JP2005341955A - 新規ポリヌクレオチド、それを用いた深在性輸入真菌症原因菌ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ）の検出用マーカ、プローブ、プライマー、検出方法およびキット - Google Patents

Abstract

【課題】深在性輸入真菌症の原因菌ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ）を特異的に検出する技術を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列は、ペニシリウム・マルネッフェイに特異的な遺伝子配列の一例である。これを検出することにより、ペニシリウム・マルネッフェイを特異的に検出できる。例えば、特定の塩基配列のフォワード側プライマーと、特定の塩基配列のリバース側プライマーを用い、ＰＣＲにより該特定の塩基配列の遺伝子断片を増幅することにより、ペニシリウム・マルネフェイを特異的に検出できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、新規ポリヌクレオチド、それを用いた深在性輸入真菌症原因菌ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）の検出用マーカ、プローブ、プライマー、検出方法およびキットに関する。

最近、世界的なグローバル化が急速に進み、以前は地域が限定され風土病とされていた病気が、流行地からの原材料を扱う人や当地を訪問した人が感染し異動先などで発病する例が増加している。これらのうち真菌によって起こる病気を輸入真菌症と呼び、通常の深在性真菌症よりも深刻で、これらの原因菌は病原性が強く、重篤に至る率が高いため早急に同定診断する必要がある。また、バイオテロリズムなどに悪用される可能性も高いため、これらの菌種を迅速に検出・同定することが望まれている。ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）は、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）と共に、危険度クラス３に属する真菌において、最も危険とされる菌であり、培養や培養後の取り扱いは慎重を要し、特定の設備を持った機関でのみ取り扱う必要がある。
従来の深在性真菌症原因菌としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ、以下Ｃ．と略す。）属真菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、以下Ａ．と略す。）属真菌、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、以下Ｃｒ．と略す。）属真菌などが知られているが、的確な治療などのために、これらの深在性真菌感染とペニシリウム・マルネッフィとを迅速に区別する必要がある。

近年、深在性真菌症は免疫不全患者に目和見感染症として増加しているが、その患者は重篤な基礎疾患を持つことが多く、早期に起炎菌を明らかにして的確な治療をすることが必要である。深在性真菌症の診断は血液培養法が基本であるが検出感度などに問題がある。これまでに抗体による診断薬が市販されているが、抗体による診断は免疫不全状態の患者には役立たない。このような現状で、近年、抗原やその他の菌体成分を直接検出する方法が開発されてきている。たとえば、マンナン、Ｄ一アラビニトル、グルカンなどを検出して感染を診断する方法が開発されている。一方、分子生物学の発展につれて、結核菌やクラミジアなど各種病原菌のＤＮＡを抽出し、いわゆるＰＣＲ法などによって核酸を検出することによって診断する方法が開発されている。深在性真菌症の分野でもリボゾームＲＮＡを検出して診断する方法などが提示されている（例えば、下記非特許文献１参照。）。本発明者らは、先にこれら各種真菌症の原因となる真菌のミトコンドリアに存在するチトクロームｂの遺伝子に着目し、アスペルギルス属およびカンジダ属真菌を検出するために用いられる核酸を提供し、さらにそれを用いることによる簡便、迅速、特異的かつ高感度な深在性真菌症の原因菌、さらにはアスペルギルス属およびカンジダ属真菌の検出方法を開発した（例えば下記特許文献１、下記特許文献２参照。）。
特開２００２−１４２７７４号公報 国際特許第９８／１００７３号パンフレット 「臨床病理」、４３省補冊、１９９５年、１１９頁

本発明の目的は、深在性輸入真菌症の原因菌のうちペニシリウム・マルネッフェイを種特異的に検出するのに使用可能な新規なポリヌクレオチドを提供することである。

本発明者らは、各種深在性真菌症の原因菌、なかでもペニシリウム・マルネッフェイの遺伝子に関する種々の検討を重ねた。その結果、これら各種深在性真菌症の原因となる真菌のミトコンドリアに存在するチトクロームｂの遺伝子の一部を増幅し、その配列を解読することに成功した。本発明者らは、その配列を基にさらに研究を重ねた結果、ペニシリウム・マルネッフェイに特異的な配列（例えば、配列番号１）を見出し、これが検出用マーカ配列として使用可能であることを突き止めた。そして、この配列を基にさらに研究を重ねた結果、前記特異的配列を検出可能なプローブおよびプライマーを設計した（例えば、配列番号２若しくは３）。本発明によれば、簡便、迅速、特異的かつ高感度にペニシリウム・マルネッフェイを検出・同定することが可能である。

