＤ ＡＮＡ ＩＩ（Thermo Fisher SCIENTICIC、UK）を用いて同定し、嫌気性菌は主に様々なラテックス凝集および生化学的スポットテストを用いて同定を行った。
但し、菌種によっては特定の同定方法を行った。
同じ穿刺部位から、血培用全血液サンプル（１つの好気性血液培養ボトルおよび１つの嫌気性血液培養ボトル）をＴｍ値分析のための血液サンプルと同時に収集した。
細菌の生化学的同定では、富山大学附属病院検査部（ＩＳＯ１５１８９認証）の標準的な方法に従って全血検体を分析した。
血液培養手順は、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄシステム（bioMerieux、Inc.、Mercy-l'Etoile、France）を用いて行った。
陽性の血液培養ボトルを適切な培地で継代培養し、十分な増殖が得られるまで（通常１８〜２４時間）好気的または嫌気的にインキュベートした。
好気性菌は主にＭｉｃｒｏＳｃａｎ ＷａｌｋＡｗａｙシステム（Siemens Healthcare Diagnostics、IL、USA）、ＲａｐＩＤ ＡＮＡ ＩＩ（Thermo Fisher SCIENTICIC、UK）を用いて同定し、嫌気性菌は主に様々なラテックス凝集および生化学的スポットテストを用いて同定を行った。
但し、菌種によっては特定の同定方法を行った。
本発明の７つのＩＭＬＬプローブを用いる改良Ｔｍマッピング法は、ＰＣＲチューブ間のＴｍ値測定誤差が±０．５℃以内のリアルタイムＰＣＲ機器でも少なくとも属レベルで、そして多くは種レベルで正確に菌を識別・同定出来る。
従って、ほぼ全てのリアルタイムＰＣＲ機器でＴｍマッピング法の施行が可能となるため、検体採取後４時間程度で不特定の感染症起炎菌が同定できる本検査法の広範な普及が期待される。
従って、ほぼ全てのリアルタイムＰＣＲ機器でＴｍマッピング法の施行が可能となるため、検体採取後４時間程度で不特定の感染症起炎菌が同定できる本検査法の広範な普及が期待される。
Claims (6)
- 感染症起炎菌の同定方法であって、下記（１）〜（５）の工程を有することを特徴とする感染症起炎菌の同定方法。
（１）血液などの検体から微生物のDNAを抽出する工程。
（２）抽出した微生物ＤＮＡを鋳型とし、複数の細菌ユニバーサルプライマーを用いてネステッドＰＣＲを行う工程。
（３）遺伝子増幅物に、不完全一致配列の線状長鎖プローブ（ＩＭＬＬプローブ）を加え、ＩＭＬＬプローブの融解温度（Ｔｍ）値の解析を行う工程。
（４）複数のＩＭＬＬプローブのＴｍ値を二次元にマッピングする工程。
（５）二次元マッピングの「形状」をデータベースと照合する工程。 - 前記工程（２）の複数の細菌ユニバーサルプライマーを用いてネステッドＰＣＲを行う工程には、複数回の工程からなる請求項１に記載の感染症起炎菌の同定方法。
- 前記工程（３）の不完全一致配列の線状長鎖プローブは、３５〜５０の塩基からなり、ミスマッチの数と位置とにより、菌種の相違によるＴｍ値の相違が遺伝子増幅物によるＴｍ値の相違より大きい請求項１または２に記載の感染症起炎菌の同定方法。
- 前記菌種の相違によるＴｍ値の相違が、菌種間で最大２０℃以上の相違である請求項３に記載の感染症起炎菌の同定方法。
- ３５〜５０塩基、かつ、ミスマッチの数と位置とにより、菌種毎に幅広いＴｍ値を有し、菌種間で最大２０℃以上の相違を有する不完全一致配列の線状長鎖プローブ。
- 配列番号１〜８又は配列番号２１〜３４のうち、いずれかの塩基配列を有する不完全一致配列の線状長鎖プローブ。
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| 仁井見英樹: "「血流感染症（ＢＳＩ）の迅速報告実践にむけて 敗血症起炎菌迅速同定システム Melting Temperature(Tm) ma", 臨床と微生物, vol. 44, no. 5, JPN6018035991, September 2017 (2017-09-01), pages 447 - 455, ISSN: 0004683030 * |
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