すなわち、本発明の第１のポリヌクレオチドは、下記の（ａ），（ｂ）および（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ａ） 配列番号１記載の塩基配列（但し、任意の位置のチミン（ｔ）は、ウラシル（ｕ）で置換されていてもよい。以下、同じ）からなるポリヌクレオチド。
（ｂ） 配列番号１記載の塩基配列と相補的配列からなるポリペプチド。
（ｃ） 配列番号１記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失若しくは付加している塩基配列からなるポリペプチドであって、（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリペプチド。
また、本発明の第２のポリヌクレオチドは、下記の（ｄ），（ｅ）および（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ｄ） 配列番号１記載の塩基配列における少なくとも１０塩基連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｅ） 配列番号１記載の塩基配列と相補的配列における少なくとも１０塩基連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｆ） 配列番号１記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失若しくは付加している塩基配列における少なくとも１０塩基連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、（ｄ）または（ｅ）のポリペプチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリペプチド。

本発明により従来、同定に時間のかかっていたペニシリウム・マルネッフェイを迅速、簡便に特異的且つ高感度で検出・同定することが可能となる。本発明の第１および第２のポリヌクレオチドは、マーカ、遺伝子増幅反応用のプライマー、若しくは直接検出用のプローブとして用いることが可能である。また、プライマーにより増幅した産物をプローブで検出することにより、感度、特異性をさらに高くすることも可能であり、その臨床的意義は大きく、さらに、現在、特に問題になっているバイオテロリズムにも迅速に対応できる。なお、本発明において、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと同一の場合がある。

本発明の第１のポリヌクレオチドにおいて、前記（ｃ）における前記（ａ）のポリヌクレオチドとストリンジェンドな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

本発明のマーカは、ペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのマーカであって、前記第１のポリヌクレオチドを含むマーカである。このマーカを、後述の本発明のプローブやプライマーを用いて検出することにより、ペニシリウム・マルネッフェイを検出・同定できる。

前記第２のポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１０塩基連続する塩基配列が、配列番号１の３‘末端若しくは５’末端から連続する塩基配列であってもよい。前記第２のポリヌクレオチドにおいて、その塩基数は、１０塩基以上、好ましくは２０〜３０塩基である。

本発明のプローブは、ペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのプローブであって、本発明の第２のポリヌクレオチドを含むプローブである。本発明のプローブは、検出用の標識（ラベル）を有することが好ましい。前記標識としては、例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチンなどがある。なお、本発明のプローブは、前記第２のポリヌクレオチド単独で構成されていてもよいし、その他のポリヌクレオチドが連結されていてもよい。

本発明のプライマーは、ペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのプライマーであって、本発明の第２のポリヌクレオチドを含むプライマーである。このプライマーは、フォファード側であってもよいし、リバース側であってもよい。本発明のプライマーとしては、例えば、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーがある。このプライマーは、フォワード側プライマーであることが好ましい。また、本発明のプライマーとしては、例えば、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーがある。このプライマーは、例えば、リバース側プライマーであることが好ましい。なお、本発明のプライマーは、前記第２のポリヌクレオチド単独で構成されていてもよいし、その他のポリヌクレオチドが連結されていてもよい。

本発明の第１のペニシリウム・マルネッフェイの検出方法は、本発明のプローブによりペニシリウム・マルネッフェイのチトクロームｂ遺伝子を検出する方法である。本発明のプローブは、前記チトクロームｂ遺伝子内の特異的配列（例えば、配列番号１）とハイブリダイズするので、これによりペニシリウム・マルネッフェイを種特異的に検出できる。また、本発明の第１のキットは、第１の検出方法によりペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのキットであって、本発明のプローブを含むキットである。

本発明の第２のペニシリウム・マルネッフェイの検出方法は、本発明のプライマーを用いた遺伝子増幅法によりペニシリウム・マルネッフェイのチトクロームｂ遺伝子を検出する方法である。本発明のプライマーは、前記チトクロームｂ遺伝子内に特異的配列（例えば、配列番号１）とハイブリダイズするので、これによりペニシリウム・マルネッフェイを種特異的に検出できる。また、本発明の第２のキットは、第２の検出方法によりペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのキットであって、本発明のプライマーを含むキットである。前記遺伝子増幅法は、ＰＣＲ法が好ましい。この場合、本発明の第２のキットは、ＰＣＲ法用の試薬を含んでいても良く、前記試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰなどがある。また、第２のキットは、増幅産物を検出するためのプローブを有していてもよく、前記プローブとしては、本発明のプローブが好ましい。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、一般的なハイブリダイズ条件をいい、例えば、下記実施例に記載するような通常のＰＣＲにおけるアニーリング条件下で、鋳型となる標的核酸にハイブリダイズし、プライマーとして機能する条件、または、標的核酸とプローブのハイブリダイズにより検出可能な電圧や電流に変化を及ぼす条件である。また、「ハイブリダイズ」とは、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡの間で、互いに相補的な塩基配列を利用して人工的に二本鎖の雑種核酸分子を形成することである。なお、配列番号２及び３で示される塩基配列は、ペニシリウム・マルネッフェイのミトコンドリアにおけるチトクロームｂ遺伝子内の３３ｎｔ〜５２ｎｔ（配列番号２）の領域及び３６７ｎｔ〜３８６ｎｔ（配列番号３）の領域それぞれとハイブリダイズするものである。

前述のように、本発明の第２のポリヌクレオチドは、プローブとして用いることができるし、ＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマーとして用いることもできる。プライマーとして用いる場合、２つの本発明の第２のポリヌクレオチドのうち、一方をフォワード側プライマーとして使用し、他方をリバース側プライマーとして使用することが好ましい。例えば、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドをフォワード側プライマーとし、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドをリバース側プライマーとして用いた場合には、被検試料中にペニシリウム・マルネッフェイのミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子が存在していれば、３５４塩基対の長さの核酸（配列番号４）が増幅される。この場合、他の種のペニシリウム属菌、アスペルギルス属菌、カンジダ属、クリプトコックス属菌などの真菌遺伝子が存在していても、これらの他の菌由来の遺伝子断片の増幅は起きない。従って、増幅の有無を調べることによりペニシリウム・マルネッフェイの検出・同定が可能である。

本発明のポリヌクレオチドは、菌由来のものであってもよいし、化学合成したものであってもよい。化学合成は、例えば、市販の核酸合成装置等を用いて実施できる。

本発明の第２のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合、標識剤で標識することが好ましい。この場合、被験試料中のペニシリウム・マルネッフェイ遺伝子と標識プローブをハイブリダイズさせた後に、遺伝子と標識プローブとの結合物もしくは非結合の標識プローブを、標識剤に適した適当な検出法で検出する。プローブに用いる標識剤は、例えば、蛍光標識、放射標識、酵素標識、ビオチン等を挙げることができる。検体、すなわち被験試料中の真菌遺伝子と前記プローブとのハイブリダイズは、検体を通常の方法で前処理、精製したものを被験試料とし、それとプローブとを混合し、室温から８０℃で１０分から４８時間処理することにより実施できる。標識の検出以外に、ハイブリダイズは、ハイブリダイズの結果生ずる電圧や電流の変化により検知しても良い。また、検体はあらかじめ本発明のプライマーを用いて増幅反応を行っておいてもよい。本発明のプローブは、例えば、ＤＮＡチップやＤＮＡアレイなどの形態で使用してもよい。

本発明の第２のポリヌクレオチドを、遺伝子増幅法用のプライマーとして用いれば、ＤＮＡポリメラーゼ等による伸長反応を行って遺伝子増幅することにより、ペニシリウム・マルネッフェイのチトクロームｂ遺伝子断片のみを特異的に増幅させ、この増幅産物を測定することによって、ペニシリウム・マルネッフェイを検出することができる。本発明のプライマーは、標識剤で標識化してもよい。ここで用いられる遺伝子増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法やその改変法があるが、特に限定されるものではなく、短鎖のオリゴ核酸をプライマーとして遺伝子合成の開始のために用いるいずれの遺伝子増幅法をも用いることができる。また、いわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを実施してもよく、この場合には被検核酸の定量も可能になる。従って、本発明における「検出」には、定量的な検出も包含される。遺伝子増幅法によるペニシリウム・マルネッフェイの検出は、上記方法により増幅された増幅産物、すなわちチトクロームｂ遺伝子断片を検出することにより行うことができるし、その他、増幅されたチトクロームｂ遺伝子断片を制限酵素によって断片化し、その断片の生成パターンを比較することによっても検出できる。ここで用いる制限酵素は、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。増幅されたチトクロームｂ遺伝子断片、または制限酵素でさらに断片化された遺伝子断片の検出手段は特に限定されることはなく、通常の遺伝子の検出方法（例えば電気泳動法など）が使用できる。増幅産物は、例えば電気泳動により分画され、特異的かつ検出に十分な程度に鮮明なバンドとして容易に検出できる。なお、遺伝子増幅法において、核酸混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）もしくはリボ核酸混合物（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）をＤＮＡもしくはＲＮＡ合成の原料として使用することが好ましい。

本発明のプローブを含む第１のキットは、前記プローブに加え、このプローブを検出するための試薬を含んでいても良い。前記その他の試薬としては、例えば、前記プローブが標識化されている場合の前記標識の検出剤、緩衝剤などがある。本発明のプライマーを含む第２のキットは、前記プライマーに加え、その他の試薬を含んでいても良い。前記その他の試薬としては、例えば、核酸合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、デオキシリボヌクレオチド混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、リボヌクレオチド混合物（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）、制限酵素、緩衝液などがある。また、本発明のプローブは、固相担体に結合させて、捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと標識プローブの２つを組合せてサンドイッチアッセイを行ってもよい。また標的核酸を標識して捕捉する方法もある。さらに、本発明のプローブをビオチンで標識し、ハイブリダイズ後、アビジン結合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイにおいて、どちらか一方に本発明のプローブを用いれば、種特異的な検出が可能となるため、他方のプローブの特異性は若干低くてもよい。また、前記結合担体で捕捉した際の電圧や電流の変化を検出しても良い。前述のように、本発明のプローブは、例えば、ＤＮＡチップやＤＮＡアレイの形態で使用してもよい。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

（各種核酸の合成）
配列番号２および３の各塩基配列で表される各ポリヌクレオチドを化学合成した。以下、配列番号２若しくは３の塩基配列からなる各ポリヌクレオチドを、それぞれ核酸２，核酸３と呼ぶ

（ペニシリウム・マルネッフェイのＰＣＲによる同定）
ポテトデキストロース液体培地で培養して得たペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ ＩＦＭ４５５４２）の菌体を、７５％エタノール処理し殺菌した。１５００ｇ、１０分間の遠心分離で菌体を得、ＤＮＡ抽出試薬（タカラバイオ社製、Ｇｅｎとるくん（登録商標）酵母用）を用いて核酸を抽出し乾燥後、−２０℃に保存した。

この核酸を鋳型にし、前記核酸２と核酸３をプライマーとして、タカラバオイ（株）のＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑを用い、リアルタイムＰＣＲ装置（Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標） ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して以下の方法でＰＣＲ反応を行い、チトクロームｂ遺伝子の一部を増幅し増幅の特異性を検証した。反応液の組成は次の通りであった。

ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（２ｘｃｏｎｃ．） １２．５μｌ
核酸２（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ； １０μｌＭ） ０．５μｌ
核酸３（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ： １０μｌＭ） ０．５μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ（＜３０ｎｇ） １μｌ
水にて全量を２５μｌにした。

反応条件は次の通りであった。
熱変性：９４℃、１０秒
アニーリングと重合反応：６０℃、３０秒
サイクル数：４０回

増幅されたＤＮＡを二重鎖ＤＮＡにインターカレーションにより蛍光を発するサイバーグリーンの蛍光強度から検出した。この結果を、図１のグラフに示す。配列２と配列３、ＴａＫａＲａ Ｓ

酸を加えて反応させた結果、ペニシリウム・マルネッフィから抽出した核酸のみに増幅反応が検出できた。すなわち、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（以後ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍをＰ．と略す。）、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉｕｍ、Ｐ．ｄｕｃｌａｕｘｉｉ、Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ、Ｐ．ｍｉｎｉｏｌｕｔｅｕｍ、Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐ．ｒｕｇｕｌｏｓｕｍ、Ｐ．ｓｐｉｎｕｌｏｓｕｍの近縁なペニシリウム属菌では、増幅は全くみられず、高頻度に罹患する深在性真菌症原因菌である、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓから抽出した核酸においても増幅は全く認められなかった。

増幅したＤＮＡの解離温度を測定した。この結果を図２に示す。図示のように、解離温度は、増幅されたＤＮＡのみ測定でき、それは７８．０３℃であることを示した。この解離温度はＤＮＡの種類で特徴的な値を示し、検出した増幅ＤＮＡが、目的のものであること、すなわち、ペニシリウム・マルネッフィ由来の遺伝子断片であることが確認できた。

本発明によれば、ペニシリウム・メルネッフェイを種特異的に検出可能である。

図１は、本発明の一実施例において、リアルタイムＰＣＲにより増幅された産物の増加パターンを示す図である。 図２は、前記実施例において、増幅が認められた二重鎖ＤＮＡの解離温度を測定した結果を示す図である。

Claims (15)

1. 下記の（ａ），（ｂ）および（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド。
   （ａ） 配列番号１記載の塩基配列（但し、任意の位置のチミン（ｔ）は、ウラシル（ｕ）で置換されていてもよい。以下、同じ）からなるポリヌクレオチド。
   （ｂ） 配列番号１記載の塩基配列と相補的配列からなるポリペプチド。
   （ｃ） 配列番号１記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失若しくは付加している塩基配列からなるポリペプチドであって、（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリペプチド。
2. 前記（ｃ）における前記（ａ）のポリペプチドとストリンジェンドな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが、配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドである請求項１記載のポリヌクレオチド。
3. ペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのマーカであって、請求項１または２記載のポリヌクレオチドを含むマーカ。
4. 下記の（ｄ），（ｅ）および（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチド。
   （ｄ） 配列番号１記載の塩基配列における少なくとも１０塩基連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
   （ｅ） 配列番号１記載の塩基配列と相補的配列における少なくとも１０塩基連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
   （ｆ） 配列番号１記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失若しくは付加している塩基配列における少なくとも１０塩基連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、（ｄ）または（ｅ）のポリペプチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリペプチド。
5. 少なくとも１０塩基連続する塩基配列が、配列番号１の３‘末端若しくは５’末端から連続する塩基配列である請求項４記載のポリヌクレオチド。
6. ペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのプローブであって、請求項４または５記載のポリヌクレオチドを含むプローブ。
7. ペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのプライマーであって、請求項４または５記載のポリヌクレオチドを含むプライマー。
8. 少なくとも１０塩基連続する塩基配列が、配列番号２記載の塩基配列である請求項７記載のプライマー。
9. フォワード側プライマーである請求項８記載のプライマー。
10. 少なくとも１０塩基連続する塩基配列が、配列番号３記載の塩基配列である請求項７記載のプライマー。
11. リバース側プライマーである請求項１０記載のプライマー。
12. ペニシリウム・マルネッフェイの検出方法であって、請求項６記載のプローブを用い、ペニシリウム・マルネッフェイのチトクロームｂ遺伝子を検出する方法。
13. 請求項１２記載の方法によりペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのキットであって、請求項６記載のプローブを含むキット。
14. ペニシリウム・マルネッフェイの検出方法であって、請求項７から１１のいずれかに記載のプライマーを用い、遺伝子増幅法によりペニシリウム・マルネッフェイのチトクロームｂ遺伝子を検出する方法。
15. 請求項１４記載の方法によりペニシリウム・マルネッフェイを検出するためのキットであって、請求項７から１１のいずれかに記載のプライマーを含むキット。

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